CN101544694A - 抗cd20四价抗体、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗CD20四价抗体、其制备方法和应用，更具体地，本发明公开了抗CD20四价抗体C2B8(ScFvHL)4－Fc，其氨基酸序列如SEQ ID No：18所示和2F2(ScFvHL)4－Fc，其氨基酸序列如SEQ ID No：20所示，以及其制备方法和其在制备抗B细胞淋巴瘤的药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明公开了一种抗四价抗体、其制备方法和其在制备抗B细胞淋巴瘤药物方法的用途。
背景技术
恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin’s lymphoma，NHL)是临床最常见的淋巴系统恶性肿瘤，其中B细胞来源的约占85％，好发于青壮年，发病率和病死率呈逐年上升趋势。根据病情特点，NHL可分为低、中、高三度。其中低度和部分中度NHL病程进展缓慢，统称为惰性NHL。它们对首次化疗敏感，但很容易复发或耐药，当再次化疗或放疗时，疗效明显降低，因而被认为是难以治愈的恶性肿瘤。近年来，单克隆抗体及其导向治疗NHL的临床试验研究取得了重大进展，其中被广泛使用且富有成效的是抗CD20的单抗制剂。CD20抗原是一种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95％以上的B细胞性淋巴瘤中表达，且表面密度很高，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。更为重要的是，CD20分子在与单克隆抗体结合后，无显著内化及脱落，故成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点[Sacchi S，Federico M，Dastoli G，Fiorani C，Vinci G，Clo V，Casolari B.Treatment of B-cell non-Hodgkin’slymphoma with anti CD 20 monoclonal antibody Rituximab.Crit Rev OncolHematol，2001，37(1)：13-25]。
目前采用抗CD20抗体治疗非霍奇金淋巴瘤已取得了较好的疗效。Rituxan(Rituximab，C2B8)为美国基因科技公司研制的以CD20为靶点的单克隆抗体，它是一种人鼠嵌合基因工程抗体，包含了鼠单克隆抗体的可变区基因和人抗体的恒定区基因[Reff ME，Carner K，Chambers KS，Chinn PC，Leonard JE，Raab R，Newman RA，Hanna N，Anderson DR.Depletion of B cells in vivoby a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20.Blood.1994，83(2)：435-45.]。Rituxan已于1997年11月获FDA的批准上市，用于复发性或顽固性低度或滤泡性非霍奇金淋巴瘤的临床治疗[Leget GA，Czuczman MS.Use of rituximab，the new FDA-approved antibody.Curr Opin Oncol.1998；10：548-551]。尽管C2B8抗体在临床治疗中已显示出较好的疗效，仍有52％的病人对C2B8治疗不产生反应。因此，寻求更为有效用于治疗B淋巴瘤的CD20抗体药物显得尤为迫切。
已有许多相关的研究阐述了抗CD20单克隆抗体可能的作用机制，主要包括补体介导的细胞溶解作用(CDC作用)，抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和对肿瘤细胞的诱导凋亡作用(Apoptosis)及生长抑制作用。而对于抗CD20抗体主要通过其中何种机制发挥抗肿瘤作用仍存在争论中。可是，目前变得越来越清楚的是，这些机制不是互相孤立地、而是互相协同地发生作用[EisenbeisCF，Caligiuri MA，Byrd JC.Rituximab：converging mechanisms of actionin non-Hodgkin’s lymphoma？Clin Cancer Res.2003；9：5810-5812.]。因此我们推测，对于C2B8抗体治疗不敏感的病人或许会对其它类型和结构的、发挥不同生物学功能的抗CD20抗体产生反应。抗CD20抗体根据其体外生物学功能的不同可以分为两型：I型CD20抗体包括C2B8和其它大部分CD20抗体，主要通过CDC功能发挥作用而凋亡作用很弱；而II型CD20抗体包括B1和11B8，主要通过凋亡发挥作用而CDC功能很弱。除了I型抗体C2B8获批准用于临床治疗以外，II型抗体B1与131I偶联制备的标记抗体药物Tositumomab也已获得批准用于非霍奇金氏淋巴瘤的治疗。更为重要的是，临床前试验已经表明11B8的裸抗体同131I标记的11B8抗体同样有效[Buchsbaum DJ，Wahl RL，Normolle DP，Kaminski MS.Therapy with unlabeled and 131I-labeled pan-B-cellmonoclonal antibodies in nude mice bearing Raji Burkitt’s lymphomaxenografts.Cancer Res.1992；52：6476-6481]。因此，由于这两型抗体具有明显不同的生物学活性，对于I型抗体治疗不敏感的病人很可能将会对II型的治疗产生反应，而反之亦然。由此，我们想到，如果一种抗体既有很强的CDC作用又具备很强的诱导凋亡的能力，它或许可以更为有效的杀伤CD20+肿瘤细胞。
经二抗交联后的CD20抗体具有明显增强的诱CD20+细胞凋亡的作用[Shan D，Ledbetter JA，Press OW.Apoptosis of malignant human B cells by ligation of CD20with monoclonal antibodies.Blood.1998；91：1644-1652]，因为这种方法用于体内治疗则不可行，因而人们继续致力于制备新型有效的抗体分子。研究表明，成为二聚体形式的抗体，其凋亡作用和生长抑制作用均可明显增强[Ghetie MA，Bright H，Vitetta ES.Homodimers but not monomers of Rituxan(chimericanti-CD20)induce apoptosis in human B-lymphoma cells and synergize witha chemotherapeutic agent and an immunotoxin.Blood.2001；97：1392-1398.]。但是，通过化学交联法产生二聚体的方式存在很多缺陷，主要是二聚体抗体的分子量大(300kDa)和半衰期短[Wolff EA，Schreiber GJ，Cosand WL，Raff HV.Monoclonal antibody homodimers：enhanced antitumor activity in nude mice.Cancer Res.1993；53：2560-2565.Ghetie MA，Podar EM，Ilgen A，Gordon BE，Uhr JW，Vitetta ES.Homodimerization of tumor-reactive monoclonalantibodies markedly increases their ability to induce growth arrest orapoptosis of tumor cells.Proc Natl Acad Sci USA.1997；94：7509-7514.]。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的申请人进行了大量的实验，采用基因工程技术构建了两种I型抗体C2B8和2F2的四价基因工程抗体，2F2是一种全人源抗CD20单克隆抗体，其CDC作用强于C2B8抗体。本发明公开的四价抗CD20抗体和原亲本抗体都可以与Raji细胞特异性结合，而且其相对亲和力相似，但本发明公开的四价抗CD20抗体有更强的凋亡诱导作用和生长抑制功能，并具有能显著提高荷瘤小鼠的生存率的优点。
实验结果表明，本发明公开的四价抗体虽然具有四个抗原结合位点，构建的四价抗体的分子量只比亲本两价抗体大25KDa，其在小鼠体内的血浆半衰期稍长于亲本二价抗体，表明这种四价抗体的结构高度稳定；本发明的申请人进而通过体内外试验比较四价抗体和原亲本二价抗体的抗肿瘤活性[按Teeling JL，French RR，Cragg MS，et al.Characterization of new human CD20 monoclonalantibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin lymphomas.Blood.2004；104：1793-1800进行]，研究结果表明，2F2的四价抗体2F2(ScFvHL)4-Fc不仅具有与其亲本两价抗体2F2相同的CDC和ADCC活性，而且在促肿瘤细胞凋亡和生长抑制功能上较原二价抗体均有明显增强，甚至强于C2B8的四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc。体内免疫治疗实验更进一步证实，四价抗体2F2(ScFvHL)4-Fc在延长荷瘤SCID小鼠的生存期上明显强于其它三种抗体，可以成为B淋巴瘤的治疗提供新型抗体药物。
利用基因工程技术构建了四价抗CD20抗体，本发明公开了：
1，一种抗CD20四价抗体；
2，上述1所述的抗CD20四价抗体为C2B8(ScFvHL)4-Fc；
3，上述2的抗CD20四价抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：18；
4，编码上述3所述抗体的核苷酸序列，为SEQ ID NO：17；
5，上述1所述的抗CD20四价抗体为2F2(ScFvHL)4-Fc；
6，上述5所述的抗CD20四价抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：20；
7，编码上述6所述抗体的核苷酸序列，为SEQ ID NO：19
8，制备上述的抗CD20四价抗体的方法，包括：
a.构建CD20单抗c2B8或2F2的单链抗体ScFv并克隆获得人抗体IgG1Fc基因；
b.将2个相同的单链抗体基因串联连接后再与人抗体Fc段基因相连得到融合基因；
c.将上述融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建成真核表达载体pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)或pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)；
d.表达载体pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)或pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)转染CHO细胞，筛选，进行亚克隆，将筛选得到的高表达克隆用扩大培养，分离纯化即得。
9.一种制剂，含有上述1、2、3、5、6任一所述的抗体和可药用的载体。
10.上述1、2、3、5、6、9任一所述的抗体或制剂在制备抗B细胞淋巴瘤的药物中的用途。
11.上述10的用途，其中B细胞淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。
12.上述11的用途，其中非霍奇金淋巴瘤为低度和部分中度非霍奇金淋巴瘤。
13.上述10的用途，其中B细胞淋巴瘤为慢性淋巴性白血病。
更具体地，本发明的申请人通过大量实验，首先分别构建了CD20单抗C2B8及2F2的单链抗体ScFvHL及ScFvHL，并克隆获得了人抗体IgG1，κ的重链恒定区基因。在此基础上采用分子克隆技术分别将单链抗体基因与人抗体Fc段基因相连，进一步将上述融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)，分别构建成真核表达载体pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)及pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)。将表达载体pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)和pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)分别用脂质体法共转染CHO细胞，用500μg/ml的G418筛选阳性细胞克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱分离纯化抗CD20四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc。
对于本发明，任何合适的真核表达载体都可以使用，这些载体可以为pCDNA3.1(+)，pDR1(图1)，pDHFF之一。
本发明的申请人对上述的四价抗CD20抗体进行了体外、体内生物学实验，体外生物学实验结果表明C2B8、2F2、抗CD20四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc都能很好地与Raji细胞特异性结合，而且它们的相对亲和力相似。但四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc的解离速率分别明显低于它们各自的亲本抗体C2B8和2F2；虽然具有四个抗原结合位点，四价抗体的分子量只比亲本两价抗体大25KDa；四价抗体在小鼠体内的血浆半衰期稍长于亲本二价抗体，表明这种四价抗体的结构高度稳定；四价抗体不仅具有与亲本抗体相同的CDC和ADCC活性，而且在促肿瘤细胞凋亡和生长抑制功能上较原二价抗体均有明显增强，其中，四价抗体2F2(ScFvHL)4-Fc的作用最强，它在2μg/ml和10μg/ml时诱导了约30％左右Daudi细胞和23％左右Raji细胞的凋亡，而四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc的作用次之，它使19％左右的Daudi细胞和16％左右的Raji细胞发生了凋亡。同样，2F2(ScFvHL)4-Fc具有最强的抑制肿瘤细胞增殖的能力，它在2μg/ml以上浓度时的抑制率分别为约95％(Daudi细胞)和88％(Raji细胞)，其作用强于C2B8(ScFvHL)4-Fc抗体，后者在2μg/ml以上浓度时的抑制率分别为约82％(Daudi细胞)和76％(Raji细胞)。体内免疫治疗实验结果更进一步证实，四价抗体2F2(ScFvHL)4-Fc在延长荷瘤SCID小鼠的生存期上明显强于其它三种抗体(C2B8，2F2和C2B8(ScFvHL)4-Fc)。
以上实验结果说明这两种抗CD20四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc的抗肿瘤疗效均明显优于它们各自的亲本抗体c2B8和2F2。而2F2(ScFvHL)4-Fc的抗肿瘤疗效最好。
本发明公开上述抗CD20四价抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述抗CD20四价抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使抗CD20四价抗体颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。
上述制剂为包含抗CD20四价抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为预防和/或治疗肿瘤的药物使用。
本发明中抗CD20四价抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0.1～3000mg/天。
本发明公开的抗CD20四价抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药。用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT—207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6—巯基嘌呤(6—MP)和6—TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素—2；胸腺肽类；4、单克隆抗体：Cetuximab(C225)；赫赛汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin)；5、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的抗CD20四价抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。
本发明所指的B细胞淋巴瘤，包括B细胞慢性淋巴细胞白血病，B细胞原淋巴细胞淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，Burkitt淋巴瘤，淋巴浆细胞淋巴瘤等，这里不再一一列举。
本发明所称的抗肿瘤药物，指具有预防和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。
附图说明
图1.pDR1表达载体结构示意图；hCMV pro表示人巨细胞病毒MajorImmediate早期启动子；BGH pA表示Bovine growth hormone多腺苷化信号；SV40 ori表示SV40病毒早期复制起点；DHFR表示二氢叶酸还原酶基因；PUCorigin为质粒复制起点；AMP为氨苄青霉素抗性基因；
图2.C2B8(ScFvHL)2Fc或2F2(ScFvHL)2Fc的基因结构图；
图3.抗CD20四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc结构图；
图4.四价抗体与原二价抗体的SDS-PAGE电泳图谱。道1，分子量蛋白Marker；道2，C2B8；道3，2F2；道4，C2B8(ScFvHL)4-Fc；道5，2F2(ScFvIIL)4-Fc。
图5四价抗体与原二价抗体的蛋白质印迹免疫分析。道1，分子量蛋白Marker；道2，C2B8；道3，2F2；道4，C2B8(ScFvHL)4-Fc；道5，2F2(ScFvHL)4-Fc。
图6抗CD20四价抗体的活性鉴定结果。图6-1抗体与Raji细胞的结合力；图6-2，C2B8(ScFvHL)4-Fc与原亲本二价抗体C2B8竞争与Raji细胞的结合；图6-3，2F2(ScFvHL)4-Fc与原亲本二价抗体2F2竞争与Raji细胞的结合；图6-4，抗CD20抗体与人补体成分C1q的结合；图6-5，抗CD20抗体与FcR(U937细胞)的结合；图6-6，抗CD20抗体解离率的检测。
图7抗CD20抗体诱导的CDC和ADCC作用结果，各图中横坐标为抗体浓度，单位ug/ml。
图8抗CD20抗体诱导的凋亡作用结果。图8-1抗CD20抗体诱导Daudi细胞凋亡作用结果，图8-2抗CD20抗体诱导Raji细胞凋亡作用结果。
图9抗CD20抗体对肿瘤细胞的生长抑制作用。Daudi(图9-1)和Raji(图9-2)细胞分别与不同浓度的抗CD20抗体于CO2培养箱孵育，台盼蓝拒染法每日计数细胞，共计数五日。Daudi(图9-3)和Raji(图9-4)细胞分别与不同浓度的抗CD20抗体于CO2培养箱孵育，第五日用MTT染色法测定细胞生长抑制率。
图10抗CD20抗体对荷瘤小鼠中治疗作用。PBS(◆)；Anti-her2(◇)；C2B8(●)；2F2(□)；C2B8(ScFvHL)4-Fc(▲)；2F2(ScFvHL)4-Fc(■)，其中横坐标为天数，纵坐标为存活率(百分比)。
具体实施方式
以下实施例、实验例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Coldspring Harbor Laboratory Press.
实施例1.抗CD20单链抗体的基因构建
参照美国专利6,399,061公开的抗人CD20单抗资料及序列，委托上海生工生物工程有限公司全基因合成抗人CD20单克隆抗体C2B8的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别显示了C2B8单抗的重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别显示了2B8单抗的轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。采用Overlapping PCR的方法将2B8重链可变区的3’-端通过(Gly4Ser)3接头与其轻链可变区的5’-端融合，构成单链抗体基因C2B8(ScFvHL)。SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6分别显示了(Gly4Ser)3接头的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别显示了C2B8(ScFvHL)的核苷酸序列和氨基酸序列。将PCR产物克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)，测序验证后确认获得了正确的克隆。本例中的正确克隆记作pGEM-T/C2B8(ScFvHL)。
参照PCT专利WO 2004/035607A2公开的抗人CD20单抗资料及序列，委托上海生工生物工程有限公司全基因合成抗人CD20单克隆抗体2F2的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因。2F2单链抗体基因2F2(ScFvHL)的构建方法同C2B8单链抗体基因C2B8(ScFvHL)的构建方法。SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10分别显示了2F2(ScFvHL)的核苷酸序列和氨基酸序列。最后将构建好的2F2(ScFvHL)基因克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)，测序验证后确认获得了正确的克隆。本例中的正确克隆记作pGEM-T/2F2(ScFvHL)。
实施例2.人抗体重链恒定区基因的克隆
用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Nucleic AcidsResearch，1982，10：4071-4079)报道的序列分别设计引物CH有义：GCT TCCACC AAG GGC CCA TC和引物CH反义TTT ACC GGG AGA CAG采用PCR反应扩增抗体重链恒定区基因。PCR反应采用热启动，反应条件：94℃ 5分钟；94℃ 45秒，60℃ 45秒，72℃ 1分10秒，30个循环；72℃ 10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH。
实施例4.构建抗CD20四价抗体
以pGEM-T/CH为模板，设计引物Fc有义GAA TTC GCC GCT GCA GAG CCC AAATCT CCC GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA和Fc反义TCT AGA TCATTT ACC GGG AGA CAG GGA通过PCR反应扩增获得人抗体IgG1的Fc基因，使其5’含有限制酶位点EcoRI，3’端含有限制酶位点XbaI，并将Fc基因中的Hinge区改为HingeM。SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14分别显示了Fc的核苷酸序列和氨基酸序列。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，记作pGEM-T(Fc)，筛选阳性克隆测序。将测序正确的Fc基因用EcoRI和XbaI双酶消化从pGEMT载体中切下，克隆到pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司产品)中，构建成pcDNA3.1(Fc)载体。将质粒pcDNA3.1(Fc)用HindIII和EcoRI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后纯化回收酶切片断pcDNA3.1Fc。
以pGEM-T/C2B8(ScFvHL)为模板，设计引物C2B8(ScFvHL)1有义AAG CTTATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCCCAGGTACAACTACAGCAGCCTGGGGCTGAG和C2B8(ScFvHL)1反义GCT AGC TCG TTT GAT CTC CAGCTT GGT C通过PCR扩增获得抗CD20单链抗体基因并使其5’含有限制酶位点HindI II，3’端含有限制酶位点NheI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，记作pGEM-T C2B8(ScFvHL)1，筛选阳性克隆测序。将测序正确的克隆用HindIII和NheI双酶消化，回收酶切片断C2B8(ScFvHL)1。
以pGEM-T/C2B8(ScFvHL)为模板，设计引物C2B8(ScFvHL)2有义GCT AGCACT GGT AGT CAG GTA CAA CTA CAG CAG CCT GGG GCT GAG CTG和C2B8(ScFvHL)2反义GAA TTC TCG TTT GAT CTC CAG CTT G通过PCR扩增获得抗CD20单链抗体基因并使其5’含有限制酶位点NheI，3’端含有限制酶位点EcoRI。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体中，记作pGEM-TC2B8(ScFvHL)2，筛选阳性克隆测序。将测序正确的克隆用NheI和EcoRI双酶消化，回收酶切片断C2B8(ScFvHL)2。
将上述获得的三个酶切片断C2B8(ScFvHL)1、C2B8(ScFvHL)2以及pcDNA3.1Fc用T4DNA连接酶(Invitrogen公司产品)进行连接，构建成真核表达载体pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)。附图2为C2B8(ScFvHL)2Fc的基因结构图。两个单链抗体之间有一个长度为15氨基酸的接头，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16分别显示了接头的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18分别显示了C2B8(ScFvHL)2Fc的核苷酸序列和氨基酸序列。
采用与C2B8(ScFvHL)2Fc融合基因构建方式相同的方法构建2F2四价抗体的表达载体pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)。附图2为2F2(ScFvHL)2Fc的基因结构图。SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20分别显示了2F2(ScFvHL)2Fc基因的核苷酸序列和氨基酸序列。
于3.5cm组织培养皿中接种3.5×105/孔的CHO细胞，培养至90-95％融合时进行转染：取10μg pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)或pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)质粒分别和20μl Lipofectamine2000试剂[Invitrogen公司产品]分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加3ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24小时后将细胞按0.8×105/皿传到10cm培养皿中，加入500μg/ml的G418筛选阳性细胞克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基(JRH Biosciences公司产品)扩大培养，用ProteinA亲和柱(GE公司产品)分离纯化CD20四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。附图3为四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc或2F2(ScFvHL)4-Fc的结构图。
实验例
实验例1 抗体的标记实验
用透析标记法标记抗体：用0.025M pH9.5的碳酸盐缓冲液将预标记的抗体(C2B8、2F2、C2B8(ScFvHL)4-Fc、2F2(ScFvHL)4-Fc或抗人her2的人源化抗体Trastuzumab(Anti-her2))稀释成1％浓度，装入透析袋中。用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液盛于小烧杯中，使透析袋浸没于FITC溶液中，在4℃避光搅拌24h。取出透析袋中标记液，用Sephadex G-50过柱，去除游离荧光素，收集荧光抗体备用。C2B8和Trastuzumab购自罗氏(中国)有限公司。2F2抗体由我们按照文献[Li BH，Wang H，Dai JX，Ji JJ，Qian WZ，Zhang DP，HouS，Guo YJ.Construction and characterization of a humanized anti-humanCD3monoclonal antibody 12F6 with effective immunoregulation functions.Immunology.2005，116(4)：487-98]中制备抗人CD3人源化抗体hu12F6的方法自行构建制备获得。
实验例2 SDS-PAGE和Western-blot检测四价抗体
纯化后的四价抗体分别在非还原(6％)和还原(12％)条件下用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测其纯度和分子量大小(图4)，同时通过Western-blot进一步鉴定其性质和分子量(图5)。Western-blot方法如下：将电泳后的胶通过电转移的方法转移至PVDF膜上，封闭后加入HRP标记的羊抗人IgG(H+L)，PBST洗两遍，最后DAB法显色。聚丙烯酰氨凝胶电泳和Western-blot的结果显示：在还原条件下，C2B8抗体和2F2抗体均呈现为分子量大小约55KDa和25KDa的重链和轻链，而四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc则被还原为一条带，其分子量大小约为93KDa。在非还原条件下，所有抗体均呈现一条带，它们的大小分别为150KDa(C2B8抗体)，162KDa(2F2抗体)，175KDa(C2B8(ScFvHL)4-Fc抗体)和186KDa(2F2(ScFvHL)4-Fc)。这些结果表明，我们所构建的四价抗体虽然具有四个抗原结合位点，其分子量却只比原来亲本抗体大25KDa。
实验例3 抗CD20四价抗体的活性测定
流式细胞术检测四价抗体与Raji细胞的结合力实验
1×106/ml的Raji细胞与不同浓度FITC标记的四价抗体在4℃共孵育1小时后，流式细胞仪检测荧光强度。与Raji细胞的结合力实验结果显示(图6-1)，四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc与它们各自对应的C2B8抗体和2F2抗体具有相似的结合曲线，均呈浓度梯度依赖性，表明它们具有与C2B8和2F2抗体相同的与CD20抗原的结合能力。
荧光竞争结合实验
将亚饱和浓度FITC标记的C2B8或2F2抗体(C2B8-FITC或2F2-FITC)与不同浓度的抗CD20抗体混合后与1×106/ml的Raji细胞孵育(4℃，1小时)，流式细胞术检测荧光强度。实验结果表明四价抗体具有与原二价抗体相似的亲和力和特异性(图6-2，图6-3)。
四价抗体与人补体成分C1q的结合实验
1×106/ml的Raji细胞与2μg/ml抗CD20抗体于37℃孵育15分钟，PBS洗过后按1％体积比加入人血清(37℃，15分钟)，PBS洗两遍后，加入FITC标记的棉羊抗人C1q单抗(Serotec公司产品)于4℃孵育30分钟，最后用流式细胞术检测荧光强度。抗体与补体成分C1q的结合实验结果显示(图6-4)，2F2结合C1q的数量明显多于C2B8，而四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc结合C1q的数量与它们各自的亲本抗体C2B8和2F2相似。
四价抗体与FcR(U937细胞)的结合实验
人细胞系U937是大量表达FcRI和FcRIII的细胞系，故检测四价抗体与FcR的结合可通过流式细胞术检测四价抗体与U937细胞的结合来实现。方法如下：U937细胞预先用500U/ml INF-γ诱导FcR的表达(CO2培养箱作用24h)，PBS洗过后将亚饱和浓度的Anti-her2-FITC与不同浓度的抗CD20抗体一起加入共孵育(4℃，1小时)，通过流式细胞术检测荧光强度来测定四价抗体与抗her2抗体竞争结合FcR的能力。图6-5的结果显示，2F2，C2B8，C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc具有相同的结合FcR的能力，提示我们构建的四价抗体可能具有ADCC作用。
四价抗体解离率的检测实验
将Raji细胞与饱和浓度FITC标记的抗CD20抗体(10μg/ml)于37℃孵育1小时，洗细胞两遍后用完全培养基重悬细胞，然后在不同时间点用流式细胞术进行检测，计算仍结合于细胞上抗体占初始结合抗体的百分率。从图6-6显示的解离率实验的结果中，我们可以看到，C2B8抗体解离的速率明显快于2F2抗体，而四价抗体的解离则明显慢于其对应的二价抗体，表明四价抗体具有多于两个的抗原结合位点，因此能够在细胞上停留更长的时间。
实验例4 抗CD20抗体诱导的CDC和ADCC作用实验：细胞杀伤实验的检测
补体介导的细胞杀伤(CDC)实验和抗体依赖细胞介导的杀伤(ADCC)实验是通过LDH非放射性试剂盒(Promega公司产品)来检测的。方法如下：细胞和抗体于无酚红DMEM培养基中在CO2培养箱孵育1小时后，按10％体积比加入人血清(用于测定CDC)或按效靶比50:1加入新鲜分离的人外周血单个核细胞(用于测定ADCC)，于CO2培养箱孵育4小时后，LDH非放射性试剂盒显色。0.2％Triton X-100作用作为100％杀伤的对照。CDC结果如图7所示：2F2抗体和2F2(ScFvHL)4-Fc抗体杀伤Daudi细胞的能力明显强于C2B8抗体和它的四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc，同样的结果也在Raji细胞中得到证实。图7亦显示了不同浓度下不同抗体介导的ADCC作用，由结果可以看出，四种抗体的ADCC作用基本相同。
实验例 5抗CD20抗体诱导凋亡实验
细胞与不同浓度的抗CD20抗体于CO2培养箱作用18小时后，用FITC标记的Annexin V(Annexin V-FITC)染色，流式细胞术检测早期凋亡细胞的比例。实验结果(图8)表明，在Daudi(图8-1)和Raji(图8-2)两组细胞中，在不同抗体浓度的条件下，二价抗体C2B8和2F2诱导产生的凋亡作用均很弱(<10％)，而四价抗体可诱导比二价抗体明显增强的凋亡作用。有趣的似，虽然C2B8抗体和2F2抗体诱导凋亡的能力相似，而它们所对应的四价抗体却具有明显不同的诱导凋亡的能力。四价抗体2F2(ScFvHL)4-Fc的作用最强，它在2μg/ml和10μg/ml时诱导了约30％左右Daudi细胞和23％左右Raji细胞的凋亡，而四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc的作用较弱，在实验所使用的浓度范围内，它最多可使19％左右的Daudi细胞和16％左右的Raji细胞发生凋亡。
实验例6 抗CD20抗体对肿瘤细胞的细胞生长抑制实验
2×105/ml的Raji和Daudi细胞分别与不同浓度的抗CD20抗体于CO2培养箱孵育，台盼蓝拒染法每日计数细胞，共计数五日，第五日再用MTT染色法染色读数后计算生长抑制率。图9-1和图9-2显示，经四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc处理的Daudi和Raji细胞，其细胞增殖的速率明显慢于经二价抗体C2B8和2F2处理的细胞，而这四种抗CD20抗体所处理细胞的增殖速率又明显慢于未经处理和抗her2抗体处理的细胞，这说明二价抗体和四价抗体均具有抑制CD20+细胞生长的作用，而四价抗体的作用又明显强于二价抗体的作用(P<0.05)；图9-3和图9-4显示的是MTT法染色第5天细胞数量后计算出的抑制率，C2B8抗体和2F2抗体在相同浓度下具有相同的抑制作用，而四价抗体的抑制作用则有明显增强；相比较而言，2F2(ScFvHL)4-Fc抗体在2μg/ml以上浓度时的抑制率分别为约95％(Daudi细胞)和88％(Raji细胞)，其作用强于C2B8(ScFvHL)4-Fc抗体，后者在实验所使用的浓度范围内最高的抑制率分别为82％(Daudi细胞)和76％(Raji细胞)。
实验例7 药代动力学实验
8周龄雌性ICR小鼠分四组，各组分别尾静脉注射不同的抗CD20抗体50μg/只，隔天眼眶抗凝取血，每只小鼠只取血一次，离心收集血浆，冻于-80℃低温冰箱，连续取40天，按照文献[Rebello P，Hale G.Pharmacokinetics ofCAMPATH-1H：assay development and validation.J Immunol Methods.2002；260：285-302]中相似的方法用流式细胞术测定血浆中抗CD20抗体的浓度：1×106/ml的Raji细胞与血浆样品在4℃共孵育1小时后，加入FITC标记的山羊抗人抗体，然后用流式细胞仪进行检测。药代动力学参数如表1所示，C2B8抗体和2F2抗体在ICR小鼠体内具有相同的血浆半衰期，而四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc的血浆半衰期则稍长于二价抗体，其它药代动力学参数的结果与血浆半衰期结果一致。
表1.抗体的药代动力学参数。
实验例8 抗CD20抗体的免疫治疗实验
SCID小鼠分二十八组，每组10只，各组分别尾静脉注射3.5×106Raji或Daudi细胞，第5天再注射不同种类和剂量的抗体，分别为5μg/只，15μg/只和50μg/只，每日观察小鼠的状态，当出现后腿麻痹时处死动物。并依据Kaplan-Meier法则绘制生存曲线，采用log-rank检验法进行统计学分析比较。如图10所示：当抗体以5μg/只的剂量注射后，C2B8抗体在Daudi-SCID小鼠中的治疗效果与PBS相比没有明显的统计学差异(P＝0.0611)；而用2F2抗体，四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc处理的Daudi-SCID小鼠生存时间却有显著延长(就每组分别与PBS或C2B8抗体处理组比较而言，P<0.0001)，其中C2B8(ScFvHL)4-Fc抗体和2F2抗体延长Daudi-SCID小鼠生存率的能力相似(P＝0.0794)。值得注意的是，四价抗体2F2(ScFvHL)4-Fc的治疗效果比C2B8抗体，2F2抗体和C2B8(ScFvHL)4-Fc抗体的治疗效果均好(就2F2(ScFvHL)4-Fc治疗组分别同其他三组抗CD20抗体处理组比较而言，P<0.0001)。同样的，在使用同一剂量的抗CD20抗体治疗Raji-SCID小鼠模型的实验组中，各抗体治疗组所获得的治疗效果与Daudi-SCID小鼠模型的结果一致。
在15μg/只的注射剂量组中，C2B8抗体，2F2抗体，四价抗体C2B8(ScFvHL)4-Fc和2F2(ScFvHL)4-Fc均显示了明显的的治疗效果(P<0.001，与PBS为对照)。相比较而言，C2B8抗体治疗组与其他三种抗体治疗组之间仍然存在着明显差异(P<0.0001)。值得一提的是，在Raji-SCID小鼠模型中，C2B8(ScFvHL)4-Fc抗体的治疗效果要强于2F2抗体(P<0.001)，而在Daudi-SCID小鼠模型中，C2B8(ScFvHL)4-Fc抗体与2F2抗体的治疗效果则无明显差异(P＝0.2297)。尤其值得注意的是，四价抗体2F2(ScFvHL)4-Fc的治疗效果在所有抗体中是最好的(P<0.0001，分别与其它各治疗组相比)，在第100天时的小鼠死亡率仅为20％。
图10的结论还表明，通过提高抗CD20抗体的剂量可以延长荷瘤小鼠的生存时间。当治疗抗体的剂量达到50μg/只时，与C2B8抗体相比，C2B8(ScFvHL)4-Fc抗体和2F2抗体的抗肿瘤效果有显著的提高(P<0.001)，但是在2F2抗体和C2B8(ScFvHL)4-Fc抗体治疗组之间则无统计学差异(Daudi-SCID小鼠中P＝0.6310，Raji-SCID小鼠中P＝0.4379)。而且，统计结果还显示，低剂量2F2(ScFvHL)4-Fc抗体治疗荷瘤小鼠的效果与高剂量C2B8(ScFvHL)4-Fc抗体或2F2抗体治疗的效果相接近；而C2B8抗体即使在高剂量治疗组中，其治疗效果也远没有低剂量2F2(ScFvHL)4-Fc抗体的治疗效果强。这些结果表明，四价抗体2F2(ScFvHL)4-Fc具有比其它三种抗体(C2B8，2F2和C2B8(ScFvHL)4-Fc)更强的抗肿瘤作用(2F2(ScFvHL)4-Fc治疗组分别与其他三组抗体治疗组比较，P<0.0001)，其在高剂量(50μg/只)时所有治疗组中的Daudi-SCID和Raji-SCID荷瘤小鼠长期存活(>100天)。
统计分析方法
除免疫治疗试验外采用t检验，P<0.05为有统计学意义。
SEQUENCE LISTING
<110>上海中信国健药业有限公司
上海国健生物技术研究院
<120>抗CD20四价抗体、其制备方法及应用
<130>Homodimers but not monomers of Rituxan(chimeric anti-CD20)
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1；97(5)：1392-8
<160>20
<170>PatentIn version 3.4
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Claims (11)
1.一种抗CD20四价抗体。
2.权利要求1所述的抗CD20四价抗体为C2B8(ScFvHL)4-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
3.编码权利要求2所述的抗CD20四价抗体的核苷酸序列，为SEQ ID NO：17。
4.权利要求1所述的抗CD20四价抗体为2F2(ScFvHL)4-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
5.编码权利要求4所述的抗CD20四价抗体的核苷酸序列，为SEQ ID NO：19。
6.制备权利要求1、2、4任一所述的抗CD20四价抗体的方法，包括：
a.构建CD20单抗C2B8或2F2的单链抗体ScFv并克隆获得人抗体IgG1Fc基因；
b.将2个相同的单链抗体基因串联连接后再与人抗体Fc段基因相连得到融合基因；
c.将步骤b得到的融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建成真核表达载体pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)或pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)；
d.将步骤c得到的表达载体pcDNA3.1(C2B8(ScFvHL)2Fc)或pcDNA3.1(2F2(ScFvHL)2Fc)转染CHO细胞，筛选，进行亚克隆，将筛选得到的高表达克隆用扩大培养，分离纯化即得。
7.一种制剂，含有上述1、2、4任一所述的抗体和可药用的载体。
8.权利要求1、2、4、7任一所述的抗体或制剂在制备抗B细胞淋巴瘤的药物中的用途。
9.权利要求8的用途，其中B细胞淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。
10.权利要求9的用途，其中非霍奇金淋巴瘤为低度和部分中度非霍奇金淋巴瘤。
11.权利要求8的用途，其中B细胞淋巴瘤为慢性淋巴性白血病。
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