CN106563126A - 一种狼蛛抗癌活性肽修饰的纳米金颗粒肿瘤靶向性系统及应用 - Google Patents
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Abstract
一种狼蛛抗癌活性肽Lycosin‑I修饰的纳米金颗粒在肿瘤靶向运输以及光热治疗中的应用,将狼蛛Lycosa singoriensis抗癌活性肽共价修饰在纳米金颗粒的表面实现功能化纳米颗粒的肿瘤靶向性转移。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物技术与纳米医学的交叉领域,具体涉及将狼蛛抗癌活性肽lycosin-I功能化修饰在两种不同形状的纳米金颗粒材料表面,构建新型肿瘤靶向性的纳米颗粒传递系统,并进一步应用于肿瘤诊断与治疗。
背景技术
纳米金颗粒是指由金核与表面壳层组成的直径在几个到几百个纳米之内间的胶体或团聚颗粒。纳米金颗粒独特的光学性质、优良的催化性以及可设计性使得其在生物传感、生物成像以及疾病诊断与治疗等多方面有巨大的应用前景。然而,纳米金颗粒在生物系统上的应用同样也面临着不可避免的技术难点;纳米金颗粒本身的大小、形状以及表面化学性质影响了其在细胞内的摄取以及转运;不同生理环境中纳米金颗粒与环境成分的非特异性相互作用也会阻碍了金颗粒的应用。通过将多肽与纳米颗粒连用,使多肽功能化修饰在纳米金颗粒材料表面,构建新型靶向性的纳米颗粒传递系统,不仅能够增强多肽分子在生物体内的稳定性,更能最大程度地提高纳米材料在疾病诊断与治疗上的功能化应用效率,进一步应用于疾病诊断与治疗。因此,如何将多肽与纳米金颗粒结合应用于医学诊断与治疗是广大学者研究的热点。
发明内容
中国专利ZL200710035478.8公开的抗癌活性肽lycosin-I是一种来源于新疆穴居狼蛛含24个氨基酸残基的多肽,进一步研究发现lycosin-I具有与磷脂膜相互作用以及改变膜通透性的能力,是开发利用lycosin-I作为临床治疗药物的一个重要的突破口。
本发明的目的旨在于提供一种新型的抗癌活性肽lycosin-I功能化修饰的肿瘤靶向性纳米金颗粒系统,并进一步应用于肿瘤的诊断与治疗。
上述发明目的是通过以下技术方案实现的:lycosin-I与两种不同的纳米金颗粒材料的共价修饰与表征;Lycosin-I-纳米金颗粒在体外与体内的肿瘤转移效率评估;lycosin-I-纳米金颗粒的细胞毒活性评估;lycosin-I-纳米金颗粒在体外与体内的肿瘤光热治疗效率评估。
本发明所用多肽-纳米颗粒复合系统是通过以下方式制备与修饰的:
(1)lycosin-I多肽:通过Fmoc /叔丁基策略和HOBt/TBTU/NMM偶联的方法化学合成制备;
(2)60 nm金纳米微球的合成:利用柠檬酸钠还原法一步合成18 nm金颗粒;
(3)金纳米棒的合成:利用种子生长法合成金纳米棒;
(4)纳米金颗粒的表面多肽修饰:修饰示意图如图1A所示;
(5)修饰后纳米金颗粒的表征:经修饰的金颗粒的物理化学性质可通过测量其光谱以及Zeta-电势来表征。
附图说明
图1,lycosin-I-纳米金颗粒的修饰与表征:图1A,lycosin-I-金纳米微球(LGNP)与lycosin-I-金纳米棒(LGNR)的修饰示意图;图1B,LGNP与LGNR的紫外-可见光分光光谱;图1C,LGNP与LGNR的尺寸与Zeta电势;
图2,LGNP的肿瘤细胞选择性细胞内转移:图2A(左),三种肿瘤细胞对三种不同表面修饰的金纳米颗粒(GNP)的摄取,这三种GNP分别为LGNP,TAT肽表面修饰的GNP(TGNP)和PEG修饰的GNP(PGNP);图2A(右),三种非肿瘤细胞对三种GNP的摄取;图2B,六种细胞对三种GNP胞内摄取效率的定量分析;
图3,LGNP的体内肿瘤靶向效应:图3A,GNP在正常小鼠体内的生物分布;图3B,GNP在肿瘤小鼠体内的肿瘤靶向效应;
图4,LGNP的细胞毒活性分析;
图5,LGNR对肿瘤细胞的光热致死效应;
图6,LGNR的体内光热治疗肿瘤效应:图6A,肿瘤组织解剖图;图6B,肿瘤组织体积变化曲线;图6C,肿瘤组织大小比较;图6D,实验小鼠体重变化情况。
具体实施方式
为了进一步评估构建的多肽-纳米颗粒复合体系的肿瘤靶向性转移效率,我们利用了暗场显微成像技术以及原子吸收光谱分析对不同细胞对纳米金颗粒的摄取量进行了系统的评估。并构建了裸鼠肿瘤移植模型来进一步评估LGNP与LGNR的体内肿瘤靶向转移能力以及光热治疗效率。
1、 主要材料和仪器
CCK-8试剂盒购于碧云天生物技术公司,其余生化试剂购自Sigma公司;实验仪器主要有:倒置生物显微镜(Nikon Ti, Japan),电子倍增电荷稱合器件(EMCCD, AndoriXonUltra 897),岛津原子吸收分光光度计AA-6880,酶标仪SN256219(Biotek Instruments,美国),紫外-可见光分光光度计(耶拿分析仪器股份公司,德国),Zeta电位仪(马尔文仪器有限公司,英国),808 nm光线耦合激光器(北京思通博远激光科技有限公司,中国);本发明使用的Hela细胞、Mat-LyLu细胞、SW480细胞等细胞均为湖南师范大学蛋白质化学与蛋白质组学实验室保藏细胞株。
2、 实验方法和结果
2.1 纳米金颗粒的表面多肽修饰及表征
纳米金颗粒的表面多肽修饰示意图如图1A所示,修饰后纳米金颗粒的表征图1B中可以看出修饰前后纳米金颗粒的紫外可见光光谱峰型与缝宽保持一致,图1C中可以看出,lycosin-I的表面修饰使两种纳米金颗粒的表面电势均发生了正向漂移,且尺寸均没有发生明显的变化。证明lycosin-I已被成功修饰至两种纳米金颗粒的表面,且不会明显改变纳米颗粒本身的理化性质。
2.2 LGNP的肿瘤细胞选择性细胞转移效应
为了提高纳米颗粒的细胞内运输效率,不同的穿膜策略与穿膜分子多年以来一直是纳米颗粒生物应用上的研究热点。其中,细胞穿膜肽(cell penetrating peptide,CPP)由于其易于合成与改造,在药物传递系统中占据着重要地位。而来自于HIV病毒的反式激活蛋白(transactivator,TAT)作为最经典的CPP之一被证实能够显著提高金纳米颗粒在细胞内的转移量。本发明中,采用TAT修饰金纳米颗粒(TGNP)作为评估细胞内摄取效率的阳性对照,修饰方法与过程与LGNP完全一致。而未经任何修饰的金颗粒在生理缓冲液环境中非常不稳定,因此我们选择利用PEG修饰的金纳米颗粒(PGNP)作为阴性对照。将终浓度64μg/mL的金颗粒溶液处理细胞2小时后吸去金颗粒培养液,并用PBS洗涤细胞去除未进入细胞中和非特异性吸附在玻片表面上的纳米颗粒。利用暗场显微成像与原子吸收分光光度计定性定量评价不同细胞对不同金颗粒的摄取量。如图2A所示,LGNP与TGNP在三种肿瘤细胞中的摄取量较PGNP有了显著的提高。通过对细胞内金颗粒摄取量的定量分析发现,lycosin-I的功能化修饰使金颗粒在三种癌细胞内的摄取效率提高了26-96倍,与作为阳性对照的TGNP摄取效率相当,甚至在Mat-LyLu细胞中LGNP的摄取量比TGNP还高出85%。在图2B中可以看出,正常细胞对LGNP组的摄取量较肿瘤细胞明显下降,而对于TGNP和PGNP的摄取量与肿瘤细胞相当,以上实验结果证明lycosin-I的功能化修饰赋予金纳米颗粒肿瘤细胞特异性的高效转移效率。
2.3 LGNP的体内肿瘤靶向效应
为了进一步探究LGNP肿瘤靶向性细胞内转移效应在体内是否会受到影响,我们通过构建Hela细胞肿瘤移植裸鼠模型来评估LGNP在体内肿瘤的汇集效应。利用尾静脉注射的方式将金纳米颗粒注射进入肿瘤移植模型构建成功的裸鼠体内,同时设置瘤内注射组作为阳性对照。注射24小时后,实验动物肿瘤组织以及肝脏和脾脏中金颗粒所占比重如图3A所示。从图中可以明显看出,通过静脉注射方式进入肿瘤小鼠体内的LGNP主要汇集在肿瘤组织以及脾脏组织中,其比重平均值分别达到254.19 μg/g和211.20μg/g,对于两种不同表面修饰的金颗粒来说,经lycosin-I修饰的金纳米颗粒对于肿瘤组织的汇聚效应明显强于PEG修饰的金纳米颗粒,证明lycosin-I偶联的金纳米颗粒在体内仍然保持对肿瘤细胞的高转移效率,并能够通过血液循环系统累积在肿瘤细胞中;
为了进一步评估LGNP在体内的安全性,我们以腹腔注射和尾静脉注射两种方式将200μg LGNP注射进入小鼠体内,通过原子吸收光谱检测24小时后LGNP在小鼠体内的分布情况。如图3B,LGNP经两种方式注射进入小鼠体内24小时后主要分布在肝脏和脾脏中。值得注意的是,在两种处理注射方式组中,所检测的脏器与血液组织样品中富集的金颗粒的总含量平均值分别为14.6μg(静脉注射)和28.0μg(腹腔注射),与初始注射量200μg相比,含量大大减少,证明大量金颗粒已被排出体外,体现出LGNP在体内的快速清除效应。
2.4 LGNP的细胞毒活性分析
为了进一步研究金颗粒转入细胞中是否会对细胞的活性产生影响,我们利用WST-8法检测了不同纳米金颗粒对于Hela细胞的细胞毒活性。实验结果如图4所示,三种不同功能化修饰的GNP对Hela细胞在所测浓度下均没有明显的细胞毒活性。证明LGNP可作为靶向肿瘤细胞的稳定分子运输载体,通过负载其他的工具分子或药物分子,为恶性肿瘤的基础研究、诊断以及治疗提供更多的突破口。
2.5 LGNR对肿瘤细胞的光热致死效应
金纳米棒是一种棒状的金纳米材料,金纳米棒是一种棒状的金纳米材料,由于存在长轴与短轴两个方向上的等离子共振效应,能将光能有效地转化为热能。利用终浓度为16μg/mL LGNR分别预处理Hela和Hek293t细胞2小时后,去除溶液中多余的纳米颗粒,激光照射组分别用能量密度为2 W/cm2和5 W/cm2的808nm激光持续照射细胞5分钟。对照组细胞加入等体积的PBS溶液。继续培养24小时后,利用CCK-8试剂盒检测细胞活性。具体分组情况以及实验结果如图5所示。在PBS处理组中,近红外激光的持续照射并不会引起细胞活性的明显下降,且与激光的强弱无关,排除了激光照射可能带来的实验干扰。在LGNR预处理Hela细胞组中,随着照射激光功率的增强,细胞的活性发生了显著的下降。而在LGNR预处理Hek293t细胞组中,不同激光照射组之间的细胞活性并不存在统计学上的差异,细胞对激光照射不再敏感。比较相同实验条件下两种细胞的活性变化程度发现,LGNR预处理组中2W激光照射下,Hek293t细胞的细胞活性为88.9%,明显强于该条件处理条件下的Hela细胞。随着激光功率的增加,两种细胞间的活性差异更加显著。这种显著的光热作用的差异符合LGNR在两种不同细胞间差异性摄取规律,同时也证明了LGNR可以通过特异性累积在肿瘤细胞将近红外激光中的光能转化为热量,进而实现对肿瘤细胞的特异性杀灭作用。
2.6 LGNR的体内光热治疗肿瘤效应
为了进一步评估LGNR的体内光热治疗肿瘤效应,我们构建了裸鼠肿瘤移植模型,并在模型建立后的第一天,第四天以及第七天通过静脉注射将200μg LGNR、PGNR和PBS对照注射进入不同分组的每只小鼠体内。在每次注射后的第24小时以及48小时的时候给予每只小鼠肿瘤组织处5分钟的激光治疗(808nm,2W/cm2)。连续培养19天后,处死小鼠,取肿瘤组织称重统计分析。实验结果如图6所示,LGNR组经激光治疗后,体内的肿瘤组织停止了生长,仍然维持在原始大小。而PGNR组以及PBS组的肿瘤仍然保持生长,并在尺寸以及重量上明显大于LGNR组。同时连续的注射以及激光照射并不会引起实验小鼠体重的明显变化。以上结果证明,LGNR在体内仍保持对肿瘤组织的靶向效应,通过累积在肿瘤组织处,并表现出高效地光热治疗效应。
上述结果表明蜘蛛抗癌活性肽lycosin-I修饰的纳米金颗粒能够选择性地、高效地进入肿瘤细胞,为针对肿瘤细胞的药物运输和基因治疗提供了一个稳定的、新型的转运平台,对于肿瘤的诊断以及治疗具有极大的临床应用潜能。
Claims (2)
1.一种狼蛛抗癌活性肽Lycosin-I修饰的纳米金颗粒。
2.根据权利要求1所述的应用。
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