CN103145832B - 一种头孢类药物通用人工抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种头孢类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以头孢类抗生素的中间体7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸为半抗原，用二琥珀酰亚胺基辛二酸盐DSS法将其与载体蛋白血蓝蛋白KLH偶联，透析，用紫外分光光度法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了头孢类药物通用人工抗原7-ADCA-DSS-KLH，本发明通过紫外光谱扫描和免疫动物的方法，证实了人工抗原的成功合成。合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了必需的头孢类药物通用人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。
Description
技术领域
一种头孢类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸,英文名:7-Aminodesacetoxycephalosporanicacid（7-ADCA），CAS号：151767-02-1，分子式为C8H10N2O3S。头孢菌素类抗生素是分子中含有头孢烯的半合成抗生素，属于β-内酰胺类抗生素。7-ADCA是β-内酰胺类抗生素中的7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的衍生物，因此它们具有相似的杀菌机制。本类药可破坏细菌的细胞壁，并在繁殖期杀菌。对细菌的选择作用强，而对人几乎没有毒性，具有抗菌谱广、抗菌作用强、耐头孢酶、过敏反应较头孢类少见等优点。所以是一类高效、低毒、临床广泛应用的重要抗生素。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残留,给人类健康带来严重危害,如产生过敏反应、破坏胃肠道菌群平衡和增强细菌耐药性导致免疫力下降及给动物源性食品生产加工带来不可估计的损失。尤其该类抗生素在乳制品中的残留引起了国内外的高度重视。头孢类抗生素种类繁多，现有的微生物检测法和仪器检测法很难实现对所有头孢类抗生素进行快速、准确的检测，有必要研究快速、便携的免疫检测技术—胶体金免疫技术。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原。目前为止，国内尚没有针对头孢类抗生素的免疫检测方法的报道，为了弥补这一空白，设计合成了以头孢类抗生素的中间体7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸为半抗原的用于头孢类抗生素检测的人工抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种头孢类药物通用人工抗原的合成方法。所制备的产品用于头孢类抗生素的免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。
本发明的技术方案：一种头孢类药物通用人工抗原的合成方法，以头孢类抗生素的中间体7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)为半抗原，用二琥珀酰亚胺基辛二酸盐(DSS)将其与载体蛋白血蓝蛋白KLH偶联，透析，经紫外鉴定偶联成功，用紫外分光光度法测定偶联物的偶联比，制得头孢类药物通用人工抗原7-ADCA-DSS-KLH。其反应方程式为：
工艺步骤为：
（1）偶联
按KLH︰7-ADCA︰DSS=1:3000:4500的摩尔比秤取相应的药品，DSS预先溶解在无水DMF中得到A液；将7-ADCA和KLH用0.01M HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）溶解，搅拌5min使两者充分溶解得到B液；然后将A液逐滴滴入B液中，4℃下反应1.5h，得人工抗原混合液。
（2）透析
透析袋前处理：取15cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用每次2L的生理盐水溶液透析2次，再用每次2L的去离子水透析2次，共透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，得到头孢类药物通用人工抗原7-ADCA-DSS-KLH。
（3）头孢类药物通用人工抗原7-ADCA-DSS-KLH的鉴定
a：蛋白含量的测定
采用考马斯亮蓝染色法测定偶联物蛋白含量。取适量KLH，用纯水配制成1mg／mL蛋白溶液，按比例稀释，使蛋白浓度分别为0μg／mL、50μg／mL、100μg／mL、150μg／mL、200μg／mL、250μg／mL、300μg／mL、400μg／mL。
加入一定量预先配制好的考马斯亮蓝试剂，反应5min。在595nm处测吸光值，绘制标准曲线。
取待测偶联物溶液，稀释后加入等量考马斯亮蓝试剂，使其在595nm处的吸光值位于标准曲线量程内。根据所测吸光值，由标准曲线计算出其相当于标准蛋白的量。
b：偶联比的计算
紫外分光光度法：分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度．在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
配制7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)浓度为0，10，20，30mg/mL的超纯水溶液，通过紫外扫描可知7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的最大吸收波长为262nm，KLH的最大吸收波长为278nm，分别在262nm、278nm处测其吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为：εA=吸光值／摩尔浓度。
配制KLH浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg／mL的超纯水溶液，通过紫外扫描可知KLH的最大吸收波长为278nm，分别在278nm、262nm测吸光值，每个浓度做平行样。
将偶联产物7-ADCA-DSS-KLH用超纯水稀释到浓度为150μg/mL，测262nm、278nm波长处的吸光值，以超纯水作空白对照，测出的吸光值在262nm处的吸光值为A1，278nm处的吸光值为A2，偶联物中7-ADCA的摩尔数为Ca，蛋白的摩尔数为Cb，通过公式Ca／Cb=(A1×εB278-A2×εB262)／(A2×εA262-A1×εA278)计算其偶联比。本实验计算得人工抗原7-ADCA-DSS-KLH溶液的偶联比为17:1。本实验计算得人工抗原7-ADCA-DSS-KLH溶液的蛋白浓度为5.32mg/mL。
本发明的有益效果：本发明成功合成了7-ADCA的人工抗原，合成步骤简洁，有效，可完全用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
附图说明
图1 7-ADCA、KLH及其偶联物7-ADCA-DSS-KLH的紫外图。
具体实施方式
实施例1
（1）偶联
按KLH︰7-ADCA︰DSS=1:3000:4500的摩尔比称取相应的药品，DSS预先溶解在无水DMF中得到A液；将7-ADCA和KLH用0.01M HEPES溶解，搅拌5min使两者充分溶解得到B液；然后将A液逐滴滴入B液中，4℃下反应1.5h，得人工抗原混合液。
（2）透析
透析袋前处理：取15cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的生理盐水溶液和2×2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到头孢类药物通用人工抗原7-ADCA-DSS-KLH。
（3）头孢类药物通用人工抗原7-ADCA-DSS-KLH的鉴定
a：蛋白含量的测定：
采用考马斯亮蓝染色法测定偶联物蛋白含量。取适量KLH，用纯水配制成lmg／mL蛋白溶液，按比例稀释，使蛋白浓度分别为0μg／mL、50μg／mL、100μg／mL、150μg／mL、200μg／mL、250μg／mL、300μg／mL、400μg／mL。
加入一定量预先配制好的考马斯亮蓝试剂，反应5min。在595nm处测吸光值，绘制标准曲线。
取待测偶联物溶液，稀释后加入等量考马斯亮蓝试剂，使其在595nm处的吸光值位于标准曲线量程内。根据所测吸光值，由标准曲线计算出其相当于标准蛋白的量。
b：偶联比的计算：
紫外分光光度法：分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度．在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
配制7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)浓度为0，10，20，30mg/mL的超纯水溶液，通过紫外扫描可知7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的最大吸收波长为262nm，KLH的最大吸收波长为278nm，分别在262nm、278nm处测其吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为：εA=吸光值／摩尔浓度。配制KLH浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg／mL的超纯水溶液，通过紫外扫描可知KLH的最大吸收波长为278nln，分别在278nm、262nm测吸光值，每个浓度做平行样。
将偶联产物7-ADCA-DSS-KLH用超纯水稀释到150μg/mL，测262nm、278nm波长处的吸光值，以超纯水作空白对照，测出的吸光值为A1，A2，通过公式Ca／Cb=(A1*εB278-A2*εB262)／(A2*εA262-A1*εA278)计算其偶联结合比。本实验计算得抗原溶液的偶联比为17:1。
（4）免疫小鼠产生了头孢类抗生素的抗体
用此人工抗原作免疫原100μg或50μL与50μL弗氏完全佐剂乳化后皮下注射每只10周龄BALB／C雄性小鼠，稀释抗原的溶液为生理盐水，每隔20天后进行加强免疫。皮下注射50μg／50μL抗原(与弗氏不完全佐剂乳化)。免疫四次后对小鼠采取断尾取血，并离心取血清。抗血清测定方法采用ELISA酶标仪法。
测定抗原效价比：将一定数量的头孢氨苄-OVA溶解在0.01M、pH7.5的HEPES缓冲液中,配成头孢氨苄-OVA浓度依次为0.16μg/mL、0.08μg/mL、0.02μg/mL、0.01μg/mL，然后取100μL依次加入每条12孔的酶标板上的1到4条的孔中，即一条上的每个孔中的溶液浓度相同，不同条上的浓度递减。37℃孵育2h后，取出用0.5%Tween-20的PBS缓冲液（0.01M、pH7.5）洗涤三次，甩干后加入含1%明胶的HEPES缓冲液（0.01M、pH7.5），每孔200μL37℃孵育2h后，取出洗涤三次甩干。将抗血清溶液依次稀释1000，3000，9000，27000倍，每个稀释倍数取50μL加入上述1到4条的1到4孔中，37℃孵育0.5h后，取出洗涤三次。然后每孔加入100μL用抗体稀释液配制的1:3000的羊抗鼠二抗，37℃孵育0.5h后，取出洗涤四次，加入100μL用显色液A液和B液按5:1配制的混合液体，反应15min后，每孔加50μL终止液（2M H2SO4），然后用酶标仪测定480nm处的吸光值。结果如下：
间接ELISA试验：在每条12孔的酶标板上每孔加入100μL的HEPES（0.01M、pH7.5）缓冲液，内含0.008μg的头孢氨苄-OVA，37℃孵育2h后，取出用含0.5%Tween-20的PBS缓冲液（0.01M、pH7.5）洗涤三次，甩干后加入含1%明胶的HEPES缓冲液（0.01M、pH7.5），每孔200μL37℃孵育2h后，取出洗涤三次甩干。在1，2条的3，4孔加入50μL HEPES缓冲液（0.01M、pH7.5），5,6孔加入50μL5ppb头孢氨苄的HEPES缓冲液（0.01M、pH7.5）；7,8孔为10ppb；9,10为20ppb；11,12不加。然后将1,2条中的头孢氨苄-OVA换成头孢羟氨苄-OVA加入到3,4条中，再换成头孢拉定-OVA加入到5,6条中。然后在除1,2孔之外的每孔中加入50μL用抗体稀释液1:1000稀释的抗血清溶液，37℃孵育0.5h后，取出洗涤三次。然后每孔加入100μL用抗体稀释液配制的1:3000的羊抗鼠二抗，37℃孵育0.5h后，取出洗涤四次，加入100μL用显色液A液和B液按5:1配制的混合液体，反应15min后，每孔加50μL终止液（2M H2SO4），然后用酶标仪测定480nm出的吸光值。结果如下：
| 1,2孔 | 3,4孔 | 5,6孔 | 7,8孔 | 9,10孔 | 11,12孔 | |
| 1,2条 | 0.002 | 1.532 | 1.212 | 0.996 | 0.775 | 1.674 |
| 3,4条 | 0.013 | 1.496 | 1.332 | 1.012 | 0.821 | 1.665 |
| 5,6条 | 0.003 | 1.511 | 1.115 | 0.925 | 0.693 | 1.681 |
从结果上可以看出，加有头孢类抗生素的孔(每条的5,6,7,8,9,10孔)的吸光值总是比不加的孔(每条的3,4,11,12孔)低，说明该血清是针对头孢类抗生素的有效血清。
Claims (1)
1.一种头孢类药物通用人工抗原的合成方法，其特征在于以头孢类抗生素的中间体7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸，缩写为7-ADCA，为半抗原，用二琥珀酰亚胺基辛二酸盐DSS法将其与载体蛋白血蓝蛋白KLH偶联，透析，用紫外分光光度法测定偶联物的偶联比，制得头孢类药物通用人工抗原7-ADCA-DSS-KLH；步骤为：
（1）偶联
按KLH︰7-ADCA︰DSS=1:3000:4500的摩尔比称取相应的药品，DSS预先溶解在无水DMF中得到A液；将7-ADCA和KLH用0.01M4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES溶解，搅拌5min使两者充分溶解得到B液；然后将A液逐滴滴入B液中，4℃下反应1.5h，得人工抗原混合液；
（2）透析
透析袋前处理：取15cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用每次2L的生理盐水溶液透析2次，再用每次2L的去离子水透析2次，共透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，得到头孢类药物通用人工抗原7-ADCA-DSS-KLH；
（3）头孢类药物通用人工抗原7-ADCA-DSS-KLH的鉴定。
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Non-Patent Citations (2)
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| 头孢氨苄人工抗原的合成及单克隆抗体的制备;赵启法;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20120915;E066-43 * |
| 牛奶中头孢类抗生素的免疫层析试纸条和ELISA试剂盒检测方法研究;谢会玲;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20100515;第10-11页 * |
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