CN101549006B - 白扁豆提取物、其提取方法及其在制备抗紫外线损伤制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白扁豆提取物、其提取方法及其在制备抗紫外线损伤制剂中的应用。本发明白扁豆提取物是将白扁豆粉碎后，先对其用生理盐水进行提取，再将提取物用饱和硫酸铵进行盐析，最后经脱盐、干燥后得到。实验证明，本发明的白扁豆提取物对组织细胞具有特殊的调控作用，可以减轻或阻止外源性因素导致的损伤，以其为活性成分制备的多种剂型的抗紫外辐射损伤药物和化妆品均具有较好的疗效，对皮肤具有强大的抗辐射作用。因此，本发明白扁豆提取物可用于制备抗紫外辐射损伤药物和抗紫外辐射化妆品。

Description

白扁豆提取物、其提取方法及其在制备抗紫外线损伤制剂中的应用

技术领域

本发明涉及植物提取物及其提取方法与应用，具体涉及白扁豆提取物及其提取方法与其新用途，特别是在制备抗紫外线损伤药物和抗紫外辐射化妆品中的应用。

背景技术

人类赖以生存的地球，由于大气臭氧层的保护，阻挡了太阳光中99％的紫外线辐射，使得地球上的万物生灵免受强紫外线的伤害，正是臭氧层这个大保护伞的保护，使得地球这颗蓝色的星球生机盎然，到处充满活力，因此，臭氧层被成为人类和生物的天然保护屏障。

自1985年首次报道南极臭氧空洞以来，大气平流层臭氧耗损已成为当今关注的全球性环境问题之一。臭氧层分布于10km～50km的平流层内，浓度的重心约在25km处，等值平均厚度约为0.3cm，臭氧的大量耗损不仅导致太阳光中紫外线辐射通量增强，而且，对人类健康和生存环境也将造成难以估量的重大伤害。因此，研究紫外线对皮肤造成的光辐射损伤，采取积极有效的防护措施，对人体皮肤健康的保护具有重要意义。

1、紫外线辐射的物理和生物学特点

紫外线是太阳光谱中波长200nm～400nm部分，在太阳光中约占6.1％(见图1)。按波长长短，一般将紫外线分为三个区：C区，短波紫外线200nm～280nm；B区，中波紫外线280nm～320nm；A区，长波紫外线320nm～400nm。太阳光中的短波紫外线由于波长短，基本上被大气臭氧层所吸收，不能到达地面。对人体皮肤有生理作用的主要是B区、A区紫外线。由图2可以看出，B区中波紫外线绝大部分被表皮吸收，少量透过真皮，被照射部位产生急性红斑效应。A区紫外线辐射占紫外线总能量的98％，绝大部分透过真皮，少量的透过真皮下的皮下组织，辐射穿透能力远远大于B区紫外线，长期照射积累，易对皮肤造成严重的损伤。

2、紫外线对皮肤的光辐射损伤

2.1紫外线辐射的急性损伤：太阳光下，皮肤长时间受到强烈照射，若不采取任何保护措施，将导致皮肤的急性红班效应。受紫外线辐射数小时后皮肤变红，8小时达到高峰后慢慢减弱，这种情况称为日炙。由太阳光引起日炙产生红班的最高波长域为300nm～310nm。皮肤受到紫外线照射后，被伤害的细胞产生炎症，使毛细血管亢进扩张，肉眼可看到表皮皮肤潮红，皮肤晒后约72小时开始逐渐变黑，由于黑色素细胞机能亢进，产生大量的黑色素，会变为黝黑的皮肤，若恢复到原皮肤颜色需数月时间。红斑效应严重者可伴有水肿、水疱、脱皮，全身症状可伴有寒颤、发烧、恶心等。

2.2紫外线辐射导致的慢性光老化：长波紫外线对皮肤的透射力强，可穿透表皮和大部分真皮层，破坏皮肤内的弹力纤维，使肌肉失去弹性，引起皮肤松弛，导致皮肤光老化。皮肤的光老化和自然老化之间存在一定的相似之处，但在临床、组织病理学等方面有着明显的不同，表1为皮肤光老化与自然老化的解剖学差别。

表1皮肤自然老化和光老化解剖学差别

3、紫外线光辐射防护

对太阳光中的紫外线辐射采取积极有效的防护措施，可预防和减轻皮肤的光辐射损伤，使皮肤在较短的时间内得到恢复，给皮肤造成的威胁将会大大减少。

3.1国内紫外吸收剂和紫外散射剂的使用状况：近年来，人们的防晒意识，对皮肤的自我保护意识逐年增强，对保护有效的防晒化妆品的需求量越来越大。每逢夏季，各品牌防晒产品接联登台亮相，各知名品牌的防晒品更是如火如荼，以其强大的广告支持及稳定的消费群力拢头筹。近年来，北京日化研究所与国外有关公司合作，对国内市场上出售的60余种防晒产品进行了防晒成分的分析及测定。结果表明：95％的防晒产品添加有有机吸收剂，70％的防晒产品添加有无机粉体，85％的防晒产品中同时添加了2种或2种以上的有机吸收剂，配方中使用最多的防晒剂达5种之多。使用频率较高的防晒剂有：甲氧基肉桂酸辛酯、二苯甲酮-3、辛基二甲基PABA、TiO₂和ZnO₂、丁基甲氧基二苯甲酰甲烷(parsol 1789)、二苯甲酮-4等。

由于技术上的原因，大部分的防晒剂还是用于中波紫外线的防护，对长波紫外线重视不够。虽然，UVA照射到人体的能量占紫外线总能量的98％，对皮肤的穿透性远大于UVB，长期的UVA照射，将导致皮肤严重的损害而难以治疗。

3.2天然防晒剂的光辐射防护：自然界中的许多中草药天然植物，在化妆品中不仅具有很好的吸收紫外线能力，还具有抗菌、增白、消炎等作用，它们广泛分布在植物的花、果、叶、和心材中。

3.2.1有机酸类

3.2.1.1异阿魏酸：它是北升麻根茎、田旋花的主要有效成分，紫外吸收特征波长325nm，对波长305nm～310nm范围内的紫外线有强烈吸收作用，该波段紫外线导致光敏性红斑生成，对阳光晒黑型皮肤有增白作用。

3.2.1.2黄木樨酸苷：从木樨全草中提取，对酪氨酸酶活性有很强的抑制作用。体外试验，黄木樨酸苷质量分数为1％，其抑制率为97.5％，能吸收紫外线并具有较好的消炎效果。增白型乳液与蛋白质类营养物质的协同性较好，用量(以质量分数计)为0.01％～5％。

3.4.2黄酮类

自然界中含黄酮化合物的中草药，在化妆品中不仅具有很好的吸收紫外线能力，还具有抗菌、增白、消炎等作用。含黄酮化合物的中草药很多，它们广泛分布在植物的花、果、叶和心材中，在植物体中与糖结合成苷。由于其结构的共轭性，黄酮化合物对紫外光均具有强烈的吸收作用，且紫外吸收能力强，吸收范围广，用量为常用防晒剂质量分数的1％即能达到相当好的效果，常用的含黄酮化合物的中草药有：黄芩、芦丁、槲皮素、甘草素。此外，黄芪总黄酮对紫外线所致红细胞溶血有很好的防护作用，对紫外线所致细胞膜脂质过氧化反应有明显的抑制作用，可能是一种较好的天然抗紫外线损伤物质。

3.4.3醌类

碳环上具有两个羰基，并含有共轭双键的化合物称为醌，如萘醌、蒽醌、菲醌。蒽醌类化合物及其衍生物能吸收紫外线，具有较好的防晒作用，如芦荟，它的有效成分芦荟苷可强烈吸收290nm～320nm范围的紫外光，并有保湿、调理皮肤的功能。研究表明，芦荟汁、凝胶和皮具均有一定的防晒作用，它的防晒效果为：凝胶＞汁＞皮，是一种较好的天然防晒剂。

4、发展趋势

世界卫生组织曾发出警告，防晒品不足以防止皮肤癌的发生，仅仅靠涂抹化妆品是不够的，还应采取其它措施。无论是中、长波紫外吸收剂，还是物理防晒剂对晒伤后引起的炎症基本上是无力的。因此，具有消炎作用的药物将会在防晒制品和晒后护理品中占有一席之地。

研究开发天然防晒原料，研究对日光紫外线造成的辐射损伤进行综合防护、抗紫外线辐射损伤、抗氧化损伤、抗炎症和防止皮肤癌的发生，对提高防晒产品的有效性、保证产品的安全性较有机合成防晒剂更具优势，且难度更大，这也是今后防晒护理品发展的趋势。

白扁豆是一种常用中药，为豆科植物Dolichos lablab的种子；白扁豆始载于《名医别录》，全国各地均有栽培，主产于浙江、安徽、湖南、河南等地。

白扁豆为药食兼优之物，营养丰富，含有脂肪油、蛋白质、尼克酸、氨基酸、维生素及糖类等成分，还含有微量元素及钙、磷、铁等，以种子、种皮(扁豆衣)、花(扁豆花)供药用或食用。白扁豆味甘、淡，性平；种子、种皮具有和胃化湿，健脾利水，清暑止泻等功能，主治脾虚腹泻、恶心呕吐、食欲不振、赤白带下等症；扁豆花具有解暑、化湿、止泻、止带等功能，主治中暑发热、呕吐泻泄、白带、痢疾等症。在历版药典当中，均收载了以白扁豆为药效成分的许多中成药，尤其是用于脾虚等症的药物中均以白扁豆为主药，临床应用极为广泛。

发明内容

本发明的目的是提供白扁豆提取物的一种新用途，其能够对抗紫外线造成的皮肤损伤，即白扁豆提取物在制备抗紫外线损伤制剂中的应用。

本发明所述的应用是以白扁豆提取物为活性成分在制备抗紫外线损伤药物或抗紫外线化妆品中的应用。

本发明所述的白扁豆提取物，是将白扁豆粉碎后，先对其用生理盐水进行提取，再将提取物用饱和硫酸铵进行盐析，最后经脱盐、干燥后得到的白扁豆提取物。

具体来讲，所述白扁豆提取物所提供的提取方法，可包括以下步骤：

1)将白扁豆机械粉碎；

2)将步骤1)得到的白扁豆粉用生理盐水进行提取；

3)将步骤2)得到的提取液用饱和硫酸铵进行盐析；

4)将步骤3)盐析得到的沉淀依次进行脱盐，干燥处理，得到白扁豆提取物。

在上述提取方法中，步骤2)中用生理盐水对白扁豆粉进行提取的方法可为：将白扁豆粉与4-10倍体积的生理盐水混和，在室温下搅拌0.5-6小时后，过滤，离心，弃沉淀，上清液为白扁豆提取液。所述过滤可用4～8层的纱布。

步骤3)中硫酸铵的质量/体积(W/V)百分浓度可为30-100％，可用其中的一种或几种浓度对其进行盐析；盐析条件可为：在4℃下盐析1-4小时。

步骤4)中用蒸馏水对步骤3)盐析得到的沉淀进行脱盐处理。

本发明的抗紫外线损伤药物可制成多种剂型，如凝胶剂、片剂(薄膜衣片)、口服液、胶囊剂、膏剂或搽剂等。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的赋形剂。所述赋形剂的添加量可根据实际情况进行调整，如0.1％-55.0％(W/V)。

具体来讲，所述凝胶剂型的抗紫外线损伤药物的原料配方，可包括下述重量份数比的组分：

白扁豆提取物                50份，

卡波姆                      5份，

氢氧化钠                    2份，

水                          1000份。

所述片剂(薄膜衣片)剂型的抗紫外线损伤药物的原料配方，可包括下述重量份数比的组分(1000片)：

白扁豆提取物                100份，

微晶纤维素                      75份，

乳糖                            70份，

羟丙纤维素                      25份，

交联羧甲基纤维素钠              25份，

95％乙醇                        50-100份，

微粉硅胶                        3份。

所述口服液剂型的抗紫外线损伤药物的原料配方，可包括下述重量份数比的组分(1000支，每支10mL)：

白扁豆提取物                    200份，

蔗糖                            100份，

苯甲酸                          10-50份，

桔子香精                        10-50份，

水                              10000份。

所述胶囊剂型的抗紫外线损伤药物的原料配方，可包括下述重量份数比的组分(1000粒)：

白扁豆提取物                      50份，

预胶化淀粉                        80份，

乳糖                              50份，

羧甲基淀粉钠                      10份。

上述膏剂、凝胶剂和搽剂剂型的药物的使用方法为直接涂抹于患处，用量一般为1-3次/天，0.2-1.0g/次，疗程一般为10-20天；上述片剂(薄膜衣片)、口服液和胶囊剂剂型的药物的使用方法为口服，用量一般为0.2-10mg/kg体重/day，疗程一般为10-20天。剂量和疗程都可根据实际情况调整。

为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂等进行组合用于治疗。

本发明的抗紫外线化妆品是在化妆品中添加可接受剂量的白扁豆提取物，适用于各种剂型的化妆品中，如膏剂、霜剂、乳剂、液剂、凝胶剂或胶囊剂等。上述各种剂型的化妆品均可以按照相关制剂领域的常规方法制备。

需要的时候，在上述化妆品中还可以加入一种或多种以上可接受的赋形剂、香料、乳化剂、防腐剂、抗氧剂和表面活性剂等化妆品添加物。所述化妆品添加物的添加量可根据实际情况进行调整，如0.1％-55.0％(W/V)。

本发明提供了白扁豆提取物的一种新用途，即在制备抗紫外线损伤药物和抗紫外线化妆品中的应用。实验证明，本发明的白扁豆提取物对组织细胞具有特殊的调控作用，可以减轻或阻止外源性因素导致的损伤，以其为活性成分制备的多种剂型的抗紫外线损伤药物和化妆品均具有较好的疗效，对皮肤具有强大的抗紫外辐射作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为太阳光线光谱

图2为皮肤对光透过波长的依赖关系

图3为红细胞凝集实验结果

图4为白扁豆提取物的SDS-PAGE检测结果

图5为表皮干细胞形态图

图6为经紫外线UVB照射后细胞表皮干细胞凋亡情况的检测结果

图7为小鼠皮肤形态结构观察结果

图8为小鼠皮肤组织中金属基质蛋白酶表达情况的检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，第三版，2002，科学出版社)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例1、白扁豆提取物的制备

本发明白扁豆提取物的获得方法，包括以下步骤：

1)将90g白扁豆机械粉碎成粉末。

2)将步骤1)得到的白扁豆粉用生理盐水进行提取，方法为：将白扁豆粉分别与6和8倍体积(4-10倍体积均可)的生理盐水混和，各自在室温下搅拌3小时(0.5-6小时均可)后，用4-8层纱布过滤，合并两批滤液，然后在4℃下20000rpm离心15min，弃沉淀，上清液为白扁豆提取液。

3)向步骤2)得到的提取液中添加固体(NH₄)₂SO₄，分别至(NH₄)₂SO₄30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(W/V)饱和浓度后进行盐析，在4℃冰箱中静置2小时(1-4小时均可)，然后在4℃下20000rpm离心15min，收集各自沉淀。

4)将步骤3)经不同浓度饱和(NH₄)₂SO₄盐析得到的沉淀分别先用蒸馏水透析进行脱盐处理，然后冷冻干燥，得到白扁豆提取物。合并各自白扁豆提取物，称重，共得到白扁豆提取物1.46g。

实施例2、白扁豆提取物的制备

本发明白扁豆提取物的获得方法，包括以下步骤：

1)将180g白扁豆机械粉碎。

2)将步骤1)得到的白扁豆粉用生理盐水进行提取，方法为：将白扁豆粉分别与4、7和10倍体积(4-10倍体积均可)的生理盐水混和，各自在室温下搅拌6小时(0.5-6小时均可)后，用4-8层纱布过滤，合并三批滤液，然后在4℃下20000rpm离心25min，弃沉淀，上清液为白扁豆提取液。

3)向步骤2)得到的提取液中添加固体(NH₄)₂SO₄，分别至30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(W/V)饱和浓度后进行盐析，在4℃冰箱中静置4小时(1-4小时均可)，然后在4℃下25000rpm离心15min，收集各自沉淀。

4)将步骤3)经不同浓度饱和(NH₄)₂SO₄盐析得到的沉淀先用蒸馏水透析进行脱盐处理，然后冷冻干燥，得到白扁豆提取物。合并、称重，共得到白扁豆提取物4.88g。

实施例3、白扁豆提取物的制备

本发明白扁豆提取物的获得方法，包括以下步骤：

1)将360g白扁豆机械粉碎。

2)将步骤1)得到的白扁豆粉用生理盐水进行提取，方法为：将白扁豆粉分别与4、6、8和10倍体积(4-10倍体积均可)的生理盐水混和，各自在室温下搅拌0.5小时(0.5-6小时均可)后，用4-8层纱布过滤，合并四批滤液，然后在4℃下30000rpm离心25min，弃沉淀，上清液为白扁豆提取液。

3)向步骤2)得到的提取液中添加固体(NH₄)₂SO₄，分别至30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(W/V)饱和浓度后进行盐析，在4℃冰箱中静置1小时(1-4小时均可)，然后在4℃下30000rpm离心10min，收集各自沉淀。

4)将步骤3)经不同浓度饱和(NH₄)₂SO₄盐析得到的沉淀先用蒸馏水透析进行脱盐处理，然后冷冻干燥，得到白扁豆提取物。合并并称重，共得到白扁豆提取物8.68g。

实施例4、红细胞凝集实验

用下述实验检测本发明白扁豆提取物对红细胞的凝集作用，方法如下：

1、制备红细胞悬液：小鼠摘除眼球取血约1mL，加入0.2mL 2％EDTA-Na溶液抗凝，混均后2000rpm离心10min，弃上清，将沉淀用10mL PBS(0.01M)冲洗，2000rpm离心10min，弃上清，冲洗3次，将沉淀用PBS配制成2％的重悬液备用。

2、红细胞凝集实验：在96孔凝血板上，每孔加入50μl PBS缓冲液后，分别加入实施例1-3获得的经30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(W/V)不同硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物：每排第一孔加入50μl提取物，混匀；再从第一孔取50μl溶液加入第二孔，混匀；再从第二孔取50μl溶液加入第三孔，混匀；依此类推，做倍比稀释，直至从第十一孔取50μl溶液加入第十二孔，混匀后从第十二孔吸弃50μl溶液。然后，往各孔中加入步骤1获得的50μl红细胞重悬液，全部加完后在摇床上振摇10min，将凝血板室温静置1-2h，观察凝集反应。

凝集效果图如图3所示，实施例1-3获得的经30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(W/V)不同硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物均对红细胞有凝集作用。

实施例5、白扁豆提取物的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测

对实施例1-3获得的经30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(W/V)不同硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物进行SDS-PAGE检测，检测方法包括以下步骤：

1、安装玻璃板；

2、配制5mL 15％分离胶；

3、小心将分离胶注入准备好的两玻璃间隙中，为上层浓缩胶留下一定的空间，轻轻在分离胶上层加水覆盖，以阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用；

4、待凝胶和水之间出现一条折光性很强的线时，说明凝胶聚合完成，用吸水纸吸干上层水；

5、配制2mL浓缩胶；

6、将浓缩胶灌入分离胶上层，插入梳子，小心不要产生气泡；

7、在浓缩胶聚合时，取不同硫酸铵饱和度沉淀得到的提取物各10μl，加入2.5μl上样缓冲液，沸水浴煮5min；

8、将玻璃板放入电泳槽中，加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，拔去梳子；

9、用微量加样枪按次序加样；

10、电泳：80V电压，至染料抵达分离胶上部，换130V电压，直至染料前沿抵达分离胶的底部，断开电源；

11、取下凝胶，切去浓缩胶，将分离胶放入一个平皿中，加入0.25％考马斯亮蓝R250染色1h；

12、回收染液，用脱色液脱色，更换两次。

电泳结果如图4所示(从左至右：泳道1为100％硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物，泳道2为90％硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物，泳道3为80％硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物，泳道4为Mark，泳道5为70％硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物，泳道6为60％硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物，泳道7为50％硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物，泳道8为40％硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物，泳道9为30％硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物)，表明在30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(W/V)不同硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物中都含有相同的成分，只是含量高低有差异。上述红细胞凝集实验结果(实施例4)和SDS-PAGE检测结果(实施例5)表明，本发明经30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(W/V)不同硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物均是有效提取物，因此决定直接用100％饱和硫酸铵进行盐析，结果用本发明的提取方法可从200g白扁豆中得到5.2g提取物。

实施例6、白扁豆提取物的抗紫外线损伤细胞实验

一、表皮干细胞的分离

参照文献(应用IV型胶原黏附法进行人表皮干细胞的体外快速分离与鉴定)中记载的方法，成功从皮肤组织中分离得到表皮干细胞，如图5所示。

2、白扁豆提取物对经紫外(UVB)照射后表皮干细胞凋亡的影响

用UVB治疗仪(Waldmann UV800K)作为UVB光源，用辐射计测定光强，通过控制照射时间来计算UVB剂量。当表皮干细胞达到90％融合时，分两组(对照组：不作任何处理，实验组：用实施例1-3获得的经30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(W/V)不同硫酸铵饱和度沉淀得到的白扁豆提取物进行处理，以2mg/ml的浓度加入到细胞培养瓶中，培养48小时)接受48mJ/cm²的UVB照射，然后用含10％(V/V)FBS的低糖DMEM完全培养基(购自美国GIBCO公司)继续培养48小时后，消化细胞，将其重悬在冰的结合缓冲液(10mM HEPES/NaOH，pH 7.4，140mM NaCl，2.5mMCaCl₂)中，再与5μl Annexin V-FITC(Serotec)暗室室温孵育10min，用PBS(0.01M)洗涤细胞，加入20μg/mL的碘化丙啶(PI)进行染色，用流式细胞仪分析(BectonDickinson)。

经紫外线UVB照射后细胞表皮干细胞凋亡情况的检测结果如图6所示，较对照组(69.6±7.6％)，实验组细胞的凋亡比例显著下降(54.4±2.8％)，证明本发明的白扁豆提取物具有抗紫外线辐射所致的细胞凋亡作用。

实施例7、抗紫外线损伤动物实验

实验动物：昆明种小白鼠40只，雌、雄各半，质量(20±2)g。

实验试剂：超氧化物歧化酶(SOD)及BCA蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

一、制备抗紫外辐射皮肤损伤药物

1、抗辐射皮肤损伤凝胶剂的制备

以本发明白扁豆提取物为有效成分的抗紫外辐射损伤凝胶剂的配方如下：

白扁豆提取物                  50g，

卡波姆                        5g，

氢氧化钠                      2g，

水                            1000mL。

赋形剂处方：

卡波姆                        5g，

氢氧化钠                      2g，

水                            1000mL。

赋形剂的制备：用1000mL水将5g卡波姆溶胀过夜(12-24小时)，再加入2g氢氧化钠调节pH值至7，搅拌均匀即得，避光保存。

赋形剂性状：白色细腻的半固体，质地均匀、稠度适宜，涂展性好，无刺激性，无油腻感。

抗紫外辐射损伤凝胶剂的制备：用500mL水将5g卡波姆溶胀过夜，再加入2g氢氧化钠调节pH值至7；再用500mL水将50g白扁豆提取物混悬，最后将两者混合均匀，得到抗紫外辐射损伤凝胶剂，避光保存。

药物性状：该凝胶剂为棕黑色细腻的半固体，质地均匀、稠度适宜，涂展性好，无刺激性，无油腻感。

2、抗紫外辐射损伤片剂(薄膜衣片)的制备

以本发明白扁豆提取物为有效成分的抗紫外辐射损伤片剂的配方如下：

白扁豆提取物                      100g，

微晶纤维素                        75g，

乳糖                              70g，

羟丙纤维素                        25g，

交联羧甲基纤维素钠                25g，

95％乙醇                          50g

微粉硅胶                3g，

                        制成1000片。

抗紫外辐射损伤片剂的制备：按照上述制剂配方，称取本发明的白扁豆提取物，加入微晶纤维素、乳糖以及25g羟丙基纤维素，用95％乙醇制粒，60℃干燥，整粒；加入其余辅料混合均匀后压片，制成1000片；包薄膜衣，包装，得到抗紫外辐射损伤片剂。

3、抗紫外辐射损伤口服液的制备

以本发明白扁豆提取物为有效成分的抗紫外辐射损伤口服液的配方如下：

白扁豆提取物                        200g，

蔗糖                                100g，

苯甲酸                              10g，

桔子香精                            10g，

水                                  10000mL，

                                    制成1000支。

抗紫外辐射损伤口服液的制备：按照制剂配方称取主药和辅料，加入水溶解，煮沸，放置，滤过，分装，每支10mL，灭菌，得到抗紫外辐射损伤口服液。

4、抗紫外辐射损伤胶囊剂的制备

以本发明白扁豆提取物为有效成分的抗紫外辐射损伤胶囊剂的配方如下：

白扁豆提取物                            50g，

预胶化淀粉                              80g，

乳糖                                    50g，

羧甲基淀粉钠                            10g，

制成                                    1000粒。

抗紫外辐射损伤胶囊剂的制备：按照上述制剂配方称取主药以及辅料，过80目筛，混匀，直接装胶囊，包装，得到抗紫外辐射损伤胶囊剂。

二、抗紫外线损伤动物实验

1、实验分组

小鼠于实验前适应环境一周，饲养温度22-25℃，背部脱毛后随机分成4个小组：空白对照组(背部不做任何处理，正常喂养)，辐射模型组(背部不做任何处理，进行辐射(辐射方法如下)，阴性对照组)，赋形剂组(背部涂抹1g赋形剂(制备方法见步骤一)，进行辐射)，给药组(再分成四小组，背部分别涂抹1g步骤一制备的四种剂型的抗辐射药物，进行辐射)。(注：当给药最低剂量为0.3g时，实验仍然可以得到相似的结果)

2、小鼠紫外线UVB辐射

将小鼠固定在特制的木板上，用铅块屏蔽，只露出处理后的背部，用UVB治疗仪进行照射，剂量为48mJ/cm²。照射2天后，处死小鼠，观察各项指标。

3、小鼠皮肤形态结构观察

将各组小鼠的皮肤样品置于福尔马林中固定48小时，乙醇逐级脱水，石蜡包埋后进行超薄切片和HE染色。

结果如图7所示，正常组(空白对照组)小鼠皮肤结构完整，表皮与真皮界线清晰，表皮较规则，真皮层较厚，染色较均匀，细胞层数较多；辐射模型组和赋形剂组小鼠皮肤结构紊乱，分不清表皮与真皮界线，染色不均匀且染色较浅；给药组小鼠皮肤结构明显比模型组和赋形剂组小鼠皮肤结构完整，表皮与真皮界线尚可看到，表皮虽乱，但真皮层较规则，染色较均匀。上述实验结果证明白扁豆提取物可以减少小鼠皮肤所受的紫外辐射损伤，用其制备的多种剂型的抗紫外辐射损伤药物均具有较好的疗效，对皮肤具有强大的抗辐射作用，且具有较高的安全性，因此，还可用该白扁豆提取物为活性成分制备抗紫外辐射化妆品。

三、小鼠皮肤中抗氧化酶SOD及丙二醛(MDA)含量的测定

辐射损伤的机理是：电离辐射作用于生物体生物膜、酶、核酸等，引起一系列自由基的损伤反应，脂质过氧化物是机体在照射后主要的辐射性毒物，照射后机体尚未发现任何损伤时，它就已经产生，因此，它既是辐射后的产物，又能加重辐射损伤。机体防御自由基脂质过氧化损伤的保护系统主要是酶类清除剂：包括SOD、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，机体内的抗氧化酶是“内源性”的抗衰老物质。抗氧化防护酶类(如SOD)活性降低可使皮肤细胞呈现衰老状态，衰老细胞由于代谢减慢，对损伤的修复功能差，更易造成光损伤，加速皮肤衰老。丙二醛(MDA)是由于器官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，它的含量与衰老及逆境伤害有密切关系。UV辐射产生大量ROS，超出了机体的正常防御能力，其在消耗皮肤内抗氧化酶SOD和CAT的同时，攻击生物膜膜上磷酯中的多不饱和脂肪酸，引发膜脂质过氧化链式反应，最终导致MDA含量增加。紫外线照射可诱发膜脂质过氧化反应，造成生物膜和DNA的损伤。因此，皮肤中SOD含量及MDA含量的高低，决定了皮肤损伤程度的大小。

用下述方法检测步骤二中各组小鼠皮肤样品的SOD及MDA含量：称量各组小鼠皮肤样品的质量，加入预冷的生理盐水，用玻璃匀浆器研磨并冷冻离心，制备成10％(V/V)的组织匀浆。在测定SOD及MDA含量之前，先测定皮肤组织匀浆的总蛋白含量。用超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒并按照试剂盒说明书的要求测定小鼠皮肤样品中的SOD含量，用购自南京建成生物工程研究所的MDA测定试剂盒并按照试剂盒说明书的要求测定小鼠皮肤样品中的MDA含量。

结果如表2和表3所示(*表示与正常组相比具有显著差别，**表示与正常组相比不具有显著差别)，模型组和赋形剂组小鼠经局部辐射后，皮肤中的SOD含量同正常组相比较，p＜0.01，具有显著差别，都降低了一定的水平，而给药组小鼠经局部辐射后，皮肤中的SOD含量同正常组相比较，p＞0.05，没有显著差别；而模型组和赋形剂组小鼠经局部辐射后，皮肤中的MDA含量同正常组相比较，p＜0.01，具有显著差别，升高幅度较大，而给药组小鼠经局部辐射后，皮肤中的MDA含量同正常组相比较，p＞0.05，没有显著差别，升高了一定水平。上述检测结果说明本发明的白扁豆提取物能降低小鼠皮肤的辐射损伤度，从而进一步证明本发明的白扁豆提取物可以减少小鼠皮肤所受的辐射损伤，用其制备的多种剂型的抗辐射皮肤损伤药物均具有较好的疗效，对皮肤具有强大的抗辐射作用，且具有较高的安全性，因此，还可用该白扁豆提取物为活性成分制备抗紫外辐射化妆品。

表2超氧化物歧化酶(SOD)含量测定

	SOD(U/mg prot)
		正常组	70.47±7.37
模型组	50.69±6.23*
		赋形剂组	51.35±6.67*
给药组	69.79±7.99**

表3丙二醛(MDA)含量的测定

	MDA(nmol/mg prot)
		正常组	2.44±0.24
模型组	3.27±0.45*
		赋形剂组	3.08±0.34*
给药组	2.54±0.25**

四、小鼠皮肤组织中金属基质蛋白酶(MMPs)的表达与活性测定漂洗液：

Tris              6.05g，

氯化钙            0.5550g，

浓盐酸            3.23mL，

氯化锌(1mM)       1mL，

                  加双蒸水至1L。

洗脱液：400mL漂洗液+10mL TRLTON X-100。

孵育液：200mL漂洗液+0.06g Brij 35(布里杰35去污剂[一种非离子型去污剂，即十二烷基聚乙二醇醚，或称聚氧乙烯月桂醚，Brij是ICI Americas公司的商标])。

研究表明，MMPs的产生能降解/抑制合成胶原的细胞外基质，造成皮肤修复缺陷，产生光老化，因此MMPs含量的多少也决定了皮肤老化的程度。检测步骤二中各组小鼠皮肤样品中MMPs的表达情况，检测方法包括以下步骤：

1)将各组小鼠皮肤制成10％的组织匀浆，进行1％明胶SDS-PAGE，检测结果符合要求。

2)安装玻璃板。

3)配制分离胶和积层胶

分离胶

水                        2.3mL，

30％丙烯酰胺              2.64mL，

Tris pH8.81.5M            2.0mL，

10％SDS                   0.08mL，

1％明胶                   0.9mL，

10％过硫酸氨              0.08mL，

TEMED                     5μl。

积层胶

水                        2.7mL，

30％丙烯酰胺              0.67mL，

Tris pH6.8 1.0M           0.5mL，

10％SDS                   0.04mL，

10％过硫酸氨              0.04mL，

TEMED                     4μl。

4)小心将分离胶注入准备好的两玻璃间隙中，为上层积层胶留下一定的空间，然后轻轻地在分离胶上层加水覆盖，以阻止空气氧对凝胶聚合的抑制作用。

5)待凝胶和水之间出现一条折光性很强的线时，说明凝胶聚合完成，用吸水纸吸干上层水。

6)将积层胶灌入分离胶上层，插入梳子，小心不要产生气泡。

7)将玻璃板放入电泳槽中，加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，拔去梳子，用电泳缓冲液冲洗梳孔。

8)取10μl样品，加入10μl上样缓冲液(1×)，用微量加样枪按次序加样。

9)电泳：90V电压，至染料抵达分离胶上部，换120V电压，直至染料前沿抵达分离胶的底部，断开电源。

10)取下凝胶，切去积层胶，将分离胶放入一个平皿中，用4℃预冷的洗脱液洗涤，45min×2次；

11)用漂洗液漂洗2次，每次20min。

12)将凝胶置于孵育液中，在37℃下孵育24h。

13)用0.25％考马斯亮蓝R250染色，脱色后观察是否在蓝色背景上显示MMPs的透亮条带。

结果如图8所示，赋形剂组和模型组中的MMPs含量明显高于正常组和给药组，而给药组同正常组相比较，给药组略高于正常组，说明本发明的白扁豆提取物能减少MMPs的产生，即对紫外辐射损伤具有保护作用。该实验结果进一步证明本发明的白扁豆提取物可以减少小鼠皮肤所受的辐射损伤，用其制备的多种剂型的抗辐射皮肤损伤药物均具有较好的疗效，对皮肤具有强大的抗紫外线作用，且具有较高的安全性，因此，还可用该白扁豆提取物为活性成分制备抗紫外线化妆品。

Claims (9)

1.白扁豆提取物在制备抗紫外线损伤药物和抗紫外线损伤化妆品中的应用，所述白扁豆提取物，是将白扁豆粉碎后，先对其用4-10倍体积的生理盐水进行提取，再将提取液用硫酸铵饱和度30-100％的硫酸铵溶液进行盐析，得到的沉淀经蒸馏水脱盐、冷冻干燥后得到白扁豆提取物。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述白扁豆提取物的制备方法，包括以下步骤：

1)将白扁豆机械粉碎；

2)将步骤1)得到的白扁豆粉与4-10倍体积的生理盐水混和，在室温下搅拌0.5-6小时后，过滤，离心，弃沉淀，上清液为白扁豆提取液；

3)将步骤2)得到的提取液用硫酸铵饱和度30-100％的硫酸铵溶液在4℃下盐析1-4小时；

4)将步骤3)盐析得到的沉淀依次用蒸馏水进行脱盐处理，冷冻干燥，得到白扁豆提取物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述步骤2)中用4-8层纱布进行过滤。

4.根据权利要求1至3任一所述的应用，其特征在于：所述抗紫外线损伤药物和抗紫外线损伤化妆品制剂的剂型为凝胶剂、片剂、口服液、胶囊剂、膏剂或搽剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述制剂为凝胶剂，其中还添加有一种或多种赋形剂；所述赋形剂的添加量为制剂总体积的0.1％-55.0％W/V。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述凝胶剂型的抗紫外线损伤药物的原料配方，包括下述重量份数比的组分：

白扁豆提取物50份，

卡波姆      5份，

氢氧化钠    2份，

水          1000份。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述片剂剂型的抗紫外线损伤药物的原料配方，包括下述重量份数比的组分：

白扁豆提取物      100份，

微晶纤维素        75份，

乳糖              70份，

羟丙纤维素        25份，

交联羧甲基纤维素钠25份，

95％醇            50-100份，

微粉硅胶          3份。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述口服液剂型的抗紫外线损伤药物的原料配方，包括下述重量份数比的组分：

白扁豆提取物 200份，

蔗糖         100份，

苯甲酸       10-50份，

桔子香精     10-50份，

水           10000份。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述胶囊剂型的抗紫外线损伤药物的原料配方，包括下述重量份数比的组分：

白扁豆提取物  50份，

预胶化淀粉    80份，

乳糖          50份，

羧甲基淀粉钠  10份。

Images