CN107759678A - 一种抗癌活性肽及应用 - Google Patents

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Abstract

一种抗癌活性肽及应用，通过氨基酸替代策略，将Lycosin‑I序列中的K替换成R，E替换成Q，得到了R‑Lycosin‑I。R‑lycosin‑I保持了Lycosin‑I的选择性，增强了对实体瘤细胞的细胞毒活性。所述的抗癌肽是经Lycosin‑I改造而来的活性多肽毒素，包含23个氨基酸残基，分子量为2928.46Da，等电点12.12，氨基酸序列为：Arg Gly Trp Phe Arg Ala Met Arg Ser Ile Ala Arg Phe Ile Ala Arg Glu Arg Leu Arg Glu His Leu。

Description

一种抗癌活性肽及应用
技术领域
本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种从Lycosin-I序列中经过氨基酸替换获得的抗癌肽在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
抗菌肽（ACPs）具有作用机制多样，杀死癌细胞迅速，不限于某个特定的靶点，使它不容易产生抗性的特点，且副作用低具备一定选择性，这对于癌症的治疗提供了一个新的机遇和方向。但作为抗癌药进行开发依然存在着很多的挑战如：抗癌肽的半衰期短，易被体内蛋白酶降解，有些抗癌肽缺乏选择性表现出较高的毒性，对肿瘤的作用较弱尤其是对实体瘤细胞。所以对抗癌肽进行修饰和改造已经成为解决这类多肽所遇到挑战的金钥匙和开发这类多肽药物的重要手段。通过各种修饰和改造的策略，赋予天然活性多肽不具备的优势，使更多的天然活性多肽得以开发，为肿瘤患者带来更多福音。
发明内容
本发明的目的旨在于提供一种具抗癌作用的多肽R-lycosin-I在抗癌方面的应用。
上述发明目的是通过以下技术方案实现的: 采用氨基酸替代的策略将Lycosin-I序列中的K替换成R，E替换成Q，通过化学合成的方法合成出R-lycosin-I用于在抗肿瘤方面的研究。
本发明提供的抗癌肽来自于Lycosin-I的改造，通过一系列的氨基酸设计合成出的一种具有23个氨基酸残基的多肽，命名为R-lycosin-I；该多肽的氨基酸序列为：Arg GlyTrp Phe Arg Ala Met Arg Ser Ile Ala Arg Phe Ile Ala Arg Glu Arg Leu Arg GluHis Leu 所述的抗癌肽的分子量为2928.46Da (M+H+)，等电点12.12。
通过本发明的抗菌实验充分表明，本发明的抗癌肽R-lycosin-I比Lycosin-I具有更强的抗癌活性，另外，保留了Lycosin-I原有的选择性，具有更高的血清稳定性，在3D肿瘤球体中穿透的更深，具有比Lycosin-I更高的肿瘤穿透性，可作为现有的抗癌药的替代药物或辅助药物。可有效解决一些传统药物低选择性和高副作用的问题，减轻癌症患者的痛苦。由于该多肽的强抗癌活性，且具有更有利于被癌细胞摄取，经胞吞作用后易从囊泡中释放出来，弥补了Lycosin-I被摄取后不易释放从而被溶酶体降解的缺陷。提高了该抗癌肽的生物利用率，增强了对肿瘤细胞尤其是实体瘤细胞作用。
R-lycosin-I的抗癌研究方法
（1）R-lycosin-I的分离纯化
通过化学合成得到的样品用10ml双蒸水溶解后，3000转/分钟离心五分钟，取上清液进行用C18 RP-HPLC进行分离纯化（图1A-B）（美国Waters公司,Alliance HPLC & Millennium高效液相色谱工作站，2690溶剂输送系统，996 PDA检测器，分离柱：反相柱，Vydac,C18,4.6mm´250mm；洗脱液分别为：A液(0.1%TFA/H2O)、B液（0.1%TFA/ACN）；洗脱梯度， 0-40min, 20-80% B液； 流速，1 ml/min；温度，40°C），在215 nm下监测多肽的洗脱，收集洗脱峰，冻干，并用质谱测定其分子量。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定其分子量为2928.46Da (M+H+)（图1B）。
（2）R-lycosin-I的物化表征方法
通过使用DLS来表征多肽的水化粒径和zeta电势，如图（1I）,可见R-lycosin-I的电势越高，这更有利于多肽与癌症细胞膜结合，有利于多肽被细胞摄取。同时用DLS来表征多肽的粒径（图1G-H）,根据有关报道，粒径小越容易被细胞摄取，R-lycosin-I具有更小的粒径更容易被癌细胞内化。使用CD来表征多肽的二级结构，R-lycosin-I的螺旋度比Lycosin-I更多，说明前者的疏水性越高，这对于提高多肽的活性非常有用。
附图说明
图1 R-lycosin-I的分离纯化和物化表征图谱；
图1A-1D R-lycosin-I与Lycosin-I的色谱和质谱表征；图1E-1F R-lycosin-I与Lycosin-I的圆二色谱图谱；图1G-1H. R-lycosin-I与Lycosin-I的粒径表征图谱；图1I.R-lycosin-I与Lycosin-I的zeta电势图。
图2是R-lycosin-I与Lycosin-I对不同细胞的细胞毒活性作用；
图2A. R-lycosin-I与Lycosin-I对4种癌细胞和2种正常细胞的细胞毒活性图谱；图2B. R-lycosin-I与Lycosin-I对A549细胞的流式凋亡图。
图3 R-lycosin-I与Lycosin-I对A549的细胞摄取图谱；
图3A-3B. 不同浓度的FITC-R-lycosin-I和cy5-Lycosin-I对A549细胞的摄取图；图3C-3E. 2种药物处理后，经cellometer K2计数后细胞摄取的量化图；
图4 FITC-R-lycosin-I和cy5-Lycosin-I激光共聚焦图谱；
图4A.替换后的多肽更利于从囊泡中释放；图4B. Genistein 和Dynasore 处理后证明A549细胞摄取药物过程中存在着囊泡运输；
图5 R-lycosin-I作用机制探讨；
图5A 加药后对A549细胞的P27蛋白表达量化图； 图5B. 加药后对A549细胞的细胞色素C的表达量化图；图5C. 加药后对A549细胞的caspase-3的活性影响；
图6 多肽的血清稳定性实验
图6A 表示的是R-lycosin-I的血清稳定性；图6B. 表示的是Lycosin-I的血清稳定性
图7 R-lycosin-I与Lycosin-I对3D肿瘤球体的毒性作用图谱；
图7A. 3D肿瘤球体的大小图谱；图7B. 药物处理后3D肿瘤大小的量化图；图7C.药物处理后，经阿尔玛蓝测定肿瘤球体的活力图。
具体实施方式
为了揭示R-lycosin-I的抗癌作用和活性增强机制，我们在细胞水平和3D肿瘤球体检测了R-lycosin-I对A549活性，所有的试验均用Lycosin-I作为对照。所有的结果均进行了统计和分析。实验的开展都是严格的根据标准化研究所进行。
1.主要材料和仪器
细胞培养的相关试剂在赛默菲世尔公司购买，其余细胞实验相关试剂自生工。A549和H460细胞从中科院上海细胞库中购买。荧光标记的Lycosin-I和R-lycossin-I均来自于吉尔生化公司。Cellometer K2，DLS,TEM，CD，荧光显微镜均来自本实验室。P27，细胞色素C的抗体购于BD公司。
2.实验方法和结果
2.1 R-lycosin-I对癌细胞和正常细胞的细胞毒活性
A549,MDA-MB-231,PC-3,Hela和HEK293T，BEAS-2B细胞以1×105的密度种于96空板中，R-lycosin-I以2倍梯度稀释加入空中，每个浓度设3个复孔，孵育24小时，加10μL的CCK-8孵育4小时，酶标仪测出吸光值。如图2A所示，R-lycosin-I对4种癌细胞的半抑制浓度（IC50）在15μM左右。对HEK293T和BEAS-2B细胞的IC50=27μM左右。与Lycosin-I相比，对癌细胞作用增强了近2倍，对正常细胞的细胞毒作用大致相同。我们取R-lycosin-I处理后的半抑制浓度作为流式凋亡实验的浓度，进行流式凋亡测定。如图2B所示，通过流式可以看出来在浓度为15μM时，R-lycosin-I处理后，凋亡的细胞从19.65%增加到了53.05%。而Lycosin-I处理的细胞的凋亡数与对照组相同。由此可见，通过氨基酸替换增强了多肽对癌细胞的细胞毒作用。
2.2 R-lycosin-I对A549细胞的细胞摄取分析
具有细胞毒作用的线性多肽作用于细胞的方式各异，主要以插入细胞膜使细胞内容物泄露，直接作用于细胞膜为主，也有经过细胞摄取从而作用于细胞内相关的蛋白从而诱导细胞凋亡的。Lycosin-I的研究表明，该多肽可以进入细胞促进细胞内与凋亡相关的蛋白的表达，引起细胞的凋亡。所以多肽进入细胞的量对于癌细胞的凋亡非常重要。所以我们拍摄不同浓度的荧光标记多肽处理A549且在不同时间点的照片。如图3A-3B所示，7.5μM R-lycosin-I在0.5h时就显示出了荧光，而Lycosin-I在浓度为15μM处理2h时候才出现一些荧光。图3C-3E所示，通过cellometer K2对带有荧光细胞数量进行量化，从荧光数量上反应细胞对药物的摄取情况。细胞对R-lycsin-I的摄取量增加的原因可能有3点，首先R-lycosin-I中的精氨酸的胍基能够与细胞的磷脂形成氢键，减少了多肽的质子化作用，而Lycosin-I中的赖氨酸是可以发生质子化，这使得R-lycosin-I的胶体稳定性更高，zeta电势增加（图1I）增强了堕胎与细胞膜的结合能力，为细胞摄取多肽提供前提。再者，R-lycosin-I的粒径更小，研究表明，在细胞内化多肽时存在着大小效应，颗粒越小的多肽更易被摄取。最后，精氨酸有助于增强多肽的疏水性，这位多肽插入磷脂双分子层提供了条件。
2.3 R-lycosin-I更倾向于从囊泡中释放出来
有研究表明，组氨酸替换有利于多肽从囊泡出释放出来；也有研究表明，将富含精氨酸的细胞穿透太TAT和细胞毒活性肽相偶联也有利于多肽出囊泡中释放出来。由于组氨酸和精氨酸性质的相似性，我们猜想，替换后的Lycosin-I是否也有利于多肽从囊泡中释放。为了进一步验证我们的猜想，我们合成出来荧光标记的多肽来进行激光共聚焦的研究。如图4A所示，荧光标记的R-lycosin-I摄取进细胞后呈弥散状态，均匀分布在细胞内，而荧光标记的Lycosin-I成点状分布，且多在细胞膜上聚集，这也能够说明在2h内R-lycosin-I被细胞摄取的速度高于Lycosin-I.为了更好的说明这一结果，我们用2种胞吞作用的抑制剂通过细胞毒性实验来验证在摄取的过程中有没有存在着囊泡运输，如图4B所示，不论是网格蛋白介导的囊泡运输抑制剂Dynasore还是脂筏介导的囊泡运输的抑制剂Genistein均能在不同程度上挽救多肽的细胞毒活性。多肽被内吞后更有利于释放意味着在细胞内多肽的数量较高，更有利于多肽影响下游的一些蛋白的表达，从而跳出被溶酶体降解的命运。
2.4 R-lycosin-I作用于癌细胞的机制探讨
之前的研究表明，Lycosin-I一方面可以上调P27从而抑制细胞的增殖另一方面可以促使线粒体释放细胞色素C，后者又可以促进caspase3的激活诱导细胞的凋亡。为了验证R-lycosin-I是否也通过影响这2个关键蛋白来达到细胞凋亡的目的，我们用R-lycosin-I处理后的细胞进行WB实验。结果如图5A-5B所示，15μM的R-lycosin-I处理细胞能明显的上调P27的表达，且能释放细胞色素C入细胞。另外我们用caspase的广谱抑制剂Z-VAD-FMK能够显著的挽救多肽带来的细胞毒作用（图5C）,说明释放的细胞色素C能够引起caspase3的变化从而诱导细胞的凋亡。
2.5 多肽的血清稳定性
线性多肽在体内的半衰期较短，主要因为体内存在许多的蛋白酶，从而易于被蛋白酶所降解。本实验我们采用CCK-8活性来评判多肽的血清稳定性，血清的浓度为20%，我们选择20%的血清浓度是因为在图7中的3D肿瘤培养中我们使用的血清浓度为20%。如图6A所示，R-lycosin-I在8小时对癌细胞的毒性为80%，而Lycosin-I在加药后30min活性就下降了30%（图6B）。通过氨基酸替换增强了R-lycosin-I的胶体稳定性，使之不易沉淀析出，具有更好的血清稳定性。
2.6多肽对3D肿瘤球体的毒性作用
3D肿瘤为2维平面细胞培养和活体组织之间的研究架起了一座桥梁。3D肿瘤生长致密很好的模拟了体内肿瘤的生长状态，对于药物的筛选意义重大。我们通过前期肿瘤球体培养后，选取大小基本一致的肿瘤球体进行加药孵育。如图7A所示，细胞分别加40μM的药物，在加药后第二天球体出现了一定程度的抑制作用，但在加药后的第四天肿瘤球体出现了生长不受药物控制的情况。出现这种现象的原因可能是由于多肽的血清稳定性较差的原因，因为肿瘤球体培养用的血清浓度为20%，这对此类线性多肽的活性影响很大。由于这个原因，我们在第四天附加药物，浓度为40μM。在第八天后可以看到对肿瘤球体出现的不同程度的抑制作用。其中，R-lycosin-I的抑制作用比Lycosin-I的强，一方面由于R-lycosin-I的活性提升，另一方面由于R-lycosin-I的胶体稳定性更高，在20%的血清中不易沉淀。图7B是对肿瘤大小的量化图。通过阿尔玛蓝测定活性的方法，我们测定了加药后肿瘤球体的活性，如图7C所示，随着肿瘤球体的减少，其活性出现了一定程度的抑制。
2.8 多肽的肿瘤穿透性
通过激光共聚焦的Z扫描，利用荧光标记的多肽来探讨多肽对于肿瘤球体的穿透性。Z扫描的步阶为10μM, 如图8A所示，在30μM的时候，R-lycosin-I处理过的球体仍然还是满球体的荧光，相反，Lycosin-I处理后的在10μM的时候荧光最多（图8B），之后减少。这说明R-lycosin-I的肿瘤穿透性比Lycosin-I的好。这种稳定的增加可能来自下面几个方面：1：经过替换后的Lycosin-I具有更强的血清稳定性，这为多肽有效穿透肿瘤实体提供了前提。2:R-lycosin-I的活性比Lycosin-I更强。3：修饰后的多肽的物化性质提升了，更有利于多肽的摄取。
上述实验结果表明R-lycosin-I增强了对实体瘤细胞的细胞毒活性，保留了Lycosin-I原有的选择性。通过将K替换成R，E替换成Q，使R-lycosin-I的物化性质更加优于Lycosin-I。增强了多肽的电势和疏水性，促使癌细胞对R-lycosin-I的摄取量增加，在此同时，替换的精氨酸更有利于多肽从内吞囊泡中释放出来，减少被溶酶体降解的机率，增加了多肽的血清稳定性。摄取量和释放量增多，多肽作用于细胞内蛋白的几率增大，增加了细胞凋亡的数量。因此，R-lycosin-I可作为巨大潜力的开发新型抗肿瘤的候选药物。
序列表
<110> 湖南师范大学
<120> 一种抗癌活性肽及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> Lycosa singoriensis
<400> 1
Arg Gly Trp Phe Arg Ala Met Arg Ser Ile Ala Arg Phe Ile Ala Arg
1 5 10 15
Glu Arg Leu Arg Glu His Leu
20

Claims (2)

1.一种抗癌活性肽及应用，将Lycosin-I序列中的K替换成R，E替换成Q，得到了具有更强细胞毒活性的线性肽用于抗肿瘤药物研发；所述的抗癌肽是以Lycosin-I为模板设计合成出来的活性多肽毒素，包含23个氨基酸残基，氨基酸序列为：Arg Gly Trp Phe Arg AlaMet Arg Ser Ile Ala Arg Phe Ile Ala Arg Glu Arg Leu Arg Glu His Leu。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的抗癌肽分子量为2928.46Da，等电点12.12。
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