CN101522714A - 用于治疗过敏性疾病的IgE重定位、功能性改变分子（ERFAM） - Google Patents

Abstract

本发明提供了结构式为A’－B’的IgE重定位、功能性改变分子(ERFAM)构建物，其中A’代表与IgE结合的部分，B’代表与限制性受体结合的部分；另外，构建物的结构式也可以是A’－X－B’，其中，A’代表与IgE结合的部分，X代表连接体部分，B’代表与限制性受体结合的部分。本发明还提供了在治疗与IgE相关的不适，如过敏时，这些分子的使用方法。

Description

用于治疗过敏性疾病的IgE重定位、功能性改变分子(ERFAM)

技术领域

本发明涉及与IgE抗体结合并将其转变为过敏症的过敏原依赖型抑制剂的分子。所述分子是有用的，例如，用于治疗过敏症及其他IgE相关的疾病。

背景技术

世界上超过5亿人患有过敏症且过敏症的流行在快速增加，影响的主要是儿童及年轻人。在英国，每年由过敏症引起的医疗花费超过10亿，在美国超过100亿，但是社会的总代价显然更高。

过敏症的特点是产生特异于某一抗原(过敏原)的IgE型抗体，引发免疫反应。一旦所述过敏原进入体内，特异性IgE的存在引发过敏性反应。IgE生物学及其在过敏性疾病中的作用已经被研究了。参阅例如Gould等所著的Annual Rev Immunol 2003，21：579-628.当过敏原进入体内时，由于IgE在各个过敏原与过敏症效应细胞的活化装置所代表的引发机制之间建立起一种连接从而引发过敏性反应。IgE建立这种连接是由于其双功能结合特性：在一端有两个过敏原特异性结合位点(F抗原结合-Fab)，在另一端，IgE的持续结合位点(Fc)与高亲和力IgE受体(FcεRI)结合。

FcεRI分子本身是双功能分子：其细胞外区域与IgE结合的同时，其细胞内区域包含能够引发活化信号级层的活性位点。在过敏症中可能还包括低亲和力的IgE受体(FcεRII/CD23)。

其他研究针对的是在过敏原特异性免疫疗法(SIT)中IgG的作用和诱导。研究说明，在SIT导致病原性IgE增加的同时也会导致IgG及IgG4水平更高的上升。参阅例如DK Ledford针对RF Lockley和SC Bukantz Eds.的文章：过敏原与过敏原免疫疗法，MarcelDekker 1999，pp.359-371所写的评论。利用体内皮肤点刺试验滴定证明SIT之后诱导的过敏原特异性IgG的量与皮肤反应的减少有关，进一步证明上述研究。参阅例如Witteman等等1996 InternationalArchives of Allergy and Immunology 109：369-375.确实，在开始急需的免疫疗法几周内，当过敏原特异IgE水平依旧较高但特异IgG4有所增加时，过敏原的临床反应有所减少。参阅例如，Lack等等1997年在Journal of Allergy and Clinical Immunology 99：530-538上发表的文献。

发明内容

包括在本发明范围内的是至少一种结构式为A’-B’的IgE重定位、功能性转变分子(ERFAM)构建物，其中A’代表与IgE结合的部分，B’代表与限制性受体结合的部分。在一些实施方案中，A’和B’被可操作的连接起来。作为选择，ERFAM的结构式也可以是A’-X-B’，其中，A’代表与IgE结合的部分；X代表连接体部分；B’代表与限制性受体结合的部分；其中A’-X-B’被可操作的连接起来。ERFAM构建物在治疗IgE相关疾病或不适是有用的，所述IgE相关疾病或不适包括对至少一种过敏原有过敏反应。在本发明的一种实施方案中，ERFAM与IgE结合并将其转换为过敏症的抑制剂。在不同的实施方案中，ERFAM特异地识别和结合至少一种，至少两种，或者至少三种或三种以上抗原决定基。这也被称为至少单特异性，至少双特异性，或至少多特异性。在一特定的实施方案中，ERFAM构建物的A’和B’部分提供了第一和第二特异性。在ERFAM至少是双特异性的相关的实施方案中，第一特异性是对于IgE的，第二特异性在功能上与IgG4抗体Fc部分相等。在相关的实施方案中，至少双特异性的ERFAM组合物包括第一部分，该部分包括IgG4同型的抗IgE抗体部分，其中所述组合物与至少一种包括IgE的抗原决定基结合但是不交联与细胞结合的IgE。

在ERFAM是至少双特异性的可选择性实施方案中，第一特异性是对于IgE的，第二特异性是对于结合抑制细胞表面受体的。具体的可选择性的双特异性ERFAM组合物包括一种识别和结合抑制细胞表面受体的结构，所述受体选自由包含免疫受体酪氨酸抑制性基序的(ITIM)受体及导致凋亡受体所组成的组。

在具体实施方案中，本发明包括包含过敏原特异性IgG4抗体的ERFAM分子。在另一种形式的实施方案中，至少一种A’部分或至少一种B’部分是只有在与IgE结合时能自然地线性化的环肽。在此实施方案中，环肽特异性地与IgE分子结合使之线性化。在更具体的实施方案中，包括至少一种IgE特异性环肽的ERFAM分子，在与IgE结合使环肽线性化后，与FcγR或相应的抑制性受体结合。

分子式A’-X-B’包括不同的连接体X，所述连接体X可操作的连接至少一种A’部分和至少一种B’部分。在具体实施方案中，连接体X包括聚乙二醇(“PEG”)连接体。其他连接体X组合物包括至少一种氨基酸，一种多肽，或其他一些本领域所知的能够可操作地连接至少两种多肽部分的化学部分。在优选的实施方案中，连接体X组合物是非免疫原性的。在包含PEG连接体X的ERFAM组合物中，ERFAM在体内的有延长的循环半衰期。在相关的实施方案中，包含PEG连接体X的ERFAM组合物免疫原性减少。

在某些实施方案中，ERFAM组合物在药用载体中。在优选的实施方案中提供了有效治疗剂量的ERFAM。也提供了一种在容器中包含至少一种ERFAM组合物的试剂盒。

本发明还提供了使用ERFAM组合物的方法。在一种实施方案中，所述方法包括，对需要调节与IgE相关超敏性反应作用的患者，施用有效治疗剂量的ERFAM分子。在具体实施方案中，应用此方法来治疗过敏症。在优选的实施方案中，施用的ERFAM分子包含过敏原特异性IgG4抗体部分。

最后，提供了至少一种生产ERFAM分子的方法，其中，所述方法包括生产ERFAM分子并将其从杂质中纯化。

除非另有说明，这里使用的所有技术及科学术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的含义相同。尽管在实践或测试本发明时可以使用与这里描述相似或相同的方法和材料，但合适的方法和材料在下面进行描述。这里提到的所有出版物，专利申请，专利及其他参考文献都通过在此引证而全部并入本文。在相冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。另外，材料，方法和实施例只是说明性的，并不起到限制作用。

从后面的详细说明和权利要求书中可以清楚地得到本发明的其他特征和优点。

附图说明

图.1是IgE重定位、功能性改变分子(ERFAM)设计和活动模式的表现。所述分子与IgE分子结合于其Fc区域，结合结果能够干涉IgE与IgE受体(FcεRI和FcεRII)的结合。同时，ERFAM为具有不同功能的受体提供了不同的结合位点，从而将IgE转换为过敏症抑制型抗体。由于ERFAM依赖性重定位，免疫效应细胞含有FcεRI结合的IgE及IgE结合的抑制性受体(例如FcγRIIb)，当抗原接触到的免疫效应细胞(例如肥大细胞或B细胞)时，FcεRI与FcγRIIb的交联作用会导致对过敏症受动器活化作用的抑制。

图.2是柱形图，显示了利用本发明的示例性ERFAM来抑制嗜碱细胞的活化作用。

图.3是柱形图，显示了利用本发明的示例性ERFAM来抑制嗜碱细胞的活化作用。

图.4是柱形图，显示了利用本发明的示例性ERFAM来抑制嗜碱细胞的活化作用。

具体实施方式

本发明的ERFAM构建物

本发明提供的是能够将IgE抗体转变为过敏症的过敏原特异性抑制剂的构建物。在此描述了几种类型的所述抑制剂，并被称为IgE重定位、功能性改变分子(ERFAM)。

图1提供了ERFAM结合的说明。ERFAM结合于IgE的Fc区域。ERFAM结合的结果封闭了其他分子与IgE的Fc区域的相互作用，从而干预IgE与IgE受体(FcεRI和FcεRII)的结合。同时，ERFAM提供了对具有不同功能受体有特异性的第二结合位点。因此，ERFAM与IgE之间的第一结合和ERFAM与具有不同功能受体之间的第二结合将IgE转换成过敏原抑制性抗体。

由于IgE通常是过敏原特异性的，对循环的和与肥大细胞相结合的IgE的结合将能够允许抑制对过敏原的由IgE调节的免疫反应，并且不干预对其他抗原的反应。

另外，ERFAM与IgE的结合不是对某一过敏原为特异性的。ERFAM可以结合任意IgE。因此，和过敏原特异性免疫疗法及其他已知的用于导致耐受性的抗过敏症疗法不同，ERFAM是一种有效的疗法，能够诱导病人对任意广谱过敏原无反应，所述广谱过敏原是指能够引起病人有过敏反应的、由过敏原特异性IgE调节的过敏原。

优选地，ERFAM诱导过敏原依赖型抑制剂的产生，该抑制剂只有在同样给予过敏原的时候才能活化。这样能对过敏症治疗进行有效的控制，避免副作用。

SIT以诱导IgG抑制性抗体的产生为目的。因此ERFAM的用法可以绕过例如SIT，将存在的能引起过敏反应的病原IgE直接转换为抗IgG-相似的过敏症抑制剂。由于不包括施用过敏原也不与FcεRI交联，所以ERFAM不会引起在前的过敏性风险。但是ERFAM本身并不是免疫疗法。

在一些实施方案中，当与IgE结合时，ERFAM分子赋予IgE过敏症抑制性抗体例如IgG4的功能性特征。在一个实施方案中，分子是与IgE结合的IgG4单克隆抗体。

在一些实施方案中，ERFAM是一种多功能的无致过敏性分子，其包含一种IgE结合位点和一种结合例如IgG4的限制性受体的受体结合位点。在某些实施方案中，ERFAM也包含一种“连接体”成分。这种连接体成分是有用的，例如用于延长ERFAM血清半衰期。ERFAM分子还可以用分子式A’-B’表示，其中A’表示第一功能元素(例如IgE结合位点)，B’表示第二功能元素(例如至少一种抑制性受体的结合位点)。作为选择，ERFAM分子还可以用分子式A’-X-B’表示，其中，A’表示第一功能元素(例如IgE结合位点)，X表示连接体成分，B’表示第二功能元素(例如至少一种抑制性受体的结合位点)。

在其他实施方案中，ERFAM分子是一种包含IgE结合位点(第一功能)和与IgG4抗体Fc部分有相似功能结合性质的位点(第二功能)的较小的双功能分子。这两个位点直接相连或通过第三部分间接相连，所述第三部分赋予分子所需的药理学和免疫学特性。双功能分子被公开在例如，PCT申请第WO 96/40788号，第WO98/09638号，第WO 02/088312号和第WO 02/102320号中。

因此，在优选的实施方案中，ERFAM分子是一种具有以下特点的双功能分子：

(1)这种分子的第一结合位点，即IgE结合位点，是一种优选的但不专属于IgG4同型的抗IgE抗体，或与IgE结合的它的片断或一种肽或一种多肽模拟分子或一种寡核苷酸；

(2)第二结合位点，即IgG4结合位点或其等同物，其中，所述位点与IgG4抗体Fc部分有相似功能结合性质。在不同的实施方案中，其是一种IgG4抗体或其Fc片断或一种抗FcγR抗体或一种肽或一种多肽模拟分子或一种寡核苷酸适体，所有的这些有与IgG4结合其受体相似的作用。在合适的情况下，组成第二位点的受体部分优选地是包含免疫受体酪氨酸依赖的抑制型基序ITIM的抑制性受体靶向分子。通常，ITIM含有与抑制性受体细胞质尾部一致的序列{ILV}-x-x-Y-x-{LV}(序列号3)。

(3)可操作的连接第一和第二结合位点的任选的连接体部分。所述连接体可以有一个或一个以上的功能，包括增加ERFAM血清半衰期，减少降解作用，和优化立体化学。这种结合上述位点并赋予他们所需的药理学及免疫学特性的中间物部分是一种聚乙二醇(PEG)部分或一种功能等同分子。

利用过敏原特异性IgG4抗体表述了等同的实施方案，对过敏症患者施用过敏原特异性IgG4抗体以获得相似效果。ERFAM分子的各个单独的成分在下面进行了更加全面的介绍。

ERFAM的IgE结合成分

在某些实施方案中，ERFAM包含本领域所知的IgE结合多肽序列。

已知的ERFAM多肽，抗体，适体，其他化学体及其等同物的IgE结合位点组分包括如下几种：

(a)抗体：包括但不仅限于E25(Novartis，授权专利)，TNX-901(Tanox，WO 92/17207)或其他在此描述的IgE结合抗体；

(b)多肽：包括但不仅限于第WO 98/04718号(ME Digan)和第WO 99/05271号(Gould等等)专利公开的多肽，及任何其他功能的IgE结合多肽序列，无论是天然产生的或是合成的，无论含有L型或D型氨基酸，无论是否含有例如糖基化，磷酸化，十二烷酰化或类似的后翻译修饰。

(c)适体：包括但不仅限于在J Immunol 157：221-230，1996中有描述的与人类IgE有高亲和力和高特异性结合的寡核苷酸，即以35核苷平末端IGELI.2(gggaggacgaugcgg；序列号：1)(K_d＝30nM)表示的2′-NH₂RNA组的A配基或以37核苷平末端DI7.4(ggggcacgtttatccgtccctcctagtggcgtgcccc；序列号：2)(K_d＝10nM)表示的ssDNA组配基，所述寡核苷酸竞争性抑制人类IgE与FclεRI的相互作用，并且封闭IgE调节的血清素从细胞中释放，此释放是用IgE特异性抗原或抗IgE抗体触发的；和

(d)拟肽：包括但不仅限于例如四环化合物(参阅例如美国专利第5,965,605号)。

可以预见的是，本发明使用了这些已知的IgE结合的部分，或本领域技术人员生产了的功能相似或等同的新部分。这里所列的一些及其他的出版物可视作为本说明书的一部分。本申请中所提及的所有出版物都通过在此引证而全文并入本文。

报道抗IgE无刺激性抗体的出版物包括，但不仅限于，PCT申请第WO 92/17207号，第WO 92/21031号，第WO 99/38531号，第WO 00/16804号和第WO 02/079257号，以及美国申请第6,329,509号，等等。选择性地，通过，例如，FcεRI α-链片断与IgE结合的可溶性FcεRI受体及其衍生物包括在美国专利第6,090,384号和PCT申请第WO 98/04718号和第WO 99/05271号中。特别地，第WO98/04718号专利(ME Digan著)描述了结合与人血清白蛋白相溶合的IgE的FcεRI α-链片断，此片断在循环中有较长时间的生存期和较低的副反应发生风险。

报道肽或其他能够抑制IgE与其受体结合的化和物的出版物包括但不仅限于，Cheng等人的美国专利第5,965,605号，和Heska报道的四环类化学化合物对IgE与其受体结合的抑制；Helm等人1997Allergy 52：1155-1169；McDonnell等人，1996Nature Struct Biol 3：419-425；Iwasaki等人，2002 Biochem Biophys Res Comm.293：542-548.；和Wiegand等人，1996 J Immunol 157：221-230。

另外的本领域已知的，能够与IgE特异性结合的适体及其他化学部分可以用来生产ERFAM分子。选择性地，使用经典方法包括但不仅限于单克隆抗体，噬菌体展示，和/或适体技术发现了新的IgE结合构建物。

ERFAM的连接体成分

第一及第二ERFAM功能性组分通过共价结合直接相连。选择性地，第一及第二ERFAM功能性组分通过一种连接体(例如下面描述的乙二醇，多肽序列，树脂，碳水化合物，聚合物或糖组)非直接的相连。存在或不存在连接体的共价联合体优选无免疫性的。

连接体分子例如聚乙二醇(或其他结构和化学部分)，提供了一种骨架，在此骨架上IgE结合位点可以与结合成分可操作的连接以创造最终的ERFAM分子。连接体成分可预见的功能是增加ERFAM分子的血清半衰期，减少降解作用，增加大小，和/或修饰ERFAM各成分之间的空间位置关系。例如，通过增加ERFAM的大小，连接体可以防止其快速从肾脏排泄和延长其循环半衰期或赋予其他药代动力学优点。

可以预见为本发明的一部分，改变药物药效性质的聚乙二醇化方法对本领域普通技术人员是已知的。PEG聚合物是有支链的或无支链的，包括由单一PEG亚单位或多个PEG亚单位组成的PEG聚合物。选择性地，连接体可操作性地框内连接在多肽序列中，例如作为灵活的枢纽。在本领域内，其他连接体部分及生产等同物的方法是已知的，通常包括，例如，化学连接体，聚合物，肽，多肽，糖，刚性珠，合成的可分开的半族，碳水化合物和甘油，和更具体的是可以包括生物素，链亲和素，细胞因子，抗体枢纽区域，蔗糖多聚体，聚乙二醇(PEG)，甲氧基聚乙二醇(MPEG)，聚乙二醇双酸，PEG一元胺，MPEG一元胺，MPEG肼，MPEG咪唑，甲氧基聚丙二醇，聚丙二醇和甲氧基聚丙二醇的共聚物，葡聚糖和聚乳酸-聚乙醇酸。参阅，例如，美国专利第6,309,633号，第6,552,167号，第6,541,610号和第6,592,847号。多肽与低分子量化合物(例如，氨基卵磷脂，脂肪酸，维生素B12和配糖)的结合在本领域是已知的，参阅，例如R.Igarishi等人，刊登在Materials，17，366，(1990)上名为“Proceed.Intern.Symp.Control.ReI.Bioact”的文献；T.Taniguchi等人刊登在Ibid 19，104，(1992)上的文献；G.J.Russel-Jones刊登在Ibid，19，102，(1992)上的文献；M.Baudys等人刊登在Ibid，19，210，(1992)上的文献。连接体分子是单价的，二价的或多价的。

连接体另外可以作为一种间隔体，这种间隔体有合适的长度，可能是大约10-20nm，大约20-40nm，大约40-60nm，大约60-100nm，大约100nm或更长，例如大约500nm或更长至大约1μm或更长。

ERFAM的抑制性受体结合成分

在实施方案中，本发明的ERFAM分子包括能与抑制性受体相互作用的抑制性受体结合分子。抑制性受体结合分子包括肽和抗体Fc区域片段。在ERFAM的一些实施方案中，使用的是IgG4抗体或其Fcγ片段。选择性地，通过抗FcγR抗体(例如抗FcγRIIb的抗体)或其片段，或具有等同结合性质的肽或适体来保证与FcγR的结合。FcγR靶向疗法在本领域内是已知的。FcγR和FcγR靶向分子(抗体，双功能抗体，肽)被公开在，例如美国专利第4,954,617号(MW Fanger等人公开了人类单核吞噬细胞上IgG的Fc受体的单克隆抗体)；美国专利第6,365,161号(Yashwant等人公开了包含抗Fc受体结合剂的治疗剂化合物)；和PCT申请第WO 96/08512号(PMHogarth等人公开了有Fc结合能力的多肽)。

在优选的实施方案中，ERFAM与包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的抑制性受体结合。包含ITIM的抑制性受体存在于免疫相关细胞的表面。免疫相关细胞的非限制性实施例包括嗜碱细胞，肥大细胞，B细胞，血小板和抗原递呈细胞(APCs)。APCs包括枝状细胞，巨噬细胞和单核细胞。优选地，包含ITIM的抑制性受体存在于嗜碱细胞或肥大细胞的表面。一种典型的包含ITIM的抑制性受体是CD31，也被认作存在于嗜碱细胞上的PECAM-I(血小板/内皮细胞黏附分子1)(参阅Fureder等人的文献Allergy.1994；49：861-5)。已经证实，由于抑制胶原糖蛋白VI受体的信号，CD31的交联至少部分地抑制血小板的活化(参阅Newman等人的文献Blood.200197(8)：2351-7)。CD31通过CD31 ITIM也抑制B淋巴细胞上的抗原受体(参阅Wilkinson等人的文献Blood.2002；100(1)：184-93)。

另一种典型的包含ITIM的抑制性受体是CD32B(也被认作FcγRIIb)。CD32B是IgG低亲和IIb的Fc片段的受体；(记录号NP_003992.2)。

其他本领域已知的包含ITIM的抑制性受体包括但不仅限于PCT申请第WO 96/40788号(PM Guyre和M Fanger)；第WO98/09638号(Kate等人证明gp49B 1交联FcεRI受体)；第WO02/088317号(Saxon等人证明FcγRIIb交联FcεRI受体)；第WO02/102320号(An等人证明FcγRIIb交联FcεRI受体)；和Daeron等人的文献1995，J Clin Invest 95：577-585。可以依据ITIMs的存在识别包含ITIM的抑制性受体。识别这些基序的方法在本领域内是已知的(参阅Staub等人的文献Cellular Signaling 2004，16：435-456)。

嗜碱细胞和肥大细胞包含大量包含ITIM的抑制性受体。本发明提供了能够靶向分离主体的两种或两种以上ERFAM分子的用药方法。ERFAM分子是连续或同时提供的。因此通过大量ERFAM分子之间的协同效应能够达到较强的抑制作用。

在特定的病患人口中，需要最小化ERFAM与IgG4受体或ERFAM第二功能部分结合或靶向的ITIM/抑制性受体单独结合的作用。因此，ERFAM可以包含一种只有在结合IgE时能够同时链化(去环化)的环肽。在这种模式中，只有这时ERFAM才能变得能够与FcγR或相应的抑制受体结合。这样可以避免由于没有结合IgE的ERFAM对FcγR的“封闭”作用。能够抑制IgE与其高亲和性受体FcεRI相互作用的合成环肽在本领域内是已知的。参阅例如McDonnel等人的文献1996 Nat Struct Biol 3：419-425。可以用相似的方法学生产只有与IgE结合时能够链化的环肽。在一种实施方案中，肽通过在末端半胱氨酸残基形成的二硫键而环化。在不同的实施方案中，环肽是L-型氨基酸肽和/或逆对映体D-型氨基酸肽。

ERFAM的调亡诱导受体结合成分

在实施方案中，本发明的ERFAM分子包含能与凋亡诱导受体相互作用的凋亡诱导受体结合分子。凋亡诱导受体在本领域内是已知的，其包括TNF相关的凋亡诱导配基受体2，TRAIL受体2，TNFR1，Fas，DR3和AIR/LARD。

ERFAM特点

ERFAM分子包括一个或一个以上下列特点。

安全性：开始时不给过敏原，降低了过敏性反应的风险。因此给药时通常不要求医院环境。

功效：一旦与肥大细胞结合的ERFAM修饰的IgE抗体(似IgG4抗体)水平达到一种抑制结合的未修饰IgE的比例时，经过治疗的过敏症患者可以自由的吃过敏性食物或暴露在过敏性环境中而没有哮喘，鼻炎等等过敏症状。事实上血液中IgE水平将会快速下降，这是因为IgE被ERFAM变成了‘似IgG4抗体’。

ERFAM作用仅限于过敏原：由于唯一的靶向抗体是IgE，因此对与其它抗原有免疫反应的抗体没有相互作用。然而，在某些情况下，ERFAM只与IgG4受体结合的作用是重要的。因此，在一个实施方案中，ERFAM是一种环肽，所述环肽只有在与IgE结合时能够自然‘去环化’且随后变得能与FcγR结合。这样能够避免FcγR被未结合IgE的ERFAM‘封闭’。

ERFAM不需要专门针对过敏原：由于预先存在的IgE负责过敏原的特异性，所以无论过敏原，ERFAM对所有IgE调节的过敏症都是有效的。事实上，致病过敏原甚至不需要被识别；唯一的诊断程序是确认过敏症是由于IgE引起的，即，IgE的水平升高了。

ERFAM不需要专门针对病人：IgE-Fc是相对常量，最终的多形性不会影响它与ERFAM的结合。但是如果这种多形性阻止了特定IgE与ERFAM的结合，则此IgE是不能与其天然配基，即高亲和性FcεRI配基结合的，从而不发生过敏反应。另外，FcγR可能也含有多形性。对于这种情况，与包含IgG4Fc部分的ERFAM相比，ERFAM的第二功能成分由针对这种多形性受体的肽、适体和/或单克隆抗体构成时，该ERFAM被证明更为有效。

ERFAM是快速作用的：由于被治疗的患者体内ERFAM结合IgE/IgE的比率上升，在治疗后几小时或几天之内过敏症状就会消失。在一种实施方案中，ERFAM被应用于过敏性反应和哮喘发作的情况以停止抗原导致的肥大细胞脱粒。ERFAM制剂可以单独施用也可以与抗组胺剂联合施用。

只需要一个短期的疗程：在有限的时间内服用少剂量就足够了。这样可以排除长时间每天或季节性的服药。一旦在循环中结合ERFAM的IgE成为主要过敏原特异性抗体，其半衰期优选地与天然IgG4半衰期相配。此外，ERFAM的药代动力学通过聚乙二醇化或其他修饰方法改变。

作用力持久(长期)：即敏感症不会复发。由于ERFAM修饰的IgE的存在，几乎不会有过敏反应的风险，通常用重复暴露于过敏原的方法来免疫调节T细胞，保证IgG4的生产，从而用IgG4的生产取代抗原特异性IgE的生产。长期过敏原耐受感应的治疗方法可以与一种或一种以上使用ERFAM的治疗联合使用。

容易接受的：ERFAM不是疫苗，不包括基因接种疫苗或其他有问题的药物。事实上，ERFAM简单的将患者自己的‘致病’IgE转变成与自然存在的保护性IgG4相似的抗体。

低成本：肽通常比抗体小，根据长度肽的分子量是几千道尔顿，与此相比，单克隆IgG抗体的分子量是150,000道尔顿。这样带来大规模的效益。第一，当抗体的治疗剂量是mg/kg时，肽等效的剂量是微克/kg。第二，肽的合成比抗体生产便宜。另外，肽的合成与例如单克隆抗体的抗体生产相比相对简单且需要较少的复杂装置。

活性依赖于过敏原的存在：ERFAM分子与其它治疗过敏疾病的分子的区别在于它们的抗过敏活性是由特异性IgE和过敏原两者引发的，因此，引起抑制作用聚类，活化受体。除非特异性IgE和过敏原都存在，否则分子不会具有抗过敏活性。因此继续自然的暴露会产生长时间的耐受性。没有其它治疗过敏病的分子具有这种依赖于特异性抗原存在的活性。

ERFAM活性的定量

用本领域技术人员已知的方法量化ERFAM活性。例如，通过测量与IgE结合的ERFAM来量化ERFAM活性。选择性地，可以通过测量与抑制性受体结合的ERFAM、活性、或抑制性受体来量化ERFAM活性。也有一些试验可以测量ERFAM活性的下游影响。

在本发明的实施方案中，在体外系统中，通过评价ERFAM限制人类嗜碱细胞活性的容量来检测ERFAM活性，其中所述人类嗜碱细胞是抗原依赖的，IgE调节的。这种体外模型系统在本领域内是已知的，可以用来复制过敏反应过程中体内发生的事件。

在系统中，从血液中纯化嗜碱细胞，例如通过使用购自MiltenyBiotec(Bergisch Gladbach，德国，编目号130-053-401)公司的嗜碱细胞分离试剂盒。

如果嗜碱细胞是从过敏供体中纯化出来的，在检测中应用时就不用进一步处理。选择性地，如果嗜碱细胞是从无过敏症个体的血液中纯化出来的，就要在有过敏原特异性IgE抗体存在条件下培养激活，所述过敏原特异性IgE抗体或者是包含在过敏供体的血浆中，或者是从过敏供体的血浆中纯化出来的。

嗜碱细胞与ERFAM共同培养，再在包含在过敏供体的血浆中，或者是从过敏供体的血浆中纯化出来的有过敏原特异性IgE抗体存在条件下培养。在这一步骤中，ERFAM在血浆中与IgE结合并与嗜碱细胞上的FcγR结合。在嗜碱细胞制备和活化/脱粒过程中加入过敏原，利用市售ELISA试剂盒(德国海尔登堡Orpegen Pharma公司的产品Basotest(r)，或其他组胺ELISA试剂盒，Neogen公司编目号为#409010的产品或Research Diagnostics Inc公司#RDI-RE59201产品或Immunotech公司#2015产品)或放射性免疫测定通过组胺释放定量法测定抗原。选择性地，通过流式细胞术评价嗜碱细胞的活化，在此系统中，通过ERFAM抑制嗜碱细胞脱粒的容量决定ERFAM的功效。

抗体成分

这里使用的术语“抗体”涉及免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含某种抗原结合位点能与某种抗原特异性结合(发生免疫反应)的分子。这种抗体包括但不仅限于，多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，单链抗体，F_ab，F_ab′和F_(ab)2片段和F_ab表达库。通常，从人体获得的抗体分子涉及IgG，IgM，IgA，IgE和IgD几类，这几类抗体之间的区别在于分子中天然存在的重链不同。确定的种类有如下子集，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4及其他。而且，在人类体中，轻链是Kappa链或Lambda链。关于抗体的参考文献包括对人类抗体种所有种类，子集和型号的引证。

术语“抗原决定基”包括对免疫球蛋白或T细胞受体具有特异性结合能力的任意蛋白决定簇。抗原决定簇通常由分子(例如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面基团组成，通常有三个特异性空间结构特点和特异性电荷特点。这里的多肽或片断包括至少一种抗原决定基。例如，本发明的抗-IgE抗体能特异性结合IgE，通过本领域技术人员已知的试验(例如放射性受体结合分析试验或类似的试验)测定这里的结合平衡常数(KD)是≤1μM的，优选<100nM，更优选<10nM，最优选<100pM到大约1pM。

这里使用的术语“抗原”，“抗原的”，“过敏原”和“引起过敏的”是指在生物体免疫细胞存在条件下诱导免疫反应的物质。抗体可能包括一种单一免疫原抗原决定簇或一种多免疫原抗原决定簇，所述多免疫原抗原决定簇是可被B细胞受体(即B细胞细胞膜上的抗体)或T细胞受体识别的。因此，这里使用的术语涉及任意能引起免疫反应的物质(例如，花生过敏原，猫皮毛过敏原等等)和本领域技术人员已知的在适当条件下有致抗原性的半抗原。

本发明的构建物或其衍生物，片断，同源类似物或直向同源物被作为耐受原用于发生免疫反应，该免疫特异性结合抗原成分。例如，当与过敏原特异性IgE抗体结合时，ERFAM将非直接结合过敏原。

生产直接抗本发明所述IgE、或其衍生物、片断、同源类似物或直向同源物的多克隆或单克隆抗体的多种方法在本领域内是已知的。参阅例如：Harlow E和Lane D在1988年写的，纽约Cold Spring港Cold Spring Harbor实验室印刷的“抗体：实验室手册”，该书在此通过引证全部并入本文。

本发明包括多克隆抗体，单克隆抗体，人源化抗体(或人类抗体)Fab片断(和单链抗体)，双特异性抗体(是能特异性结合至少两个不同的抗原的单克隆抗体，优选人类抗体或人源化抗体)，和复共轭对复合物抗体(由两个共价连接的抗体组成的抗体)的应用。本发明还包括对抗体功能受动器的修饰，从而提高，例如，抗体在治疗过敏症时的效力。本发明也适合于包括一种结合抗体的免疫复合物，所述结合抗体的分子式是A′-B′或A′-X-B′。用多种双功能蛋白耦合剂(例如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)，亚氨基四氢噻吩(IT)，双功能酰亚胺酯类衍生物(例如二甲氧苯丙氨盐酸盐)，活化酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸盐)，醛(例如戊二醛)，双叠氮化合物(例如双(p-叠氮苯甲酰)己二胺)，双重盐衍生物(例如双(p-重氮苯甲酰)-乙二胺)，二异氰酸盐(例如甲苯2，6-二异氰酸盐)和双活性氟化合物(例如1，5-二氟苯基-2，4-二硝基苯))构成由A’和B’部分组成的所述复合物。例如，利用Vitetta等人在文献Science，238：1098(1987)中描述的方法可以制备ERFAM构建物。

ERFAM的诊断应用

ERFAM用于本领域已知的蛋白质定位和/或定量技术方法(例如，用于测量合适生理样品的蛋白质水平，用于诊断方法，用于成像等等)中。在给定的实施方案中，包含抗原结合区域的抗IgE或抑制性受体的抗体，蛋白质或其衍生物，片段，类似物或同源物被用作药学活性成分。例如，当应用于成像时，抗体与可检测物质的耦合(即物理连接)可以促进检测。可检测物质的例子包括多种酶，酶活辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，和放射性材料。合适的酶的例子包括山葵过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-牛乳糖酶或乙酰胆碱酯酶；合适的荧光材料包括7-羟基香豆素，荧光素，异硫氰酸荧光素，玫瑰精，双氯均三嗪胺，丹磺酰氯或藻红蛋白；一种发光材料的例子包括发光氨；生物发光材料的例子包括荧光素酶，虫荧光素和发光蛋白质，合适放射性材料的例子包括¹²⁵I，¹³¹I，³⁵S或³H。

ERFAM疗法

本发明的ERFAM构建物，包括多克隆、单克隆、人源化和全人类抗体，均被考虑为治疗剂。这种治疗剂通常用于治疗或预防患者的疾病或病原。一种优选的使用是用于治疗过敏原调节的过敏反应。对患者施用抗体制剂，通常通过抗体与目标物结合起作用。这种作用有两种，一种依赖于已知抗体分子与目标问题抗原之间相互作用的特异性本能。在第一个实施例中，施用抗体可能消除或抑制IgE与FcεRI的自然结合。在这种情况下，ERFAM分子通过FcεRIα亚族位点结合IgE Fc区域，妨碍IgE的结合。因此，ERFAM分子通过于肥大细胞结合的IgE交联减少了级层反应。

选择性地，另一种作用是ERFAM分子得出的一种生理结果，此生理结果是通过与能抑制过敏反应的效应体结合位点结合而得出的。发明人不希望受其限制的一种可预期的机制是，ERFAM分子的IgG4部分为Fc受体复合物补充抑制性亚族，从而调控级层，导致对其结合的刺激免疫细胞的抑制作用，而不是活化作用。

抗体的治疗有效剂量通常与达到治疗目标所需要的量有关。需要用药的量进一步依赖于ERFAM分子与其特异性抗原/受体的结合亲和力，还依赖于施用的ERFAM分子从被用药主体的血清中消耗的速率。抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常用范围是，作为非限制性实施例，从大约0.1mg/kg体重到大约50mg/kg体重，常用用药频率范围可能(例如)从每天两次到每周一次。在优选的实施方案中，ERFAM分子药丸以单注射剂形式施用，然后用SIT治疗引起持久的耐受力，且没有例如过敏性休克的副作用风险。

药物组合物

本发明的抗体构建物以及本领域技术人员容易识别的相关分子可以按药物组合物的形式施用，用于治疗各种疾病。已有文献提供了生产这种组合物的原理和需要考虑的事，以及选择成分的指导，例如在文献REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OFPHARMACY 19th ed.(Alfonso R.Gennaro，等人编辑)Mack Pub.Co.，Easton，Pa.1995；Haxwood Academic出版的DRUGABSORPTION ENHANCEMENT：CONCEPTS，POSSIBILITIES，LIMITATIONS，AND TRENDS，Langhorne，Pa.，1994；和纽约M.Dekker的文献PEPTIDE AND PROTEIN DRUG DELIVERY(Advances In Parenteral Sciences，Vol.4)，1991。

包括ERFAM构建物的肽可通过化学合成和/或通过DNA重组技术生产。参阅例如Marasco等人的文献Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7889-7893(1993)。制剂中可包含处理特殊指示所需的一个以上活性化合物，优选那些有互补活性，彼此之间不会有反作用的制剂。选择性地，或另外，组合物可能包括一种能够提高其功能的制剂，例如象IL-2，IFN-γ，IL-IO和/或TGF-β，或能与游离的IL-4或IL-13结合的制剂。这些分子以合适的结合物存在，施用量要能够达到预期的目的。

活性成分可以包裹在微囊中，所述微囊是通过例如凝聚技术或通过表面聚合作用制备的，例如，在胶体给药系统(例如脂质体，白蛋白微球，微乳，纳米颗粒和纳米微囊)或粗乳液中分别为羟甲基纤维素或明胶微囊及聚甲基丙烯酸甲酯微囊。

体内用药的制剂是无菌的。这可以通过除菌滤膜过滤很容易的实现。

可以制备缓释制剂。缓释制剂适当的实施例包括包含抗体的固体疏水聚合物的半透明基质，所述基质有特定的形状，例如膜型，或微囊。缓释基质的实施例包括聚酯，水凝胶(例如聚2-羟乙基甲基丙烯酸)，或聚乙烯醇，聚交酯(美国专利第3,773,919号)，L-谷氨酸与γ-乙烷基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然有些聚合物(例如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸)能够在超过100天的时间里释放分子，但也有些水凝胶能够在较短的时间内释放蛋白。

本发明的ERFAM构建物及其衍生物，片段，类似物或同源物可以并入适于用药的药物组合物中。这种组合物通常包括ERFAM构建物和药学可接受载体。这里“药学可接受的载体”包括与药事管理学相一致的任意的和所有的溶剂，分散介质，包衣料，抗菌剂和抗真菌剂，等渗和延缓吸收的制剂等等。最新版的Remington′sPharmaceutical Sciences中描述了合适的载体，Remington′sPharmaceutical Sciences是该领域标准参考文献，在这里通过引证并入本文。这种载体或稀释剂优选的实施例包括但不仅限于水，盐，finger’s溶液，葡萄糖溶液，和5％人血清白蛋白。可以使用脂质体和非水相媒介物(例如不易挥发的油)。使用这种媒介物或制剂作为药学活性物质在本领域内是已知的。除了那些已知与活性成分不协调的常用媒介物或制剂，其他的均可于本发明的组合物。补充性的活性化合物也可加入到组合物中。

药物组合物的制剂设计要与其目标用药途径相一致。用药途径的实施例包括注射用药(例如，静脉用药，皮内用药，皮下用药，口服用药(例如吸入用药)，透皮给药)和直肠用药。用于注射用药，皮内用药或皮下用药的溶液或悬浮液包括下列成分：一种无菌稀释剂例如注射用水，盐溶液，不挥发油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂例如依地酸钙钠(EDTA)；缓冲液例如醋酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，和能够调节肌肉弹性的试剂例如氯化钠或葡萄糖。通过酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠调节pH值。注射用制剂可以装入由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射剂或多剂量瓶中。

适于注射用的药物组合物包括无菌水溶液(水可溶情况)或分散系和可以随时制成注射用无菌溶液或分散系的无菌粉末。对于静脉用药，适合的载体包括生理盐水，抑菌注射用水，Cremophor EL^TM(BASF公司，Parsippany，NJ.)或磷酸缓冲液(PBS)。在所有情况下，将组合物灭菌，其流动性达到易于注射的程度。在生产和储藏条件下，载体是稳定的，免受例如细菌或真菌微生物的污染作用。载体可以是一种溶剂或是分散媒介，包含例如，水，乙醇，多羟基化合物(例如甘油，丙二醇和液态聚乙二醇等等)和他们之间合适的混合物。通过使用例如卵磷脂之类的包衣料，通过维持悬浮液中要求的颗粒大小及通过使用表面活性剂可以维持合适的流动性。通过使用不同的抗菌剂及抗真菌剂(例如苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，抗坏血酸，局部抗菌剂等等)可以预防微生物作用。在一些情况下，优选在组合物中包括等渗试剂，例如糖，多元醇(例如木糖醇)，山梨醇，氯化钠。可以通过在组合物中加入延缓吸收试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)的方法延长注射用组合物的吸收时间。

将一种或几种上述成分按照需要结合，得到合适的溶剂，将此溶剂与所需量的ERFAM构建物混合，然后过滤灭菌，制备无菌注射用溶液。通常，将活性成分与无菌载体混合制备分散剂，所述无菌载体包含一种基本分散介质和上面提到得其他一些所需成分。对于制备无菌注射用无菌粉末的情况，制备方法是通过真空干燥或冷冻干燥从之前过滤干燥后的溶液中产生活性成分与附加的所需成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食性载体。他们可以被装入明胶胶囊中，也可以压制成片剂。为了达到口服给药的目的，活性成分可以与赋形剂混合，以普通片，口含片或胶囊的形式被使用。也可以用流化载体制备口服组合物用作漱口药物，其中流化载体中的化合物是口服使用的，漱口后吐出或咽下。药学上相协调的粘合剂和/或辅助材料可以作为组合物的一部分被包括。普通片，丸剂，胶囊剂，口含片等等可以包含下列任意成分或其天然相似化合物：粘合剂(例如微晶纤维素，黄蓍胶或明胶)；赋形剂(例如淀粉或乳糖)；崩解剂(例如藻酸，羟乙酸淀粉钠或玉米淀粉)；润滑剂(硬脂酸镁)；助流剂(微粉硅胶)；甜味剂(例如蔗糖或糖精)；或佐味剂(薄荷油，水杨酸甲酯或橘子香精)。

在一个实施方案中，与能够保护化合物不从体内快速排出的载体一起制备活性化合物，例如控制释放制剂，包括植入剂和微囊化给药系统。使用可生物降解的，生物相容性好的聚合物，例如，乙烯-乙酸乙烯酯，聚酸酐，胶原，聚原磷酯和聚乳酸。这些制剂的制备方法对本领域技术人员是已知的。这些材料也可以从Alza公司和诺华制药公司购得。

将ERFAM组合物设计成单位剂量形式的制剂是有利的，可以方便给药和保证剂量一致性。这里用到的“单位剂量形式”涉及适合治疗主体单一剂量的体内不连续单位；每个单位包含产生所需治疗效果的预先确定量的活性成分和必需的药用载体。直接根据活性成分独特的性质，所达到的特殊治疗效果和使用此活性成分组合治疗个体时的内在局限性来规定单位剂量形式的使用方法。

药物组合物与用药说明一起可以放入容器，包裹，试剂盒或自动售货机中。在某一实施方案中，ERFAM与抗组胺剂一起包裹在试剂盒中，在另一实施方案中，ERFAM制剂包含抗组胺剂。理想的情况是，在主体暴露于过敏原之前或之后片刻施用ERFAM制剂。包含抗组胺剂的ERFAM制剂可以包装为非处方药物被过敏症患者使用来抑制过敏反应。

结合聚合物的ERFAM构建物治疗剂

基于本发明的公开，本领域技术人员可以制备经过化学修饰(例如结合聚合物)的ERFAM构建物。最适于加入ERFAM构建物的化学部分(如涉及的ERFAM构建物的衍生物)包括水可溶性聚合物。水可溶性聚合物的优势在于与它结合的蛋白质在水相环境中不会沉淀。在一些实施方案中，此聚合物是在制备治疗产品或组合物时药学可接受的聚合物。

尽管可以预见一个以上聚合物分子可以与ERFAM结合，如果需要的话，也可以用单一的聚合物分子与ERFAM构建物结合。在一些实施方案中，使用两个，三个或四个聚合物分子进行结合，例如，第一及第二聚合物分子结合在ERFAM的每个N-末端的氨基酸上，第三聚合物分子结合在内部的氨基酸上(例如无末端氨基酸)。结合的ERFAM组合物在体内和非体内应用时都有功效。另外，公认的是适于末端应用的结合聚合物可以使用其他基团，部分或其他结合类型。给聚合物共价结合某种功能性部分从而赋予聚合物抵抗紫外降解能力，或抗氧化能力，或持续的血清保持力，或其他性质和特点，通过实施例证明，这些应用是有用的。作为进一步的实施例，在一些应用过程中使聚合物功能化赋予它反应特点或可交联特点，从而提高结合材料整体性质和特点是有用的。因此，聚合物可能包含很多功能，重复基团，联结或其他特征结构不排除以结合ERFAM组合物为目的的功效。

本领域普通技术人员基于考虑结合聚合物/蛋白是否用于医疗，如果是的话，考虑所需剂量，循环时间，对蛋白酶的抵抗力或其他有待考虑的事项能够选择所需的聚合物。衍生物的效力通过以所需形式(例如，通过渗透泵，或通过注射或灌输，或进一步设计成口服制剂，肺部用药制剂或其它给药途径)施用衍生物来探知并确定。

合适的水可溶性聚合物包括但不仅限于聚乙二醇，二甲苯与丙二醇的共聚物，羟甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚1，3-二氧戊烷，聚1，3，6-三恶烷，乙烯/苯酐共聚物，聚氨基酸(可以是均聚物也可以是随机共聚物)，和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，聚丙二醇均聚物，聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物，聚氧乙烯多羟基化合物(例如，甘油)，聚乙烯醇，或他们的混合物。由于在水中的稳定性，聚乙烯醇丙醛在制备过程中更有优势。

聚合物是任意适合的分子量大小，可以是有支链的，也可以是无支链的。

对于聚乙二醇(PEG)来讲，为了方便处理和制备，优选的分子量在约2KDa到约100KDa之间(这里使用的术语“大约”是指在制备聚乙二醇过程中，有些分子比规定的分子量较重，有些较轻)。依据所需达到的治疗状态(例如所需控制释放的持续时间；对生物活性有作用(如果有的话)；容易处理；缺乏抗原性程度及聚乙二醇对蛋白或其他治疗剂的其它已知作用)，使用其他大小的聚合物。在一些实施方案中，优选的分子量是大约10KDa。

所附上的聚合物分子数量是变化的，本领域技术人员可以确定其对功能的作用。一种衍生物可能是相同或不同化学部分(例如，不同质量的聚乙二醇聚合物)的单衍生物，或者是双衍生物，三衍生物，多衍生物或这些衍生物的结合。聚合物分子与蛋白质(或多肽)分子的比率及其在反应混合物中的浓度是变化的。总的来说，多种因素可以决定最适比率(依据反应效率，没有多余的未反应的蛋白质或聚合物存在)，例如所需的衍生程度(例如，单衍生，双衍生，三衍生，等等)，所选聚合物分子量，聚合物是否有支链及反应条件。

在某种实施方案中，考虑蛋白质功能区域或抗原区域的作用，给蛋白质分子附上聚乙二醇分子(或其它化学基团)。本领域技术人员可以使用多种附着方法。参阅例如，欧洲专利第401384号(将PEG与G-CSF耦合)；Malik等人的文献Exp.Hematol.20：1028-1035，1992(报道了用三氟代乙烷磺酰氯使GM-CSF聚乙二醇化)。

例如，聚乙二醇通过反应基(例如一种自由氨基或羟基基团)与氨基酸残基共价结合。所述反应基是指活性聚乙二醇分子结合的基团。含有自由氨基的氨基酸残基可能包括赖氨酸残基及N-末端氨基酸残基。含有自由羟基基团的氨基酸残基包括天氡氨酸残基，谷氨酸残基和C-末端氨基酸残基。巯基基团也可以用作附着聚乙二醇分子的反应基。在一些附着氨基酸基团的实施方案中，以治疗为目的优选N-末端基团或赖氨酸基团。如果需要连接受体的话，就应当避免附着受体主要连接的残基。

某种情况可能明确需要一种N-末端化学修饰的蛋白质。以聚乙二醇分子作为现有的ERFAM组合物的例证，所述情况可以选择不同的聚乙二醇分子(不同分子量，支链等等)，反应混合物中聚乙二醇分子与蛋白质(或多肽)分子不同的比率，所需完成的不同聚乙二醇化类型，及获得选择性N-末端聚乙二醇化蛋白质不同的方法。获得N-末端聚乙二醇化蛋白的方法(即，如果需要的话将此部分与单聚乙二醇化部分分开)是通过从大量聚乙二醇化蛋白质分子中纯化N-末端聚乙二醇化材料。通过还原烷基化完成选择性N-末端化学修饰，从而开发特殊蛋白质中可用于衍生的前体氨基酸(赖氨酸相对N-末端氨基酸)不同类型的不同反应。在适当的反应条件下，可以得到N-末端用含有羰基的聚合物充分选择性衍生的蛋白质。利用赖氨酸残基的epsilon-氨基(e-氨基)与蛋白质N-末端残基的alpha-氨基(a-氨基)的pka不同，在某一pH值下进行选择性N-末端聚乙二醇化。通过这种选择性衍生可以控制水溶性聚合物对蛋白质的附着作用：聚合物的联结作用主要发生在蛋白质的N末端，其他反应基(例如赖氨酸侧链氨基基团)并没有发生明显的修饰作用。

通过还原烷基化作用，水溶性聚合物成为上述类型，且含有一种单反应性醛基，能够于蛋白质耦合。可以使用含有单反应性醛基的聚乙二醇丙醛。

本发明包括原核表达的，真核表达的或合成的ERFAM的使用。

通过本领域已知的聚乙二醇化反应进行聚乙二醇化。参阅，例如，文献Focus on Growth Factors，3(2)：4-10，1992；欧洲专利第0154316号；欧洲专利第0 401 384号及这里引用的其他关于聚乙二醇化的出版物。通过反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。

通过酰化反应进行的聚乙二醇化主要包括聚乙二醇(PEG)活化酯衍生物的反应。使用任意已知的或充分发现的反应性聚乙二醇分子进行聚乙二醇化。优选的活性聚乙二醇酯是将PEG酯化为N-羟基丁二酰亚胺(NHS)。这里使用的术语“酰化反应”包括但不仅限于下列蛋白治疗剂与水溶性聚合物(例如PEG)的连接类型：氨基化合物，氨基甲酸盐，聚氨酯等等。参阅文献Bioconjugate Chem.5：133-140，1994.选择任意已知的聚乙二醇化反应条件或完全反应的条件，避免选择阻止聚合物结合ERFAM构建物活性的温度，溶剂和pH值。

通过酰化作用完成的聚乙二醇化主要产生一种聚聚乙二醇化ERFAM产品。在一些实施方案中，连接体是氨基。另外，在一些实施方案中，产物完全是(例如>95％)单，双或三聚乙二醇化衍生物。根据使用的特异性反应条件大量生成高聚乙二醇化程度的产品。如果需要的话，通过标准的纯化工艺(包括透析，盐析，超滤，离子交换色谱，凝胶过滤色谱和电泳)将更纯的聚乙二醇化产品从混合物(例如未反应物)中分离出来。

通过烷基化作用完成的聚乙二醇化通常包括末端醛基化的PEG在还原剂存在条件下与ERFAM发生反应。通过烷基化作用完成的聚乙二醇化也可以产生聚聚乙二醇化ERFAM产品。另外，可以控制反应条件使聚乙二醇化只发生在ERFAM分子N-末端的一个氨基基团上(例如，一种单聚乙二醇化蛋白)。在单聚乙二醇化或聚乙二醇化情况下，PEG分子通过-CH2-NH-基团附着在蛋白质分子上。要特别说明一下-CH2-基团，这里涉及的这类连接键是一种烷基连接键。

通过还原烷基化完成衍生作用产生单聚乙二醇化产品，从而开发可用于衍生的前体氨基酸(赖氨酸相对N-末端氨基酸)不同类型的不同反应。利用赖氨酸残基的e-氨基与蛋白质N-末端残基的α-氨基的pka不同，在某一pH值下进行反应。通过这种选择性衍生作用，控制包含反应基，例如乙醛，的水溶性聚合物与蛋白质的附着作用：聚合物主要结合与蛋白质的N末端且对其他反应基，例如赖氨酸侧链氨基基团，没有发生明显的修饰作用。

用于酰化反应及烷基化反应步骤的聚合物分子选自上面描述的水溶性聚合物。修饰选择的聚合物使之含有单一反应基，例如，一种可以进行酰化反应的活性酯基或可以进行烷基化反应的醛基，以便于控制本方法提供的聚合反应程度。可仿效的反应性醛基化PEG是水溶性聚乙二醇丙醛，或者它的单C1-C10烷氧化或芳氧化衍生物(参阅美国专利第5,252,714号)。聚合物可以是有支链的也可以是无支链的。选择含有单一反应酯基基团的聚合物进行酰化反应。选择含有单一醛基基团的聚合物进行还原烷基化反应。通常，水溶性聚合物不会选自天然糖残基，因为这种糖残基通常较为容易的得自哺乳动物重组表达系统。聚合物可以是任意分子量的，可以是有支链的也可以是无支链的。

这里用到的可仿效的水溶性聚合物是聚乙二醇。这里使用的聚乙二醇是指包括用于衍生蛋白质的所有形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧化或芳氧化聚乙二醇。

通常，在能够使生物活性底物与活性聚合物分子发生反应的任意适合条件下完成化学衍生作用。制备聚乙二醇化ERFAM的方法通常包括以下步骤：a)在能够使分子附着一个或一个以上PEG基团的条件下，ERFAM蛋白或多肽与聚乙二醇(例如反应性PEG酯化或醛基化衍生物)发生反应，和b)得到反应产物。通常酰化作用最佳的反应条件是由已知参数和所需结果一件件决定的。例如，PEG与蛋白的比率越大，聚聚乙二醇化产品的百分比越大。

生成充分均一化单聚合物/ERFAM分子的还原烷基化作用通常包括以下步骤：a)在还原烷基化条件下，在允许ERFAM氨基末端进行a-氨基基团选择性修饰的pH值下，ERFAM蛋白或多肽与反应性PEG分子反应；及b)获得反应产物。

pH值还影响聚合物与使用的蛋白的比例。通常，如果pH较低，则需要相对于蛋白较多的过量聚合物(即反应性N末端a-氨基基团越少，达到最适情况所需的聚合物越多)。如果pH较高，则聚合物：蛋白质的比例不需要很大(即可以使用的反应性基团越多，需要的聚合物分子越少)。为了达到本发明的目的，pH值的范围通常是3-9，优选3-6。

另一个需要重点考虑的地方是聚合物的分子量。通常，聚合物的分子量越大，附着在蛋白质上的聚合物分子越少。相似的，在优化这些参数的过程中要考虑到聚合物的支链。通常，分子量越大(或支链越多)，聚合物：蛋白的比例越大。通常，进行这里预见的聚乙二醇化反应，优选的平均分子量是大约2KDa到大约100KDa。优选的平均分子量是大约5KDa到大约50KDa，例如大约10KDa。

在一些实施方案中，ERFAM通过多肽上的末端反应基连接聚合物。选择性地，或另外，ERFAM通过内在的赖氨酸残基，例如引入用来构造ERFAM分子的天然氨基酸序列的赖氨酸残基的侧链氨基连接。因此结合物可以从无末端反应基中分出。有反应基的聚合物在这里被指定为“活性聚合物”。反应基与蛋白质上的自由氨基或其他反应基发生选择性反应。

活性聚合物可能在ERFAM可利用的氨基上发生附着作用，引入ERFAM多肽氨基酸序列的残基或它们的变量，所述氨基例如赖氨酸残基的a-氨基基团或e-氨基基团。ERFAM分子(可利用)的自由羧基基团，合适活性的羰基基团，羟基，胍基，咪唑基，氧化醣基基团和巯基基团也可以作为附着位点。

根据蛋白浓度，通常每摩尔蛋白质要使用大约1.0到约10摩尔的活性聚合物。最终所得量是当最小化产品非特异性修饰时的最大反应程度与在此同时，能够维持最适活性，如果可能的话同时，优化蛋白的半衰期的界定化学之间的平衡。在一些实施方案中，蛋白质至少保留了50％的生物活性，在其他的实施方案中，几乎保留了100％。

聚合物可以通过本领域内已知的方法与ERFAM多肽耦合。例如，在某些实施方案中，聚烃基乙二醇与ERFAM或ERFAM变异株中的赖氨酸基团耦合。与赖氨酸基团的连接可以通过例如聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺(ss-PEG)和聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA-PEG)的N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)完成。合适的聚烃基乙二醇基团包括，例如，羧甲基-NHS，正亮氨酸-NHS，SC-PEG，tresylate，醛基，环氧化物，羰基咪唑，和PNP碳酸盐。

附加的氨基反应性PEG连接体可被琥珀酰亚胺酯取代。所述琥珀酰亚胺酯包括，例如，异硫氰酸盐，硝基苯碳酸盐，环氧化物，和碳酸苯并三唑。在一些实施方案中，选择条件使选择性，程度和反应力最大化。

如果需要的话，ERFAM分子可包含一种标记，例如随后能够被蛋白水解酶释放的标记，例如可以被肠激酶分裂位点分离的组氨酸标记(即10组氨酸)。因此，赖氨酸基团可以通过组氨酸标记与低分子量连接体的第一反应而选择性修饰，所述低分子量连接体例如能与赖氨酸和N-末端发生反应随后释放组氨酸标记的Traut′s试剂(Pierce)。之后，多肽会含有一种自由SH基团，该基团能被包含硫醇反应性头部基团的PEG分子选择性修饰，所述硫醇反应性头部基团例如马来酰亚胺基团，乙烯砜基团。卤代醋酸盐基团，或自由或被保护的SH基团。

Traut’s试剂可以被任意能够为附着PEG产生特异位点的连接体代替。通过实施例，Traut’s试剂被SPDP，SMPT，SATA，或SATP(都可购自Pierce)代替。相似的，蛋白质与嵌入马来酰亚胺(例如SMCC，AMAS9 BMPS，MBS，EMCS，SMPB，SMPH，KMUS，或GMBS)，卤代醋酸盐基团(例如SBAP，SIA，SIAB)或乙烯砜基团的氨基反应性连接体反应，将反应产物与包含自由SH的PEG反应。对使用的连接体唯一的限制是对其大小的限制，它不能妨碍随后的N-末端标记的移出。

因此，在其他实施方案中，聚烃基乙二醇与ERFAM分子或ERFAM变异株的半光氨酸基团耦合。使用例如马来酰亚胺基团，乙烯砜基团，卤代醋酸盐基团和硫醇基团可以影响耦合作用。

在一些实施方案中，组合物中聚合物连接的ERFAM相对于没有聚合物存在的变异株多肽，具有更长的血浆半衰期。选择性地，或另外，组合物中结合聚合物的ERFAM连接GFR，活化RET，使神经元细胞改变规格化，或提高神经元细胞存活率，或使他们生理功能相结合。

在一些实施方案中，组合物作为一种稳定的，水相可溶的聚合物结合的ERFAM，或聚合物结合ERFAM的变异株被提供，并与聚乙二醇基团耦合。如果需要的话，ERFAM或ERFAM变异株构建物通过不稳定粘合剂与聚乙二醇分子相连。不稳定粘合剂可以被例如生化水解，蛋白水解，巯基裂解分裂。例如，粘合剂在体内(生理学上的)条件下可以被分裂。

本领域技术人员可以确定其他例如溶剂，反应时间，温度等等反应参数和纯化产品的方法。

ERFAM构建物的合成和分离

ERFAM变异体可以用本领域已知的方法进行分离。应用标准蛋白纯化方法可以从免疫细胞，杂种瘤或组织源中分离出自然生成的ERFAM子集。选择性地，ERFAM变异体可以通过标准肽合成技术化学合成。在肽领域内，已经很好的建立了短氨基酸序列的合成方法。参阅例如Stewart等人所著的固相多肽合成(2d ed.，1984年)。

在另一种实施方案中，ERFAM构建物通过重组DNA技术生产。例如，其中连接体部分是一种多肽连接体的，编码ERFAM的核酸分子可以被插入一种载体，例如，一种表达载体，之后将核酸引入细胞中。合适的细胞包括，例如哺乳动物细胞(例如人类细胞或中华仓鼠卵巢细胞)，真菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞和病毒细胞。在重组细胞中表达时，细胞在允许ERFAM构建物表达的条件下培养。如果需要的话，可以从细胞悬浮液中回收ERFAM构建物。这里使用的“回收”的意思是将回收步骤之前存在于细胞或培养基中的多肽变异体从这些成分中分离出来。回收步骤可能包括一步或一步以上复折叠或纯化步骤。

使用一些本领域已知的方法构造ERFAM构建物。定点突变是这些方法之一，在此过程中，一个特定的核酸(或，如果需要的话一小部分特定的核酸)发生改变从而改变了编码ERFAM构建物的序列中的一个氨基酸(或者，如果需要的话，一小部分预定的氨基酸残基)。本领域技术人员可以认识到定点突变是一种常规的，普遍应用的技术。事实上，可以购得很多定点突变的试剂盒。其中之一是Clontech实验室(Palo Alto，Calif.)出售的＂Transformer SiteDirected Mutagenesis Kit＂。

除非特别指出，本发明实践所使用的是细胞生物学，细胞培养，分子生物学，微生物学，重组DNA，蛋白质化学和免疫学常规的技术，包括在本领域技术范围内。这些技术在文献上也有描述。参阅，例如参阅1989年Sambrook，Fritsch和Maniatis等人编辑的ColdSpring Harbor实验室出版的“分子克隆：实验室手册”，第二版；DNA克隆，卷I和II(D.N.Glover编辑，1985)；MJ.Gait1984年编辑的“寡聚核苷酸合成”；Mullis等人的美国专利第4,683,195号；B.D.Haines和SJ.Higgins1984年编辑的“核酸杂交”；B.D.Hames和SJ.Higgins 1984年编辑的“转录与翻译”；Alan R.Liss公司R.I.Freshney 1987年编辑的“动物细胞培养”；IRL 1986年出版的“免疫细胞和酶”；B.Perbal 1984年所著的“分子克隆实践指导”；纽约学术出版社出版的Wu等人编辑的“发酵学方法”卷154和155；Cold Spring Harbor实验室J.H.Miller和M.P.Calos 1987年编辑的“哺乳动物细胞基因转移载体”；学术出版社1987年出版的Mayer和Walker编辑的“细胞核分子生物学中的免疫化学方法”；D.M.Weir和CC.Blackwell 1986年编辑的“免疫学实验手册”卷I-IV；Cold Spring Harbor实验室1986年出版的“鼠胚胎操作”。

聚合物结合的ERFAM构建物

如果需要的话，聚合物结合的ERFAM构建物可以作为融合蛋白被提供。蛋白的融合多肽衍生物包括保持生物活性前体蛋白的多种结构形式。这里使用的“融合”是指通过各自的肽骨架，例如通过在相同阅读窗(即在阅读窗内)内编码这些蛋白的聚核苷酸分子的基因表达而共线性，共价连接两个或两个以上蛋白或其片断。优选不同来源的蛋白或其片段。因此，一些融合蛋白包括与不是ERFAM变异体的第二部分共价结合的ERFAM变异体构建物或片断。在一些实施方案中，第二部分是由包含单体的多肽衍生出来的，足够赋予ERFAM构建物提高的溶解性和/或生物利用度。

包含聚合物结合ERFAM的药物组合物

本发明还提供了包含聚合物结合ERFAM的药物组合物。这里使用的“药物组合物”定义为包括本发明的ERFAM构建物或结合体，分散在生理学上可接受的载体中，任选地包含一种或一种以上生理学可相容成分。因此，药物组合物可能包含一种赋形剂，例如水，一种或一种以上微量元素，糖，去污剂和一种或一种以上例如惰性蛋白(例如肝磷脂或白蛋白)之类的载体。

ERFAM构建物本身可以用药也可以以药学可接受的酯，盐，和其生理功能性衍生物的形式用药。在这种药学或医学制剂中，修饰的ERFAM构建物与一种或一种以上药学可接受的载体和其他任选的治疗剂成分一起使用。

药学可接受的载体的意思是与制剂中其他成分是相容的，且不会对使用者产生不适当的毒性。为了达到所需的药理学效果或医学有益效果，提供足够量的ERFAM构建物，同时，如这里所描述的，为了达到所需体内剂量或浓度的生物利用度，要给予合适的量。

制剂包括适于肠胃外用药的制剂和肠胃用药制剂，和包括口服用药，直肠用药，口腔粘膜用药，局部用药，鼻部用药，眼部用药，皮下用药，肌肉用药，静脉用药，透皮用药，椎管用药，动脉用药，关节用药，蛛网膜下用药，支气管用药，淋巴用药，阴道用药，宫腔用药的特殊的用药方式。优选适于作为局部或系统的气雾剂或肠胃外用药的制剂。

当在包括液体溶剂的制剂中使用ERFAM构建物时，制剂有利于进行口服用药，支气管用药或肠胃外用药。当制剂中液体悬浮物或生物相容性载体制剂中的粉末使用了ERFAM构建物时，制剂有利于进行口服用药，直肠用药或支气管用药。选择性地，通过气化载体气体中的粉末形成粉末的气体悬浮液，可以经鼻用药或支气管用药，病人可以从包括一种合适的气化装置的呼吸器中吸入粉末。

包括本发明蛋白质的制剂可以方便的以单位剂量形式存在，用药剂学领域已知的多种方法制备。这些方法通常包括将活性成分引入由一个或一个以上助剂成分组成的载体中并与之结合。

代表性地，通过将活性成分均一地且密切地加入到液态载体，细碎的固态载体或两者之中，与之结合制备制剂，然后如果需要的话，可以将产品定形成所需制剂的剂量形式。

适于口服用药的本发明制剂可以以不连续的单位存在，例如胶囊，直肠用胶囊，片剂，菱形片，每种单位含有预定量的活性成分粉末或颗粒；也可以以水相液体或无水相液体中的悬浮物形式存在，例如，糖浆，酏剂，乳液或顿服剂。

适用于肠胃外用药的制剂包括活性结合体的无菌水相产品，该产品与受试者的血液(例如，生理盐水溶液)等渗。这种制剂可能包括悬浮剂，增稠剂或其他将血液成分或一个或一个以上器官设计为化合物目标的微颗粒系统。制剂可能以单剂量或多剂量形式存在。

鼻用喷雾制剂包括含有防腐剂和等渗试剂的纯化的活性结合物水溶液。可以调整这种制剂的pH值和渗透压使之与鼻粘膜相一致。

适于直肠用药的制剂可以以含有合适载体的栓剂的形式存在，所述合适的载体例如可可油，氢化油脂，氢化油脂羧基酸。通过与鼻用喷雾剂相似的方法可以制备例如滴眼液的眼用制剂，区别是要调整pH值和渗透压与眼部的粘膜相配。

局部用药的制剂包括溶解或悬浮于一种或一种以上介质中的结合体，所述介质例如矿物油，石油，多羟基醇，或其他用作局部药物制剂的基质。

除了上述成分之外，本发明制剂进一步包括一种或多种选自稀释剂，缓冲剂，调味剂，崩解剂，表面活性剂，增稠剂，润滑剂，防腐剂(包括抗氧化剂)等等的附加成分。前面的事项也用到了ERFAM融合蛋白(例如，ERFAM-HAS融合蛋白)。

因此，作为本发明说明性应用，本发明包括为溶液中ERFAM构建物体外稳定性提供合适的融合蛋白。可以使用融合蛋白来，例如增加ERFAM构建物多肽部分对酶降解作用的抵抗力，和提供改善储藏时间，室温稳定性等等的方法。应当理解，上述注意事项也使用了本发明的ERFAM-构建物血清白蛋白融合蛋白(包括人/人源化ERFAM-构建物血清白蛋白融合蛋白)。

治疗方法

聚合物结合的ERFAM构建物，聚合物结合的ERFAM构建物变异体和短链聚合物结合的ERFAM构建物可以用来治疗或缓解活体动物体，优选哺乳动物体，更优选包括人的灵长类动物体由于响应免疫抑制型活性而引起的不适或疾病症状。优选的症状是治疗患者的不适当的过敏性反应。

产生活性分子的方法

前面叙述了通过噬菌体展示(WO 90/02809)和适体产生(WO92/14843)来生产肽配体的方法。试剂盒(噬菌体及其各自的寡核苷酸基因库)可以从许多公司购得，目前已在研究中广泛应用。

使用ERFAM或IgG4治疗过敏症的方法

在需要治疗的过敏反应过程中或反应之外，对患有IgE-诱导的过敏症的患者施用ERFAM(或过敏原特异性IgG4)。本领域技术人员很容易确定有效的治疗剂量，在这里，将被治疗的病人过敏反应的急剧缓解或消除作为终点。经过合适的时间(例如第二天)，通过对可疑过敏原进行皮肤点刺试验或通过过敏原诱导的嗜碱细胞脱粒(使用体外血)确定ERFAM的过敏原抑制作用。如果过敏反应确实减少了，对过敏原在ERFAM覆盖下用药来诱导免疫耐受力，永久治愈过敏症。

本发明在下面的实施例中进行了进一步的描述，所述实施例不限制权利要求书要求保护的范围。

实施例

下面的实施例通过非限制性例子阐明本发明的不同方面。

实施例1：通过将IgE抗体与IgG4抗体耦合获得ERFAM

从Washington Biotechnology公司(Simpsonville，MD)购得抗IgE的兔类多克隆抗体，按照KJ Dorrington和HH Bennich 1978年在免疫学评论第41卷3-26页发表的文献“人免疫球蛋白E的结构-功能关系”，该抗体通过用GVSAYLSRP SPFDLFIRKSPTITCL(序列号1)免疫处理兔子获得，该肽段代表局限于人的IgE重链序列的Cε3域中的335-359氨基酸残基。使用生物素酰化目标蛋白结合AffinityPak^TM固定化抗生物素蛋白色谱柱(Pierce)将抗体从兔血清中亲和纯化出来，用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)进一步浓缩。用购自Pierce公司的BCA蛋白分析系统确定抗体浓度。人IgG4抗体(从人骨髓瘤细胞中亲和纯化得到)可以购自Sigma公司(编目号I-4683)。用购自Pierce(23456)公司的可控蛋白-蛋白交联试剂盒将两种抗体交联得到ERFAM化合物。

简要地，500微升二甲替甲酰胺加入并溶解于2mg N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代乙酸(SATA)中，然后将28微升(表示超出10倍摩尔量)加入到2ml抗IgE抗体(在PBS-EDTA溶液中浓度为3mg/ml)中，室温下培养30分来增加分子中的巯基基团。然后将5mg盐酸羟胺溶解于100微升结合物缓冲液(从试剂盒中得到)中，加入到SATA修饰的抗IgE抗体中用以在进一步的2小时培养中对潜在的巯基基团脱保护。之后用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)除去未反应的化合物。在磷酸缓冲液(PBS)中用购自Pierce的BCA蛋白分析系统测定巯基活化的抗体的浓度并将浓度调整到2mg/ml。

利用相同试剂盒中的试剂得到的亲和纯化后的人IgG4抗体进行马来酰亚胺活化。将2mg硫代-琥珀酰亚胺酯4-[N-马来酰亚胺甲酰]环己胺-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)溶解于2ml PBS中，然后将10微升(超出10倍摩尔量)加入到500微升人IgG4抗体中(在PBS中为1mg/ml)。培养30分钟后，用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)除去未反应的sulfo-SMCC。马来酰亚胺活化的抗体浓度用购自Pierce的BCA蛋白分析系统测定并将浓度调整到2mg/ml。

将2mg/ml等体积的巯基活化的抗IgE抗体与马来酰亚胺活化的IgG4抗体混合，在室温下培养60分，然后用PBS稀释至10ml，并用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)洗涤。使用BCA蛋白分析试剂盒估计ERFAM浓度并将最终浓度调整为2mg/ml。将ERFAM分装成两份，之后向其中的一份中加入20微升0.5mg/ml的GVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCL(序列号：1)多肽PBS溶液，从而封锁抗IgE抗体结合位点，同时，向另一份中加入等体积的PBS溶液。在使用前，将ERFAM在4℃下储藏至少24小时。

从血液中在Histopaque-1077(购自Sigma公司)层上离心分离外周血单个核细胞。进一步，用磁珠(购自Miltenyi Biotech公司的编目号为130-053-401的嗜碱细胞分离试剂盒)分离多形核嗜碱细胞(PB)。如Kleine等人在Int Arch Allergy Immunol.2001；126(4)：277-85上发表的文献所述，通过在室温条件下，在乳酸缓冲液(13.4mM乳酸，14OmM NaCl，5mM KCl，pH 3.9)中培养3.5分钟来剥去附着在PB上的IgE分子。然后，如Shreffler等人在文献JAllergy Clin Immunol.2004；113(4)：776-82中所述，用有NP-特异性嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基和白细胞介素3(2ng/ml)存在的AIMV细胞无血清培养基培养，对NP激活PB。

外周血单个核细胞重新悬浮(在0.1ml AIM V细胞培养基中悬浮50,000每96孔板的小孔)，在50微升AIM V渗析的NP-特异性嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基(用来对NP激活)和20微升2mg/ml ERFAM溶液(抗IgE-IgG4)或用封闭肽预先培养的等体积的ERFAM溶液存在的条件下培养过夜。

第二天，在每个孔中加入20微升NP-6-牛血清白蛋白(1mg/ml)，在37℃下进一步培养15分钟。收集悬浮物并在-20℃下冷冻用以测量随后的组氨酸释放，同时，将细胞转入5ml FACS试管中用4ml含有1％胎牛血清和0.1％叠碳化钠的磷酸盐缓冲液洗涤。然后将PB染色，如Boumiza等人的文献Clin Exp Allergy.2003；33(2)：259-65所描述的，通过估定活性标记CD203c在细胞表面上的表达来确定PB活性。用抗IgE FITC(荧光探针Serotec STAR96F)，抗-CD203cPE(Immunotech公司IM3575)，含有链亲和素-多甲藻素-氯叶素-蛋白混合物(Becton Dickinson 554064)的抗-MHCII-生物素(Ancell131-O3O)和抗CD45 APC(Becton Dickinson 555485)，在室温下将PB染色30分。之后洗去未结合抗体，用FACS Calibur细胞仪对PB进行流式细胞计数分析。

图2显示的结果证明当肽封闭ERFAM的抑制作用减小时，ERFAM(抗IgE-IgG4)抑制嗜碱细胞活化(表现为IgE+表达CD203c细胞的百分比)。棒状图表示了平均值+三倍测量值标准差。抗IgE-IgG4 ERFAM能够抑制93.95％±0.61％的嗜碱细胞活化作用，如果将ERFAM与抗IgE产生的封闭肽一起预培养，就会失去抑制活性。

实施例2：通过将IgE-结合的寡聚核苷酸与抗FcγR抗体耦合获得 ERFAM

IgE结合的寡聚核苷酸5’-GGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCC-3’(序列号：2)购自MWG Biotech(德国Ebersberg)。通过包含6个碳原子的间隔子将巯基附着在寡聚核苷酸上，引入此巯基基团对5’末端进行修饰。此寡聚核苷酸的IgE结合蛋白已经被Wiegand TW，Williams PB，Dreskin SC，Jouvin MH，KinetJP，Tasset D所著的文献(人类IgE高亲和性寡聚核苷酸配体抑制与Fcε受体的结合)，J Immunol.1996；157(1)：221-30中报道过。

一种亲和纯化的抗人类CD32-B的羊多克隆抗体购自Santa-Cruz生物技术公司(sc-13271)，防止抗人CD32-B抗体与CD32-B结合的相应的封闭肽(编目号SC-13271P)也购自Santa-Cruz生物技术公司。

使用购自Pierce公司(23456)的可控蛋白-蛋白交联试剂盒将两种寡聚核苷酸与抗人CD32-B抗体相交联生产ERFAM化合物。使用相同试剂盒的试剂对亲和纯化后的抗-人CD32-B抗体进行马来酰亚胺胺活化。2mg sulfo-SMCC溶解于2ml PBS中，然后3微升(超过10倍摩尔量)加入到150微升抗人CD32-B抗体(在PBS中1mg/ml)中。培养30分钟，之后用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)除去未反应的sulfo-SMCC。马来酰亚胺活化的抗体浓度用购自Pierce的BCA蛋白分析试剂盒测定，并调整到在PBS溶液中为2mg/ml。

将等体积的2mg/ml的包含巯基的IgE结合寡聚核苷酸与马来酰亚胺活化的抗CD32-B抗体混合，在室温下培养60分，然后用PBS稀释至10ml并用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000洗涤。它们的浓度用购自Pierce的BCA蛋白分析试剂盒测定，并调整到在PBS溶液中为2mg/ml，所得化合物被分成两份。向其中的一份中加入20微升0.5mg/ml的抗CD32-B产生的肽的PBS溶液，从而封闭抗-CD32-B抗体的结合位点，同时，向另一份中加入等体积的PBS溶液。在使用前将ERFAM在4℃下储藏至少24小时。

从血液中在Histopaque-1077(购自Sigma公司)层上离心分离外周血单个核细胞。进一步，用磁珠(购自Miltenyi Biotech公司的编目号为130-053-401的嗜碱细胞分离试剂盒)分离多形核嗜碱细胞(PB)。如Kleine等人在Int Arch Allergy Immunol.2001；126(4)：277-85上发表的文献所述，通过在室温条件下，在乳酸缓冲液(13.4mM乳酸，14OmM NaCl，5mM KCl，pH 3.9)中培养3.5分钟来剥去附着在PB上的IgE分子。然后，如Shreffler等人在文献JAllergy Clin Immunol.2004；113(4)：776-82中所述，用有NP-特异性嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基和白细胞介素3(2ng/ml)存在的AIM V细胞无血清培养基培养，对NP激活PB。

外周血单个核细胞重新悬浮(在0.1ml AIM V细胞培养基中悬浮50,000每96孔板的小孔)，在50微升AIM V渗析的NP-特异性嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基(用来对NP激活)和20微升2mg/mlERFAM溶液(IgE结合寡聚核苷酸-抗-CD32-B)或用封闭肽预先培养的等体积的ERFAM溶液存在的条件下培养过夜。

第二天，在每个孔中加入20微升NP-6-牛血清白蛋白(1mg/ml)，在37℃下进一步培养15分钟。收集悬浮物并在-20℃下冷冻用以测量随后的组氨酸释放，同时，将细胞转入5ml FACS试管中用4ml含有1％胎牛血清和0.1％叠碳化钠的磷酸盐缓冲液洗涤。然后将PB染色，如Boumi.za R，Monneret G，Forissier MF，Savoye J，GutowskiMC，Powell WS，Bienvenu J.等人在文献(通过检测CD203c代替检测CD63显著改进了嗜碱细胞活化作用试验)，Clin Exp Allergy.2003；33(2)：259-65所描述的，通过估定活性标记CD203c在细胞表面上的表达来确定PB活性。用抗IgE FITC(荧光探针Serotec STAR96F)，抗-CD203c PE(Immunotech公司IM3575)，含有链亲和素-多甲藻素-氯叶素-蛋白混合物(Becton Dickinson 554064)的抗-MHCII-生物素(Ancell131-O3O)和抗CD45 APC(Becton Dickinson 555485)，在室温下将PB染色30分。之后洗去未结合抗体，用FACS Calibur细胞仪对PB进行流式细胞计数分析。

图2显示的结果证明当肽封闭ERFAM的抑制作用减小时，ERFAM(IgE-结合寡聚核苷酸-抗-CD32-B)抑制嗜碱细胞活化(表现为IgE+表达CD203c细胞的百分比)。棒状图表示了平均值+三倍测量值标准差。IgE-结合寡聚核苷酸-抗-CD32-B ERFAM能够抑制95.79％±0.51％的嗜碱细胞活化作用，如果将ERFAM与抗CD32-B抗体产生的封闭肽一起预培养，抑制活性会降低到34.88％±1.98％。

实施例3：通过将抗IgE抗体与抗FcγR抗体通过聚乙二醇耦合获得 ERFAM

从Washington Biotechnology公司(Simpsonville，MD)可以购得抗IgE的兔类多克隆抗体，按照KJ Dorrington和HH Bennich 1978年在免疫学评论第41卷3-26页发表的文献“人免疫球蛋白E的结构-功能关系”，该抗体通过用GVSAYLSRP SPFDLFIRKSPTITCL(序列号1)免疫处理兔子获得，该肽段代表局限于人的IgE重链序列的Cε3域中的335-359氨基酸残基。使用生物素酰化目标蛋白(Sigma-Genosys公司合成)结合AffinityPak^TM固定化抗生物素蛋白色谱柱(Pierce)将抗体从兔血清中亲和纯化出来，用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)进一步浓缩。用购自Pierce公司的BCA蛋白分析系统确定抗体浓度。一种亲和纯化的抗人类CD32-B的羊多克隆抗体购自Santa-Cruz生物技术公司(sc-13271)，防止抗人CD32-B抗体与CD32-B结合的相应的封闭肽(编目号SC-13271P)也购自Santa-Cruz生物技术公司。

通过使用购自Pierce(23456)的可控蛋白-蛋白交联试剂盒将抗IgE抗体与抗人CD32-B抗体交联生产ERFAM化合物。向交联的抗体中加入活化的聚乙二醇(分子量20,000道尔顿)用以产生具有附加生物性质(免疫原性较小，在循环过程中有较长的半衰期)的分子。

最初，用相同试剂盒中的试剂将亲和纯化后的CD32-B抗体进行马来酰亚胺活化。将2mg硫代-琥珀酰亚胺酯4-[N-马来酰亚胺甲酰]环己胺-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)溶解于2ml PBS中，然后将3微升(超出10倍摩尔量)加入到150微升抗人CD32-B抗体(在PBS中为1mg/ml)中。培养30分钟后，用Sartorius浓缩仪(MWCO100,000)除去未反应的sulfo-SMCC。马来酰亚胺活化的抗体浓度用购自Pierce的BCA蛋白分析试剂盒测定并将浓度调整到在PBS中为2mg/ml。

将等体积的2mg/ml包含巯基的抗-IgE抗体和马来酰亚胺活化的抗CD-32-B抗体混合，在室温下培养60分，然后用10mM pH为8.5的硼酸缓冲液稀释至10ml，用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)洗涤。用购自Pierce的BCA蛋白分析系统测定它们的浓度并将浓度调整到2mg/ml。按照Beauchamp CO，Gonias SL，Menapace DP，PizzoSV 1983年发表在Anal Biochem，131(1)：25-33的文献“一种合成聚乙二醇-蛋白加合物的新工艺；对功能的作用，受体识别，和过氧化物歧化酶，乳铁传递蛋白和α-2-巨球蛋白的消除”所述的方法将聚乙二醇(PEG，Fluka公司购得，编目号95172)活化。简要地，通过加热到37℃将PEG溶解在二氧杂环乙烷(Sigma Aldrich公司购得，编目号27，053-9)中，终浓度为50mM，然后向其中加入1，1’-羰基二咪唑(Fluka公司购得，编目号21860)终浓度为0.5M。在37℃下将混合物水浴摇床培养2h，然后用购自NBS-Biologicals(编目号X-I 1S-100)的MicroKros透析分离系统，先后用2 x 100ml PBS和2 x 100ml 10mM，pH 8.5的硼酸钠缓冲液将混合物析出。将0.1mlERFAM和0.1ml活化PEG(两种聚合物都溶解于10mM，pH 8.5的硼酸钠缓冲液中)混合并在4℃下培养48h。使用Slide-a-Lyzer迷你透析分离系统(MWCO 3,500道尔顿，购自Pierce公司，编目号69550)将缓冲液用PBS(2 x 50ml，每次透析循环6h)置换出来，然后，将聚乙二醇化的ERFAM分成两份。向其中的一份中加入20微升0.5mg/ml的抗CD32-B抗体生产肽的PBS溶液用来封闭抗CD32-B的结合位点，同时，向另一份中加入等体积的PBS。在使用前将ERFAM在4℃下至少储存24小时。

从血液中在Histopaque-1077(购自Sigma公司C-8889)层上离心分离外周血单个核细胞。进一步，用磁珠(购自Miltenyi Biotech公司的编目号为130-053-401的嗜碱细胞分离试剂盒)分离多形核嗜碱细胞(PB)。

如Kleine Budde I，de Heer PG，van der Zee JS，Aalberse RC在文献“剥离的嗜碱细胞组氨酸释放生物分析系统作为检测血清中过敏原特异性IgE的工具”Int Arch Allergy Immunol.2001；126(4)：277-85中所述，通过在室温条件下，在乳酸缓冲液(13.4mM乳酸，14OmMNaCl，5mM KCl，pH 3.9)中培养3.5分钟来剥去附着在PB上的IgE分子。然后，如Shreffler WG，Beyer K，Chu TH，Burks AW，SampsonHA在文献“微阵列免疫测定：临床历史，体外IgE功能和引起过敏原的花生抗原决定基的结合”J Allergy Clin Immunol.2004；113(4)：776-82中所述，用有NP-特异性嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基和白细胞介素3(2ng/ml)存在的AIM V细胞无血清培养基培养，对NP激活PB。

外周血单个核细胞重新悬浮(在0.1ml AIM V细胞培养基中悬浮50,000每96孔板的小孔)，在50微升AIM V渗析的NP-特异性嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基(用来对NP激活)和20微升2mg/ml ERFAM溶液(抗IgE抗体-PEG-抗-CD32-B)或用封闭肽预先培养的等体积的ERFAM溶液存在的条件下培养过夜。

第二天，在每个孔中加入20微升NP-6-牛血清白蛋白(1mg/ml)，在37℃下进一步培养15分钟。收集悬浮物并在-20℃下冷冻用以测量随后的组氨酸释放，同时，将细胞转入5ml FACS试管中用4ml含有1％胎牛血清和0.1％叠碳化钠的磷酸盐缓冲液洗涤。然后将PB染色，如Boumi.za R，Monneret G，Forissier MF，Savoye J，GutowskiMC，Powell WS，Bienvenu J.等人在文献(通过检测CD203c代替检测CD63显著改进了嗜碱细胞活化作用试验)，Clin Exp Allergy.2003；33(2)：259-65所描述的，通过估定活性标记CD203c在细胞表面上的表达来确定PB活性。用抗IgE FITC(荧光探针Serotec STAR96F)，抗-CD203c PE(Immunotech公司IM3575)，含有链亲和素-多甲藻素-氯叶素-蛋白混合物(Becton Dic kinson 554064)的抗-MHCII-生物素(Ancell131-O3O)和抗CD45 APC(Becton Dickinson 555485)，在室温下将PB染色30分。之后洗去未结合抗体，用FACS Calibur细胞仪对PB进行流式细胞计数分析。

图2显示的结果证明当肽封闭ERFAM的抑制作用减小时，ERFAM(抗IgE抗体-PEG-抗-CD32-B)抑制嗜碱细胞活化(表现为IgE+表达CD203c细胞的百分比)。棒状图表示了平均值+三倍测量值标准差。抗IgE抗体-PEG-抗-CD32-B ERFAM能够抑制95.2％±0.68％的嗜碱细胞活化作用，如果将ERFAM与抗CD32-B抗体产生的封闭肽一起预培养，会使其失去抑制活性。

实施例4：通过将IgE结合成分(抗-IgE或其片段，多肽或寡聚核 苷酸)与抗-FcγR抗体(或它的Fab片段)耦合获得ERFAM。

从Washington Biotechnology公司(Simpsonville，MD)可以购得抗IgE的兔类多克隆抗体，按照KJ Dorrington和HH Bennich 1978年在免疫学评论第41卷3-26页发表的文献“人免疫球蛋白E的结构-功能关系”，该抗体通过用GVSAYLSRP SPFDLFIRKSPTITCL(序列号1)免疫处理兔子获得，该肽段代表局限于人的IgE重链序列的Cε3域中的335-359氨基酸残基。使用生物素酰化目标蛋白(Sigma-Genosys公司合成)结合AffinityPak^TM固定化抗生物素蛋白色谱柱(Pierce)将抗体从兔血清中亲和纯化出来，用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)进一步浓缩。用购自Pierce公司的BCA蛋白分析系统确定抗体浓度。一种亲和纯化的抗人类CD32-B的羊多克隆抗体购自Santa-Cruz生物技术公司(sc-13271)。使用购自Pierce公司的可控蛋白-蛋白交联试剂盒将两种抗体交联制备ERFAM化合物。

简要地，500微升二甲替甲酰胺加入并溶解于2mg N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代乙酸(SATA)中，然后将28微升(表示超出10倍摩尔量)加入到2ml抗IgE抗体(在PBS-EDTA溶液中浓度为3mg/ml)中，室温下培养30分来增加分子中的巯基基团。然后将5mg盐酸羟胺溶解于100微升结合物缓冲液(从试剂盒中得到)中，加入到SATA修饰的抗IgE抗体中用以在进一步的2小时培养中对潜在的巯基基团脱保护。之后用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)除去未反应的化合物。在磷酸缓冲液(PBS)中用购自Pierce的BCA蛋白分析系统测定巯基活化的抗体的浓度并将浓度调整到2mg/ml。

利用相同试剂盒中的试剂得到的亲和纯化后的抗人CD32-B抗体进行马来酰亚胺活化。将2mg硫代-琥珀酰亚胺酯4-[N-马来酰亚胺甲酰]环己胺-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)溶解于2ml PBS中，然后将3微升(超出10倍摩尔量)加入到150微升抗人CD32-B抗体中(在PBS中为1mg/ml)。培养30分钟后，用Sartorius浓缩仪(MWCO100,000)除去未反应的sulfo-SMCC。马来酰亚胺活化的抗体浓度用购自Pierce的BCA蛋白分析系统测定并将浓度调整到2mg/ml。

等体积的2mg/ml巯基活化的抗IgE抗体和马来酰亚胺活化的抗-CD32-B抗体混合并在室温下培养60分，然后将所得化合物分成两份。向其中的一份中加入20微升0.5mg/ml的GVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCL(序列号：1)的肽段的PBS溶液，用来封闭抗IgE抗体的结合位点，同时，向另一份中加入等体积的PBS溶液。在使用前将ERFAM在4℃下至少储存24小时。

从血液中在Histopaque-1077(购自Sigma公司C-8889)层上离心分离外周血单个核细胞。进一步，用磁珠(购自Miltenyi Biotech公司的编目号为130-053-401的嗜碱细胞分离试剂盒)分离多形核嗜碱细胞(PB)。

在乳酸缓冲液中(13.4mM乳酸，140mM NaCl，5mM KCl，pH3.9)室温条件下培养3.5分钟剥离附着在PB上的IgE分子。外周血单个核细胞重新悬浮(在0.1ml AIM V细胞培养基中悬浮50,000每96孔板的小孔)，在50微升AIM V渗析的NP-特异性嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基(用来对NP激活)和20微升2mg/mlERFAM溶液(抗IgE*-抗-CD32-B)或用封闭肽预先培养的等体积的ERFAM溶液存在的条件下培养过夜。

第二天，在每个孔中加入20微升NP-6-牛血清白蛋白(1mg/ml)，在37℃下进一步培养15分钟。收集悬浮物并在-20℃下冷冻用以测量随后的组氨酸释放，同时，将细胞转入5ml FACS试管中用4ml含有1％胎牛血清和0.1％叠碳化钠的磷酸盐缓冲液洗涤。用抗IgEFITC(荧光探针Serotec STAR96F)，抗-CD203c PE(Immunotech公司IM3575)，含有链亲和素-多甲藻素-氯叶素-蛋白混合物(BectonDickinson 554064)的抗-MHCII-生物素(Ancell 131-O3O)和抗CD45APC(Becton Dickinson 555485)，在室温下将PB染色30分。之后洗去未结合抗体，用FACS Calibur细胞仪对PB进行流式细胞计数分析。

图3显示的结果证明当肽封闭ERFAM的抑制作用减小时，ERFAM(抗IgE任选连接抗-CD32-B)抑制嗜碱细胞活化(表现为IgE+表达CD203c细胞的百分比)。棒状图表示了平均值+三倍测量值标准差。

实施例5：用也能引起过敏抑制作用的过敏原特异性IgG4抗体替代 ERFAM-等价物。

用亲和色谱柱，例如购自Amersham Biosciences(Little Chalfont，英国，编目号#17-0716-01)的HiTrap NHS-activated HP色谱柱，用购自Sigma-Aldrich公司(Poole，英国)的抗人IgG4抗体将过敏原特异性IgG4从血浆中分离出来。之后，将经过洗堤的IgG4加入到IgE激活的嗜碱细胞中，使用上述方法确定过敏原特异性IgG4限制IgE调节的嗜碱细胞脱粒的能力。

实施例6：通过将IgE结合化合物(抗-IgE或其片断，多肽或寡聚 核苷酸)与抗CD31抗体或其Fab片断耦合得到ERFAM。

从Washington Biotechnology公司(Simpsonville，MD)可以购得抗IgE的兔类多克隆抗体，按照KJ Dorrington和HH Bennich 1978年在免疫学评论第41卷3-26页发表的文献“人免疫球蛋白E的结构-功能关系”，该抗体通过用GVSAYLSRP SPFDLFIRKSPTITCL(序列号1)免疫处理兔子获得，该肽段代表局限于人的IgE重链序列的Cε3域中的335-359氨基酸残基。使用生物素酰化目标蛋白(Sigma-Genosys公司合成)结合AffinityPak^TM固定化抗生物素蛋白色谱柱(Pierce)将抗体从兔血清中亲和纯化出来，用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)进一步浓缩。用购自Pierce公司的BCA蛋白分析系统确定抗体浓度。一种亲和纯化的抗人类CD31多克隆抗体购自Serotec公司(MCA 1738)。使用购自Pierce公司的可控蛋白-蛋白交联试剂盒将两种抗体交联制备ERFAM化合物。

简要地，500微升二甲替甲酰胺加入并溶解于2mg N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代乙酸(SATA)中，然后将28微升(表示超出10倍摩尔量)加入到2ml抗IgE抗体(在PBS-EDTA溶液中浓度为3mg/ml)中，室温下培养30分来增加分子中的巯基基团。然后将5mg盐酸羟胺溶解于100微升结合物缓冲液(从试剂盒中得到)中，加入到SATA修饰的抗IgE抗体中用以在进一步的2小时培养中对潜在的巯基基团脱保护。之后用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)除去未反应的化合物。在磷酸缓冲液(PBS)中用购自Pierce的BCA蛋白分析系统测定巯基活化的抗体的浓度并将浓度调整到2mg/ml。

利用相同试剂盒中的试剂得到的亲和纯化后的抗人CD31抗体进行马来酰亚胺活化。将2mg硫代-琥珀酰亚胺酯4-[N-马来酰亚胺甲酰]环己胺-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)溶解于2ml PBS中，然后将3微升(超出10倍摩尔量)加入到150微升抗人CD32-B抗体中(在PBS中为1mg/ml)。培养30分钟后，用Sartorius浓缩仪(MWCO100,000)除去未反应的sulfo-SMCC。马来酰亚胺活化的抗体浓度用购自Pierce的BCA蛋白分析系统测定并将浓度调整到2mg/ml。

等体积的2mg/ml巯基活化的抗IgE抗体和马来酰亚胺活化的抗-CD32-B抗体混合并在室温下培养60分，然后将所得化合物分成两份。然后向其中的一份中加入20微升0.5mg/ml的GVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCL(序列号：1)的肽段的PBS溶液，用来封闭抗IgE抗体的结合位点，同时，向另一份中加入等体积的PBS溶液。在使用前将ERFAM在4℃下至少储存24小时。

从血液中在Histopaque-1077(购自Sigma公司C-8889)层上离心分离外周血单个核细胞。进一步，用磁珠(购自Miltenyi Biotech公司的编目号为130-053-401的嗜碱细胞分离试剂盒)分离多形核嗜碱细胞(PB)。

在乳酸缓冲液中(13.4mM乳酸，14OmM NaCl，5mM KCl，pH3.9)室温条件下培养3.5分钟剥离附着在PB上的IgE分子。外周血单个核细胞重新悬浮(在0.1ml AIM V细胞培养基中悬浮50,000每96孔板的小孔)，在50微升AIM V渗析的NP-特异性嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基(用来对NP激活)和20微升2mg/mlERFAM溶液(抗IgE抗体-抗-CD31)或用封闭肽预先培养的等体积的ERFAM溶液存在的条件下培养过夜。

第二天，在每个孔中加入20微升NP-6-牛血清白蛋白(1mg/ml)，在37℃下进一步培养15分钟。收集悬浮物并在-20℃下冷冻用以测量随后的组氨酸释放，同时，将细胞转入5ml FACS试管中用4ml含有1％胎牛血清和0.1％叠碳化钠的磷酸盐缓冲液洗涤。用抗IgEFITC(荧光探针Serotec STAR96F)，抗-CD203c PE(Immunotech公司IM3575)，含有链亲和素-多甲藻素-氯叶素-蛋白混合物(BectonDickinson 554064)的抗-MHCII-生物素(Ancell 131-O3O)和抗CD45APC(Becton Dickinson 555485)，在室温下将PB染色30分。之后洗去未结合抗体，用FACS Calibur细胞仪对PB进行流式细胞计数分析。

图3显示的结果证明当肽封闭ERFAM的抑制作用减小时，ERFAM(抗IgE-抗CD31)抑制嗜碱细胞活化(表现为IgE+表达CD203c细胞的百分比)。棒状图表示了平均值+三倍测量值标准差。

实施例7：通过将IgE结合化合物(抗-IgE或其片断，多肽或寡聚 核苷酸)与抗-抗FcγR抗体或其Fab片断耦合获得的ERFAM与另一 种通过将IgE结合化合物(抗-IgE或其片断，多肽或寡聚核苷酸) 与抗CD31抗体或其Fab片断耦合获得的ERFAM混合所得混合物 的作用。

使用上述方法制备抗IgE-抗-CD32B和抗IgE-抗-CD31两种ERFAM分子。为了测试它们，向PB中分别加入20微升，估计所得抑制效果。

实施例8：通过将抗IgE抗体与抗FcγR抗体的Fab片段耦合获 得ERFAM。

从Washington Biotechnology公司(Simpsonville，MD)可以购得抗IgE的兔类多克隆抗体，按照KJ Dorrington和HH Bennich 1978年在免疫学评论第41卷3-26页发表的文献“人免疫球蛋白E的结构-功能关系”，该抗体通过用GVSAYLSRP SPFDLFIRKSPTITCL免疫处理兔子获得，该肽段代表局限于人的IgE重链序列的Cε3域中的335-359氨基酸残基。使用生物素酰化目标蛋白(Sigma-Genosys公司合成)结合AffinityPak^TM固定化抗生物素蛋白色谱柱(Pierce)将抗体从兔血清中亲和纯化出来，用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)进一步浓缩。用购自Pierce公司的BCA蛋白分析系统确定抗体浓度。从Santa-Cruz生物技术公司购买亲和纯化后的抗人CD32-B羊多克隆抗体(sc-13271)。在购自Pierce公司的(catalogue number 44885)ImmunoPure Fab制备试剂盒中用木瓜蛋白酶消化此抗体。简要地，将42mg半胱胺酸盐酸盐溶解于12ml pH为10的磷酸缓冲液中(两种试剂都来自试剂盒)制备12ml消化缓冲液。将0.2ml木瓜蛋白酶浆倒入1.5ml Eppendorf试管中，用1ml消化缓冲液洗涤3次(1000g下离心30秒)。移出缓冲液，加入100微升抗CD32B和100微升缓冲液。在37℃下摇床水浴培养Eppendorf，然后再次离心，收集包含被消化抗体的悬浮物。将此悬浮物转入另一个1.5ml Eppendorf试管中与0.2ml固定化蛋白A(从购自Pierce公司，编目号为44667的Immunopure Protein A抗体纯化试剂盒中得到)混合，室温下进一步培养30分。通过离心收集包含Fab片段的悬浮物，在购自Pierce公司的(编目号69550)的Slide-a-Lyzer MicroDialysis unit中用2x50mlPBS渗析，每次6小时。所得Fab溶液用Slide-a-Lyzer浓缩仪(Pierce公司，编目号66528)浓缩。最后Fab的浓度用购自Pierce公司(编目号为23225)的BCA分析仪测定，并用pH 7.4的PBS调整到0.5mg/ml。

用购自Pierce(23456)公司的可控蛋白-蛋白交联试剂盒将抗体与Fab片段交联得到ERFAM化合物。

简要地，500微升二甲替甲酰胺加入并溶解于2mg N-琥珀酰亚胺S-乙酰硫代乙酸(SATA)中，然后将28微升(表示超出10倍摩尔量)加入到2ml抗IgE抗体(在PBS-EDTA溶液中浓度为3mg/ml)中，室温下培养30分来增加分子中的巯基基团。然后将5mg盐酸羟胺溶解于100微升结合物缓冲液(从试剂盒中得到)中，加入到SATA修饰的抗IgE抗体中用以在进一步的2小时培养中对潜在的巯基基团脱保护。之后用Sartorius浓缩仪(MWCO 100,000)除去未反应的化合物。在磷酸缓冲液(PBS)中用购自Pierce的BCA蛋白分析系统测定巯基活化的抗体的浓度并在PBS中将浓度调整到2mg/ml。

利用相同试剂盒中的试剂对抗人CD32-B抗体的Fab片段进行马来酰亚胺活化。将2mg硫代-琥珀酰亚胺酯4-[N-马来酰亚胺甲酰]环己胺-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)溶解于2ml PBS中，然后将2微升(超出10倍摩尔量)加入到50微升抗人CD32-B抗体中(在PBS中为0.5mg/ml)。培养30分钟后，用购自Pierce公司的(编目号69550)的Slide-a-Lyzer MicroDialysis unit除去未反应的sulfo-SMCC。

将等体积的0.5mg/ml巯基活化的抗IgE抗体与马来酰亚胺活化的抗人CD32-B抗体的Fab片段混合，在室温下培养60分，然后将所得化合物分装成两份，之后向其中的一份中加入20微升0.5mg/ml的GVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITCL(序列号：1)多肽PBS溶液，从而封锁抗IgE抗体结合位点，同时，向另一份中加入等体积的PBS溶液。在使用前，将ERFAM在4℃下储藏至少24小时。

从血液中在Histopaque-1077(购自Sigma公司C-8889)层上离心分离外周血单个和细胞。进一步，用磁珠(购自Miltenyi Biotech公司的编目号为130-053-401的嗜碱细胞分离试剂盒)分离多形核嗜碱细胞(PB)。

通过在室温条件下，在乳酸缓冲液(13.4mM乳酸，14OmM NaCl，5mM KCl，pH 3.9)中培养3.5分钟来剥去附着在PB上的IgE分子。外周血单个核细胞重新悬浮(在0.1ml AIM V细胞培养基中悬浮50,000每96孔板的小孔)，在50微升AIM V渗析的NP-特异性嵌合IgE抗体包含细胞悬浮培养基(用来对NP激活)和20微升2mg/ml ERFAM溶液(抗IgE结合抗人CD32-B抗体的Fab片段)或用封闭肽预先培养的等体积的ERFAM溶液存在的条件下培养过夜。

第二天，在每个孔中加入20微升NP-6-牛血清白蛋白(1mg/ml)，在37℃下进一步培养15分钟。收集悬浮物并在-20℃下冷冻用以测量随后的组氨酸释放，同时，将细胞转入5ml FACS试管中用4ml含有1％胎牛血清和0.1％叠碳化钠的磷酸盐缓冲液洗涤。然后用抗IgE FITC(荧光探针Serotec STAR96F)，抗-CD203c PE(Immunotech公司IM3575)，含有链亲和素-多甲藻素-氯叶素-蛋白混合物(BectonDickinson 554064)的抗-MHCII-生物素(Ancell 131-O3O)和抗CD45APC(Becton Dickinson 555485)，在室温下将PB染色30分。之后洗去未结合抗体，用FACS Calibur细胞仪对PB进行流式细胞计数分析。

图4显示的结果证明当肽封闭ERFAM的抑制作用减小时，ERFAM(抗IgE结合抗人CD32-B抗体的Fab片段)抑制嗜碱细胞活化(表现为IgE+表达CD203c细胞的百分比)。棒状图表示了平均值+三倍测量值标准差。IgE-结合寡聚核苷酸-抗-CD32-B ERFAM能够抑制87.38％±1.55％的嗜碱细胞活化作用，如果将ERFAM与抗IgE产生的封闭肽一起预培养，抑制活性会降低到30.89％±2.42％。

等同物

尽管这里详细的公开了具体的实施方案，但是通过实施例公开的实施方案只是以说明为目的的，并不限制公开发明的实现方式或所附权利要求书所要求保护的范围。特别地，发明人已经考虑了，在不背离本发明权利要求书的精神和权利要求书所定义的范围的情况下，本发明有多种不同的代替，改变和修饰。具有实施方案所述知识的本领域普通技术人员应该相信多种改变或修饰只是一种常规的实现方式。本发明的其他方面，有点和改进应被认为包括在所附权利要求保护的范围内。

Claims (24)

1.一种组合物，其包括分子式为A’-B’的IgE重定位、功能性改变分子(ERFAM)，其中：

A’代表结合IgE的部分；和

B’代表结合抑制性受体的部分，

其中，A’可操作地连接B’。

2.如权利要求1所述的组合物，进一步包括可操作的连接A’和B’的连接体部分。

3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物存在于包括所述IgE，所述ERFAM和所述抑制性受体的多体组合物中。

4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述B’与结合IgG4抗体Fc部分的抗原连接。

5.如权利要求1所述的组合物，其中，B’是IgG4的同型抗体。

6.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物不与结合细胞的IgE交联。

7.如权利要求2所述的组合物，其中，所述连接体包括聚乙二醇连接体。

8.如权利要求2所述的组合物，其中，所述ERFAM与不包括所述连接体的ERFAM相比，有延长的循环半衰期或减少的免疫原性。

9.如权利要求1所述的组合物，其中，B’结合的受体选自由包含免疫受体酪氨酸依赖的抑制型基序(ITIM)的受体和凋亡诱导受体组成的组。

10.如权利要求9所述的组合物，其中所述(ITIM)包含受体存在于选自由嗜碱细胞，肥大细胞，B细胞，血小板和抗原存在细胞所组成的组的细胞表面。

11.如权利要求9所述的组合物，其中所述包含(ITIM)的受体是CD31或CD32B。

12.如权利要求1所述组合物，其中A’或B’包括能够通过与IgE结合而线性化的环肽。

13.如权利要求1所述组合物，进一步包括药用载体。

14.包括权利要求1所述组合物的试剂盒。

15.分子式为A’-B’的组合物，其中：

A’包括抗IgE抗体或它们的抗IgE结合片段；和

B’包括结合包含(ITIM)的受体的抗体，

其中，A’可操作地连接B’.

16.如权利要求15所述组合物，进一步包括一种可操作地连接A’和B’的连接体。

17.如权利要求15所述组合物，其中所述包含(ITIM)的受体是CD31或CD32B。

18.治疗患有敏症的患者的方法，包括对所述患者施用治疗有效剂量的分子式为A’-B’的ERFAM分子，其中：

A’包括结合IgE的部分；和

B’包括结合抑制性受体的部分，

其中，A’可操作地连接B’，因此治疗患有所述过敏症的患者。

19.如权利要求18所述方法，其中A’包括一种抗IgE抗体或其抗IgE抗体结合片段，B’包括与包含(ITIM)的受体结合的抗体。

20.如权利要求18所述方法，其中ERFAM分子包括过敏原特异性IgG4抗体。

21.如权利要求18所述组合物，进一步包括可操作地连接A’和B’的连接体部分。

22.预防或减轻患者过敏反应的方法，包括在患者暴露于过敏原之前或同时，对患者施用有效剂量的分子式为A’-B’的ERFAM分子，其中：

A’包括结合IgE的部分；和

B’包括结合抑制性受体的部分，

其中，A’可操作地连接B’，从而预防或减轻所述患者的过敏性反应。

23.如权利要求22所述方法，其中A’包括抗IgE抗体或其抗IgE结合片段，和B’包括与包含(ITIM)的受体结合的抗体。

24.如权利要求22所述组合物，进一步包括可操作地连接A’和B’的连接体部分。

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