CN101503461A - 一种具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽 - Google Patents

一种具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含18个精氨酸(R)的多肽，其两端分别包括9个精氨基残基，中间插入6－15个氨基酸的插入序列。它具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽，在药物领域、特别是治疗肝癌的药物领域有用。

Description

一种具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽
[技术领域]
本发明涉及一种多肽，具体来说涉及一种具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽。
[背景技术]
细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象。肿瘤细胞的发生、发展过程受多种因素影响。主要表现为细胞增殖失控、分化受阻、凋亡紊乱等特征。大量研究表明诱导肿瘤细胞分化、凋亡在肿瘤发生、发展及其治疗中起重要作用。
诱导肿瘤细胞凋亡的药物研究也已成为近几年的抗肿瘤药物研究热点之一，研发各种有效提高细胞凋亡能力的药物即细胞凋亡诱导剂可能是最有前途的治疗癌症策略[1]。现已研发出多种通过诱导细胞凋亡的抗癌药[2-4]。包括类黄酮及其衍生物：如黄酮、异黄酮和黄烷酮，其中一些物质已被发现具有抗肿瘤和抗炎症等活性，如汉黄芩素1和非瑟酮2是其中最有效的细胞凋亡诱导剂。香豆素类化合物类：4，6，或7-苯乙烯基香豆素类化合物，对其进行体外抗癌活性筛选，发现6-苯乙烯基香豆素类化合物6及7-苯乙烯基香豆素类化合物7对L-1210，HL-60，Hcr-8，KB和Bel-7402细胞有效，4-苯乙烯基香豆素类化合物对KB细胞有效，显示了一定的抗癌活性，且发现6-或7-位衍生物的活性较4-位衍生物活性高。黄樟素氧化物及其衍生物：如黄樟素氧化物12对血管内皮细胞(VEC)的生长和凋亡有重要作用。吲哚类衍生物及其药物学上可接受的盐14，可作为细胞凋亡诱导剂。多环化合物类：被取代的2-芳基-4-(芳氨基)嘧啶及其类似物16可在各种不同的临床条件下诱导生长和扩散失控的细胞凋亡，该类化合物是caspase活化剂和细胞凋亡诱导剂。大环内酯化合物如布雷菲德菌素A及其衍生物，Ammoeidin。不含杂环的化合物如蒽醌衍生物大黄素、茚酮衍生物Indanocine、类维生素TINPB衍生物。萜类化合物及多环化合物毛兰素(Erianin，Eri)显著抑制人类白血病HL-60细胞的生长。此外，糖类的多糖31，它可作为细胞凋亡诱导剂用于肿瘤、自身免疫性疾病和炎症等的治疗。而新近设计的多肽R9-KLAKLAKKLAKLAK序列也可以通过干扰线粒体的膜电位而具有诱导细胞凋亡功能[5]。
[发明内容]
发明人设计了一种含18个精氨酸(R)的多肽，其两端分别包括9个精氨基残基，中间插入6-15个氨基酸的插入序列，发现此类多肽具有诱导肝癌细胞凋亡的功能。
此类多肽的体外半数抑制浓度IC50低于已报道的具有类似功能的多肽序列R9-KLAKLAKKLAKLAK，显示有更好的生物学活性。
此外，此类多肽中的插入序列可以调节，可根据不同的作用靶位要求进行序列设计，从而增加该多肽作用的特异性。
本发明的优选方案是一种含18个精氨酸(R)的多肽，其两端分别包括9个精氨基，中间插入10个氨基酸的插入序列。
[附图说明]
图1为多肽处理浓度和细胞数量曲线。
图2为TUNEL方法检测细胞凋亡的照片。
[具体实施方式]
多肽中间插入序列为序列GSLLGRMKGA。多肽序列确定后可以按照本领域各种公知的方法合成，也可交生物技术公司(上海生工生物工程技术服务有限公司，上海市松江区车墩工业区香闵路698号)合成。干粉以蒸馏水溶解在-80度保存。
以已知能诱导细胞凋亡的多肽R9-KLAKLAKKLAKLAK为阳性对照多肽。以肝癌细胞系HepG2细胞为研究平台。适当数量的HepG2细胞接种于24孔板和铺有盖玻片的6孔板中，贴壁24小时后，以0、10、20、40、80μM的多肽R9-GSLLGRMKGA-R9(SEQ No.1，从左到右以氨基端到羧基端，下同)、R9-KLAKLAKKLAK LAK(阳性对照，SEQ No.2)及多肽R9(SEQ No.3)处理HepG2细胞24h。以苔盼蓝染色方法检测活细胞数，TUNEL方法检测细胞凋亡。
结果显示，R9-GSLLGRMKGA-R9和R9-KLAKLAKKLAKLAK均能有效诱导HepG2细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的效率依赖于处理浓度。多肽R9-GSLLGRMKGA-R9的半数有效抑制浓度IC50为25μM，而R9-KLAKLAKKLAKLAK序列诱导细胞凋亡的IC50为40μM。
HepG2细胞以0、5、10、20、40、80μM的多肽R9-KLAKLAKKLAKLAK(KLA组)、R9-GSLLGRMKGA-R9(R18组)、和R9处理24h后。消化贴壁细胞以苔盼蓝染色方法计数活细胞，以各组的0μM亚组的细胞数为100％，其余各亚组细胞数与之相比以计算细胞存活率。
20μM多肽处理24h后HepG2细胞凋亡检测，深黑色细胞(箭头)为发生凋亡的细胞。A组：R9-KLAKLAKKLAKLAK；B组：R9-GSLLGRMKGA-R9；C组：对照。结果显示，图1所示细胞存活率与图2所示的细胞凋亡检测结果基本一致，证明本发明多肽成功诱导了HepG2细胞凋亡。
基于上述发现，发明人认为上述多肽在药物领域、特别是治疗肝癌的药物领域有用。可以按照常规工艺将其制成注射液，通过静脉给药。剂量控制在1.9-6.1mg/Kg，本领域技术人员也可以根据实际情况进行适当的调整。
【参考文献】
1、Targeted manipulation of apoptosis in cancer treatment.CallJA，Eckhardt SG，Camidge DR.Lancet Oncol.2008；9(10)：1002-11
2、Induction of apoptosis by cancer chemotherapy.KaufmannSH，Earnshaw WC.Exp Cell Res.2000 Apr 10；256(1)：42-9
3、沙磊，赵宝祥，谭伟，苗俊英等，细胞凋亡诱导剂研究进展，有机化学，2004，8：864-871.
4、Lavfuk IN，Gollks A，Krammer PH.Caspases：pharmaeologi calmanipulation of cell death.J ClinInvest，2005，115(10)：2665-2672.
5、Law B，et al.A mitochondrial targeted fusion peptide exhibitsremarkable cytotoxicity.Mol Cancer Ther.2006，5(8)：1944-9.
序列表
<110>北京大学人民医院
<120>一种具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽
<160>3
<210>1
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工设计的序列，具有诱导肝癌细胞凋亡功能
<400>1
Figure A200910008895D00081
<210>2
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工设计的序列，具有诱导肝癌细胞凋亡功能
<400>2
Figure A200910008895D00082
Figure A200910008895D00091
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工设计的序列，用作对照
<400>3
Figure A200910008895D00092

Claims (5)

1、一种多肽，其两端分别包括9个精氨基残基，中间为6-15个氨基酸的插入序列。
2、根据权利要求1所述的多肽，其中所述的插入序列为10个氨基酸的插入序列。
3、根据权利要求1或2所述的多肽，其序列如下：R9-GSLLGRMKGA-R9(SEQ No.1)。
4、权利要求1或2所述多肽在制药中的应用。
5、权利要求3所述多肽在制药中的应用。
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