CN101497922A - Pnma5基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PNMA5基因的应用，用于制备诊断肝癌的产品和制备治疗肝癌的药物。本发明的PNMA5基因，可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速，且为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。

Description

PNMA5基因的应用

技术领域

本发明涉及一种基因，尤其涉及一种PNMA5基因的应用。

背景技术

肝癌是一种较为常见的恶性肿瘤。肝癌在我国恶性肿瘤死亡率中分别排第2和第3位，每年有约11万人死于肝癌，约占全世界肝癌死亡人数的45％(Feitelson MA，Sun B，Liu J，et al.Genetic mechanisms of hepatocarcinogenesis[J].Oncogene，2002，21(2)：2593-2604)。因此，提高肝癌早期诊断水平、选择科学合理的治疗方法和采取有效的预防复发转移措施将是改变这种局面的三个关键环节。

目前诊断原发性肝癌最重要的肿瘤标志物是甲胎球蛋白(AFP)，但在我国原发性肝癌患者中，血清AFP水平高于正常值者只占60％～70％；其中只有约32％的患者血清AFP水平能达到诊断标准(>400μg/L)，其余均为低浓度阳性。此外，部分肝炎、肝硬变等非肝癌患者的血清AFP水平也可异常升高。这些都影响了AFP这一指标的诊断特异性。因此，有待开发新的特异性肿瘤标记物，以提高原发性肝癌的诊断水平。

此外，由于我国肝癌患者多合并严重的肝硬化，且易肝内播散和远处转移，使手术切除受到很大限制，而且放化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞和免疫系统也有破坏和抑制作用。因此，治疗肝癌除了传统的手术、放疗、化疗方式外，还需要肿瘤治疗疫苗的辅助治疗。

肿瘤-睾丸(cancer-testis，CT)基因表达的抗原可诱导机体产生细胞免疫和/或体液免疫，为肿瘤免疫治疗的研究和应用开辟了新的路径。Scanlan等人根据RT-PCR结果将已知的CT基因分为4大类：第1类为睾丸特异性表达基因；第2类是组织限制性表达基因，除睾丸、卵巢和胎盘外，仅在脑或胰腺或肝脏中表达；第3类属组织差异性表达基因，除睾丸、卵巢和胎盘外，在其他3-6种组织中有共同表达；第4类为组织普遍性表达基因，在所有组织共同表达(Matthew J.Scanlan，Andrew J.G.Simpson，andLloydJ.Old.The cancer/testis genes：Review，standardization，and commentary.Cancer Immunity，2004，4(1)，1-8)。因此，发现新的肿瘤相关CT基因，可促进抗原特异性肿瘤疫苗的发展，为肿瘤免疫治疗提供新的机遇(ELke J，Dirk J，KnuthAlexander.Clinical cancer vaccine trials.CurrOpin Immunol，2002，14(2)：178-182)。

PNMA5基因，又叫KIAA1934基因，定位在X染色体上(Nagase T，Kikuno R，OharaO.Prediction of the coding sequences of unidentified human genes.XXI.Thecomplete sequences of 60 new cDNA clones from brain which code for largeproteins.DNA Res.2001，8(4)：179-187)。该基因全长为3194bp，编码一个448个氨基酸残基的蛋白质，它与肿瘤-睾丸-脑抗原家族成员PNMA1、PNMA2及PNMA3有很高的同源性。

有关PNMA5基因功能的研究非常少，目前，未见文献报道关于PNMA5基因与肝癌的关系。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种PNMA5基因的应用，该PNMA5基因可作为肝癌诊断的标记分子，提高了肝癌诊断的准确性。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种PNMA5基因在制备治疗肝癌的药物中的应用，使肿瘤的复发和转移得到有效控制。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种PNMA5基因在制备诊断肝癌的产品中的应用。

所述诊断肝癌的产品包括：用RT-PCR、实时定量PCR或免疫检测诊断肝癌的产品。

在本发明中，所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增PNMA5基因的引物。

所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增PNMA5基因的引物。

所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括：与PNMA5蛋白特异性结合的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。

在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对PNMA5蛋白特异的抗体。例如，将提纯的人PNMA5基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人PNMA5蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备(例如，Kohler et al.，Nature 256：495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6：292，1976)。本发明的抗体包括可以阻抑PNMA5功能的抗体，也可以是不影响人PNMA5功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人PNMA5基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人PNMA5基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的PNMA5基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞例如E.coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化PNMA5蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。

在本发明的另一方面，提供了一种PNMA5基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。

所述治疗肝癌的药物包括：通过RNA干扰抑制PNMA5基因表达的双链核糖核酸，或基于PNMA5抗原蛋白的肿瘤疫苗，或用于抑制PNMA5蛋白活性的蛋白质。

在本发明中，所述RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。

在本发明中，所述肿瘤疫苗是指用肿瘤组织中的特殊物质来激发患者体内的免疫功能，使患者的免疫功能能够杀伤肿瘤细胞。肿瘤疫苗主要指治疗性疫苗，是在病人得病后再用疫苗的方法进行治疗，以控制肿瘤的复发和转移。肿瘤疫苗具有个体性，因为每一个病人所得的肿瘤类型、分期都不一样，肿瘤细胞所表达的物质也不同，而肿瘤疫苗又是由病人本身的肿瘤制成，因此针对患者具体的肿瘤制备的肿瘤疫苗具有个体化特征，其副作用小，针对性强。

所述肿瘤疫苗制备时，用手术方法切取肿瘤患者的肿瘤组织并无菌冷冻保存，以提取肿瘤抗原。本发明的PNMA5抗原蛋白可作为肿瘤抗原被提取。获得肿瘤抗原是第一步，接着要获得树突状细胞，即从病人血液的单个核细胞中获得。采出单个核细胞后再进行筛选和体外培养，然后用肿瘤抗原PNMA5在体外刺激树突状细胞，使该树突状细胞能够传递免疫信息，最后将训练好的树突状细胞回输到体内，使体内产生针对肿瘤抗原PNMA5的免疫应答。

本发明治疗肝癌的药物施用方式可以是口服、全身施用(例如，透过皮肤、鼻吸入或者用栓剂)或肠胃外施用(例如，肌肉内、静脉内或皮下)。

本发明的药物也可被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物，可通过常规方法进行制备。针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。

本发明实验证明PNMA5基因在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，因此PNMA5基因可作为诊断肝癌的特异标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。本发明的实验还证明沉默PNMA5基因的表达可抑制肝癌细胞生长，因此PNMA5基因为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。

附图说明

图1是本发明通过RT-PCR检测PNMA5基因在人类正常组织中的表达图；

图2是本发明通过RT-PCR检测PNMA5基因在人肝癌组织和癌旁组织中的差异表达图；

图3是本发明通过实时荧光定量RT-PCR检测PNMA5基因在人肝癌组织和癌旁组织中差异表达的箱线图；

图4是本发明利用RT-PCR检测PNMA5基因在肝癌细胞株中的表达图；

图5是本发明利用RT-PCR和荧光定量PCR检测siRNAs沉默Focus和PLC细胞中PNMA5基因表达的结果图；

图6是本发明Focus和PLC细胞在转染siRNA-NC、siRNA-1和siRNA-2后的生长曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

RT-PCR实验检测PNMA5基因在人类正常组织及肝癌组织中的表达情况。

1.组织分离(Tissue isolation)

本发明所用肝癌及癌旁组织均来自临床肝癌的手术病人。手术切除的肝癌组织一经离体，迅速切取病灶及周围5公分以外正常组织，并放入液氮中保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。15种人体正常组织(脑、心、肺、脾、肾、胃、食管、小肠、卵巢、乳腺、前列腺、胰腺、肝、胎肝及睾丸)RNA均购自Clontech公司。逆转录酶为M-MLV Reverse Transcriptase，Promega CO.。PCR试剂Taq DNA聚合酶、dNTP等均为大连宝生物技术有限公司。PNMA5基因(GeneID：114824)的引物是Forward：5’-AAGCCAGTGTCTCTGCACCT-3’(SEQ ID NO：1)、Reverse：5’-CTTGATCTCGACCTGGCTTC-3’(SEQ ID NO：2)，PCR产物长度为400bp。作为内对照的β-actin引物是Forward：5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’(SEQ ID NO：3)、Reverse：5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’(SEQ ID NO：4)；β-actin扩增片断长度为400bp。

2.总RNA的抽提试剂盒

抽提RNA试剂采用TRIzol reagent(GIBCO/BRL)，该试剂是基于酸性酚一步抽提法生产的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要进行无RNA酶处理，以保证实验中无RNA酶的环境。

3.RNA的抽提步骤

将碾杵和匀浆器等器皿在200℃干烤4h，去除RNA酶，冷却；加入液氮中预冷，将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入TRIzol试剂的匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4℃离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4℃离心分层；将上层水相转入一无RNA酶的离心管中，加异丙醇，4℃离心沉淀RNA；用75％乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA质量鉴定：紫外分光光度计测定260/280比值(比值均在1.7～2.0)；并在MOPS甲醛变性胶中观察有无降解，本发明所用RNA均无降解。为了去除基因组DNA的污染，全部RNA均用无RNA酶的DNA酶I(美国Ambion公司)消化。

4.cDNA的合成

取总RNA2μg，随机引物1μl，70℃保温3min，立即冰上变性5min。加入5×buffer，DTT和0.05g·L^-1的dNTP各2μl及1μl的逆转录酶，充分混匀后，42℃2h。模板使用终浓度通常为0.01g·L^-1。

5.半定量RT-PCR

以cDNA为模板，PCR扩增PNMA5基因，同时以β-actin作为模板量的对照。PCR条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，共35循环(β-actin为25循环)；72℃延伸5min。用2％琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物。

6.实验结果显示，PNMA5基因仅在睾丸、卵巢和大脑组织中表达，其它组织中未见表达(见图1)。利用半定量RT-PCR方法检测PNMA5基因在12对人类肝癌组织及癌旁组织中的表达情况，结果发现PNMA5基因在5(42％)例肝癌中明显上调，阳性结果

(见图2)。在图2中，“N”指癌旁组织，“C”指肝癌组织。

7.根据上述实验结果，可通过RT-PCR诊断肝癌：设计PNMA5基因的PCR引物，检测肿瘤组织中PNMA5基因RNA的含量，RNA含量高则说明患肝癌的可能性高，反之则低。

实施例2实时荧光定量RT-PCR实验

使用TaKaRa生物公司的新型实时荧光定量PCR仪(Thermal Cycler DiceDetection System，日本)，检测PNMA5基因在上述12对人类肝癌组织及其对应的癌旁组织中的表达。反应体系如下：总体积20ul，SYBR Premix EX Taq 10ul，引物(10uM)各0.4ul，DNA 2ul，ddH₂O 7.2ul，上下颠倒混匀试剂，离心后放入PCR仪中进行扩增反应。仪器使用按厂家的说明操作。β-Actin被用来当作内对照。所述实验均重复三次以确保结果的可靠性。肝癌和癌旁组织中的PNMA5基因的表达水平按以下方法进行计算：PNMA5ΔCt＝平均PNMA5_Ct-平均β-actin_Ct，PNMA5Δ Δ Ct＝PNMA5Δ Ct_癌组织-PNMA5Δ Ct_癌旁组织，癌和癌旁组织中的PNMA5基因的倍数关系用2^-PNMA5ΔΔCt来计算。实验数据用SPSS软件统计(χ²检验)，P<0.01定义为有统计学意义。

结果显示，PNMA5基因在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，大于2倍的有7例(58％，P<0.01)，其中大于4倍以上的有3例，因此，PNMA5基因在肝癌组和癌旁组中的表达有明显差异(见图3和表1)。在图3中，“*”代表p<0.01，方框内横线代表每组检测值ΔCt的中值，方框外的上下短线分别代表检测值中的最高值和最低值。本发明荧光定量PCR检测的阳性率高于上述普通RT-PCR的结果，这可能与荧光定量PCR的高灵敏度有关。

表1 PNMA5基因在12对肝癌样本中的表达分析

该实验结果表明，可通过实时荧光定量PCR诊断肝癌：设计PNMA5基因的PCR引物，检测肝癌组织中PNMA5基因RNA的含量，RNA含量高则说明患肝癌的可能性高，反之则低。

实施例3 免疫检测

1.抗原蛋白获得

(1)利用基因工程表达：可从Genbank数据库中获得人PNMA5基因的cDNA序列，通过PCR扩增获得编码框，插入原核生物或真核生物表达载体中，表达PNMA5蛋白，并按基因工程表达产物的纯化体系纯化蛋白质。

(2)通过培养高表达PNMA5基因的人体来源细胞或组织，再分离纯化PNMA5蛋白。

2.抗体制备

可采用以下几种方法制备抗体：

(1)细胞融合法：用上述制备的PNMA5蛋白免疫动物(包括兔子、山羊等)，获得脾脏细胞，再与骨髓瘤细胞融合，并按常规单克隆抗体制备技术制备单克隆抗体。

(2)利用噬菌体表面展示库，克隆免疫动物的脾脏IgG可变区并表达成基因工程单克隆抗体。

(3)利用纯化的蛋白质免疫动物，制备多抗血清。

3.检测

(1)用制备的抗体(多抗或单抗)，用组织化学方法进行肝癌的病理检测，阳性信号为肝癌。

(2)取患者血清，用ELISA方法检测，阳性反应为肝癌可疑病人。

(3)将PNMA5抗体作为蛋白质芯片的探针之一，用于多种肿瘤诊断。

实施例4 肝癌细胞株模型的选择

为了寻找深入研究PNMA5基因功能的细胞模型，利用半定量的RT-PCR技术，检测PNMA5基因在5个常见的人类肝癌细胞(BEL7405、SMMC7721、PLC、YY8103和Focus)中的表达。结果发现PNMA5基因在Focus和PLC中高表达，在BEL7405、SMMC7721和YY8103细胞仅有较弱的表达(见图4)。因此，选择Focus和PLC作为进一步研究PNMA5基因的细胞模型。

肝癌细胞株Focus、PLC由本实验室保种，复苏后在含10％胎牛血清、200单位/毫升青霉素、200皮克/毫升链霉素的DMEM(GIBCO)培液中，5％ CO₂、37℃条件下培养，以用于siRNA转染。

实施例5基于肝癌细胞株PLC、Focus对PNMA5基因进行RNA干扰实验

为了研究RNA干扰对PNMA5基因的瞬间沉默作用，首先针对PNMA5基因的编码区序列设计并化学合成2条特异性siRNA片段(siRNA-1、siRNA-2)，同时合成1条与人类无同源性的无关siRNA作为阴性对照(siRNA-NC)，详细序列见表2。将该些siRNA片段分别瞬间转染Focus和PLC细胞，培养5d后收集细胞，利用RT-PCR和荧光定量PCR技术分析PNMA5基因的表达。结果发现，与对照组(siRNA-NC)相比，转染siRNA-1和siRNA-2的Focus和PLC细胞中PNMA5基因均被明显下调(见图5A，5B，5C，5D)。在图5中，A和C分别为RT-PCR检测siRNAs沉默Focus和PLC细胞中PNMA5基因的表达，B和D分别为荧光定量PCR检测siRNAs沉默Focus和PLC细胞中PNMA5基因的表达。

表2 特异性RNA干扰片段的序列

实施例6 转染PNMA5基因特异性siRNA后的细胞增殖分析

为了研究上述3种siRNAs对Focus和PLC细胞生长的影响，利用CCK-8(cellcounting kit-8，细胞计数试剂盒，Dojindo)的技术分别检测转染siRNAs三天后，细胞生长曲线的变化。

在96孔板中每孔接种3×10³肝癌细胞(无血清培养液)，待细胞密度达到40％左右时，利用Lipofectamine 2000(Invotrogen)转染试剂分别将上述3种siRNA按终浓度50nmol/L(0.25μL)的量转染进肝癌细胞中，4h后换成含10％胎牛血清的DMEM。以24h为一个检测单位培养5天，每天检测1次该细胞密度。每孔待测细胞液中加10μL CCK-8，37℃孵育1h。利用酶标仪(Bio-Tek，MQX200)在450nm波长下检测其吸光度以代表细胞存活能力，绘制生长曲线。所有实验均独立重复3次。

结果显示，与对照组(siRNA-NC)相比较，转染siRNA-1和siRNA-2后Focus和PLC细胞的生长均受到明显抑制，p<0.05(见图6A和6B)。在图6中，A为Focus细胞的生长曲线图，B为PLC细胞的生长曲线图。该结果表明，沉默PNMA5基因的表达可抑制肝癌细胞的生长增殖水平。

实施例7 PNMA5抗原蛋白作为肿瘤疫苗的应用

1.原发性肝癌组织标本在术中取材，术后均经病理诊断确证。采用美国PEL-FREEZA-SSP UNITRAY试剂盒对肝癌组织DNA进行PCR扩增，PCR产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳，根据电泳结果对细胞株HLA-A位点分型。

2.总RNA的提取和cDNA的合成：利用Trizol试剂(Gibco BRL公司)提取肝癌组织总RNA，溶于适量焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的超纯水中并定量。取5μg RNA标本，用逆转录酶Superscript II合成cDNA。

3.抗原基因cDNA的PCR扩增：总反应体积为50μl。其中含2μl cDNA、25pmolCT抗原基因PNMA5的引物。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

4.PCR产物的纯化、克隆和测序：参照《分子克隆》(第3版)的方法。

5.DC(树突状细胞)的体外分离和培养：患者外周静脉血经淋巴细胞分层液Ficoll梯度离心后分离界面单个核细胞。细胞经洗涤2次后，用无血清培养基AIM—V培养液(Gibco BRL公司)悬浮，调整细胞浓度到3×10⁶个/ml，接种入6孔培养板。在37℃、5％CO₂孵箱中培养过夜后，轻轻吹打悬浮细胞并回收冻存，用以制备效应细胞。在贴壁细胞培养液中加入含1000U/ml粒单集落刺激因子和500U/ml白细胞介素的AIM-V。培养至第7天时，收获悬浮的DC。

6.多肽合成：PNMA5抗原多肽由多肽合成仪合成。T2细胞或HLA-A2的EBV(Epstein Barr Virus，非洲淋巴细胞瘤病毒)转染的人B淋巴细胞与终浓度为20ug/ml的PNMA5抗原多肽共孵育4小时，洗涤后作为靶细胞。

7.通过以下方式鉴定本发明治疗肝癌的肿瘤CT抗原疫苗，通过DC递呈PNMA5抗原肽活化效应T细胞，产生特异性针对PNMA5抗原表位的免疫应答：

(1)DC膜标志的鉴定：用荧光标记抗体，HLA-DR(购自Pharmingen公司)检测，通过流式细胞仪检测细胞表型。

(2)DC细胞的处理：DC经离心后重悬浮在2mlAIM-V中，并加入PNMA5抗原肽至该多肽终浓度为40ug/ml。37℃、5％CO₂培养18小时，经3000rad放射线照射后，洗涤待用。

(3)效应细胞的制备：非贴壁细胞复苏后，与照射后的DC细胞以20：1混合共孵育6-7天，再按照相同比例加入DC，6-7天后，再次重复刺激一次，作为效应T细胞。于0、7、10、14、19天，分别留取培养上清，用于细胞因子检测。

(4)细胞因子检测：采用细胞因子检测试剂盒(购自美国Endogen公司)检测培养上清中分泌的细胞因子。

8.实验结果表明，经本发明PNMA5抗原肽刺激的DC所活化的效应T细胞，能产生特异性针对PNMA5抗原表位的免疫应答，从而特异性杀伤结合有该相同PNMA5抗原肽的靶细胞，说明本发明PNMA5抗原蛋白可以作为潜在的肝癌治疗性疫苗。

实施例8 以PNMA5基因表达产物为靶分子设计的基因治疗

以PNMA5基因表达产物为靶分子，设计一种携带某基因的表达载体，导入该载体，其产物对PNMA5基因的表达有抑制作用，或对PNMA5蛋白活性有抑制作用。

序列表

<110>上海人类基因组研究中心

<120>PNMA5基因的应用

<130>NP-08-12215

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>2

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>3

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>4

<210>5

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_RNA

<222>(1)..(21)

<223>siRNA

<400>5

<210>6

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_RNA

<222>(1)..(21)

<223>siRNA

<400>6

<210>7

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

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<221>misc_RNA

<222>(1)..(23)

<223>siRNA

<400>7

<210>8

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

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<221>misc_RNA

<222>(1)..(23)

<223>siRNA

<400>8

<210>9

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

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<223>siRNA

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<210>10

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_RNA

<222>(1)..(21)

<223>siRNA

<400>10

Claims (7)

1.一种PNMA5基因的应用，其特征在于，所述PNMA5基因在制备诊断肝癌的产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诊断肝癌的产品包括：用RT-PCR、实时定量PCR或免疫检测诊断肝癌的产品。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增PNMA5基因的引物。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增PNMA5基因的引物。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括：与PNMA5蛋白特异性结合的抗体。

6.一种PNMA5基因的应用，其特征在于，所述PNMA5基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述治疗肝癌的药物包括：通过RNA干扰抑制PNMA5基因表达的双链核糖核酸，或基于PNMA5抗原蛋白的肿瘤疫苗，或用于抑制PNMA5蛋白活性的蛋白质。

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