CN101514338A - 采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法。包括如下步骤：1)加入γ－甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷、γ－甲基丙烯酰氧丙基三乙氧基硅烷或γ－甲基丙烯酰氧丙基甲基二甲氧基硅烷与正硅酸甲酯或正硅酸乙酯，搅拌混合，加入去离子水和酸或碱催化剂，搅拌，得到均匀的溶胶；2)向溶胶中加入缓冲液，缓冲液含有0.005－0.04g/ml溶胶的脂肪酶，缓冲液的用量为0.5～1ml，搅拌；3)静置老化，真空干燥，研磨，得到固定化脂肪酶。本发明操作过程简便易行，所制备的多种固定化脂肪酶其酶活力较游离酶均有明显提高，其中，固定化的Arthrobacter sp.脂肪酶的水解活力为游离酶的11倍。
Description
技术领域
本发明涉及酶的固定化方法，尤其涉及一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法。
背景技术
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)是一种水解酶，它能够特异性地在油水界面上发挥催化活性，并且反应条件温和，催化稳定性高、区域和立体选择性强，因此被广泛应用于有机合成及光学化合物的手性拆分中。然而，酶在实际应用过程中往往难于回收利用，并且重复利用性较差，这样不仅降低了酶的使用效率，提高了生产成本，且难以实现连续化工业操作。将酶进行固定化通常是解决上述问题的一种有效途径。酶进行固定化后，不仅有望提高其活性，而且便于酶的回收利用及产物的分离纯化，使得连续化工业生产成为可能。目前常用的酶固定化方法均可用于脂肪酶的固定化，例如：吸附法、共价结合法以及包埋法。吸附法所制备的固定化酶通常酶活损失少，但重复利用性较差；共价结合法是提高酶稳定性的一种较好途径，然而该法制备过程不够温和，因此酶活损失较大。自九十年代初开始，不断有学者证明，溶胶凝胶包埋法能够被广泛应用于包埋生物活性物质，例如碱性磷酸酶、壳多糖酶、天冬氨酸酶、β-葡萄糖酰化酶以及细胞色素c和肌红蛋白，并能较大程度上保存其原有的活性(Braun S.et al.Materlett(1990)10：1-8；Ellerby L.M.et al.Science，(1992)255：1113-1115)。该法一般是用含高化学活性组分的化合物作前驱体(如TEOS等)，在液相下将这些原料均匀混合，并进行水解、缩合化学反应，在溶液中形成稳定的透明溶胶体系，溶胶经陈化、聚合后，形成三维空间网络结构的凝胶。采用这种方法包埋生物分子，具有适用范围广、生物活性物质活性和稳定性高，以及材料性质(如孔径等)可控等优点。然而，奇怪的是，当采用上述方法对脂肪酶进行固定化时，其活力回收往往很低(＜5％)。直到1995年，Manfred T. Reetz等人发现，只有采用疏水性的硅烷前驱体包埋脂肪酶时，才能获得高活力的固定化酶(ManfrenT.R.et al.Biotechnol Bioeng(1996)49：527-534)，其原因是由于脂肪酶是一种界面催化酶，在疏水界面上有利于其活性构象的获得和保持。采用带有疏水烷基链的硅烷试剂包埋脂肪酶时，其比活力往往可以提高几倍以上。自此，多种疏水性的凝胶材料被广泛应用于包埋脂肪酶，例如甲基三甲氧基硅烷、丙基三甲氧基硅烷、丁基三甲氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷等(Jyp-Ping Chen；Wei-ShinLin.Enzyme Microb Technol(2003)32：801-811；Pedro Vidinha et al.J Biotechnol121(2006)23-33)。然而，到目前为止，已报道的凝胶前驱体多为直链的烷烃类有机硅烷试剂，即CnH2n-1Si(OCH3)3或CnH2n-1Si(OC2H5)3，n＝1-12。同时，有文献报道，包埋酶的活力随着烷基链的增加而增加，然而，当烷基链的碳原子数大于8时，所得到的凝胶酶往往会出现孔塌陷现象，影响酶的性质(Pedro Vidinhaet al.J Biotechnol 121(2006)23-33)。由于硅烷化试剂中的有机官能团的性质直接影响和改变凝胶材料的性质以及酶蛋白分子的构象，因此，尝试新型的有机硅烷化试剂有望进一步提高固定化脂肪酶的性能。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法。
采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法包括如下步骤：
1)加入摩尔比为3∶1～1∶3，总摩尔数为4mmol的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧丙基三乙氧基硅烷或γ-甲基丙烯酰氧丙基甲基二甲氧基硅烷与正硅酸甲酯或正硅酸乙酯，在200～300rpm下搅拌混合，加入0.5ml的去离子水和30-50μl的0.1mol/l的酸或碱催化剂，0-25℃下继续搅拌30～60min，得到均匀的溶胶；
2)向溶胶中加入pH为7.0～9.0，浓度为0.03～0.06M的缓冲液，缓冲液含有0.005-0.04g/ml溶胶的脂肪酶，缓冲液的用量为0.5～1ml，继续搅拌10～30min后，在100～150rpm搅拌1～2h；
3)在4～10℃下静置老化12～24h，于30～35℃真空干燥3-7天，研磨，得到固定化脂肪酶。
所述的脂肪酶为Candida rugosa、Candida antarctica、Arthrobacter sp.、Mucor miehei或Candida lipolytica脂肪酶。酸催化剂为盐酸、硫酸或硝酸。碱催化剂为氢氧化钠或氨水
本发明操作过程简便易行，所制备的多种固定化脂肪酶其酶活力较游离酶均有明显提高，其中，固定化的Arthrobacter sp.脂肪酶的水解活力为游离酶的11倍。
附图说明
图1是溶胶凝胶过程原理示意图。
具体实施方式
本发明所制备的固定化脂肪酶及游离脂肪酶的酶活力测定采用标准的p-NPP(对硝基苯酚棕榈酸酯)为底物的酯水解反应为模型反应。具体测定方法为：将75μlp-NPP的异丙醇溶液(3mg/ml)加入1.35ml的磷酸缓冲液(pH7.5，50mM)中，混合均匀后，向其中加入0.2mg游离酶粉或者2mg上述固定化酶起始反应。采用分光光度法，在410nm的波长条件下分别于不同时刻测定上述反应液的吸光变化，根据吸光值计算酶的水解活力。以35℃下每分钟催化产生1μmol p-NP(对硝基苯酚)所需的酶量(或固定化酶量)为一个酶活力单位(U，μmol·min-1·g-1)。
本发明的反应方程式为
实施例1
1)加入摩尔比为3∶1，总摩尔数为4mmol的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯，在200rpm下搅拌混合，加入0.5ml的去离子水和30μl的0.1mol/l的盐酸催化剂，0℃下继续搅拌30min，得到均匀的溶胶；
2)向溶胶中加入pH为7.0，浓度为0.03M的缓冲液，缓冲液含有0.005g/ml溶胶的脂肪酶(Arthrobacter sp.)，缓冲液的用量为0.5ml，继续搅拌10min后，在100rpm搅拌1h；
3)在4℃下静置老化12h，于30℃真空干燥3天，研磨，得到固定化脂肪酶1#。
以γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物为前驱体，采用溶胶凝胶技术制备固定化的脂肪酶。其原理示意图如图1所示。
实施例2
1)加入摩尔比为1∶3，总摩尔数为4mmol的γ-甲基丙烯酰氧丙基三乙氧基硅烷与正硅酸乙酯，在300rpm下搅拌混合，加入0.5ml的去离子水和50μl的0.1mol/l的氢氧化钠催化剂，25℃下继续搅拌60min，得到均匀的溶胶；
2)向溶胶中加入pH为9.0，浓度为0.06M的缓冲液，缓冲液含有0.04g/ml溶胶的脂肪酶(Arthrobacter sp.)，缓冲液的用量为1ml，继续搅拌30min后，在150rpm搅拌2h；
3)在10℃下静置老化24h，于35℃真空干燥7天，研磨，得到固定化脂肪酶2#。
实施例3
将γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物(4mmol，摩尔比为1/1)，0.5ml的去离子水，50μl/ml溶胶的0.1mol/l的盐酸溶液混合，并在250rpm，0℃条件搅拌30min，形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有0.01g/ml溶胶的酶粉(Arthrobacter sp.)的缓冲液(0.03M，pH8.0)，缓冲液的用量为1ml。该混合液搅拌10min后，在100rpm条件下继续搅拌1h。然后该混合物在4℃条件下静置老化过夜。最后，于35℃条件下真空干燥7天，研磨后得包埋固定化脂肪酶3#。固定化酶的比活力为游离酶的11倍。
实施例4
将γ-甲基丙烯酰氧丙基三乙氧基硅烷与正硅酸乙酯的混合物(4mmol，摩尔比为3/1)，0.5ml的去离子水，30μl/ml溶胶的0.1mol/l的硫酸溶液混合，并在250rpm，0℃条件搅拌30min，形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有0.005g/ml溶胶的酶粉(Arthrobacter sp.)的缓冲液(0.03M，pH8.0)，缓冲液的用量为1ml。该混合液搅拌10min后，在100rpm条件下继续搅拌1h。然后该混合物在4℃条件下静置老化过夜。最后，于35℃条件下真空干燥7天，研磨后得包埋固定化脂肪酶4#。固定化酶的比活力为游离酶的9倍。
实施例5
将γ-甲基丙烯酰氧丙基甲基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物(4mmol，摩尔比为1/1)，0.5ml的去离子水，50μl/ml溶胶的0.1mol/l的硝酸溶液混合，并在250rpm，0℃条件搅拌30min，形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有0.04g/ml溶胶的酶粉(Arthrobacter sp.)的缓冲液(0.03M，pH7.0)，缓冲液的用量为1ml。该混合液搅拌10min后，在100rpm条件下继续搅拌1h。然后该混合物在4℃条件下静置老化过夜。最后，于35℃条件下真空干燥7天，研磨后得包埋固定化脂肪酶5#。固定化酶的比活力为游离酶的8倍。
实施例6
将γ-甲基丙烯酰氧丙基甲基二甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物(4mmol，摩尔比为1/1)，0.5ml的去离子水，50μl/ml溶胶的0.1mol/l的盐酸溶液混合，并在250rpm，0℃条件搅拌30min，形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有0.02g/ml溶胶的酶粉(Arthrobacter sp.)的缓冲液(0.03M，pH8.0)，缓冲液的用量为1ml。该混合液搅拌10min后，在100rpm条件下继续搅拌1h。然后该混合物在4℃条件下静置老化过夜。最后，于35℃条件下真空干燥7天，研磨后得包埋固定化脂肪酶6#。固定化酶的比活力为游离酶的7.5倍。
实施例7
将γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物(4mmol，摩尔比为1/3)，0.5ml的去离子水，50μl/ml溶胶的0.1mol/l的氨水溶液混合，并在250rpm，0℃条件搅拌30min，形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有0.03g/ml溶胶的酶粉(Arthrobacter sp.)的缓冲液(0.03M，pH8.0)，缓冲液的用量为1ml。该混合液搅拌10min后，在100rpm条件下继续搅拌1h。然后该混合物在4℃条件下静置老化过夜。最后，于35℃条件下真空干燥5天，研磨后得包埋固定化脂肪酶7#。固定化酶的比活力为游离酶的6倍。
实施例8
将γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸乙酯的混合物(4mmol，摩尔比为1/1)，0.5ml的去离子水，50μl/ml溶胶的0.1mol/l的氢氧化钠溶液混合，并在250rpm，0℃条件搅拌30min，形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有0.03g/ml溶胶的酶粉(Arthrobacter sp.)的缓冲液(0.03M，pH9.0)，缓冲液的用量为1ml。该混合液搅拌10min后，在100rpm条件下继续搅拌1h。然后该混合物在4℃条件下静置老化过夜。最后，于35℃条件下真空干燥7天，研磨后得包埋固定化脂肪酶8#。固定化酶的比活力为游离酶的6倍。
实施例9
将γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物(4mmol，摩尔比为1/1)，0.5ml的去离子水，50μl/ml溶胶的0.1mol/l的盐酸溶液混合，并在250rpm，0℃条件搅拌30min，形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有0.01g/ml溶胶的酶粉(Candida rugosa)的缓冲液(0.03M，pH7.5)，缓冲液的用量为1ml。该混合液搅拌10min后，在100rpm条件下继续搅拌1h。然后该混合物在4℃条件下静置老化过夜。最后，于35℃条件下真空干燥7天，研磨后得包埋固定化脂肪酶9#。固定化酶的比活力为游离酶的10倍。
实施例10
将γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物(4mmol，摩尔比为1/1)，0.5ml的去离子水，50μl/ml溶胶的0.1mol/l的盐酸溶液混合，并在250rpm，0℃条件搅拌30min，形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有0.01g/ml溶胶的酶粉(Candida antarctica)的缓冲液(0.03M，pH7.5)，缓冲液的用量为1ml。该混合液搅拌10min后，在100rpm条件下继续搅拌1h。然后该混合物在4℃条件下静置老化过夜。最后，于35℃条件下真空干燥7天，研磨后得包埋固定化脂肪酶10#。固定化酶的比活力为游离酶的6倍。
实施例11
将γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物(4mmol，摩尔比为1/1)，0.5ml的去离子水，50μl/ml溶胶的0.1mol/l的盐酸溶液混合，并在250rpm，0℃条件搅拌30min，形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有0.01g/ml溶胶的酶粉(Mucor miehei)的缓冲液(0.03M，pH7.0)，缓冲液的用量为1ml。该混合液搅拌10min后，在100rpm条件下继续搅拌1h。然后该混合物在4℃条件下静置老化过夜。最后，于35℃条件下真空干燥7天，研磨后得包埋固定化脂肪酶11#。固定化酶的比活力为游离酶的10倍。
实施例12
将γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷与正硅酸甲酯的混合物(4mmol，摩尔比为1/1)，0.5ml的去离子水，50μl/ml溶胶的0.1mol/l的盐酸溶液混合，并在250rpm，0℃条件搅拌30min，形成均匀的溶胶。然后向溶胶中加入含有0.01g/ml溶胶的酶粉(Candida lipolytica)的缓冲液(0.03M，pH7.5)，缓冲液的用量为1ml。该混合液搅拌10min后，在100rpm条件下继续搅拌1h。然后该混合物在4℃条件下静置老化过夜。最后，于35℃条件下真空干燥7天，研磨后得包埋固定化脂肪酶12#。固定化酶的比活力为游离酶的8倍。
表1溶胶凝胶法包埋多种脂肪酶的活力及比活力
Claims (4)
1.一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)加入摩尔比为3∶1～1∶3，总摩尔数为4mmol的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧丙基三乙氧基硅烷或γ-甲基丙烯酰氧丙基甲基二甲氧基硅烷与正硅酸甲酯或正硅酸乙酯，在200～300rpm下搅拌混合，加入0.5ml的去离子水和30-50μl的0.1mol/l的酸或碱催化剂，0-25℃下继续搅拌30～60min，得到均匀的溶胶；
2)向溶胶中加入pH为7.0～9.0，浓度为0.03～0.06M的缓冲液，缓冲液含有0.005-0.04g/ml溶胶的脂肪酶，缓冲液的用量为0.5～1ml，继续搅拌10～30min后，在100～150rpm搅拌1～2h；
3)在4～10℃下静置老化12～24h，于30～35℃真空干燥3-7天，研磨，得到固定化脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于所述的脂肪酶为Candida rugosa、Candida antarctica、Arthrobacter sp.、Mucor miehei或Candida lipolytica脂肪酶。
3.根据权利要求1所述的一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于所述的酸催化剂为盐酸、硫酸或硝酸。
4.根据权利要求1所述的一种采用甲基丙烯酰氧丙基凝胶制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于所述的碱催化剂为氢氧化钠或氨水。
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