CN101484578A - 靶向ires序列的短干扰rna双链及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的针对IRES序列的抑制性多聚核苷酸。本发明也提供了包含本发明的新的抑制性多聚核苷酸的基因工程表达载体、宿主细胞、转基因动物和转基因植物。此外，本发明也提供了应用此抑制性多聚核苷酸的方法。

Description

靶向IRES序列的短干扰RNA双链及其用途

相关申请

本申请要求2006年4月19日提交的60/792,968号美国临时专利申请的优先权，其全部内容结合于此作为参考。

发明背景

发明领域

本发明涉及抑制性多聚核苷酸尤其是短干扰RNA(siRNA)双链(duplexes)的用途，所述多聚核苷酸在抑制基因表达的方法(如筛查实验)中靶向内部核糖体进入位点。

相关背景

本领域众所周知，基因的转录通常需要启动子，所述启动子位于基因上游；转录通常生成单顺反子mRNA(即mRNA转录物只包含一个蛋白编码区)。在帽子依赖(cap-dependent)机制中，所得的单顺反子mRNA的翻译通常由翻译起始复合物启动，所述帽子机制涉及单顺反子mRNA5’端帽子结构的识别(例如见Merrick和Hershey(1996)“真核蛋白合成的途径和机制”，In Translational control，J.W.B.Hershey，M.B.Mathews和N.Sonenberg编(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，pp.31-69)。翻译起始复合物通常沿单顺反子mRNA移动，直到到达第一起始密码(AUG)，通常在帽子结构的50-100个核苷酸以内，mRNA通常由此开始翻译成蛋白。换而言之，mRNA翻译成蛋白通常始于第一起始密码子AUG。这种在大多数真核细胞和一些原核细胞中发现的单顺反子转录和翻译的标准模型，对重组DNA技术的应用(例如基因治疗)提出了质疑，因为有时在单一宿主细胞内转移和表达多个转基因是有利的。

在重组DNA技术发展的早期，当研究者对在单一宿主细胞内表达一种以上蛋白感兴趣时，待转移的基因(转基因，例如编码各种目的蛋白的基因)被置于不同的表达载体中，这样宿主细胞就必需被各种这样的载体成功地修饰。正如预期的那样，用一种以上的表达载体修饰宿主细胞通常是困难而费力的。或者，构建含有编码目的蛋白的各转基因的单一表达载体，使得各转基因的转录都由其各自的启动子控制，即几个单顺反mRNAs由单一表达载体转录。但是，几个启动子在同一个表达载体中存在，随着时间的延长经常会引起表达降低或丧失，这很可能是由于启动子序列间的互相干扰造成的。随着内部核糖体进入位点(IRES)的发现和应用，这些问题已经得到解决。IRES通常位于蛋白编码区的下游，其翻译从第一起始密码子开始。IRES序列允许蛋白翻译从内部(即第二)起始密码(AUG)(即IRES和第一起始AUG密码子下游的AUG密码子)开始，因此使mRNA转录物变成多顺反子的，即能包含一个以上蛋白编码区。

迄今为止，IRESes已在无帽子结构的病毒mRNA的5’区发现，所述病毒例如小核糖核酸病毒科成员，如脊髓灰质炎病毒(poliomyelitisvirus)(Pelletier et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8(3)：1103-12)、脊髓灰质炎病毒(PV，polioviurs)、脑心肌炎病毒(EMCV)(Jang et al.(1988)J.Virol.62(8)：2636-43)，及手足口病病毒(FMDV)(综述见于Belshamand Sonenberg(1996)Microbiol.Rev.60(3)：499-511；Robertson etal.(1999)RNA5(9)：1167-79；Jackson and Kaminski(1995)RNA 1(10)：985-1000；Herman(1989)Trends Biochem.Sci.14(6)：219-22)。在其他病毒转录物中也检测到IRESes，所述病毒例如VL30型鼠反转录转座子(Berlioz et al.(1995)J.Virol.69(10)：6400-07)、心病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、丙型肝炎病毒(HCV)，最近，在编码Friend(FMLV)和Moloney(MoMLV)鼠白血病病毒gag前体的mRNA中也发现了IRES(Berlioz and Darlix(1995)J.Virol.69(4)：2214-22；Vagner etal.(1995)J.Bio.Chem.270(35)：20376-83)。细胞的RNAs中发现的IRESes也有描述。包含IRESes的细胞mRNAs的例子包括：编码免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的mRNA(Macejak and Sarnow(1991)Nature 353：90-94)；某些生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子2和胰岛素样生长因子的mRNA(Teerink etal.(1995)Biochim.Biophys.Acta 1264(3)：403-08；Vagner etal.(1995)Mol.Cell.Biol.15(1)：35-44)；翻译起始因子eIF4G(Gan andRhoads(1996)J.Biol.C hem.271(2)：623-26)和酵母转录因子TFIID和HAP4的mRNA(Iizuka et al.(1994)Mol.Cell.Biol.14(11)：7322-30)(亦可见于，Oh et al.(1992)Gene 175(1-2)：121-25；Tomanin etal.(1997)Gene 193(2)：129-40；Gambotto et al.(1999)Cancer GeneTher.6(1)：45-53；Qiao et al.(1999)Cancer Gene Ther.6(4)：373-79)。

就重组DNA技术而言，已描述了包含IRESes的表达载体(参见，International Published Patent Application Nos.WO 98/37189；WO99/25860；及WO 93/03143)。通常，这些表达载体允许IRES位于至少两个转基因之间，并因而允许至少两个转基因由单一启动子表达。特别地，单一启动子转录生成的mRNA可以是多顺反子，如，其中至少有两个蛋白编码区被至少一个IRES分开，翻译既可以从第一AUG起始密码子开始，也可以从IRES下游的内部AUG密码子开始。

IRES在重组DNA技术领域是强有利的工具，因为它们允许从一个mRNA转录物中翻译几个基因。换而言之，利用IRES在单一宿主细胞中表达多个不同的转基因，避免了使用多个表达载体修饰宿主细胞，或者使用包含几个启动子的表达载体修饰宿主细胞，所述启动子间可能会相互干扰。此外，几个研究组已经报道EMCV-IRES在鸡和小鼠胚胎中以及在成年小鼠多个器官中的稳定性和功能(Ghattas etal.(1991)Mol.Cell.Biol.11(12)：5848-59；Kim et al.(1992))Mol.Cell.Biol.12(8)：3636-43；Creancier et al.(2000)J Cell.Biol.150(1)：275-81)。

尽管IRESes已经被用于重组DNA技术中，但是这项技术的应用，如基因治疗，可能还有赖于以下研究才得以发展：1)这种转基因的表达对修饰的宿主细胞或生物体的影响，如转基因对修饰的宿主细胞代谢的影响；2)转基因编码的蛋白的功能。一种研究转基因的表达对宿主细胞或生物体影响和作用的常用方法是，转基因成功地导入宿主细胞或生物体并经其表达后，再抑制(如降低、干扰、下调、敲减(knockdown)等)转基因的表达。

抑制目的基因(如转基因、内源性基因等)表达的几种方法包括反义、三链螺旋、共抑制及RNA干扰(RNAi)方法。这些方法涉及靶向(targeting)核酸分子的应用，所述靶向核酸分别是靶基因mRNA转录物(或其部分)的反向互补物，与靶基因形成三链螺旋结构，是靶基因的精确复制体，或者是包含靶基因(或其部分)核苷酸序列的短干扰RNA(siRNA)的双链分子。目前，这些方法已经被用于特异性地靶向单个目的基因，这样，要求靶向分子(如，反义分子、三螺旋形式分子、共抑制转基因分子和siRNA分子)序列至少相应于目的靶基因的一部分(即，至少与靶基因的其中一条链或两条链的至少一部分特异性杂交)。这样，这些方法的应用需要研究者知道目的靶基因的序列，和/或靶基因序列的一部分，这部分是最有可能成为靶点的部分，并需要研究者构建每种靶基因的独特靶向分子。迄今为止，如果事先不知道目的基因的序列，就没有机制可用来抑制靶基因的表达，而且，如果目的基因的序列已知，也没有有效的测试能够确定基因序列的哪一部分更容易受到抑制。

本发明通过提供抑制性多聚核苷酸以及在下述方法中使用这些抑制性多聚核苷酸解决了这些问题，所述方法例如：1)抑制(如降低、干扰、下调、敲减等)至少一个目的转基因的表达，不要求研究者知道或确定该转基因的序列；和/或2)筛选靶向多聚核苷酸的文库抑制目的基因的表达，无论目的基因是转基因还是内源性基因。

发明概述

本发明涉及以下发现，即靶向IRES的抑制性多聚核苷酸可用于下调(如抑制)至少一种目的基因的表达，所述目的基因和其蛋白编码区一起转录，作为包含相应于靶IRES的核苷酸序列的mRMA转录物的一部分。因此，本发明提供一种针对IRES的抑制性多聚核苷酸，如具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的IRES。

本发明的抑制性多聚核苷酸可以是siRNA分子，如，在本发明的一项实施方案中，抑制性多聚核苷酸包含siRNA的第一链。在本发明的另一项实施方案中，siRNA的第一链具有以下核苷酸序列的RNA等同物或基本由其组成，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列、SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一部分、SEQ ID NO：1的核苷酸序列的互补物和SEQ ID NO：1的核苷酸序列的互补物的一部分。在本发明的另一项实施方案中，siRNA的第一链的长度为5-548个核苷酸。在本发明的另一项实施方案中，siRNA的第一链具有以下核苷酸序列的RNA等同物或基本由其组成，所述核苷酸序列选自SEQ IDNO：2的核苷酸序列、SEQ ID NO：3的核苷酸序列、SEQ ID NO：4的核苷酸序列，及其亚序列(subsequence)的核苷酸序列。在本发明的另一项实施方案中，siRNA的第一链是自我互补的，进一步包含发夹环结构，如本发明的siRNA可以包含以下核苷酸序列的RNA等同物，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：2的核苷酸序列的互补核苷酸序列、SEQ ID NO：3的核苷酸序列的互补核苷酸序列和SEQ ID NO：4的核苷酸序列的互补核苷酸序列。在本发明的另一项实施方案中，抑制性多聚核苷酸是反义分子。

本发明也提供编码本发明的抑制性多聚核苷酸的分离的DNA分子，如本文所述。在本发明的一项实施方案中，DNA分子可操作地连接于至少一个表达控制序列。本发明也提供用编码本发明的抑制性多聚核苷酸的DNA分子转化或转染的宿主细胞。此外，本发明还提供包含编码本发明的抑制性多聚核苷酸的DNA分子的微生物。在一项实施方案中，本发明提供一种非人转基因动物，其体细胞和生殖细胞包含编码本发明的抑制性多聚核苷酸的DNA。在另一项实施方案中，本发明提供一种转基因植物，其体细胞和生殖细胞包含编码本发明的抑制性多聚核苷酸的DNA。

在本发明的一项实施方案中，本发明的siRNA(例如如上所述)进一步包含与siRNA第一链互补的第二链。而且，本发明提供编码本发明siRNA第二链的分离DNA分子。在本发明的一项实施方案中，分离DNA分子可操作性连接于至少一个表达控制序列。本发明也提供被这种操作性连接的DNA分子转化的宿主细胞。在一项实施方案中，本发明提供含有编码本发明siRNA的第二链的DNA的微生物。本发明也提供一种非人转基因动物，这种动物的体细胞和生殖细胞中含有编码本发明siRNA分子第二链的DNA。在另一项实施方案中，本发明提供一种转基因植物，这种植物的体细胞和生殖细胞中含有编码本发明siRNA第二链的DNA。

本发明也提供包含本发明的抑制性多聚核苷酸的试剂盒及本发明的抑制性多聚核苷酸的方法。

本发明也提供一种下调宿主细胞表达转基因的方法，其中转基因作为mRNA转录物的一部分被转录，所述mRNA转录物包含相应于IRES的核苷酸序列，所述方法包括将靶向IRES的抑制性多聚核苷酸导入宿主细胞的步骤。在本发明的一项实施方案中，IRES具有SEQ IDNO：1的核苷酸序列或基本由其组成。

附图简述

图1显示EMCV-IRES的核苷酸序列(等同于SEQ ID NO：1)。EMCV-IRES序列中的黑体部分是其三部分的示例(IRES1、IRES2和IRES3；分别为SEQ ID NOs：2、3和4)，这三部分可能是siRNA分子的最佳靶点。方框中显示的是三种siRNA分子的示例(siRNA1、siRNA2和siRNA3；分别为SEQ ID NOs：5、6和7)，这些分子可能用于靶向EMCV-IRES(分别以IRES1、IRES2和IRES3为靶点)。

图2A显示CHO细胞产生的抗体滴度(μg/ml；y-轴)，CHO细胞经遗传修饰从多顺反子mRNA中表达抗体，所述多顺反子mRNA经下列分子转染后包含至少一种EMCV-IRES序列：对照转染试剂(对照)，针对IRES1的siRNA1分子(IRES1)，针对IRES2的siRNA2分子(IRES2)，针对IRES3的siRNA3分子(IRES3)，或是siRNA1、siRNA2和siRNA3分子的合并(合并)。杠条(bar)代表三次实验抗体滴度的均数±SEM(n＝3)，或是转染后三天(第3天；)或是转染后六天(第6天；■)。图2B显示CHO细胞产生的重组抗体的细胞特异性产量(滴度/细胞#/天；y-轴)，所述CHO细胞经遗传修饰从多顺反子mRNA中表达抗体，所述多顺反子mRNA经下列分子转染后包含至少一种EMCV-IRES序列：对照转染试剂(对照)，针对IRES1的siRNA1分子(IRES1)，针对IRES2的siRNA2分子(IRES2)，针对IRES3的siRNA3分子(IRES3)，或是siRNA1、siRNA2和siRNA3分子的合并(合并)。杠条代表三次实验抗体滴度的均数±SEM(n＝3)，或是转染后三天(第3天；

)或是转染后六天(第6天；■)。

发明详述

本发明涉及内部核糖体进入位点(IRESes)的发现及其在重组DNA技术中的应用，以启动和控制多顺反子mRNA转录物中蛋白编码区的翻译。本发明基于以下发现：用抑制性多聚核苷酸靶向(targeting)靶IRES，能有效抑制靶IRES上游至少一个蛋白编码区的翻译，或许能抑制包含相应于靶IRES的核苷酸序列的mRNA转录物中所有蛋白编码区的翻译。因此，本文提供针对IRES(即靶IRES)的抑制性多聚核苷酸及在敲减(knock down)目的基因表达的非特异性方法中的使用它们的方法。由于靶点是IRES，所以这种方法不需要使抑制性多聚核苷酸精确地以目的基因为目标，即本文提供的方法不需要知道或确定目的基因的序列，而且允许靶向分子抑制多种转基因的表达。此种方法只需要从目的基因中转录的蛋白编码区存在于包含相应于靶IRES的核苷酸序列的mRNA转录物中。换而言之，含有IRES的整个mRNA转录物可能会受到本发明的抑制性多聚核苷酸(如siRNA分子)的靶向攻击，以进行抑制。例如，以包含(从5’到3’)第一转基因、IRES和第二转基因的mRNA转录物中IRES为靶点的siRNA分子，可用于敲减第一转基因和第二转基因的表达。mRNA转录物不需要是多顺反子才能成功地被本发明的抑制性多聚核苷酸靶向攻击。例如，以只包含一个转基因的mRNA转录物中IRES为靶点的siRNA(这个转基因位于IRES的上游或下游)可用于敲减这个转基因的表达。在优选实施方案中，从目的基因，即含有目的基因的蛋白编码区转录的mRNA，位于IRES的上游。

特别地，本发明是基于如下发现：针对IRES的抑制性多聚核苷酸可抑制蛋白编码区的翻译，所述蛋白编码区是包含相应于靶IRES的核苷酸序列的mRNA转录物的一部分。对本领域的技术人员显而易见的是，针对IRES的抑制性多聚核苷酸的使用，产生了敲减目的基因表达的方法，目的基因的蛋白编码区存在于包含相应于靶IRES核苷酸序列的mRNA转录物中。这种方法不需要修饰或靶向转基因本身。技术人员知道本文提供的抑制性多聚核苷酸不仅能下调目的基因，而且可以用于筛查siRNA文库的方法，如作为阳性对照。

这样，本发明提供以IRES为靶点的抑制性多聚核苷酸。此外，本发明提供修饰宿主细胞或生物体来表达本发明抑制性多聚核苷酸的方法，而且提供这种修饰的宿主细胞或生物体。本发明还提供使用抑制性多聚核苷酸来改变目的基因表达和作为筛查实验(如siRNA筛查实验)中阳性对照的方法。

根据本发明，目的基因可编码治疗蛋白。本文使用的治疗蛋白，是一种蛋白或肽链，其对身体区域发挥生物学作用，或通过介质对其远距离作用的身体区域发挥生物学作用。例如，治疗蛋白可以是分泌蛋白，如抗体、抗体的抗原结合片段、可溶性受体、受体融合、细胞因子、生长因子、酶或凝血因子，本文将有更详细描述。上面列举的蛋白仅是示例，并不是限制。本领域的普通技术人员会知道任何蛋白都可以按照本发明使用，而且能根据需要选择待产生的特殊蛋白。

说明书中的术语多肽、蛋白、肽是同义的，可以替换使用。因此，本文的蛋白、肽或多肽通常包含2个以上氨基酸。例如，蛋白、肽或多肽包含约2-约20个氨基酸，约20-约40个氨基酸，约40-约100个氨基酸，约100-约200个氨基酸，约200-约300个氨基酸等。

本文的氨基酸是指任何天然氨基酸，任何氨基酸衍生物，或任何本领域已知的模拟氨基酸。在某些实施方案中，蛋白或肽的残基是连续的，没有任何非氨基酸中断氨基酸残基序列。在其他实施方案中，这种序列可以含有一个或多个非氨基酸部分。在特殊的实施方案中，蛋白或肽残基的序列可以被一个或多个非氨基酸部分中断。

本文的抗体是指任何有抗原结合区的抗体样分子，包含抗体片段，如Fab’、Fab、F(ab’)₂、单结构域抗体(DABs)、Fv、scFv(单链Fv)等。制备和使用不同的以抗体为基础的构建体或片段的技术是本领域技术人员熟知的。制备和表征抗体的方法也是本领域技术人员熟知的(见，Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1988；在此完整地引入作为参考)。例如，抗体可包含至少一条，优选两条全长重链，以及至少一条，优选两条轻链。本文使用的术语“抗体”包括抗体片段或变体分子，如抗原结合片段(Fab，F(ab’)₂，Fv，单链Fv片段，重链片段(如camelid VHH)及免疫球蛋白融合体(如SMIP^TM)。

抗体可以是单克隆或单特异性抗体。抗体也可以是人的、人源化的、嵌合体的、CDR-移植的或者体外产生的抗体。在其他实施方案中，抗体有重链恒定区，如选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在另一项实施方案中，抗体有轻链，如选自κ或λ。在一项实施方案中，恒定区可以改变，如突变，从而改变抗体的性质(如，增加或减少Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数量、效应细胞功能或补体功能中的一种或多种)。典型地，抗体特异性与预定抗原结合，所述抗原如疾病相关抗原，所述疾病如神经变性疾病、代谢性疾病、炎症、自身免疫疾病和/或恶性疾病。

小分子(Modular)免疫药物(SMIP^TM)提供了含有结合结构域多肽的变体分子的示例。SMIPs及其应用公开于美国公开专利申请Nos.2003/0118592、2003/0133939、2004/0058445、2005/0136049、2005/0175614、2005/0180970、2005/0186216、2005/0202012、2005/0202023、2005/0202028、2005/0202534、2005/0238646及其相关的专利家族成员，所有这些专利全部通过引用结合于本文中。

单结构域抗体可包含那些补体决定区是单域(single domain)多肽一部分的抗体。实例包括，但并不限于，重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、由常规四链抗体衍生的单域抗体、基因工程化抗体及除了那些由抗体衍生而来的以外的单域支架(scaffold)。单域抗体可以是本领域已知或未知的任一种单域抗体。单域抗体可以来自任何物种，包括，但不局限于，小鼠、人类、骆驼、驼马、山羊、兔子和牛。根据本发明的一个方面，本文的单域抗体是被称为缺乏轻链的重链抗体的天然单域抗体。例如，这种单域抗体公布于国际公开申请No.WO9404678。需要澄清的是，来源于天然缺乏轻链的重链抗体的可变区在本文称为VHH或纳米抗体(nanobody)，以区别于传统四链免疫球蛋白的VH。这种VHH分子可以来自骆驼科物种(如骆驼、驼马、单峰骆驼、羊驼和红褐色美洲驼)的抗体。除骆驼科外，其他物种可以产生天然缺乏轻链的重链抗体；这种VHHs在本发明的范围中。

包含在术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的例子包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL、CH1区组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1区组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH区组成；(v)dAb片段，由VH区组成；(vi)camelid或camelized的可变区，如VHH区；(vii)单链Fv(scFv)；(viii)双特异性抗体；(ix)融合于Fc区的免疫球蛋白分子的一个或多个片段。而且，虽然Fv片段的VL和VH区由分离的两个基因编码，但是它们能通过重组的方法，用合成的连接体连接，使之成为单一蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见Bird et al.(1988)Science 242：423-26；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85：5879-83)。这种单链抗体也包含在术语抗体的“抗原结合片段”中。这些抗体片段可通过本领域技术人员已知的传统技术得到，而且可以用评估完整抗体的方法来评估这些片段的功能。

不同于“双特异性”或“双功能”抗体，抗体的每个结合位点都相同。“双特异性”或“双功能”抗体是人工杂合抗体，有两个不同的重链/轻链对及两个不同的结合位点。“双特异性”抗体可由多种方法产生，包括杂交瘤细胞融合，或Fab’片段连接(参见，Songsivilai andLachmann(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-21；Kostelny et al.(1992)J.Immunol.148：1547-53)。

靶序列

本发明可用于大多数，如果不是全部，众所周知的IRESes(尤其那些通常用于重组DNA方法的IRESes)，不需要过多的实验。因此，本发明的一部分是，与本发明有关的靶序列是来自任何病毒或细胞基因的IRES序列。大多数IRES序列可从公共数据库中获得，所述数据库如www.ncbi.nlm.nih.gov，www.rangueil.inserm.fr/IRESdatabase等。作为一个非限制性例子，本发明涉及从脑心肌炎病毒(EMCV)基因组中分离的IRES的用途。这样，在一项实施方案中，本发明涉及分离和纯化的EMCV-IRES多聚核苷酸。

编码EMCV-IRES的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。与本发明相关的多聚核苷酸也包括在严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交，和/或编码基本保持EMCV-IRES生物活性的mRNA的多聚核苷酸。与本发明相关的多聚核苷酸还包括SEQ ID NO：1所示序列的连续部分，含有至少约15-30个核苷酸，如19-27个核苷酸。在一项实施方案中，与本发明相关的多聚核苷酸还包括SEQ IDNO：1所示序列的连续部分，含有约19或21个连续核苷酸。

与本发明相关的分离多聚核苷酸(如，SEQ ID NO：1，其互补物和其连续部分)可用作杂交探针和引物，以识别和分离具有与编码所公开的多聚核苷酸相同或相似序列的核酸。识别和分离核酸的杂交方法包含聚合酶链反应(PCR)，Southern印记杂交和Northern印记杂交，为本领域技术人员熟知。

杂交反应可以在不同严格条件下进行。杂交反应的严格条件包括任意两个核酸分子相互杂交的困难程度。优选的是，每一个杂交多聚核苷酸在简化(reduced)严格条件下，更优选严格条件，最优选高度严格条件下与相应的多聚核苷酸杂交。严格条件的实例如下方表1所示：高度严格条件至少像例如条件A-F一样；严格条件至少像例如条件G-L一样；简化严格条件至少像例如条件M-R一样。

表1

 

严格条件	多聚核苷酸杂交	杂交长度(bp)1	杂交温度和缓冲液2	清洗温度和缓冲液
					A	DNA:DNA	>50	65℃；1XSSC或42℃；1XSSC，50％甲酰胺	65℃；0.3XSSC
B	DNA:DNA	<50	TB *；1XSSC	TB *；1XSSC
					C	DNA:RNA	>50	67℃；1XSSC或45℃；1XSSC，50％甲酰胺	67℃；0.3XSSC
D	DNA:RNA	<50	TD *；1XSSC	TD *；1XSSC
					E	RNA:RNA	>50	70℃；1XSSC或50℃；1XSSC，50％甲酰胺	70℃；0.3XSSC
F	RNA:RNA	<50	TF *；1XSSC	Tf *；1XSSC
					G	DNA:DNA	>50	65℃；4XSSC或42℃；4XSSC，	65℃；1XSSC

 

			50％甲酰胺
					H	DNA:DNA	<50	TH *；4XSSC	TH *；4XSSC
I	DNA:RNA	>50	67℃；4XSSC或45℃；4XSSC，50％甲酰胺	67℃；1XSSC
					J	DNA:RNA	<50	TJ *；4XSSC	TJ *；4XSSC
K	RNA:RNA	>50	70℃；4XSSC或50℃；4XSSC，50％甲酰胺	67℃；1XSSC
					L	RNA:RNA	<50	TL *；2XSSC	TL *；2XSSC
M	DNA:DNA	>50	50℃；4XSSC或40℃；6XSSC，50％甲酰胺	50℃；2XSSC
					N	DNA:DNA	<50	TN *；6XSSC	TN *；6XSSC
O	DNA:RNA	>50	55℃；4XSSC或42℃；6XSSC，50％甲酰胺	55℃；2XSSC
					P	DNA:RNA	<50	TP *；6XSSC	TP*；6XSSC
Q	RNA:RNA	>50	60℃；4XSSC或45℃；6XSSC，50％甲酰胺	60℃；2XSSC
					R	RNA:RNA	<50	TR *；4XSSC	TR*；4XSSC

¹杂交长度是对杂交多聚核苷酸的杂交区的预计。当多聚核苷酸与未知序列的靶多聚核苷酸杂交时，杂交长度应是杂合多聚核苷酸的长度。当已知序列的多聚核苷酸杂交时，杂交长度可通过对比多聚核苷酸的序列及识别最佳互补序列的区域决定。

²SSPE(1^* SSPE是0.15M NaCl，10mM NaH₂PO₄，及1.25mM EDTA，pH7.4)在杂交和洗脱缓冲液中可由SSC替代(1^*SSC是0.15M NaCl，及15mM柠檬酸钠)；杂交完成后洗脱15分钟。

TB^*-TR^*：长度少于50个碱基对的杂合子的杂交温度应比杂合子的解链温度(Tm)低5-10℃，而Tm值可根据下面的公式计算。长度少于18个碱基对的杂合子Tm(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。长度在18-49个碱基对之间的杂合子Tm(℃)＝81.5+16.6(log₁₀ Na⁺)+0.41(G+C)％-(600/N)。其中N是杂合子中碱基的数量，Na⁺是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1^*SSC中Na⁺＝0.165M)。

多聚核苷酸杂交的严格条件的其他例子见于Sambrook et al.(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，Chs.9 & 11，Clod Spring Harbor Laboratory Press，Clod Spring Harbor，NY和Ausubel et al.，eds.(1995)Current Protocols in MolecularBiology，Sects.2.10&6.3-6.4，John Wiley&Sons，Inc.，在此引用作为参考。

与本发明相关的分离多聚核苷酸也可用作杂交探针和引物，来识别和分离与公开的多聚核苷酸有同源序列的DNAs。这些同源物是从和公开多聚核苷酸不同的物种中分离出来的，或是来自同一物种，但和公开多聚核苷酸有显著相似的序列。优选的是，多聚核苷酸同系物与公开的多聚核苷酸至少有60％的序列相同；更优选的是至少有75％相同；最优选的是至少有90％相同。优选地，公开多聚核苷酸的同源物是从病毒中分离的，如，小核糖核酸病毒科的病毒。

正如以下所描述，与本发明相关的分离多聚核苷酸也可用作杂交探针和引物，来识别表达本发明抑制性多聚核苷酸的细胞和组织，及确定它们表达的条件。

总的说来，本发明的多聚核苷酸是分离物，为分离和/或纯化的形式，或游离或基本游离于其天然结合的物质，例如游离或基本游离于基因组(如小核糖核酸病毒基因组)中的核酸侧翼序列，除了一个或多个可能的表达调节序列。本发明的多聚核苷酸可以是全部或部分合成的，而且可以包括基因组DNA、cDNA或RNA。当本发明的多聚核苷酸包括RNA时，所示的序列应解释为RNA等同物，如用U取代T。

抑制性多聚核苷酸

本发明的目的之一是提供针对靶IRES的抑制性多聚核苷酸，它可用于下调目的基因(如内源性基因，转基因等)的表达，目的基因的转录引起它的蛋白编码区包含于mRNA转录物中，所述mRNA转录物含有相应于靶IRES的核苷酸序列，其中这种方法不需要修饰或靶向目的基因本身。本发明的另一个目的是提供使用本发明的抑制性多聚核苷酸作为阳性对照，筛查抑制性多聚核苷酸文库的方法。最后，本发明证实，通过使用抑制性多聚核苷酸，可以实现在细胞或生物体中抑制(如降低、干扰、下调、敲减等)目的转基因的表达，如靶向(如结合和/或切开)IRES mRNA(如EMCV-IRES mRNA)的siRNA，从而阻止与IRES mRNA相同的mRNA转录物中任何蛋白编码区的翻译。

在细胞或生物体中，通过使用不同抑制性多聚核苷酸，能改变与本发明相关的IRES序列的表达，如反义多聚核苷酸，结合和/或切开从本发明基因转录的mRNA的核酶，靶向基因调节区的三联体形式的寡聚核苷酸，和引起靶mRNA序列特异性降解的短干扰RNA(如Galderidi et al.(1999)J.Cell.Physiol.181：251-57；Sioud(2001)Curr.Mol.Med.1：575-88；Knauert and Glazer(2001)Hum.Mol.Genet.10：2243-51；Bass(2001)Nature 411：428-28)。

本发明的抑制性反义或核酶多聚核苷酸可与本发明相关的IRES序列整条编码链或其中一部分互补。或者，抑制性多聚核苷酸可与本发明相关的IRES序列编码链的非编码区互补。本发明的抑制性多聚核苷酸可通过本领域熟知的化学合成和/或酶连接反应构建。化学合成的多聚核苷酸的核苷键能被修饰，从而增强其抵抗核酸酶介导的降解反应的能力，同时增加其序列的特异性。这种连接修饰包含，但是不局限于，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酰胺化物(phosphoroamidate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、吗啉代及核酸肽(PNA)连接(Galderisiet al.，supra；Heasman(2002)Dev.Biol.243：209-14；Mickelfield(2001)Curr.Med.Chem.8：1157-79)。或者，将本发明的多聚核苷酸以反义(即反向)顺序亚克隆到表达质粒中，使用该表达质粒生物合成反义分子。

在另一实施方案中，本发明的反义多聚核苷酸分子是α异头多聚核苷酸分子。α异头多聚核苷酸分子和RNA互补链形成特异的双链杂交，与平常的β单位不同，这种杂交链是相互平行的。依据本领域已知的技术，反义多聚核苷酸分子也可以包含2’-o-甲基核糖核苷或RNA-DNA嵌合体。

本发明包含的抑制性三体(triplex-forming)寡聚核苷酸(TFOs)结合在DNA二聚体的大沟处，具有高特异性和高亲和力(Knauert andGlazer，supra)。本发明基因的表达能被靶向作用于与基因调节区(即启动子或增强子序列)互补的TFOs所抑制，形成三螺旋结构，阻止基因的转录。

在本发明的一项实施方案中，这种抑制性多聚核苷酸是短干扰RNA(siRNA)分子(参见，Galderisi et al.(1999)J.Cell Physiol.181：251-57；Sioud(2001)Curr.Mol.Med.1：575-88)。这些siRNA分子是短(优选19-25个核苷酸，更优选19或21个核苷酸)双链RNA分子，能引起靶mRNA的序列特异性降解。这种降解被称为RNA干扰(RNAi)(如，Bass(2001)Nature 411：428-29)。RNAi起初在低等生物体中发现，现在已经有效用于哺乳动物细胞，且最近发现RNAi可以预防小鼠的爆发性肝炎，这种小鼠经靶向Fas mRNA的siRNA分子治疗(Song et al.(2003)Nat.Med.9：347-51)。此外，最近报道向鞘内输送siRNA可以阻断大鼠体内两种模式(激动剂诱导的疼痛模式和神经性疼痛模式)的疼痛反应(Dorn et al.(2004)Nucleic AcidRes.32(5)：e49)。

本发明的siRNA分子双链结构可以含有聚合RNA的一条或多条链，即这种双链结构由含有发夹环的单一自我互补RNA链或两条互补链形成。即使siRNA发生与靶序列相关的插入，缺失或点突变，也能有效抑制靶序列的表达(Fire et al.，U.S.Patent No.6,506,559)。因此本发明的siRNA分子含有的核酸序列，其序列基本与相应于靶IRES的mRNA中至少一部分相一致。例如，本发明的siRNA分子的双链区与这种mRNA的至少部分序列有90％以上的序列是一致，优选100％一致。或者，序列基本一致的定义是，至少在严格条件下，如上面表1定义的条件G-L，siRNA分子双链区的至少一条链能和靶IRES至少一部分杂交。在优选实施方案中，在高度严格条件下，如上面表1所示的条件A-F，siRNA分子能和靶IRES的至少一部分杂交。由于并不需要本发明siRNA分子双链区的至少一条链和靶序列至少一部分之间100％序列一致，所以针对例如具有SEQ ID NO：1或基本由其组成的IRES序列的siRNA，也能抑制位于mRNA转录物中的任何蛋白编码区的表达，这种mRNA转录物包含由于突变、多态性、遗传密码重复、进化偏离等而与SEQ ID NO：1不同的IRES序列(参见，Fire et al.，supra)。基本一致的核酸序列的长度可至少是10、15、19、21、23、25、27、50、100、200、300、400或500个核酸，优选19-27个核酸，最优选19或21个核酸(参见，Fire et al.，supra)。

本发明的抑制性多聚核苷酸的设计以本领域熟知的标准为基础(如，Elbashir et al.(2001)EMBO J.20：6877-88)，或是用公知的算法(如公开的算法)。例如，本发明抑制性多聚核苷酸的靶向部分(如，siRNA分子的双链区)优选地以AA(最优选)、TA、GA或CA开始；本发明的siRNA分子优选包含G C比为45-55％的序列；本发明的siRNA分子优选一行(row)中不包含三个相同的核苷酸；本发明的siRNA分子优选一行中不包含七个混合G/Cs。基于这些标准，或其他已知的标准(如，Reynolds et al.(2004)Nat.Biotechnol22：326-30)，本领域技术人员可设计本发明的siRNA分子，该siRNA分子以IRES为靶点，如，具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列和/或基本由其组成的EMCV-IRES。例如，在一项实施方案中，本发明的siRNA分子具有选自SEQ ID NO：2的核苷酸序列、SEQ ID NO：3的核苷酸序列及SEQ ID NO：4的核苷酸序列和/或基本由其组成。在这个实施方案中，本发明的siRNA分子还包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列、SEQ ID NO：3的核苷酸序列及SEQ ID NO：4的核苷酸序列各自的互补序列。

例如，本发明的siRNA分子可由两个互补的单链RNA分子退火产生，或通过使用单发夹样RNA分子使其自身折叠生成需要的双链部分(Yu et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99：6047-52)。这种siRNA分子可化学合成(Elbashir et al.(2001)Nature 411：494-98)或在体外用单链DNA模板转录产生(Yu et al.，supra)。或者，这种siRNA分子可用表达载体瞬间(Yu et al.，supra；Sui et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：5515-20)或稳定转染(Paddison et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：1443-48)生物生成，如下面所述，这种表达载体在其启动子的正义或反义方向上含有与本发明相关的多聚核苷酸。重组RNA聚合酶可用于体内或体外转录，或修饰细胞的内源性RNA聚合酶可以在体内调节转录。最近，在初级人体细胞，以有效的序列特异性方式降低靶mRNA水平，这可以用表达发夹RNAs的腺病毒载体来证实，所述发夹RNAs可进一步加工成siRNA分子(Arts etal.(2003)Genome Res.13：2325-32)。

本发明的抑制性多聚核苷酸可用本领域熟知的化学合成和酶连接反应构建。化学合成的多聚核苷酸的核苷铰链可被修饰，增强其抵抗核酸酶介导的降解反应的能力，在某些生物体中避免由双链RNA产生的普通应急(panic)反应，或是增加序列特异性。这种连接修饰包含，但是不局限于，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酰胺化物，硼烷磷酸酯、吗啉代及核酸肽(PNA)连接(Galderisi et al.，supra；Heasman，supra；Mickelfield，同上)。

正如上面所述，与本发明相关的分离多聚核苷酸，或其连续部分，以正义或反义方向可操作性连接于表达控制序列，或连接到用于本发明抑制性多聚核苷酸(即siRNA分子)重组表达的表达载体上。抑制性多聚核苷酸重组表达的常用方法是本领域熟知的。

本文中使用的表达载体是指能运输其所连接的另一种核酸的核酸分子。载体的一种类型是质粒，它是环状双链DNA，其它DNA片段能与其相连接。载体的另一种类型是病毒载体，其他DNA片段能连接到病毒基因组中。某些载体能在其导入的宿主细胞中自我复制(如有细菌复制起始点的细菌载体和游离哺乳动物载体)。其他载体(如非游离哺乳动物载体)导入宿主细胞后，能整合到宿主细胞基因组中，因此，随着宿主基因组的复制而复制。而且，某些载体能指导其所连接的抑制性多聚核苷酸的表达。这种载体在这里指重组表达载体(或简称，表达载体)。通常，重组DNA技术中应用的表达载体常以质粒的形式。在本说明书中，质粒和载体可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意图包括其它形式的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)，它们可发挥相同功能。

本领域的普通技术人员将知道怎样构建转录本发明抑制性多聚核苷酸的表达载体。首先，技术人员知道，调节区(如，启动子、增强子、沉默子、拼接子、受体等)可用于从表达构建体中转录RNA链或本发明的抑制性多聚核苷酸RNA链。其次，技术人员会认识到，如在构建本发明的双链siRNA分子中，靶IRES的靶部分的正义和反义链能作为两个分离的RNA链转录，这两条分离的RNA链可退火连接，或是作为单独的RNA链转录，自身退火形成发夹环。例如，技术人员将知道如何构建表达构建体，其中靶IRES的靶部分可插入到两个启动子(如两个噬菌体T7启动子，或两个不同的启动子)之间，这样进行转录，将形成互补RNA链，随后退火形成本发明的抑制性siRNA。或者，靶IRES的靶部分可作为单个表达载体的第一和第二编码区，其中靶IRES靶部分的第一编码区在其控制启动子的正义方向，其中靶IRES靶部分的第二编码区在其控制启动子的反义方向。技术人员将认识到，如果靶IRES靶部分的正义和反义编码区由两个独立的启动子进行转录，结果是形成两条独立的RNA链，随后退火形成本发明的抑制性siRNA。另一方面，如果靶IRES的正义和反义靶部分的转录受单个启动子控制，形成的转录物将是自身互补的单链发卡RNA，即，形成自身折叠的双链，产生本发明的siRNA分子。之后，技术人员也将认识到，靶IRES靶部分的正义和反义编码区间的间隔序列，如核苷酸，将提高单链RNA形成发夹环的能力，其中发夹环包含间隔序列。在优选实施方案中，间隔序列包含核苷酸的长度，至少为约5、6、11或15个核苷酸。最后，技术人员也将认识到，靶IRES靶部分的正义和反义编码区可以各自在不同的表达载体上，且受各自的启动子控制。

本发明的重组表达载体可携带附加序列，如调节宿主细胞载体复制的序列(如，复制起始点)及筛选标记基因。这种筛选标记基因有利于筛选载体导入的宿主细胞。例如，典型的筛选标记基因在那些已经导入载体的宿主细胞中具有抗药性，如G418、均霉素或氨甲喋呤。优选的筛选标记基因包含二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr^-宿主细胞，用氨甲喋呤或氨苄青霉素筛选)及neo基因(用G418筛选)。

可选择或构建合适的载体，包含适当的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸序列、增强子序列、标记基因和其他序列，如，在宿主细胞内调节载体复制的序列(如复制起始区)。载体可以是质粒或病毒，如噬菌体或噬菌粒。要了解更详细的内容可参考：Molecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd ed.，Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。许多已知的操纵核酸的技术和方案，例如核酸构建体制备、诱导突变、测序、DNA导入细胞，基因表达，蛋白分析等，都详细描述在Current Protocols in Molecular Biology，2 nd ed.，Ausubel et al.eds.，John Wiley&Sons，1992.

在一项实施方案中，本发明的重组载体包含EMCV-IRES，所述EMCV-IRES具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列和其互补序列，或其连续部分，和/或基本由它们组成，用于本发明的抑制性多聚核苷酸的转录，如上所述样。例如：本发明的表达载体可以包含一个或两个双链DNA拷贝，其中第一DNA链包含选自SEQ ID NO：1第27-46位核苷酸序列、第347-366位核苷酸序列、第472-491位核苷酸序列和它们的亚核苷酸序列或部分序列的核苷酸序列，其中第二DNA链包含第一DNA核苷酸序列的互补序列。技术人员将会发现，这样的构建体可生成本发明的抑制性多聚核苷酸，这种抑制性多聚核苷酸序列具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列、SEQ ID NO：3的核苷酸序列、SEQ IDNO：4的核苷酸序列及其亚序列或基本由它们组成。因此，SEQ ID NO：1的第27-46位核苷酸(即SEQ ID NO：2)、第347-366位核苷酸(即SEQ ID NO：3)、第472-491位核苷酸(即SEQ ID NO：4)分别是siRNA靶位点的实例。

宿主细胞或生物体

本发明另一方面提供了用本发明的抑制性多聚核苷酸来修饰宿主细胞或生物体的方法。此外，本发明提供了包含本文公开的抑制性多聚核苷酸的宿主细胞或生物体。

多种细胞系都可作为合适的宿主细胞导入或重组表达本发明的抑制性多聚核苷酸。本发明的抑制性多聚核苷酸(或转录本发明的抑制性多聚核苷酸的表达载体)可导入例如来自植物或动物组织的细胞系。本领域的技术人员将认识到，本发明的抑制性多聚核苷酸(或转录本发明的抑制性多聚核苷酸的表达载体)优选地导入含有与本发明相关的IRES多聚核苷酸(如SEQ ID NO：1)的宿主细胞中，更优选的是导入修饰后含有与本发明相关的IRES多聚核苷酸的宿主细胞中。技术人员将认识到，作为本发明的一部分，哺乳动物宿主细胞应被修饰，从而含有与本发明相关的病毒IRES多聚核苷酸，阻止当以IRES多聚核苷酸为靶点的本发明抑制性多聚核苷酸被导入修饰宿主细胞后，内源性基因的不慎抑制。如果宿主细胞不是来自哺乳动物细胞，优选来自哺乳动物基因的IRES序列。尽管这是优选的实施方案，但是技术人员也会认识到，本发明的抑制性多聚核苷酸(或转录本发明的抑制性多聚核苷酸的表达载体)也可导入不含有本发明相关的IRES多聚核苷酸的宿主细胞中，如作为对照。

哺乳动物宿主细胞系包括例如COS细胞、CHO细胞、293细胞、A431细胞、3T3细胞、CV-1细胞、HeLa细胞、L细胞、BHK21细胞、HL-60细胞、U937细胞、HaK细胞、Jurkat细胞，以及初生组织和原移植物体外培养获得的细胞株。植物宿主细胞系包括，谷物(corn)细胞、烟草细胞、拟南芥细胞、油菜籽细胞和浮萍植物细胞系，但不仅限于这几种。

另外，也可在低等真核生物如酵母或原核生物中重组表达本发明的抑制性多聚核苷酸。可能适合的酵母菌株包括啤酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母和念珠菌。可能适合的细菌菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌。

本发明中的抑制性多聚核苷酸也可以通过将分离的多聚核苷酸可操作性连接于一个或多个昆虫表达载体(如杆状病毒载体)中的合适的控制序列，并利用昆虫细胞表达系统进行重组表达。杆状病毒/Sf9表达系统的材料和方法可通过商业途径以试剂盒形式(例如：MAXBAC试剂盒，Invitrogen，Carlsbade，CA)获得。

将本发明中的抑制性多聚核苷酸(或转录抑制性多聚核苷酸的表达载体)转入宿主细胞或生物体的方法作为常规的技术为人所熟知，并且可被使用。

例如，若通过化学合成或体外酶合成，则抑制性多聚核苷酸可在导入宿主细胞或生物体前纯化。比如，RNA可通过溶剂或树脂提取、沉淀作用、电泳、层析作用，或它们的组合从混合物中纯化。可选择的是，RNA可不纯化或小量纯化来避免样品处理造成的损失。RNA可干粉保存或溶于水保存。溶液可包含缓冲液或盐来提高双链RNA的结合和/或稳定性。纯化后，抑制性多聚核苷酸(或转录该抑制性多聚核苷酸的表达载体)可被直接导入宿主细胞；也可以导入细胞外的空腔或细胞间质间隙或组织的血液循环；口服导入；或在含有抑制性多聚核苷酸溶液中浸浴细胞或组织进行转导。导入核酸的物理方法包括注射本发明抑制性多聚核苷酸溶液、通过表面覆盖抑制性多聚核苷酸颗粒的轰击、在溶液中浸泡或浸浴细胞和组织，或者电穿孔法。

对于真核细胞，将编码抑制性多聚核苷酸的表达载体转导的合适技术，包括钙磷酸化共沉淀转染、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法、脂质体介导的转染以及逆转录病毒或其它病毒(如牛痘病毒或对于昆虫细胞用杆状病毒)转导的方法。在优选的实施方案中，包装进入病毒颗粒的病毒构建体应可有效地将表达结构转导进入细胞，以及将表达构建体所编码的抑制性多聚核苷酸有效转录。对于细菌细胞，合适的转导技术包括氯化钙法、电穿孔法和噬菌体法。熟练的专业人员会认识到，对于植物细胞，可使用那些与真核细胞中使用的常见技术类似的方法(例如：农杆菌介导的转化和应用胶体金颗粒的物理方法以介导质粒DNA转入植物组织的基因枪技术)。此外，发明的抑制性多聚核苷酸可与其他成份一起被导入细胞，所述其他成份具有一个或多个如下活性：增强细胞的摄取、促进双链的退火、稳定退火链的杂交或提高靶IRES的靶向性。最后，在导入后可引起或容许核酸的表达，例如通过在利于基因表达的情况下培养宿主细胞。

本发明的抑制性多聚核苷酸在生物体中的表达也可以通过建立非人转基因植物或动物而实现；所述植物或动物的基因组导入了与本发明相关的IRES多聚核苷酸或者其连续的部分。这些转基因植物或动物包括那些含有抑制性多聚核苷酸多个拷贝的植物或动物。组织特异性调节序列可操作性连接于IRES多聚核苷酸或者其连续部分，在特定的细胞或特定的发育阶段直接表达抑制性多聚核苷酸。建立转基因植物(例如，通过抑制性核苷酸的物理导入)或转基因动物(例如，通过胚胎操作和显微注射法，包括但不限于，小鼠、山羊、线虫等)的方法已经成为常规的并为本领域熟知(例如，Ma et al.(1995)Science268：716-19；Smith and Glick(2000)BiotechnoL Adv.1 8：85-89；Peeterset al.(2001)Vaccine 19：2756-61；.Bockamp et al.(2002)PhysioLGenomics 11-115-32).。

本发明方法

不采用传统基因筛选中耗时和费力的突变体分离方法，通过使用抑制性多聚核苷酸抑制目的基因(如，内源性基因、转基因等)的表达，未表征的基因的功能可被测定。这样的表达抑制可被用于，如减少目的基因的数量或/和改变目的基因表达活性的时间。本发明可用于确定药学上的潜在靶点，了解与发育相关的正常和病理性活动，确定与出生后发育/衰老相关的信号转导途径等。作为一个非限制性的例子，简单的测试可以修饰宿主细胞来表达导入的目的基因(已知或未知功能)，使得蛋白编码区在包含相应于靶IRES序列的mRNA转录物中转录，然后利用本发明的靶向靶IRES的抑制性多聚核苷酸来抑制(减低、下调、敲减、抑制等)转导的目的转基因的表达。另一个非限制性的实施方案中，本发明的抑制性多聚核苷酸可用作筛选实验(例如siRNA筛选实验)中的阳性对照。

表达的抑制是指在基因产物(如mRNA和/或蛋白)水平上可见到表达的下降，并且可以采用宿主细胞或生物体的外在属性的测试方法来检测，或采用生物化学的方法比如杂交反应(如：Northern印迹分析法、RNA酶保护测试、微点阵等)，反转录和聚合酶链反应，结合反应(如，Western印迹，ELISA，FACS等)，报告系统测定，药物抗性测定等来检测。根据检测的方法不同，与未经处理的宿主细胞或生物体相比，使用本发明的抑制性多聚核苷酸处理过的宿主细胞或生物体其目的基因可达到5％、10％、33％、50％、90％、95％或99％的表达抑制。此外，依据本文提供的方法处理的宿主细胞可导致一部分细胞(如：至少2％、5％、10％、20％、50％、75％、90％、95％或99％处理的细胞)展现出目的基因的表达抑制。增加抑制性多聚核苷酸的量可提高抑制作用的效果。熟练的专业技术人员可认识到由于抑制性多聚核苷酸是针对靶IRES基因而不是目的基因的，处理过的细胞或组织中的目的基因在蛋白水平和mRNA水平上显示出不同的表达水平。例如，尽管对目的基因mRNA水平上的检测可以确定抑制作用的有效性，例如通过Northern印迹分析，但是确定抑制作用程度的更好的方法是检测蛋白的表达水平。

本发明的抑制性多核苷酸可按照上述方法足量地导入宿主细胞或生物体，使得至少有一个拷贝的抑制性多核苷酸被导入宿主细胞。高剂量(例如，至少每个细胞有5、10、100、500或1000个拷贝)的抑制性多聚核苷酸可以产生高效的抑制作用。

目的转基因的下调

本发明提供一种能够抑制目的转基因表达的方法，所述转基因的位于含相应于靶IRES的核苷酸序列的mRNA转录物中的蛋白编码区被宿主或生物体转录。该方法包括将靶向靶IRES的抑制性多聚核苷酸导入包含目的基因的宿主细胞或生物体，其中转基因转录到包含相应于靶IRES的序列的mRNA转录物。熟练的专业技术人员会认识到，尽管本发明的抑制性多聚核苷酸分子特异性靶向IRES，但本发明的抑制性多聚核苷酸的导入也可引发位于与IRES相同的mRNA转录物的的任一蛋白编码区的下调。

因此，本发明的抑制性多聚核苷酸是十分有用的，因为它们不止用来抑制靶IRES基因的表达，即它们也可以用来敲减具有不同于(即不相应于)抑制性多核苷酸序列的核苷酸序列的转基因的表达(见实施例1)。只要转基因的转录导致其蛋白编码区位于mRNA转录物中，任何转基因可被本发明的抑制性多聚核苷酸抑制，所述mRNA转录物包含相应于本发明相关IRES序列的核苷酸序列。

筛选试验

如上所述，以靶向靶IRES的本发明的抑制性多聚核苷酸可以被用来抑制基因的表达，所述基因例如作为mRNA转录物的一部分被转录的转基因，所述mRNA转录物包含相应于靶IRES的序列。在至少一个其它的实施方案中，本发明的抑制性多聚核苷酸在针对特定基因(包括内源性基因、转基因等)的抑制性多聚核苷酸的筛选文库的方法中作为阳性对照。

本发明的抑制性多聚核苷酸可在筛选抑制性多聚核苷酸(例如siRNA分子)文库的方法中作为阳性对照，所述方法用于筛选最适于抑制目的基因表达的抑制性多聚核苷酸。对于高通量检测来说，每个检测板上的阳性对照可用来验证每个平板上的结果。

例如，目的转基因可以被置入表达载体，这样它的蛋白编码区域作为mRNA转录物的一部分被转录，所述mRNA转录物包含相应于靶IRES的核苷酸序列。表达载体随后可用来修饰宿主细胞。随后用针对目的转基因的抑制性多聚核苷酸文库处理修饰的宿主细胞，其中所述文库至少包含一种作为阳性对照的本发明的靶向靶IRES的抑制性多聚核苷酸。

在本发明的另一实施方案中，本发明中的抑制性多聚核苷酸可以用作阳性对照来筛选针对内源性目的基因的抑制性多聚核苷酸的文库或优化文库的筛选。例如，宿主细胞可以用包含报告核酸的表达载体来修饰，其中报告核酸的蛋白编码区是包含相应于靶IRES的核苷酸序列的mRNA转录物的一部分。在这个实施方案中，本发明的抑制性多聚核苷酸可通过抑制报告核酸的表达而用作阳性对照。检测这种报告核酸活性的抑制作用可由公知的报告检测来进行，以对筛选方案进行验证。

本发明的抑制性多聚核苷酸在下调报告核酸的表达的方法中的用途可用于筛选针对内源性目的基因的抑制性多聚核苷酸文库，和/或筛选转基因文库以筛选可诱导产生新的表型的序列。后一方法中抑制性多聚核苷酸的功能源自本发明的抑制性多聚核苷酸下调转录至mRNA转录物的任一基因的表达的功能，所述mRNA转录物包含相应于IRES的序列。例如，一个文库可包含许多表达载体，每个表达载体包含独特的转基因序列、IRES和报告核酸，这样它们将被转录至同一个多顺反子mRNA。之后该文库可以用来修饰多种宿主细胞，其中每一宿主细胞被不同的表达载体修改。随后可以观察每一修饰的宿主细胞的表型。产生目的表型的转基因可进一步用发明的抑制性多聚核苷酸进行分析(例如，其表达可以被抑制)，其中报告核酸的表达下调将作为阳性指征，观察到的相反的表型与转基因的下调相关。

在上述描述的检测方法中，可应用许多公知的报告核酸及相关的检测方法。一个实施方案中，报告核酸是绿色荧光蛋白。在第二实施方案中，报告子(reporter)是β半乳糖苷酶。在其它的实施方案中，报告核苷酸是碱性磷酸酶、β-内酰胺酶、荧光素酶或氯霉素乙酰转移酶。

本发明可单独使用或作为试剂盒的组成成份使用，所述试剂盒中至少包含将本发明的抑制性多聚核苷酸导入测试样品中所必需的一种反应试剂，所述测试样品是宿主细胞或生物体。该试剂盒也可包括供试剂盒使用者实施本发明的操作说明。

本申请中所引用的参考文献、专利和专利申请的全部内容在此引用作为参考。

实施例

下面的实施例提供了本发明的例示性实施方案，并不是限制本发明。本领域普通技术人员会认识到许多其他的实施方案也包含在本发明范围之内。

实施例1

用针对EMCV-IRES的siRNA敲减基因表达

实施例1.1：材料和方法

用公众可获得的DharmaconsiRNA设计算法(见www.dharmacon.com/sidesign/；也可见Reynoldes et al，同上)设计针对EMCV-IRES的siRNA。应用Dharmacon算法鉴别出的IRES序列的三个部分作为最佳靶序列(IRES1、IRES12、IRES3)，同时也被选为siRNA分子的靶标(图1)。特别地，应用Dharmacon(Lafayette，CO)合成的siRNA1、siRNA2和siRNA分别靶向IRES1、IRES 2和IRES3(图1)。

用三种合成的siRNA分子转染一种经过稳定修饰而表达重组抗体的CHO细胞系。用编码抗体重链的表达载体和编码抗体轻链的表达载体修饰CHO细胞系。该表达载体把重链或轻链转录到多顺反子mRNA，该mRNA包含相应于EMCV-IRES的序列上游的重链或轻链蛋白编码区，和相应于EMCV-IRES的序列下游的不同选择标记。预期siRNA介导的对包含EMCV-IRES的转录物的敲减将导致重组抗体(也就是IRES上游的重链和/或轻链基因)表达的敲减。通过监测重组单克隆抗体的表达可容易地在条件培养基中测定表达的敲减，例如通过western印迹、ELISA、自动微珠俘获(bead-based capture)/检测的方法(例如：基于IGEN检测(Roche Diagnostics，Alameda，CA))。在72小时和144小时分泌检测中，单独应用各siRNA转染修饰的CHO细胞系或用三种siRNA的合并物(pool)转染修饰的CHO细胞系(各n＝3)。在72小时(3天)和144小时(6天)时应用基于IGEN检测来评价抗体滴定和细胞数量，以估计细胞特异性产率(滴定/细胞数量/天数)，针对实验过程中不同接种密度和细胞生长对滴定数据进行标准化(normalize)。

实施例1.2-结果

图2A和2B显示在条件培养基中，三种siRNAs都可介导单克隆抗体转基因表达的敲减。针对IRES2和IRES3的siRNA分子看来比针对IRESI的siRNA分子更有效；siRNA分子合并物敲减表达中非常有效。敲减可以在转染后72小时和144小时观察到。这种效应可在表达不同单克隆抗体的几种CHO细胞系种观察到(数据未给出)。本发明表明IRESsiRNAs可与表达载体中应用IRES的细胞系同时使用。用基于滴度的测试来监测基因表达产物敲减的能力也免除了发展其它确认实验(例如实时定量PCR)的需求。

序列表

<110>Wyeth

<120>靶向IRES序列的短干扰RNA双链及其用途

<130>01997.039500

<150>60/792,968

<151>2006-04-19

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>548

<212>DNA

<213>脑心肌炎病毒

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>脑心肌炎病毒

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>脑心肌炎病毒

<400>3

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>脑心肌炎病毒

<400>4

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>siRNA1的第一链(如图1中)

<220>

<221>misc_RNA

<222>(1)..(21)

<400>5

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>siRNA2的第一链(如图1中)

<220>

<221>misc_RNA

<222>(1)..(21)

<400>6

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>siRNA3的第一链(如图1中)

<220>

<221>misc_RNA

<222>(1)..(21)

<400>7

Claims (25)

1.一种针对IRES的抑制性多聚核苷酸。

2.权利要求1的抑制性多聚核苷酸，其中IRES具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

3.权利要求2的抑制性多聚核苷酸，其中抑制性多聚核苷酸包含siRNA的第一链。

4.权利要求3的抑制性多聚核苷酸，其中siRNA的第一链具有以下核苷酸序列的RNA等同物，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列、SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一部分、SEQ ID NO：1的核苷酸序列的互补序列和SEQ ID NO：1的核苷酸序列的互补序列的一部分。

5.权利要求4的抑制性多聚核苷酸，其中siRNA的第一链的长度是5-548个核苷酸。

6.权利要求5的抑制性多聚核苷酸，其中siRNA的第一链具有以下核苷酸序列的RNA等同物，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：2的核苷酸序列、SEQ ID NO：3的核苷酸序列、SEQ ID NO：4的核苷酸序列和它们的亚序列的核苷酸序列。

7.权利要求6的抑制性多聚核苷酸，其中siRNA的第一链是自我互补的，并进一步包含发夹环。

8.权利要求7的抑制性多聚核苷酸，其中siRNA的第一链进一步包含以下核苷酸序列的RNA等同物，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：2的核苷酸序列的互补核苷酸序列、SEQ ID NO：3的核苷酸序列的互补核苷酸序列、SEQ ID NO：4的核苷酸序列的互补核苷酸序列。

9.权利要求2的抑制性多聚核苷酸，其中抑制性多聚核苷酸是反义分子。

10.权利要求6的抑制性多聚核苷酸，其中抑制性多聚核苷酸进一步包含与siRNA的第一链互补的siRNA的第二链。

11.一种分离的DNA分子，其编码权利要求1-9中任一项的抑制性多聚核苷酸。

12.权利要求11的分离的DNA分子，其中该DNA分子可操作地连接于至少一个表达控制序列。

13.用权利要求12的分离的DNA分子转化或转染的宿主细胞。

14.一种微生物，其包含编码权利要求1-9中任一项的抑制性多聚核苷酸的DNA。

15.一种非人转基因动物，它的体细胞和生殖细胞包含编码权利要求1-9中任一项的抑制性多聚核苷酸的DNA。

16.一种转基因植物，它的体细胞和生殖细胞包含编码权利要求1-9中任一项的抑制性多聚核苷酸的DNA。

17.一种分离的DNA分子，它编码权利要求10的siRNA的第二链。

18.权利要求17的分离的DNA分子，其中DNA分子可操作地连接于至少一个表达控制序列。

19.用权利要求18的分离的DNA分子转化或转染的宿主细胞。

20.一种微生物，其包含编码权利要求10的siRNA的第二链的DNA。

21.一种非人转基因动物，它的体细胞和生殖细胞包含编码权利要求10的siRNA的第二链的DNA。

22.一种转基因植物，它的体细胞和生殖细胞包含编码权利要求10的siRNA的第二链的DNA。

23.包含权利要求1的抑制性多聚核苷酸的试剂盒。

24.通过宿主细胞下调转基因表达的方法，其中转基因作为包含相应于IRES的核苷酸序列的mRNA转录物的一部分而被转录，所述方法包括将靶向IRES的抑制性多聚核苷酸导入宿主细胞的步骤。

25.权利要求24的方法，其中IRES基本上由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。

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