CN101504340B

CN101504340B - 儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理试剂盒及方法

Info

Publication number: CN101504340B
Application number: CN2009100249348A
Authority: CN
Inventors: 康学军; 顾忠泽; 方芳; 马玉琴; 陆祖宏
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2009-03-03
Filing date: 2009-03-03
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2029-03-03
Also published as: CN101504340A

Abstract

本发明提供了一种儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括固相微萃取器(1)、注射器(2)、接收管(3)、可与儿茶酚胺类物质选择性络合生成络合物的试剂溶液A(4)、有利于多种儿茶酚胺类物质同时被富集的试剂溶液B(5)。固相微萃取器(1)由纳米纤维(6)装填到过滤管(7)中制成，注射器(2)的前端与过滤管(7)的后端开口可以紧密配合。

Description

儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种基于功能纳米纤维的萃取方法，特别是涉及一种基于功能纳米纤维的生物样品中儿茶酚胺类物质选择性富集前处理方法和装置。

背景技术

儿茶酚胺类物质是人和动物体内一类重要的生物活性物质，也是神经递质，其体内浓度与人的生理、病理状况及精神和情绪状态密切相关，是一种可以量化的指标。目前研究结果表明它在体内的浓度水平与抑郁症，焦虑症，精神分裂症，高血压，糖尿病肾病等疾病有关。越来越多的医疗及研究机构开始关注这一指标的检测。

但儿茶酚胺类物质检测困难，目前只有少数专业的实验室可以检测，操作过程繁琐，检测费用高昂。因为生物体内儿茶酚胺类物质浓度低，干扰严重且不易去除，很多已报道的检测数据明显偏离正常范围，不同实验室数据之间有的甚至相差三个数量级。

生物样品中儿茶酚胺类物质用传统的液液萃取法分离提取很难达到满意效果，因为儿茶酚胺类物质的极性大，水溶性强，并且易见光被氧化破坏，所以需要快速高效的前处理技术。

相关的方法中有用氧化铝柱，葡聚糖凝胶柱或离子交换柱纯化样品。研究发现如果只单独使用氧化铝柱进行纯化，不能有效去除杂质，肾上腺素和去甲肾上腺素的检测被严重干扰；单独使用葡聚糖凝胶同样不能有效去除干扰组分，只有将二者联用才能达到较为理想的提取目标物去除杂质的目的，但是将二者连用去除杂质，过程又太繁琐、耗时费力，难以自动化。目前也有一些新的尝试，有的把络合剂固定在一定载体上制成特定分离柱，或者合成杯环芳烃或者冠醚高聚物来进行分子亲和提取，这些方法可以起到一定的去除杂质的作用，但是还达不到快速高效的要求，且浓缩富集效果不甚理想，所以还没有推广应用。因此生物样品中儿茶酚胺类物质测定亟需高效快速的样品前处理方法达到去除杂质浓缩目标物的作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种萃取效率高且可以有效去除杂质的儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理试剂盒及方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理试剂盒，该试剂盒包括固相微萃取器、注射器、接收管、可与儿茶酚胺类物质选择性络合生成络合物的试剂溶液A、有利于多种儿茶酚胺类物质同时被富集的试剂溶液B，固相微萃取器由纳米纤维装填到过滤管中制成，注射器的前端与过滤管的后端开口可以紧密配合，也可方便分开；所述纳米纤维为聚苯乙烯，所述纳米纤维直径为10～1000nm，所述纳米纤维装填量为1～2mg。

优选的，所述试剂溶液A是硼酸，吡啶硼烷，1，4-苯二硼酸，二苯基硼酸-2-氨基乙酯，硼氢化钾，硼酸铵，硼酸镁，氟硼酸钾中任一种的溶液。

优选的，所述试剂溶液B是硫酸铵，磷酸二铵，氯化四丁基铵，氢氧化四丁基铵，苯扎氯铵中任一种的溶液。

本发明还提供了一种儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理方法，该方法包括：提供含儿茶酚胺类物质的生物样品，可与儿茶酚胺类物质选择性络合生成络合物的试剂溶液A，有利于多种儿茶酚胺类物质同时被富集的试剂溶液B和装填好纳米纤维的固相微萃取器及用于给所述固相微萃取器加压的注射器；

将所述试剂溶液A、含儿茶酚胺类物质的生物样品和试剂溶液B进行混合，得到混合溶液；用注射器吸取空气给所述固相微萃取器加压使所述混合溶液流过装填有纳米纤维的固相微萃取器，所述混合溶液中儿茶酚胺类物质与试剂A的络合物被吸附于所述纳米纤维表面；用溶剂将儿茶酚胺类物质从固相微萃取器中洗脱下来。

优选的，所述试剂溶液A是硼酸，吡啶硼烷，1，4-苯二硼酸，二苯基硼酸-2-氨基乙酯，硼氢化钾，硼酸铵，硼酸镁，氟硼酸钾中任一种的溶液，试剂溶液A浓度为1～10mg/mL。

优选的，所述试剂溶液B是硫酸铵，磷酸二铵，氯化四丁基铵，氢氧化四丁基铵，苯扎氯铵中任一种的溶液，试剂溶液B浓度为0.05～2mol/L。

优选的，所述纳米纤维为聚苯乙烯纳米纤维，该聚苯乙烯纳米纤维直径为10～1000nm，聚苯乙烯纳米纤维装填量为1～2mg。

优选的，所述溶剂为甲醇或醋酸。

优选的，所述混合溶液中试剂溶液A、生物样品、试剂溶液B混合体积比为3∶3∶1。

本发明的有益效果在于：

1)由于纳米纤维的比表面积巨大，有较强的与目标分子相互作用力。只使用微量的吸附剂，吸附萃取效率却可以大大提高；2)操作过程简单、快速，这一特点适合见光易被氧化的儿茶酚胺类物质的快速前处理；3)微萃取器中被富集的目标物只需用很少体积的溶剂即可解吸附，省去了常规固相萃取的洗脱液需挥发溶剂浓缩目标物的操作；4)试剂溶液A中的三价硼化合物都是缺电子的分子，分子中硼的空p轨道具有接受电子的能力，它们可与醚类、胺类化合物形成络合物；基于试剂溶液A对儿茶酚胺类物质选择性络合作用和纳米纤维的高吸附性，实现高效、快速的生物样品中儿茶酚胺类物质选择性分离、纯化和富集，从而使后续检测方法达到灵敏度和选择性高的目的。

附图说明

图1为本发明提供的生物样品中儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理装置示意图；

固相微萃取器1、注射器2、接收管3、试剂溶液A 4、试剂溶液B 5；

图2为尿液加标样不经处理，直接进样的色谱图a和尿液加标样用本发明提供的的茶酚胺类物质选择性分离富集前处理试剂盒和方法处理后进样分析的色谱图b；

图3为经过放大的图2中的b曲线，色谱图上出峰的物质分别为：

1：去甲肾上腺素；2：肾上腺素；3：内标；4：3，4-二羟基苯乙酸；5：多巴胺。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

本发明提供一种基于功能纳米纤维的生物样品中儿茶酚胺类物质选择性富集前处理试剂盒和处理方法，该试剂盒包括固相微萃取器1、注射器2、接收管3、可与儿茶酚胺类物质选择性络合生成络合物的试剂溶液A 4、有利于多种儿茶酚胺类物质同时被富集的试剂溶液B 5。固相微萃取器1由纳米纤维6装填到过滤管7中制成，注射器2的前端与过滤管7的后端开口可以紧密配合。纳米纤维为聚苯乙烯纳米纤维，聚苯乙烯纳纳米纤维直径为10-1000nm，聚苯乙烯纳米纤维装填量为1～2mg。试剂溶液A 4，该溶液可与儿茶酚胺类物质选择性络合生成络合物，选择性高。试剂溶液B 5可提高多种儿茶酚胺类物质的提取回收率。试剂溶液A 4∶生物样品∶试剂溶液B 5混合体积比为3∶3∶1。注射器2的前端与过滤管7的后端开口可以紧密相配合和方便的分开。用注射器2吸取空气给固相微萃取器1内的溶液加压使溶液得以通过固相微萃取器1。其中所使用的固相微萃取器1在专利号为200510123148.5中有揭示。

本发明提供的一种基于功能纳米纤维的生物样品中儿茶酚胺类物质选择性富集前处理方法，该方法包括：

提供含儿茶酚胺类物质的生物样品，可与儿茶酚胺类物质选择性络合生成络合物的试剂溶液A，有利于多种儿茶酚胺类物质同时被富集的试剂溶液B和装填好纳米纤维的固相微萃取器及用于给所述固相微萃取器加压的注射器；

将所述试剂溶液A、含儿茶酚胺类物质的生物样品和试剂溶液B进行混合，得到混合溶液；用注射器吸取空气给所述固相微萃取器加压使所述混合溶液流过装填有纳米纤维的固相微萃取器，所述目标化合物被吸附于所述纳米纤维表面；用溶剂将儿茶酚胺类物质从固相微萃取器中洗脱下来，配合适当检测体系检测。所述混合溶液中的目标物是指儿茶酚胺类物质与试剂A的络合物。

所述试剂溶液A可以是硼酸，吡啶硼烷，1，4-苯二硼酸，二苯基硼酸-2-氨基乙酯，，硼氢化钾，硼酸铵，硼酸镁，氟硼酸钾中任一种的溶液，试剂溶液A浓度为1～10mg/mL。

所述试剂溶液B可以是硫酸铵，磷酸二铵，氯化四丁基铵，氢氧化四丁基铵，苯扎氯铵中任一种的溶液，试剂溶液B浓度为0.05～2mol/L。

所述纳米纤维为聚苯乙烯纳米纤维，该聚苯乙烯纳米纤维直径为10～1000nm，聚苯乙烯纳米纤维装填量为1～2mg。

所述溶剂为甲醇或醋酸。

所述混合溶液中试剂A、生物样品、试剂B混合体积比为3∶3∶1。

具体说明如下：

向含儿茶酚胺类物质的生物样品中加入试剂溶液A，试剂A可以选择硼酸，吡啶硼烷，1，4-苯二硼酸，二苯基硼酸-2-氨基乙酯，，硼氢化钾，硼酸铵，硼酸镁，氟硼酸钾溶液等，该试剂溶液与儿茶酚胺类物质生成络合物；再向样品混合液中加入试剂溶液B。试剂溶液B可以选择硫酸铵，磷酸二铵，氯化四丁基铵，氢氧化四丁基铵，苯扎氯铵溶液等，该试剂溶液B有利于多种儿茶酚胺类物质同时被富集。混合溶液中生成的络合物借助外力如气压的方式，流过装填于固相微萃取器中的纳米纤维时被吸附于纳米纤维表面，用适当微量溶剂可将儿茶酚胺类物质从固相微萃取器中洗脱下来；配合适当检测体系检测。微量溶剂可以是甲醇或醋酸。

该方法的特点是：试剂A中的三价硼化合物都是缺电子的分子，分子中硼的空p轨道具有接受电子的能力，它们可与醚类、胺类化合物形成络合物；基于试剂A对儿茶酚胺类物质选择性络合作用和纳米纤维的高吸附性，实现高效、快速的生物样品中儿茶酚胺类物质选择性分离、纯化和富集，从而使后续检测方法达到灵敏度和选择性高的目的。

本发明提供的基于功能纳米纤维的生物样品中儿茶酚胺类物质选择性富集的样品前处理试剂盒使用中仅使用微升量溶剂，几乎是无溶剂操作，减少环境污染，有利于操作人员健康。

本发明提供的基于功能纳米纤维的生物样品中儿茶酚胺类物质选择性富集的样品前处理试剂盒优点在于：1)由于纳米纤维的比表面积巨大，有较强的与目标分子相互作用力。只使用微量的吸附剂，吸附萃取效率却可以大大提高；2)操作过程简单、快速，这一特点适合见光易被氧化的儿茶酚胺类物质的快速前处理；3)微萃取器中被富集的目标物只需用很少体积的溶剂即可解吸附，省去了常规固相萃取的洗脱液需挥发溶剂浓缩目标物的操作。

应用实例：

1.取本发明提供的所述生物样品中儿茶酚胺类物质选择性富集的样品前处理试剂盒，里面配有一定数量的装填好聚苯乙烯纳米纤维的固相微萃取器，试剂溶液A一瓶，试剂溶液B一瓶，注射器一支。

2.将试剂溶液A、含儿茶酚胺类物质的样品(如果需内标，需添加好内标液)水溶液，试剂溶液B按体积比3∶3∶1进行混合，将混合液加入固相微萃取器中，用注射器吸取空气加压的方法使样液流过纳米纤维；再吸取50μl纯水过萃取器；用50μL甲醇洗脱过萃取器；洗脱液注入高效液相色谱-荧光检测器体系检测，计算萃取回收率。结果提取回收率达97～99％。

3.以公认预处理最为复杂的人尿液样品进行试验，配制100ng/mL儿茶酚胺类物质尿液加标样，将试剂溶液A∶尿液加标样∶试剂溶液B按体积比3∶3∶1进行混合；同2项下操作，洗脱液注入高效液相色谱-荧光检测器体系检测。结果见图2和图3。图2中的a曲线代表未采用本发明提供的方法及试剂盒的色谱图，图2中的b曲线代表采用本发明提供的方法及试剂盒的色谱图。图3为经过放大的图2中的b曲线。

Claims

1.一种儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括固相微萃取器(1)、注射器(2)、接收管(3)、可与儿茶酚胺类物质选择性络合生成络合物的试剂溶液A(4)、有利于多种儿茶酚胺类物质同时被富集的试剂溶液B(5)；固相微萃取器(1)由纳米纤维(6)装填到过滤管(7)中制成，注射器(2)的前端与过滤管(7)的后端开口可以紧密配合，也可方便分开；所述纳米纤维(6)为聚苯乙烯，其直径为10～1000nm，装填量为1～2mg。

2.根据权利要求1所述的儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理试剂盒，其特征在于：所述试剂溶液A(4)是硼酸、吡啶硼烷、1，4-苯二硼酸、二苯基硼酸-2-氨基乙酯、硼氢化钾、硼酸铵、硼酸镁或氟硼酸钾中任一种的溶液。

3.根据权利要求1所述的儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理试剂盒，其特征在于：所述试剂溶液B(5)是硫酸铵、磷酸二铵、氯化四丁基铵、氢氧化四丁基铵或苯扎氯铵中任一种的溶液。

4.一种儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理方法，其特征在于该方法包括：提供含儿茶酚胺类物质的生物样品，可与儿茶酚胺类物质选择性络合生成络合物的试剂溶液A，有利于多种儿茶酚胺类物质同时被富集的试剂溶液B和装填好纳米纤维的固相微萃取器及用于给所述固相微萃取器加压的注射器；

5.根据权利要求4所述的儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理方法，其特征在于：所述试剂溶液A是硼酸、吡啶硼烷、1，4-苯二硼酸、二苯基硼酸-2-氨基乙酯、硼氢化钾、硼酸铵、硼酸镁或氟硼酸钾中任一种的溶液，试剂溶液A浓度为1～10mg/mL。

6.根据权利要求4所述的儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理方法，其特征在于：所述试剂溶液B是硫酸铵、磷酸二铵、氯化四丁基铵、氢氧化四丁基铵或苯扎氯铵中任一种的溶液，试剂溶液B浓度为0.05～2mol/L。

7.根据权利要求4所述的儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理方法，其特征在于：所述纳米纤维为聚苯乙烯纳米纤维，该聚苯乙烯纳米纤维直径为10～1000nm，聚苯乙烯纳米纤维装填量为1～2mg。

8.根据权利要求4所述的儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理方法，其特征在于：所述溶剂为甲醇或醋酸。

9.根据权利要求4所述的儿茶酚胺类物质选择性分离富集前处理试剂盒，其特征在于：所述混合溶液中试剂溶液A、生物样品、试剂溶液B混合体积比为3∶3∶1。