CN101487030B - 酶促制备羧酸酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶促制备羧酸酯的方法，其特征在于通过引入气体来混合并排出反应的水，同时达到低效率比EV。

Description

酶促制备羧酸酯的方法
本发明涉及一种酶促制备羧酸酯的新方法。
背景技术
羧酸酯是一类重要的化合物。例如，脂肪酸酯常常用于化妆品配方中的油相。已知有多种方法可以由羧酸制备羧酸酯。关于这一主题的第一篇概述见于Becker等，“Organikum”，22版，Wiley-VCH 2004，Weinheim，Germany，472页及其后各页。
近来，发现了更多的基于生物催化剂的方法。这种方法的主要优点在于其温和的反应条件，这允许在相对低的温温度、通常是100℃以下温和地发生转化。同时，酶促方法经常体现出另一个优点，特别是它们常常具有高化学选择性、区域选择性和对映选择性。使用非均相生物催化剂，例如固定于惰性载体上的酶或者含酶的微生物，优点在于反应过后催化剂便于去除或者如果需要能够循环使用。用于酶固定的载体常常是离子交换树脂或具有合适粒度分布的聚合物小球。这类载体的实例为商业化产品来自Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark的Novozym 435、Lipozym RM IM或Lipozym TL IM，或日本Amano的Amano PS。然而，已经报道了很多获得固定酶制剂的其他方法，例如在K.Faber报道的“Biotransformations inOrganic Chemistry”中，见于Springer：2000，Berlin，Germany，384 ff.，J.Am.Chem.Soc.1999，121，9487-9496，J.Mol.Catal.B，2005，35，93-99或者在专利申请DE 10 2007 031689.7中。
为了确保可复用性的另外一个条件是将机械力最小化，这种机械力作用于所用的催化剂并导致载体分解(disintegration)，因此大大降低了粒度，从而不能满足易于去除的要求，并且常常观察到催化剂活性的严重损失。这种机械力尤其存在于使用传统的搅拌反应器时，例如DE 10 2007031689.7描述了在使用于搅拌烧瓶后发生的酶固定物(enzyme immobilizate)粒度的下降。
提高所用的催化剂的机械稳定性的一个方法是使用固定床式反应器。例如Eur.J.Lipid Sci.Technol.2003，105，601-607描述了使用固定床式反应器来进行脂肪酶催化的酯化反应。在这里，催化剂填满床体，将反应混合物从储备池中通过固定床体循环抽出，直到转化率达到预期要求。
降低反应温度可以得到最佳的产品质量，但利用该方法在工业上进行反应的时候也有缺点。从相应的酸和醇来制备羧酸酯的反应是一个平衡反应，其中产品、尤其是形成的反应水必须从反应体系中去除以达到高转化率。为了达到特别高的转化率，例如99％以上的转化率，几乎必须要完全去除水分。这一般是通过蒸馏来完成。
本领域技术人员熟悉的是，从混合物中蒸馏去除物质，随着待去除的物质的浓度降低蒸馏逐渐更加困难，因为该物质在混合物中的蒸汽压比纯物质状态大大减小(拉乌尔定律)。因此，必须使用其他特殊的方法来有效去除水分。
一种热力学的控制方法在于提高混合物的温度，例如远远高于100℃，但是在酶促反应中这种方法不适用。首先，因为该方法排除了酶促反应的实际优势、具体而言即在低温进行反应的优势，第二是由于在这么高的温度下酶的使用寿命会大大缩短。
另外一种热力学控制方法在于控制周围环境的压力与混合物中待去除的水的蒸汽压极其相近。但是为达到这个目的高真空度仅在高水平的成本可实施，而且不方便在产业化规模、即在数吨产能的工厂里执行。
另外的选择是使用一种溶剂，它或者能够提高水的蒸汽压，或者能与水共沸蒸馏出来。但是使用这些溶剂通常都不理想，因为首先它们增加了额外成本(较低的反应器的负载量，循环成本等)。第二，对于很多产品应用来说，必须确保没有溶剂残余物，例如在化妆品或者制药工业中，通常必须降低到一位数的ppm级范围。通常这在原则上可行，但是一般需要额外的工艺步骤，例如蒸馏、萃取或者蒸发，这些都会占用额外的时间，从而进一步增加制备成本，降低过程的空间-时间产率。
进一步的变体在于，将反应混合物进入气体空间的质量传递的动力学限制最小化，例如，在使用降膜蒸发器的情况下增加混合物表面积。这里也一样，设备的复杂性也经常不成比例地高。
J.Biotech.2004，110，209-217描述了在喷射反应器中酶切酯用于合成酮洛芬。由于反应在水中进行，但是要去除的不是通常在有机介质中很难去除的水分，而是2-氯乙醇。但转换率仅仅能够达到40％以下。在这些低转化率的情况下，由于大量的过量的水，没有达到反应平衡，同时，由于热力学原因，根本没有必要产物，因此对反应状态没有影响。此外作者发现在第三次使用酶后，活性大大损失(见215页图6，已引证)，因此无法说明具有良好的可复用性。在喷射反应器中最初观察到反应速率比固定床反应器要高是由于酶浓度提高了三分之一(前者是5mmol的酯用50mg酶，后者40mmol酯用300mg酶，见215页图6的脚注，已引证)；产量的提高是由于在显著更低的转化率终止喷射反应并且采用了较高的初始速率的结果。
在工业上进行酯化反应的过程中，通常需要将反应时间最小化来降低制备成本。通常总体反应时间应该低于24小时，优选低于12小时，更优选低于6小时，尤其是低于3小时。鉴于此原因，必须要了解所要研究反应的反应速率决定因素。在酯化反应的情况下可能是催化剂的用量，或者像上面所说的反应中水的去除。第一种情况下，提高催化剂用量是一种方法，第二种情况需要优化排水。
上面所描述的目前本领域技术发展水平代表性地指明了用于酶促酯化的工业方法，其中酶的用量理论上应允许反应时间是24小时以下，优选12小时以下，更优选6小时以下，最佳3小时以下，但是实际上最终大大延长反应时间的在于排水的限制。
用于测量反应效率的一种方法是通过比较达到特定转化率时实际观察到的有效反应时间(ER)与计算得出的理论最小反应时间(TR)。后者可以根据测量出的反应中使用的酶的比活性和数量以及这种酶对该反应的Michaelis-MentenKm常数计算得到最接近的值。例如，其理论基础可见于Voet，Voet，“Biochemie”[Biochemistry]，第一版，Wiley-VCH：1992，Weinheim，Germany，P329-331。可以用得到的有效反应时间ER和理论最小反应时间TR的商来说明该过程的效率。效率比(EV)是下面用于衡量酶促酯化反应过程的非常合适的量度。
“材料和方法”部分详细叙述了理论推算的最小反应时间TR和效率比EV的方法。
在理想情况下，EV值为1；在实际反应中，将EV值降低到越接近1越理想。尤其是在诸如高于99％的高转化率反应中，观察到的效率比远远大于1，甚至大于5或大于10。利用实施例6中适当的EV值计算方法，非本发明的实施例1和2表明现有技术方法的EV值很高。
仍然需要用于酶促制备羧酸酯的反应方法，所述方法克服了现有技术的至少一个缺点。
发明目的
因此，本发明的一个目的在于提供一种用于在无溶剂、酶促条件下自羧酸和醇制备羧酸酯的普遍适用的方法，该方法转化率很高，反应时间短同时可多次地重复使用。
本发明的另外没有明确说明的目的明显地阐述在下面的实施例和权利要求书内容中。
我们惊奇地发现，这个目的通过反应器设计而实现，该反应器的设计通过引入气体从而既能够混合反应物又能排出反应过程中的水。
本发明因此提供利用所述的反应器设计制备羧酸衍生物的方法。
发明描述
在本发明的方法中，通过引进气流混合所用的反应混合物和生物催化剂，同时去除反应过程中形成的水。
由于本发明的方法可以免于在反应室中使用搅拌器，并且由于通过气体供给来确保混合，由搅拌器引起的对于催化剂颗粒的机械应力和热应力被将至最小。这是催化剂重复使用的根本的前提条件。
根据本发明内容，所使用的气体与反应物、催化剂或者反应器材料不发生任何反应。优选使用空气、贫气(lean air)、氧气、氮气、惰性气体或者二氧化碳。使用的气体可以由适当的压力容器供给，例如气瓶或者压缩机。废气流可以直接排出或者通过适当的措施重复使用和循环。
本发明所使用的催化剂可以具有这样的平均粒度的颗粒，使得它们能够通过通常可用的过滤系统保留在反应容器中而不会造成任何大的压力降低，也就是说，颗粒粒度大于0.5μm，优选大于5μm，更优选大于10μm，特别是大于25μm。
制备酶固定物可以使用全细胞、静息细胞、纯化的酶或者含有所述酶或其混合物的细胞提取物。优选使用水解酶，例如脂肪酶、酯酶或者蛋白酶，例如来自皱落假丝酵母(Candida rugosa)、南极洲假丝酵母(CandidaAntarctica)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、(Thermomyces langosiosus)、猪胰腺、Mucor miehei、产碱杆菌(Alcaligines sp.)的脂肪酶，来自皱落假丝酵母的胆固醇酶，来自猪肝脏的酯酶，尤其优选使用脂肪酶。因此，酶固定物优选含有水解酶类的酶，优选脂肪酶。
用于固定所述酶或者含有酶的微生物的载体可以是惰性的有机或无机载体。所用的惰性载体优选为那些颗粒载体，或者存在于酶固定物中的载体，这些载体优选粒径分布中至少90％的颗粒的粒度为0.5到5000μm、优选10μm到2000μm、更优选25μm到2000μm的载体。所用的有机载体可以特别是那些包含以下物质或由以下物质组成的载体：聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚乙烯对苯二甲酸酯、PTFE和/或其他聚合物。根据待固定的酶，所用的载体材料可以尤其是酸性或者碱性交换树脂，例如Duolite A568，Duolite XAD 761，Duolite XAD 1180，Duolite XAD 7HP，Amberlite IR 120，Amberlite IR 400，Amberlite CG 50，Amberlyst 15(所有的产品均来自Rohmand Haas)，或者Lewatit CNP 105和Lewatit VP OC 1600(产品来自Lanxess，Leverkusen，德国)。所用的无机载体材料可以是现有技术中已有的氧化物和/或陶瓷载体。更具体地，使用的无机载体可以是，例如，才利特(Celite)、沸石、二氧化硅、可控孔度玻璃(CPG)或者其他载体，例如L.Cao描述的“Carrier-bound Immobilized Enzymes：Principles，Application and Design”，Wiley-VCH：2005，Weinheim，Germany。更优选地，酶固定物中存在的惰性载体或者用于制备酶固定物的惰性载体由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯或者聚丙烯酸酯组成。
因此，本发明提供了一种通过酶促合成羧酸酯的方法，该方法通过引入气体来混合并排出反应的水，同时达到低效率比EV。
本发明进一步提供了一种将酶催化剂以颗粒形式共价或者非共价地固定于载体材料的方法。
本发明进一步提供了一种方法，其中载体材料的平均粒度大于0.5μm。
本发明进一步提供了一种方法，其中所用的气体为空气、贫气、氧气、氮气或者二氧化碳，优选空气或者氮气。
本发明进一步提供了一种方法，其中所述反应在20℃-100℃的温度进行。
本发明进一步提供了一种方法，其中转化率达到95％，效率比EV95＜3.0。
本发明进一步提供了一种方法，其中转化率达到98％，效率比EV98＜4.0。
本发明进一步提供了一种方法，其中转化率达到99％，效率比EV99＜5.0。
本发明进一步提供了一种方法，其中转化率达到99.6％，效率比EV99.6＜8.0。
根据本发明内容，所述酶催化剂可以共价或者非共价地固定于载体颗粒。
本发明所用的酶固定物的实例是来自Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark的Novozym 435、Lipozym RM IM oder Lipozym TL IM或者来自日本Amano的Amano PS。
本发明的方法在20℃-100℃、优选40℃-90℃的温度进行。
研究发现，在酯化反应中，本发明的方法可以达到转化率95％，效率比EV95＜3.0，优选＜2.5，更优选＜2.0，特别是＜1.75.
此外，发现在酯化反应中，本发明的方法可以达到转化率98％，效率比EV98＜4.0，优选＜3.00，更优选小于2.50。
此外，发现在酯化反应中，本发明的方法可以达到转化率99％，效率比EV99＜5.0，优选＜4.0，更优选小于3.0，特别是＜2.5。
最后，发现在酯化反应中，本发明的方法可以达到转化率99.6％，效率比EV99.6＜8.0，优选＜5.0，更优选＜4.0，特别是＜3.5。
根据本发明，优选地使用所述方法进行通式I的反应：
其中，
R1为含有2-30个碳原子的直链、支链、饱和或不饱和、任选地被另外取代的羧酸的酰基，
R2为含有2-30个碳原子的直链、支链、饱和或不饱和、任选地被另外取代的烃基。
根据本发明，所述R1和R2的任选的其它取代基可以各自独立地是例如羟基、酯基、聚酯基、碳酸酯基、聚碳酸酯基、醚基、聚醚基、氨基甲酸酯基、聚氨基甲酸酯基、酰胺基、聚酰胺基、烷基氨基、二烷基氨基、卤化物、硅氧烷基、无机酸的酯基、硫酸酯、磷酸酯或者类似基团。
在一种优选实施方式中，R1是商业上可获得的酸类的酰基，例如乙酸，丙酸，丁酸，戊酸，氯乙酸，三氟乙酸，乙基已酸，异壬酸，异三癸酸(isotridecanoic acid)或者异硬脂酸。
在另一种优选实施方式中，所用的R1基是基于天然植物油或动物油的天然脂肪酸的酰基。优选使用天然脂肪酸，例如羊油酸，羊脂酸，羊蜡酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，棕榈油酸，异硬脂酸，硬脂酸，12-羟基硬脂酸，二羟基硬脂酸，油酸，亚油酸，岩芹酸，反油酸，花生酸(arachic acid)，二十二酸，芥子酸，鳕烯酸，亚麻酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸或花生四烯酸酸，单独使用或以混合物使用。同样R1基可以是羧基官酸的缩聚产物的酰基，如聚-12-羟基硬脂酸或聚蓖麻油酸。用作所述R1基的酰基可以是诸如天然脂肪酸混合物的技术级混合物，所述天然脂肪酸例如，菜籽油脂肪酸，大豆油脂肪酸，葵花籽油脂肪酸，牛油脂肪酸，棕榈油脂肪酸，棕仁油脂肪酸，椰子脂肪酸，根据它们的具体来源和使用的提纯过程，它们的具体成分可以发生变化，同时也可以含有典型的第二成分，例如不饱和、功能化或支链成分。另外也可以使用其他来源的酸的混合物，例如基于石化过程的产品。
在另一种实施方式中，所用的R2基是例如以下醇类的羟基：丙醇，丁醇，己醇，辛醇，或其异构体，如异丙醇，异丁醇，2-乙基己醇，异壬醇，异十三烷基醇；多羟基醇，例如1，6-己二醇，1，2戊二醇，二羟基丙酮，1，2-丙二醇，1，3-丙二醇，新戊二醇，三羟甲基丙烷，季戊四醇，山梨醇，丙三醇，双甘油，三甘油，聚丙三醇，乙二醇，二乙二醇，三乙二醇，聚乙二醇；或者氨基官能化的醇，例如N，N-二甲乙醇胺。进一步的实例是利用已知方法由来源于天然植物油或动物油的一元脂肪酸制备的醇的烃基，所述脂肪酸含有6-30个碳原子，特别是含有8-22个碳原子，例如羊油酸，羊脂酸，羊蜡酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，棕榈油酸，异硬脂酸，硬脂酸，12-羟基硬脂酸，二羟基硬脂酸，油酸，亚油酸，岩芹酸，反油酸，花生酸，二十二酸，芥子酸，鳕烯酸，亚麻酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸或者花生四烯酸，单独使用或者以混合物使用。
本发明的聚醚取代的R2基的实例是聚乙二醇，聚丙二醇，聚丁二醇，聚氧化苯乙烯、或者至少两种以下单体的共聚物的烃基，这些单体为乙二醇，丙二醇，丁二醇，氧化苯乙烯和聚合甘油。这些聚醚取代的基团反过来也会进一步在羟基上被基团取代，例如烷基醚或烷基醚或者烷基酯。
本发明的聚醚取代的R2基的实例是是含有自由羟基并基于ε-己内酯和γ-戊内酯的聚合物，例如Daicel的Placcel L212AL。
本发明的聚碳酸酯取代的R3基是含有自由羟基并基于二烷基碳酸和二羟基烷基单元的聚合物，例如Daicel的Placcel CD220。
本发明的聚硅氧烷取代的R2基的实例为含有自由烷基羟基的有机改性的聚硅氧烷，例如，可通过本领域技术人员已知的方法用末端(terminally)不饱和醇将SiH-硅氧烷氢化硅烷化获得。具体地，这里可以使用直链链烯醇，例如5-己烯-1-醇，或者烯丙氧基衍生物，如烯丙氧基乙醇，烯丙基丙三醇，烯丙基聚丙三醇，烯丙基三羟甲基丙烷，烯丙基聚乙二醇，烯丙基聚乙二醇，或者烯丙基聚乙二醇-聚丙二醇共聚物。
本发明的聚硅氧烷取代的R1基的实例为含有自由羧基的有机改性的聚硅氧烷，例如，可通过本领域技术人员已知的方法用末端不饱和酸将SiH-硅氧烷氢化硅烷化获得。具体地，这里可以使用丙烯酸，甲基丙烯酸或者十一烯酸。
下面的实施例和理论考虑的目的在于详细阐明本发明，不限制由本说明书和权利要求书所体现的保护范围。
以下将通过实施例来阐述本发明的方法，而不意于将本发明限制于这些例示的实施方式中。下文所指定的范围、通式或者化合物种类不仅包括明确提及的相应的范围或者化合物种类，同时包括可以通过选择个别值(范围)或化合物而获得的子范围和子类。本说明书中所引用的文献的内容全部并入本发明的公开内容中。例如具有不同单元的聚合物载体材料、酸或者酯在本发明内容中不止一次地描述，这些单元可以在这些化合物中随机分布(任意低聚体)或者规则地出现在这些化合物中(嵌段低聚体)。这些化合物中单元数量的信息应解释为对所有相应化合物进行平均的平均值。
如果所述反应物将用于以非化学计量比的比例进行的酯化反应，则报告的转化率数据基于不足的成分。
材料和方法：
Novozym 435(NZ435)是购于Novozymes A/S，Bagsvaerd/Denmark的商品化酶固定物，脂肪酶B来自通过吸附在聚甲基丙烯酸酯上而固定的南极洲假丝酵母。
确定通过Novozym 435催化制备肉荳蔻酸肉荳蔻酯的反应的k cat 。
将10mg Novozym 435加入等摩尔的5ml底物溶液(肉荳蔻酸和肉荳蔻醇)，在60℃搅拌下温度。在25min内每隔5min取样(取样体积为50μl)并将其转入950μl的癸烷(内标：4mM十二烷)中。用最初产品形成速率确定kcat，确定结果为7000μmol*mg-1*min-1。通过气相色谱检测肉荳蔻酸肉荳蔻酯(Shimadzu 2010，色谱柱为SGE的BTX柱；长25m，I.D.0.22μm；膜：0.25μm；检测器类型：FID，检测器温度：300℃；注射器温度为275℃，注射体积为1μl，分流比：35.0；载气压力(氦气)150kPa；温度程序：初始温度60℃，维持1.5min，升温速率为20℃/min，最终温度为250℃，维持2.5min)。
确定通过Novozym 435催化制备肉荳蔻酸肉荳蔻酯的反应的K M
将10mg Novozym 435加入5ml等摩尔的不同浓度的底物溶液(肉荳蔻酸和肉荳蔻醇在各种情况下在甲基环己烷中的浓度为10mM到1000mM)，在60℃搅拌下温育。各种浓度的样品分别在25min内每隔5min取样(取样体积为50μl)并将其转入950μl的癸烷(内标：4mM十二烷)中。根据最终所测量的起始速率对底物浓度的曲线可以估算在KM为150mM时的半最大反应速率。为了简明起见，不用对单个成分测量该常数，而是对反应过程中由于等摩尔消耗的该特定混合物进行测量。
推导效率比EV：
所研究的模式反应是利用南极洲假丝酵母的固定脂肪酶B制备肉荳蔻酸肉荳蔻酯。本领域技术人员熟悉的是，实际反应速率随着底物浓度的下降而降低。Michaelis-Menten方程式描述了它们的数学关系，另见Voet，Voet，“Biochemie”，第一版，Wiley-VCH：1992，Weinheim，Germany，P329-331。
这里给出方程式1，其中
[S]＝平衡时底物浓度：
- d [ S ] dt = v = v max · [ S ] [ S ] + K M 方程式1，其中
vmax＝kcat·cE    方程式2
其中，CE＝酶浓度。从中可以得到方程式3：
- d [ S ] dt = v = k cat · c E · [ S ] [ S ] + K M 方程式3
为了测定转化率的时间依赖性，可以结合方程式3得到方程式4：
TR n = [ S 0 ] - [ S ] v max + K M v max · ln [ S 0 ] [ S ] 方程式4
其中TRn：为达到转化率n的理论最小反应时间，
[S0]为t＝0时的底物浓度，
[S]：为转化率为n时的底物浓度。
从这个模式反应可以得出，例如，使用0.4％重量的酶，kcat为7000μmol*mg-1*min-1，KM＝150mmol*L-1，要达到99.6％的目的转化率，所用的TR99.6为112min。
将所研究的实例的有效反应时间ERn与理论反应时间TRn相比较，根据方程式5得到转化率为Cn时的效率比EVn：
EVn＝ERn/TRn    方程式5
实施例1(非本发明)在搅拌烧瓶中合成肉荳蔻酸肉荳蔻酯：
将329g肉豆蔻醇和351g肉豆蔻酸在1L的初始装料容器中加热到60℃，通过磁力搅拌器混合。向其中加入2.72g的Novozym 435，采用5mbar的真空去除反应过程中生成的水。通过酸值滴定方法监控本反应过程约24小时(见表1)。
表1：实施例1的转化率数据：
  时间[min]   转化率[％]
  0   0.0％
  60   43.9％
  122   71.1％
  180   93.0％
  355   95.1％
  640   98.0％
  802   99.0％
  1079   99.4％
  1440   99.6％
实施例2(非本发明)在固定床反应器中合成肉荳蔻酸肉荳蔻脂-利用 高价改性降膜方法去除反应过程的水分：
将502g肉豆蔻醇和513g肉豆蔻酸在2L-5-颈瓶中加热到60℃，通过机械搅拌器混合。向加热到60℃的固定床(高2cm，直径3cm)中加入4.06g的Novozym 435。然后利用齿轮泵将反应混合物通过加热到60℃的不锈钢管通过负载酶的固定床，并回到所述瓶中，流速设定为50ml*min-1。利用5mbar的真空蒸馏去除反应过程中生产的水分。为了加速去除水分，使重新进入所述瓶中的反应混合物在加热到60℃的玻璃柱内壁上的薄膜中流下约15cm的距离。通过酸值滴定方法监控本反应过程约14小时(见表2)。
表2：实施例2的转化率数据：
  时间[min]   转化率[％]
  0   0.0％
  180   81.1％
  240   91.0％
  300   96.2％
  420   98.2％
  540   99.1％
  840   99.6％
实施例3(本发明)利用喷射法去除水分合成肉荳蔻酸肉荳蔻酯：
将11010g肉豆蔻醇和11500g肉豆蔻酸在加热到60℃的玻璃容器中加热到60℃，该玻璃容器内径为300mm，高700mm。通过安装在容器底部的环形喷射器(sparger)，以5m3/h的流速将氮气引进混合物。加入90g的Novozym 435，通过酸值滴定方法监控本反应过程约6小时(见表3)
表3：实施例3的转化率数据：
  时间[min]   转化率[％]
  0   0.0％
  60   67.0％
  120   92.0％
  180   96.9％
  240   98.8％
  300   99.5％
  360   99.7％
实施例4(本发明)利用喷射法去除水分合成肉荳蔻酸肉荳蔻酯：
将55305g肉豆蔻醇和56705g肉豆蔻酸在加热到60℃的玻璃容器中的加热到60℃，该玻璃容器内径为300mm，高2500mm。通过安装在容器底部的环形喷射器，以5m3/h的流速将空气引进混合物。加入448g的Novozym 435，通过酸值滴定方法监控本反应过程约9小时(见表4)
表4：实施例4的转化率数据：
  时间[min]   转化率[％]
  0   0.0％
  30   35.4％
  60   49.9％
  90   65.0％
  120   74.5％
  165   83.9％
  180   85.4％
  210   89.1％
  240   91.3％
  300   96.6％
  360   98.3％
  420   99.2％
  480   99.5％
  540   99.8％
实施例5(本发明)利用喷射法去除水分合成肉荳蔻酸肉荳蔻酯：
将55305g肉豆蔻醇和56780g肉豆蔻酸在加热到60℃的玻璃容器中的加热到60℃，该玻璃容器内径为300mm，高2500mm。通过安装在容器底部的环形喷射器，以13.5m3/h的流速将空气引进混合物。加入448g的Novozym 435，通过酸值滴定方法监控本反应过程约7小时(见表5)
表5：实施例5的转化率数据：
  时间[min]   转化率[％]
  0   0.0％
  30   34.0％
  65   62.2％
  95   76.2％
  125   85.7％
  155   92.7％
  185   95.8％
  225   98.0％
  275   98.8％
  335   99.4％
  395   99.7％
实施例6(本发明)确定实施例1-5的EVn：
对于实施例1-5，分别测定了达到转化率为95％，98％，99％和99.6％所需要的时间(如果需要可插补数据)。在这些转化率情况下，分别计算出TR，ER和EV。
表6：测定TRn，ERn和EVn
*实施例1和2非本发明。
分析结果非常清楚地表明，在喷射条件下的酯化反应比传统的减压条件下在搅拌烧瓶或者固定床反应器大大提高了反应速度。此外，明显地，喷射速度有很大的影响：在实施例5中，相对于实施例4，喷射速度从5m3/h增加到13m3/h，使EV值平均降低了1/3。
实施例7：催化剂的再利用
与实施例3-5相似，重复使用未纯化处理过的酶催化剂进行多次反应合成肉荳蔻酸肉荳蔻酯，在300min后测定转化率(每批投料25.6g肉豆蔻酸，25.0g肉豆蔻醇以及0.20g Novozym 435，氮气的喷射速度为1500ml/min)。进行6次重复实验。
表7：实施例7的转化率数据
  重复   300min后的转化率
  1   99.5％
  2   99.4％
  3   99.4％
  4   99.3％
  5   99.2％
  6   99.4％
显然地，即使在重复使用催化剂的情况下，也没有观察到可能由于催化剂失活导致的转化率的明显损失，都达到了相近的转化率。
实施例8：制备椰油酸癸酯
将429g正癸醇(Aldrich，OHN：340mgKOH/g)和553g椰子脂肪酸(EdenorHK 8-18，来自Cognis，AN：271.4mgKOH/g)在加热到60℃的玻璃容器中加热到60℃，该玻璃容器内径为100mm，高500mm。通过安装在容器底部的玻璃料(glass frit)，以31/min的流速将氮气引进混合物。加入3.9g的Novozym 435。9小时后，反应物混合物的酸值达到0.86mgKOH/g。
实施例9：制备聚醚酯
将418.7g聚乙二醇/聚丙二醇(摩尔质量2790g/mol，OHN：40.2mgKOH/g，组成：52％乙二醇，48％丙二醇)和55.3g的十一烯酸(2当量，Aldrich，AN：304.4mgKOH/g)在加热到60℃的玻璃容器中的加热到60℃，该玻璃容器内径为100mm，高500mm。通过安装在容器底部的玻璃料，以21/min的流速将氮气引进混合物。加入9.5g的Novozym 435。23小时后，反应物混合物的酸值达到1.0mgKOH/g。
实施例10：制备聚酯
将404.6g己二酸二乙酯(Aldrich)和236.4g的1，6-己二醇(Aldrich)在加热到60℃的玻璃容器中的加热到60℃，该玻璃容器内径为100mm，高500mm。通过安装在容器底部的玻璃料，以21/min的流速将氮气引进混合物。加入6.4g的Novozym 435。24小时后，通过1H NMR确定基于己二酸二乙酯的转化率为94％。GPC分析(Agilent 1100，四氢呋喃流速为1ml/min，聚苯乙烯为标样)表明，形成的聚合物MW＝3819g/mol，MN＝1854g/mol。

Claims (9)

1.酶促合成羧酸酯的方法，其特征在于不用搅拌器而通过喷射引入气体实现混合反应物和生物催化剂并排出反应的水，同时达到低效率比EV，条件是不使用搅拌烧瓶或固定床反应器，并且其特征在于转化率达到95%，效率比EV95<3.0，其中所述效率比EV是有效反应时间ER和理论最小反应时间TR的商，TR可以根据以下方程式4计算
TR n = [ S 0 ] - [ S ] v max + K M v max &CenterDot; ln [ S 0 ] [ S ]      方程式4
其中TRn：为达到转化率n的理论最小反应时间，
[S0]为t=0时的底物浓度，
[S]：为转化率为n时的底物浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将催化剂以颗粒形式共价或非共价地固定在载体材料上。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述载体材料的平均粒度大于0.5μm。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于所用的气体为空气、贫气、氧气、氮气、惰性气体或二氧化碳。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所用的气体为空气或氮气。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于反应在20℃到100℃的温度进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于转化率达到98%，效率比EV98<4.0。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于转化率达到99%，效率比EV99<5.0。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于转化率达到99.6%，效率比EV99.6<8.0。
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