CN101566579A - 一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法 - Google Patents
一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101566579A CN101566579A CNA2009100272912A CN200910027291A CN101566579A CN 101566579 A CN101566579 A CN 101566579A CN A2009100272912 A CNA2009100272912 A CN A2009100272912A CN 200910027291 A CN200910027291 A CN 200910027291A CN 101566579 A CN101566579 A CN 101566579A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dyeing
- live vaccine
- fowl pox
- pox virus
- recombinant fowl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法。该方法是将带LacZ标记基因的重组鸡痘病毒活疫苗稀释后接种次代CEF，72h终止培养，加戊二醛固定液固定后，用X－gal染色液染色，37℃培养箱过夜或8－12小时，取出培养板放倒置显微镜下计数蓝染的空斑，计算疫苗病毒含量。本发明方法与现有技术相比，具有操作简单、耗时短、计数准确的优点。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗的制造与检验，具体涉及一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法。
背景技术
近年来，重组鸡痘病毒活疫苗研制已成为疫苗研制的热点，许多国家已有产品获准生产。在我国禽流感重组鸡痘病毒活疫苗已上市，还有多个产品处于临床试验阶段。常用的鸡痘病毒活疫苗空斑形成单位(PFU)计数方法多以琼脂覆盖法或显微镜下直接计数法进行。琼脂覆盖法操作繁琐，影响因素多，空斑出现迟；显微镜下直接计数时常常因为空斑不典型，特别是孔板或培养瓶边缘的空斑难以确认，或有细胞团块干扰，造成计数不准确。因此，在重组鸡痘病毒活疫苗制造和检验中，迫切需要一种简易、快速、准确的检测疫苗病毒PFU的方法。
技术内容
为了克服现有重组鸡痘病毒活疫苗空斑计数方法操作繁琐、计数不准确的不足，本发明提供一种重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法，有效地解决了问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法，是将重组鸡痘病毒活疫苗10倍系列稀释，接种24孔培养板培养的次代CEF，每个稀释度接种3孔，72h终止培养，吸去培养液，加2mL/L戊二醛固定液固定15min，吸去固定液，加500ug/ml X-gal染色液染色，37℃培养箱过夜(或8-12小时)。取出培养板放倒置显微镜下计数蓝染的空斑，计算疫苗病毒含量(PFU)。
由于近几年研制的重组鸡痘病毒活疫苗，插入的筛选标记基因一般都选择LacZ基因(表达β-半乳糖苷酶)，本研究利用重组鸡痘病毒携带LacZ标记基因特点，建立了用X-gal直接进行病毒空斑染色计数PFU的方法。本方法可适用于所有选择LacZ基因作为标记基因的重组鸡痘病毒活疫苗的PFU检测。
X-gal染色原理是X-gal被重组鸡痘病毒表达的β-半乳糖苷酶裂解成半乳糖和5-溴-4-氯-3-羟基吲哚，5-溴-4-氯-3-羟基吲哚然后被氧化成5，5’-二溴-4，4’-二氯-靛蓝(蓝色产物)。
本发明的有益效果是，X-gal染色计数法，细胞培养终止时间为72h，而常规的琼脂覆盖法计数空斑要5～6天。染色计数法计数时，培养板边缘空斑染色清楚，染色的蓝色空斑与背景对比清晰，识别容易，使得PFU计数快速而准确。
附图说明
图1是X-gal染色的rFPV-11SH5A空斑(100×)
A.接种72h，染色的空斑。
B.位于孔板边缘的染色空斑。
C.接种48h，空斑染色细胞少
图2是两种PFU计数方法的计数结果
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
重组鸡痘活疫苗(rFPV-11SH5A)：(陈素娟，孙蕾，石火英，彭大新，刘秀梵；《禽流感病毒H5亚型主要保护性抗原在禽痘病毒中的高效表达》中国兽医学报，2007，27(2)：200-2002)
实施例1.表达禽流感HA基因重组鸡痘活疫苗(rFPV-11SH5A)的检测。取实验室制备的8批次rFPV-11SH5A疫苗细胞苗，分别进行染色计数法计数和直接计数法计数。
染色计数法计数：rFPV-11SH5A疫苗细胞苗10倍系列稀释，各取100ul 10-4～10-6稀释度的病毒，接种到24孔培养板培养的次代鸡胚成纤维细胞(CEF)上，每个稀释度接种3孔，吸附2h，加维持液，37℃CO2培养箱，72h终止培养，吸去培养液，加2mL/L戊二醛固定液固定15min，吸去固定液，加500ug/ml X-gal染色液染色，37℃培养箱过夜(或8-12小时)。取出培养板放倒置显微镜下计数蓝染的空斑。培养板边缘空斑染色清楚，染色的蓝色空斑与背景对比清晰，识别容易，见图1。
染色计数法计数的PFU数是直接计数法的1.6-3.3倍，见图2。
Claims (2)
1、一种重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法，其特征在于，是将带LacZ标记基因的重组鸡痘病毒活疫苗稀释，接种次代CEF，72h终止培养，吸去培养液，加戊二醛固定液固定，吸去固定液后，加X-gal染色液染色，37℃培养箱过夜或8-12小时，取出培养板放倒置显微镜下计数蓝染的空斑，计算疫苗病毒含量。
2、根据权利要求1所说的重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法，其特征在于，具体操作是：将重组鸡痘病毒活疫苗10倍系列稀释，接种24孔培养板培养的次代CEF，每个稀释度接种3孔，72h终止培养，吸去培养液，加2mL/L戊二醛固定液固定15min，吸去固定液，加500ug/ml X-gal染色液染色，37℃培养箱过夜或8-12小时，取出培养板放倒置显微镜下计数蓝染的空斑，计算疫苗病毒含量。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2009100272912A CN101566579A (zh) | 2009-05-27 | 2009-05-27 | 一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2009100272912A CN101566579A (zh) | 2009-05-27 | 2009-05-27 | 一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101566579A true CN101566579A (zh) | 2009-10-28 |
Family
ID=41282839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2009100272912A Pending CN101566579A (zh) | 2009-05-27 | 2009-05-27 | 一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101566579A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109119168A (zh) * | 2018-06-28 | 2019-01-01 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种鸡胚的测试方法和系统、存储介质 |
| CN110412028A (zh) * | 2018-04-27 | 2019-11-05 | 中国科学院动物研究所 | 一种昆虫颗粒体病毒的计数方法 |
-
2009
- 2009-05-27 CN CNA2009100272912A patent/CN101566579A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110412028A (zh) * | 2018-04-27 | 2019-11-05 | 中国科学院动物研究所 | 一种昆虫颗粒体病毒的计数方法 |
| CN109119168A (zh) * | 2018-06-28 | 2019-01-01 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种鸡胚的测试方法和系统、存储介质 |
| CN109119168B (zh) * | 2018-06-28 | 2022-03-22 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种鸡胚的测试方法和系统、存储介质 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101665781B (zh) | 高滴度猪圆环病毒2型培养细胞、制备方法及其用法 | |
| CN107760654A (zh) | 一种无血清、无饲养层的小鼠诱导多能干细胞的培养基及其方法 | |
| Liu et al. | Detection and molecular characterization of recombinant avian leukosis viruses in commercial egg-type chickens in China | |
| CN101566579A (zh) | 一种检测重组鸡痘病毒活疫苗空斑的染色计数方法 | |
| Al-Garib et al. | Tissue tropism in the chicken embryo of non-virulent and virulent Newcastle diseases strains that express green fluorescence protein | |
| CN103937746A (zh) | 一种制备动物转基因阳性单细胞克隆的方法 | |
| Zaffuto et al. | Primary chicken tracheal cell culture system for the study of infection with avian respiratory viruses | |
| CN103571795B (zh) | 用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法 | |
| CN103923876A (zh) | 一种单细胞克隆培养方法 | |
| CN108384759A (zh) | 诱导皮肤成纤维细胞重编程的方法及其应用 | |
| CN102943127A (zh) | 禽白血病j亚群病毒pcr检测用引物及检测试剂盒 | |
| CN106939318A (zh) | 一种单细胞克隆分离方法 | |
| CN102590507A (zh) | 一种df1细胞培养外源性禽白血病病毒的快速检测方法 | |
| CN110042087A (zh) | 一种重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP及其应用 | |
| Durruthy et al. | Derivation of GMP-compliant integration-free hiPSCs using modified mRNAs | |
| CN105695392A (zh) | 一种可提高肝细胞体外分化表型及功能的培养方法 | |
| CN105483087B (zh) | 一种人支气管上皮细胞株hbe-tt | |
| CN107083355A (zh) | 一种饲养层细胞及其制备方法与应用 | |
| CN106636206A (zh) | 一种merrf患者的外周血单个核细胞的非整合性重编程方法 | |
| CN105861447A (zh) | 一种非病毒iPSCs诱导组合物及其试剂盒 | |
| CN101693887A (zh) | 高通量病毒快速培养鉴定的方法及其应用 | |
| CN106047932B (zh) | 甲基-β-环糊精在提高杆状病毒外源蛋白表达量中的应用 | |
| CN105259007B (zh) | 一种牛体外受精囊胚双重染色的方法 | |
| CN109666650A (zh) | 一种细胞重编程方法 | |
| CN110387357A (zh) | 一种带荧光标记的重组病毒的纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20091028 |