BRPI0709623A2 - polinucleotìdeo inibitório, molécula de dna isolado, célula hospedeira, microorganismo, animal transgênico não humano, planta transgênica, kit, e, método para regular de modo negativo a expressão de um transgene por uma célula hospedeira - Google Patents

Abstract

POLINUCLEOTìDEO INIBITóRIO, MOLéCULA DE DNA ISOLADO, CéLULA HOSPEDEIRA, MICROORGANISMO, ANIMAL TRANSGêMCO NãO HUMANO, PLANTA TRANSGêNICA, KIT, E, MéTODO PARA REGULAR DE MODO NEGATIVO A EXPRESSãO DE UM TRANSGENE POR UMA CéLULA HOSPEDEIRA. A invenção provê novos polinueleotídeos inibitórios dirigidos contra sequências IRES. A invenção também provê vetores de expressão geneticamente engenheirados, células hospedeiras, animais transgênicos, e plantas transgênicas compreendendo os novos polinucleotídeos inibitórios da invenção. A invenção adicionalmente provê métodos de usar os polinucleotídeos inibitórios da invenção.

Description

"POLINUCLEOTÍDEO INIBITÓRIO, MOLÉCULA DE DNA ISOLADO,CÉLULA HOSPEDEIRA, MICROORGANISMO, ANIMALTRANSGÊNICO NÃO HUMANO, PLANTA TRANSGÊNICA, KIT, E,MÉTODO PARA REGULAR DE MODO NEGATIVO A EXPRESSÃO DEUM TRANSGENE POR UMA CÉLULA HOSPEDEIRA"Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica o benefício de prioridade para pedidode patente US provisório No. 60/792.968, depositado em 19 de abril de 2006,que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.FUNDAMENTOS DA INVENÇÃOCampo da Invenção

A presente invenção refere-se ao uso de polinucleotídeosinibitórios, particularmente duplexes de RNA interferência curta (siRNA),que marcam um sítio de entrada de ribossoma interno nos métodos de inibiçãoda expressão de genes, por exemplo, testes de triagem.Fundamento da Técnica Relacionada

Sabe-se bem na técnica que a transcrição de um genegeralmente requer um promotor que está a montante do gene, esta transcriçãogeralmente resulta em mRNA monocistrônico (isto é, um transcrito de mRNAque compreende somente uma região de codificação de proteína), e que atradução do mRNA monocistrônico resultante é geralmente iniciada por umcomplexo de iniciação de tradução em um mecanismo dependente determinação que envolve o reconhecimento de uma estrutura de terminação 5'terminal no mRNA monocistrônico (ver, por exemplo, Merrick e Hershey(1996) "The pathway and mechanism of eukaryotic protein synthesis." InTranslational Control, J.W.B. Hershey, M.B. Mathews, e N. Sonenberg, Eds.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), pp. 31-69).O complexo de iniciação de tradução geralmente se movimenta junto com omRNA monocistrônico até que ele alcança um primeiro códon de iniciação(AUG), geralmente em 50-100 nucleotídeos da estrutura de terminação, peloque a tradução de mRNA em proteína deve geralmente começar. Em outraspalavras, a tradução do mRNA em proteína geralmente começa no primeirocódon AUG de iniciação. Este modelo canônico de transcrição e traduçãomonocistrônicas, encontrado na maior parte de células eucarióticas e algumasprocarióticas, coloca um problema na utilização de tecnologia de DNArecombinante, por exemplo para terapia com genes, porque é às vezesvantajoso transferir e expressar transgenes múltiplos dentro de uma célulahospedeira única.

Primeiramente no desenvolvimento de tecnologia de DNArecombinante, quando um investigador estava interessado na expressão demais de uma proteína em uma célula hospedeira única, os genes a seremtransferidos (transgenes), por exemplo os codificando cada proteína deinteresse, foram colocados em diferentes vetores de expressão, necessitando que a célula hospedeira fosse modificada com sucesso com cada um destesvetores de expressão. Como esperado, a modificação de uma célulahospedeira com mais do que um vetor de expressão com freqüênciademonstrou ser difícil e laboriosa. Alternativamente, um vetor de expressãoúnico compreendendo cada transgene que codificou uma proteína (s) deinteresse foi criado de modo que a transcrição de cada transgene foicontrolada por seu próprio promotor individual, isto é, vários mRNAsmonocistrônicos foram transcritos a partir de um vetor de expressão único. Noentanto, a presença de vários promotores dentro de um vetor de expressãocom freqüência resultou em redução ou perda de expressão com o tempo, provavelmente devido à interferência entre as seqüências de promotor. Estesproblemas foram resolvidos pela descoberta e subseqüente utilização de sítiosde entrada de ribossomas internos (IRESes). Um IRES é geralmente colocadoa jusante de uma região de codificação de proteína , cuja tradução é iniciadapor um primeiro códon de iniciação. A seqüência de um IRES permite que atradução da proteína comece a partir de um códon de iniciação interno (isto é,segundo) (AUG), isto é, um códon AUG a jusante do LRES e o primeirocódon AUG de iniciação, e assim permite que um transcrito de mRNA sejapolicistrônico, isto é, capaz de compreender mais do que uma região decodificação de proteína.

Até agora, IRESes foram identificados na região 5' de mRNAsvirais não terminados, como membros da família Picornaviridae, porexemplo, vírus poliomielite (Pelletier et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8(3): 1103-12), poliovírus (PV)5 vírus de encefalomiocardite (EMCV) (Jang et al.(1988) J. Virol. 62(8):2636-43), e vírus da febre aftosa (FMDV) (revistos emBelsham e Sonenberg (1996) Microbiol. Rev. 60(3):499-51 1; Robertson et al.(1999) RNA 5(9): 1167-79; Jackson e Kaminski (1995) RNA 1(10):985-1000;Herman (1989) Trends Biochem. Sei. 14(6):219-22). IRESes também foramdetectados em transcritos de outros vírus, como retrotransposons murinos tipoVL30- (Berlioz et al. (1995) J. Virol. 69(10):6400-07), cardiovírus, rinovírus,aftoviras, vírus de hepatite C (HCV), e mais recentemente em mRNAscodificando o precursor gag precursor do vírus de leucemia de murinos deFriend (FMLV) e Moloney (MoMLV) (Berlioz e Darlix (1995) J. Virol.69(4):2214-22; Vagner et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(35):20376-83). Apresença de IRESes em RNAs celulares também foi descrita. Exemplos demRNAs celulares que compreendem IRESes incluem os codificando proteínade ligação de cadeia pesada de imunoglobulina (BiP) (Macejak e Sarnow(1991) Nature 353:90-94); alguns fatores de crescimento como fator decrescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento de fibroblastos2 e fator de crescimento de tipo insulina (Teerink et al. (1995) Biochim.Biophys. Acta 1264(3):403-08; Vagner et al. (1995) Mol Cell. Biol. 15(1):35-44); fator de iniciação de tradução eIF4G (Gan e Rhoads (1996) J. Biol.Chem. 271(2):623-26), e os fatores de transcrição de leveduras TFIID eHAP4 (lizuka et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14(11):7322-30) (ver também , Ohet al. (1992) Genes Dev. 6(9): 1643-53; He et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 93(14):7274-78; He et al. (1996) Gene 175(1-2): 121-25; Tomanin et al.(1997) Gene 193(2): 129-40; Gambotto et al. (1999) Câncer Gene Ther.6(l):45-53; Qiao et al. (1999) Câncer Gene Ther. 6(4):373-79)).

No contexto de tecnologia de DNA recombinante, os vetoresde expressão compreendendo IRESes foram descritos (ver, por exemplo,pedidos de patente publicados internacionais Nos. WO 98/37189; WO99/25860; e WO 93/03143). Geralmente, estes vetores de expressão devempermitir a colocação de um IRES entre pelo menos dois transgenes, esubseqüentemente devem permitir a expressão de pelo menos dois transgenesde um promotor único. Em particular, a transcrição do promotor único deveresultar em um mRNA que poderia ser policistrônico, por exemplo, em quepelo menos duas regiões de codificação de proteína fossem separadas por pelomenos um IRES, e a tradução iria começar em ambos o primeiro códon AUGde iniciação, e um códon (s) AUG interno a jusante do IRES (es).

IRESes são ferramentas poderosas no campo de tecnologia deDNA recombinante porque eles permitem a tradução de vários genes a partirde um transcrito de mRNA único. Em outras palavras, o uso de um IRES paraa expressão de transgenes diferentes múltiplos por uma única célulahospedeira obvia a necessidade de modificar uma célula hospedeira com ouvetores de expressão múltiplos ou com um vetor de expressão compreendendovários promotores que podem interferir entre si. Adicionalmente, váriosgrupos tem registrado a estabilidade e funcionalidade do EMCV- IRES emembriões de camundongos e galinhas, e em muitos órgãos de camundongosadultos (Ghattas et al. (1991) Mol. Cell. Biol. ll(12):5848-59; Kim et al.(1992) Mol Cell. Biol. 12(8):3636-43; Creancier et al. (2000) J. Cell. Biol.150(1):275-81).

Apesar de IRESes terem sido incorporados em tecnologia deRNA recombinante, a utilidade desta tecnologia, por exemplo em terapia degenes, pode ter avançado sobre a investigação em 1) os efeitos da expressãodestes transgenes sobre a célula hospedeira modificada ou organismo, porexemplo o efeito do transgene no metabolismo do hospedeiro modificado, e2) as funções das proteínas codificadas por transgenes. Um método popular deinvestigação do(s) efeito(s) e função (ões) da expressão do transgene sobreuma célula hospedeira ou organismo é para inibir (por exemplo reduzir,interferir, regular de modo negativo, nocaute, etc) a expressão do transgeneapós ter sido introduzido com sucesso no e expressado pela célula hospedeiraou organismo.

Várias abordagens foram desenvolvidas para inibir a expressãode um gene de interesse (por exemplo um transgene, gene endógeno, etc)incluindo anti-sentido, hélice tripla, co-supressão e métodos RNAi. Estesmétodos tem envolvido a utilização de moléculas de ácido nucleico demarcação que são o complemento reverso do transcrito de mRNA do genemarcado (ou porções do mesmo), formam estruturas de hélice tripla com ogene marcado, são duplicatas exatas do gene marcado, ou são moléculasduplex de RNA interferência curta (siRNA) compreendendo uma seqüêncianucleotídica do gene marcado (ou porções do mesmo), respectivamente. Atéagora, estas abordagens tem sido usadas para especificamente marcar umúnico gene de interesse, e como tal, requerem que a seqüência da molécula demarcação (por exemplo a molécula anti-sentido, molécula formadora dehélice tripla, a molécula de transgene de co-supressão, e a molécula desiRNA) correspondem a (isto é, especificamente hibridizam em pelo menosuma porção de um, o outro, ou ambos os filamentos de ) pelo menos umaporção do gene marcado de interesse. Como tal, a aplicação destasabordagens tem requerido até agora do investigador conhecer a seqüência dogene marcado de interesse, e/ou a porção da seqüência de gene marcado quetem a maior suscetibilidade para ser marcada, e para criar uma molécula demarcação única para cada gene marcado. Até agora, não se encontram nemum mecanismo pelo qual se pode inibir a expressão de um gene marcado semprimeiro conhecer a seqüência do gene de interesse, nem, se a seqüência dogene de interesse for conhecida, se encontra disponível um teste eficiente paradeterminar qual porção da seqüência do gene é mais suscetível à inibição.

A presente invenção resolve estes problemas ao proverpolinucleotídeos inibitórios e métodos de usar estes polinucleotídeosinibitórios em métodos de, por exemplo, 1) inibir (por exemplo, reduzir,interferir com, regular de modo negativo, nocautear, etc), a expressão de pelomenos um transgene de interesse que não requer ao investigador conhecer oudeterminar a seqüência do transgene e/ou 2) triar bibliotecas de marcação depolinucleotídeo s para inibir a expressão de um gene de interesse, sem levarem conta se o gene de interesse é um transgene ou um gene endógeno.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção é relacionada com a descoberta de que ospolinucleotídeos inibitórios que marcam um IRES podem ser usados pararegular de modo negativo (por exemplo inibir) a expressão de pelo menos umgene de interesse que é transcrito com uma região de codificação de proteínacomo parte de um transcrito de mRNA compreendendo uma seqüêncianucleotídica correspondendo ao IRES marcado. Assim, a presente invençãoprovê um polinucleotídeo inibitório dirigido contra um IRES, por exemploum IRES que tem a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1.

Um polinucleotídeo inibitório da invenção pode ser umamolécula de siRNA, por exemplo, em uma forma de realização da invenção,um polinucleotídeo inibitório da invenção compreende um primeiro filamentode um siRNA. Em outra forma de realização da invenção, o primeirofilamento do siRNA tem e/ou consiste essencialmente do RNA equivalente deuma seqüência nucleotídica selecionada dentre o grupo consistindo daseqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1, uma porção da seqüêncianucleotídica de SEQ ID NO: 1, o complemento da seqüência nucleotídica deSEQ ID NO:l, e uma porção do complemento da seqüência nucleotídica deSEQ ID NO: 1. Em outra forma de realização da invenção, o primeirofilamento do siRNA está entre 5 e 548 nucleotídeos em comprimento. Emoutra forma de realização da invenção, o primeiro filamento do siRNA teme/ou consiste essencialmente do RNA equivalente de uma seqüêncianucleotídica selecionada dentre o grupo consistindo da seqüência nucleotídicade SEQ ID NO:2, a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:3, a seqüêncianucleotídica de SEQ ID NO:4, e a seqüência nucleotídica de subseqüências damesma. Em outra forma de realização da invenção, o primeiro filamento dosiRNA é auto-complementar e ainda compreende uma alça em forma degrampo de cabelo, por exemplo, um siRNA da invenção pode compreender oRNA equivalente de uma seqüência nucleotídica selecionada dentre o grupoconsistindo da seqüência nucleotídica complementar a uma seqüêncianucleotídica de SEQ ID NO:2, a seqüência nucleotídica complementar a umaseqüência nucleotídica de SEQ ID NO:3, e a seqüência nucleotídicacomplementar a uma seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:4. Em aindaoutra forma de realização da invenção, o polinucleotídeo inibitório é umamolécula anti-sentido.

A presente invenção também provê moléculas de DNA isoladoque codificam os polinucleotídeos inibitórios da invenção, por exemplo, comodescrito aqui. Em uma forma de realização da invenção, a molécula de DNA éligada operativamente a pelo menos uma seqüência de controle de expressão.

A presente invenção também provê uma célula hospedeira transformada outransfectada com tais moléculas de DNA que codificam os polinucleotídeosinibitórios da invenção. Ainda mais, a invenção também provê ummicroorganismo que contém a(s) molécula (s) de DNA que codifica(m) umpolinucleotídeo inibitório da invenção. Em uma forma de realização, ainvenção provê animal transgênico não humano em que as células somáticas egerminais contém DNA que codifica um polinucleotídeo inibitório dainvenção. Em outra forma de realização, a invenção provê uma plantatransgênica em que as células somáticas e germinais contém DNA quecodifica um polinucleotídeo inibitório da invenção.

Em uma forma de realização da invenção, um siRNA dainvenção (por exemplo, como descrito acima) ainda compreende um segundofilamento que é complementar ao primeiro filamento do siRNA. Também, apresente invenção provê uma molécula de DNA isolado que codifica umsegundo filamento de uma molécula de siRNA da invenção. Em uma formade realização da invenção, a molécula de DNA isolado pode ser ligadaoperativamente a pelo menos uma seqüência de controle de expressão. Ainvenção também provê uma célula hospedeira transformada com esta(s)molécula(s) de DNA ligada (s) operativamente. Em uma forma de realização,a invenção provê um microorganismo que contém DNA que codifica osegundo filamento de um siRNA da invenção. A invenção também provê umanimal transgênico não humano em que as células somáticas e germinaiscontém DNA que codifica um segundo filamento de uma molécula de siRNAda invenção. Em outra forma de realização, a invenção provê uma plantatransgênica em que as células somáticas e germinais contém DNA quecodifica um segundo filamento de um siRNA da invenção.

A invenção também provê um kit compreendendo umpolinucleotídeo inibitório da invenção e métodos de usar um polinucleotídeoinibitório da invenção.

A invenção também provê um método de regular de modonegativo a expressão de um transgene por uma célula hospedeira, em que otransgene é transcrito como parte de um transcrito de mRNA compreendendoa seqüência nucleotídica correspondendo a um IRES, o métodocompreendendo a etapa de introduzir na célula hospedeira um polinucleotídeoinibitório que marca o IRES. Em uma forma de realização da invenção, oIRES tem e/ou consiste essencialmente de uma seqüência nucleotídica deSEQID NO: 1.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIG. 1 mostra a seqüência nucleotídica de EMCV-IRES(equivalente a SEQ ID NO: 1). Está indicado em negrito dentro da seqüênciaEMCV-IRES os exemplos de três porções da seqüência EMCV-IRES (IRESIIRES2, e IRES3; SEQ ID NOs:2, 3, e 4, respectivamente) que podem serotimamente marcadas pelas moléculas de siRNA. Também são mostrados emcaixas os exemplos de três moléculas de siRNA moléculas (siRNA 1 ,siRNA2, e siRNA3; SEQ ID NOs: 5, 6, e 7, respectivamente) que podem serusadas para marcar EMCV-IRES (a IRESI, IRES2, e IRES3,respectivamente).

FIG 2 demonstra o título de anticorpo (μ£/πι1, eixo y)produzido por células CHO geneticamente modificadas para expressaranticorpos de um mRNA policistrônico compreendendo pelo menos umaseqüência EMCV- IRES após transformada com o seguinte (eixo x):reagentes de transfecção de controle (controle), moléculas de siRNA 1dirigidas contra IRESl (IRESI), moléculas siRNA2 dirigidas contra IRES2(IRES2), moléculas siRNA3 dirigidas contra IRES3 (IRES3), ou um laço demoléculas siRNA 1 , siRNA2 e siRNA3 (laço). Barras representam o título deanticorpo médio ± SEM de três experiências (n=3), ou três dias após atransfecção (dia 3; 0)ou seis dias após a transfecção (dia 6; ■). Figura 2Bdemonstra a produtividade específica de célula (título/ célula # dia; eixo y), deanticorpo recombinante produzido por células CHO geneticamentemodificadas para expressar anticorpos de um mRNA policistrônicocompreendendo pelo menos uma célula de seqüência EMCV-IRES apóstransfecção com o seguinte (eixo x): reagentes de transfecção de controle(controle), moléculas SiRNAl dirigidas IRESl (IRESI), moléculas siRNA2dirigidas contra IRES2 (IRES2), moléculas siRNA3 dirigidas contra IRES3(IRES3), ou um laço de moléculas siRNA 1, siRNA2 e siRNA3 (laço).Barras representam o título de anticorpo médio ± SEM de três experiências(n=3), ou três dias após a transfecção (dia 3; ou seis dias após a transfecção(dia 6; ).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à descoberta de que sítios deentrada de ribossoma interno (IRESes) e o uso subseqüente de IRESes emtecnologia de DNA recombinante para iniciar e controlar a tradução de umaregião de codificação de proteína dentro de um transcrito de mRNApolicistrônico. A invenção é baseada na descoberta de que a marcação de um IRES marcado com polinucleotídeos inibitórios eficientemente evita atradução de pelo menos a região de codificação de proteína a montante doIRES marcado, e talvez todas as regiões de codificação de proteína dotranscrito de mRNA compreendendo uma seqüência nucleotídicacorrespondendo ao IRES marcado. Conseqüentemente, são providos aqui os polinucleotídeos inibitórios dirigidos para um IRES (isto é, um IRESmarcado) e métodos de usar os mesmos em abordagens não específicas paranocautear a expressão de um gene de interesse. Como este é o IRES que estásendo marcado, este método não requer dirigir os polinucleotídeos inibitóriosprecisamente contra o gene de interesse; isto é, métodos providos aqui não requerem que a seqüência do gene de interesse seja conhecida oudeterminada, e permite que as moléculas de marcação sejam usadas parainibir a expressão de muitos transgenes. O método somente requer que aregião de codificação de proteína transcrita do gene de interesse esteja dentrode um transcrito de mRNA compreendendo uma seqüência nucleotídicacorrespondendo a um IRES marcado. Em outras palavras, é provável que todoo transcrito de mRNA compreendendo o IRES será marcado por umpolinucleotídeo inibitório da invenção, por exemplo uma molécula de siRNA,para inibição. Por exemplo, uma molécula de siRNA marcando o IRES emum transcrito de mRNA compreendendo (de 5' a 3') um primeiro transgene, oIRES, e um segundo transgene, pode ser usada para nocautear a expressão deambos o segundo e o primeiro transgenes. Um transcrito de mRNA nãoprecisa ser policistrônico para ser marcado com sucesso por umpolinucleotídeo inibitório da invenção. Por exemplo, um siRNA marcandouma seqüência de IRES em um transcrito de mRNA que compreende somenteum transgene, que está ou a montante ou a jusante do IRES, pode ser usadopara nocautear a expressão do transgene. Em uma forma de realizaçãopreferida, o mRNA transcrito do gene de interesse, isto é, contendo a regiãode codificação de proteína do gene de interesse, está a montante de um IRES.

Em particular, a presente invenção é baseada na descoberta deque polinucleotídeos inibitórios dirigidos contra um IRES podem inibir atradução de uma região de codificação de proteína que faz parte de umtranscrito de mRNA compreendendo a seqüência nucleotídicacorrespondendo to the IRES marcado. Será evidente para um versado natécnica que o uso de tais polinucleotídeos inibitórios dirigidos para um IRESpermite métodos de nocaute da expressão de um gene de interesse, cuja regiãode codificação de proteína está dentro de um transcrito de mRNAcompreendendo a seqüência nucleotídica correspondendo ao IRES marcado, eque tais métodos não requerem a modificação ou marcação do própriotransgene. Um versado na técnica irá reconhecer que a inibição dospolinucleotídeos aqui providos não irá somente permitir a regulação de modonegativo de um gene de interesse, mas também pode ser usada em métodos detriagem de bibliotecas de siRNA, por exemplo, como controles positivos.

Como tal, a invenção provê polinucleotídeos inibitórios quemarcam um IRES. Além disso, a invenção provê métodos de modificação deuma célula hospedeira ou organismo para expressar os polinucleotídeosinibitórios da invenção, e também provê estas células hospedeiras ouorganismos modificados. A invenção também provê métodos de usar ospolinucleotídeos inibitórios para alterar a expressão de genes de interesse ecomo controles positivos em testes de triagem, por exemplo, testes de triagemde siRNA.

De acordo com a invenção, um gene de interesse podecodificar uma proteína terapêutica. Uma proteína terapêutica, como usadaaqui, é uma proteína ou peptídeo que tem um efeito biológico sobre umaregião no corpo em que ela atua ou em uma região do corpo em que ela atuaremotamente via intermediários. Uma proteína terapêutica pode ser, porexemplo, uma proteína secretada, como, um anticorpo, um fragmento deligação a antígeno de um anticorpo, um receptor solúvel, uma fusão dereceptor, uma citocina, um fator de crescimento, uma enzima, um fator decoagulação, como descrito em maiores detalhes aqui. A lista acima deproteínas é apenas exemplar em natureza, e não se destina a ser uma recitaçãolimitativa. Um versado na técnica irá entender que qualquer proteína pode serusada de acordo com a presente invenção e será capaz de selecionar a proteínaparticular a ser produzida com base como necessário.

Como usado no relatório, os termos polipeptídeo, proteína epeptídeo são sinônimos e são usados de modo interpermutável.Conseqüentemente, como usado aqui, o tamanho de uma proteína, peptídeoou polipeptídeo geralmente compreende mais de 2 aminoácidos. Porexemplo,uma proteína, peptídeo ou polipeptídeo pode compreender de cercade 2 a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 20 a cerca de 40 aminoácidos, decerca de 40 a cerca de 100 aminoácidos, de cerca de 100 aminoácidos a cercade 200 aminoácidos, de cerca de 200 aminoácidos a cerca de 300aminoácidos, e assim em diante.

Como usado aqui, um aminoácido refere-se a qualqueraminoácido de ocorrência natural, qualquer derivado de aminoácido ouqualquer mimético de aminoácido conhecido na técnica. Em algumas formasde realização, os resíduos da proteína ou peptídeo são seqüenciais, semqualquer aminoácido interrompendo a seqüência de resíduos de aminoácidos.Em outras formas de realização, a seqüência pode compreender uma ou maisporções de aminoácidos. Em formas de realização particulares, a seqüência deresíduos da proteína ou peptídeo pode ser interrompida por uma ou maisporções não aminoácido.

Como usado aqui, um anticorpo refere-se a qualquer moléculade tipo anticorpo que tem uma região de ligação de antígeno, e incluifragmentos de anticorpo como Fab1, Fab, F(ab')2, anticorpos de domínio único(DABs), Fv, scFv (Fv de cadeia única), e semelhantes. As técnicas parapreparar e usar várias construções com base em anticorpos e fragmentos sãobem conhecidas na técnica. Meios para preparar e caracterizar anticorpos sãobem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; incorporado aquipor referência em sua totalidade). Por exemplo, um anticorpo pode incluirpelo menos uma e preferivelmente duas cadeias pesadas de comprimentocompleto e pelo menos uma, e preferivelmente duas cadeias leves. O termo"anticorpo" como usado aqui inclui um fragmento de anticorpo ou umamolécula variante como um fragmento de ligação a antígeno (por exemplo umFab, F(ab')2, Fv, um fragmento Fv de cadeia única, um fragmento de cadeiapesada, (por exemplo VHH de camelídeo) e uma fusão de domínio de ligação - imunoglobulina (por exemplo, SMIP ™).

O anticorpo pode ser anticorpo monoclonal ou deespecificidade única. O anticorpo também pode ser um anticorpo humano,humanizado, quimérico, enxertado com CDR, ou gerado in vitro. Em aindaoutras formas de realização, o anticorpo tem uma região constante de cadeiapesada selecionada dentre, por exemplo [IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4. Emoutra forma de realização, o anticorpo tem uma cadeia leve selecionadadentre, por exemplo kappa ou lambda. Em uma forma de realização, a regiãoconstante é alterada, por exemplo mudada, para modificar as propriedades doanticorpo (por exemplo para aumentar ou diminuir um ou mais dentre: ligaçãode receptor Fe, glicosilação de anticorpo, o número de resíduos de cisteína,função de célula efetuadora, ou função de complemento). Tipicamente, oanticorpo especificamente liga a um antígeno predeterminado, por exemploum antígeno associado com um distúrbio, por exemplo um distúrbioneurodegenerativo, metabólico, inflamatório, autoimune, e/ou maligno.

Small Modular ImmunoPharmaceuticals (SMIP ™ ) provêemum exemplo de uma molécula variante compreendendo um polipeptídeo dedomínio de ligação. SMIPs e seus usos e aplicações são descritos em, porexemplo, pedidos de patente publicados US, Nos. 2003/01 18592,2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970,2005/0186216, 2005/0202012, 2005/0202023, 2005/0202028, 2005/0202534,e 2005/0238646, e membros da família de patentes relacionadas dos mesmos,todos sendo aqui incorporados por referência em suas totalidades.

Os anticorpos de domínio único podem incluir anticorposcujas regiões de determinação complementares são parte de um polipeptídeode domínio único. Os exemplos incluem, mas não são limitados a anticorposde cadeia pesada, anticorpos naturalmente isentos de cadeias leves, anticorposde domínio único derivados de anticorpos de quatro cadeias convencionais,anticorpos engenheirados e armações de domínio único diferentes dasderivadas dos anticorpos. Os anticorpos de domínio único podem ser qualquerum existente na técnica, ou quaisquer anticorpos de domínio único futuros. Osanticorpos de domínio único podem ser derivados de quaisquer espéciesincluindo, mas não limitados a camundongo, humano, camelo, llama, cabra,coelho e bovino. De acordo com um aspecto da invenção, um anticorpo dedomínio único como usado aqui é um anticorpo de domínio único deocorrência natural conhecido como anticorpo de cadeia pesada isento decadeias leves. Estes anticorpos de domínio único são descritos no pedidopublicado internacional No. WO 9404678, por exemplo. Por razões declareza, este domínio variável derivado de um anticorpo de cadeia pesadanaturalmente isento de cadeia leve é conhecido aqui como VHH ounanocorpo para distinguir o mesmo do VH convencional das imunoglobulinasde quatro cadeias. Esta molécula de VHH pode ser derivada de anticorposcriados em espécies Camelidae, por exemplo em camelos, llamas,dromedários, alpacas e guanacos. Outras espécies além dos Camelidae podemproduzir anticorpos de cadeia pesada naturalmente isentos de cadeia leve;estes VHHs estão dentro do escopo da invenção.

Os exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo"fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmentoFab, um fragmento monovalente consistindo de domínios VL, VH, CL eCHI, (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo doisfragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de gancho, (iii) umfragmento Fd consistindo de domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fvconsistindo de domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) umfragmento dAb, que consiste de um domínio VH; (vi) um domínio variávelcamelídeo ou camelizado, por exemplo um domínio VHH; (vii) um Fv decadeia única; (viii) um anticorpo bi-específico; e (ix) um ou mais fragmentosde uma molécula de imunoglobulina fusionada a uma região Fc. Além disso,apesar do dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, serem codificados porgenes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, porum ligador sintético que permite aos mesmos serem feitos como uma cadeiade proteína única em que as regiões VL e VH formam pares para formarmoléculas monovalentes (conhecidas como Fc de cadeia única (scFV), ver,por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-26; Huston et al. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85:5879-83). Estes anticorpos de cadeia únicasão também destinados a serem englobados no termo "fragmento de ligação aantígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usandotécnicas convencionais bem conhecidas na técnica, e os fragmentos sãoavaliados para funcionar no mesmo modo como são os anticorpos intactos.Além de anticorpos "bi-específicos" ou "bifiincionais", umanticorpo é entendido como tendo cada um de seus sítios de ligação idêntico.Um anticorpo "bi-específico" ou "bifuncional" é um anticorpo híbridoartificial tendo dois pares diferentes de cadeia pesada/ leve e dois sítios deligação diferentes. Os anticorpos bi-específicos podem ser produzidos porvários métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmento Fab1(ver, por exemplo, Songsivilai e Lachmann (1990) Clin. Exp. Immunol.79:315-21; Kostelny et ai. (1992) J. Immunol. 148:1547-53).

Seqüências de alvo

A invenção pode ser aplicada à maior parte, se não todos, osIRESes bem conhecidos (particularmente os usados como rotina em métodosde DNA recombinante), sem experimentação indevida. Assim, é parte dainvenção que a seqüência alvo relacionada com a invenção seja umaseqüência de IRES derivada de qualquer gene viral ou celular. As seqüênciasda maior parte de IRESes são disponíveis de bases de dados públicas, porexemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov,www.rangueil.inserm.fr/IRESdatabase, etc.Como um exemplo não limitativo, a presente invenção refere-se ao uso de umIRES isolado do genoma do vírus da encefalomiocardite (EMCV). Como tal,em uma forma de realização, a presente invenção refere-se a polinucleotídeosisolados e purificados de EMCV-IRES.

A seqüência nucleotídica de um cDNA codificando EMCV-IRES é especificada em SEQ ID NO: 1. Polinucleotídeos relacionados com apresente invenção também incluem polinucleotídeos que hibridizam sobcondições estringentes para SEQ ID NO: 1, ou complementos da mesma, e/oucodificam mRNAs que retém uma atividade biológica substancial de EMCV-IRES. Polinucleotídeos relacionados com a presente invenção tambémincluem porções contínuas da seqüência especificada em SEQ ID NO: 1compreendendo pelo menos cerca de 15 a 30 nucleotídeos, por exemplo, 19-27 nucleotídeos. Em uma forma de realização, polinucleotídeos relacionadoscom a presente invenção também incluem porções contínuas da seqüênciaespecificada em SEQ ID NO: 1 compreendendo cerca de 19 ou 21nucleotídeos consecutivos.

Os polinucleotídeos isolados relacionados com a presenteinvenção (por exemplo, SEQ ID NO:l, complementos da mesma e porçõescontínuas da mesma), podem ser usados como sondas de hibridização einiciadores para identificar e isolar ácidos nucleicos tendo seqüênciasidênticas a, similares às codificando os polinucleotídeos descritos. Os -métodos de hibridização para a identificação e isolamento de ácidos nucleicosincluem reação de cadeia polimerase (PCR), hibridização Southern ehibridização Northern, e são bem conhecidos dos versados na técnica.

As reações de hibridização podem ser realizadas sob condiçõesde estringências diferentes. A estringência de uma reação de hibridizaçãoinclui a dificuldade com a qual quaisquer duas moléculas de ácido nucleicoirão hibridizar uma com a outra. Preferivelmente, cada polinucleotídeo dehibridização hibridiza em seu polinucleotídeo correspondente sob condiçõesde estringência reduzida, mais preferivelmente condições estringentes, e omais preferivelmente condições altamente estringentes. Os exemplos decondições de estringência são mostrados na tabela 1 abaixo: as condiçõesaltamente estringentes são as que são pelo menos tão estringentes como, porexemplo, condições A-F, condições estringentes são pelo menos tãoestringentes como, por exemplo, condições G-L; e condições de estringênciareduzida são pelo menos tão estringentes como, por exemplo, condições M-R.

Tabela 1

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1 O comprimento do híbrido é o antecipado para a(s) região (ões) hibridizada(s) dospolinucleotídeos de hibridização. Quando hibridizando um polinucleotídeo para umpolinucleotídeo alvo de seqüência desconhecida, o comprimento do híbrido é consideradocomo sendo o do polinucleotídeo de hibridização. Quando polinucleotídeos de seqüênciaconhecida são hibridizados, o comprimento do híbrido pode ser determinado poralinhamento das seqüências dos polinucleotídeos e identificação da região ou regiões decomplementaridade de seqüência ótima.

2 SSPE ( KSSPE é 0,15M NaCl, 10 mM NaH2PO4, e l,25mM EDTA, pH 7,5) pode sersubstituído por SSC (lxSSC é 0,15M NaCl e 15mM citrato de sódio nos tampões dehibridização de lavagem, as lavagens são realizadas durante 25 min após a hibridizaçãoestar completa.

Tb* Tr * : A temperatura de hibridização para híbridos antecipada como sendo menor que50 pares de base em comprimento deve ser de 5- 10 0C menor do que a temperatura defusão ( Tm) do híbrido, onde Tm é determinado de acordo com as seguintes equações. Parahíbridos com menos do que 18 pares de base em comprimento, Tm (°C) = 2 (# de A + Tbases) + 4 (# de G + C bases). Para híbridos entre 18 e 49 pares de base em comprimento,Tm (°C) = 81,5 + 16,6 (Iogi0Na+) + 0,41 (% G + C) - (600/N), onde N é o número de basesno híbrido, e Na+ é a concentração de íons sódio no tampão de hibridização (Na+ paraIxSSC = 0,165M).

Os exemplos adicionais de condições de estringência para a hibridização depolinucleotídeos são providos em Sambrook et al (1989) Molecular Cloning : ALaboratory Manual, Caps. 9 e 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY, e Ausubel et al , eds (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Sec. 2.IOe 6.3-6.4, John Wiley & Sons, Inc , incorporados aqui por referência.

Os polinucleotídeos isolados relacionados com a presenteinvenção também podem ser usados como sondas de hibridização einiciadores para identificar e isolar DNAs tendo seqüências homólogas aospolinucleotídeos descritos. Estes homólogos são polinucleotídeos isolados dediferentes espécies do que as dos polinucleotídeos descritos, ou dentro damesma espécie, mas com similaridade de seqüência significante para ospolinucleotídeos descritos. Preferivelmente, os homólogos depolinucleotídeos tem pelo menos 60% de identidade de seqüência, maispreferivelmente pelo menos 75% de identidade, e o mais preferivelmente pelomenos 90% de identidade com os polinucleotídeos descritos. Preferivelmente,homólogos dos polinucleotídeos descritos são os isolados de um vírus, porexemplo um vírus de família Picornaviridae.

Os polinucleotídeos isolados relacionados com a presenteinvenção também podem ser usados como sondas de hibridização einiciadores para identificar células e tecidos que expressam ospolinucleotídeos inibitórios da presente invenção, como descrito abaixo, e ascondições sob as quais eles são expressados.

Geralmente,um polinucleotídeo de acordo com a presenteinvenção é provido como um isolado, em forma isolada e/ou purificada, oulivre ou substancialmente livre de material com o qual ele é naturalmenteassociado, como livre ou substancialmente livre de um ácido(s) nucleico (s)flanqueando a seqüência em um genoma (por exemplo um genoma depicornavírus), exceto possivelmente uma ou mais seqüência (s) regulatória(s)para expressão. Um polinucleotídeo da invenção pode ser total ouparcialmente sintético e pode incluir DNA genômico, cDNA ou RNA. Ondeum polinucleotídeo de acordo com a intermediário inclui RNA, referência àseqüência mostrada deve ser construída como referência ao equivalente doRNA, por exemplo com U substituído por T.Polinucleotídeos inibitórios

E um objeto da invenção prover polinucleotídeos inibitóriosdirigidos contra um IRES marcado que pode ser usado em métodos deregulação de modo negativo da expressão de um gene de interesse (porexemplo gene endógeno, transgene, etc), cuja transcrição resulta em suaregião de codificação de proteína estando dentro de um transcrito de mRNAcompreendendo uma seqüência nucleotídica correspondendo ao IRESmarcado, e em que os métodos não requerem modificação ou marcação dopróprio gene de interesse. É outro objeto da invenção prover métodos detriagem de bibliotecas de polinucleotídeos inibitórios usando ospolinucleotídeos inibitórios da invenção como controles positivos. Para isto,os inventores demonstraram que a expressão inibida (isto é, reduzida,interferida com, regulada de modo negativo, nocauteada, etc) de um transgenede interesse pode ser obtida em uma célula ou organismo através do uso dospolinucleotídeos inibitórios, por exemplo moléculas de siRNA, que marcam(por exemplo ligam e/ou clivam) IRES mRNA (por exemplo, EMCV-IRESmRNA), assim evitando a tradução de qualquer região de codificação deproteína encontrada no mesmo transcrito de mRNA que o IRES mRNA.

A expressão alterada das seqüências IRES relacionadas com a invenção em uma célula ou organismo pode ser obtida através do uso devários polinucleotídeos inibitórios, como polinucleotídeos anti-sentido,ribozimas que ligam e/ou clivam o mRNA transcrito dos genes da invenção,oligonucleotídeos formando triplex, que marcam as regiões regulatórias dosgenes, e RNA interferência curta que causa a degradação específica daseqüência de mRNA alvo (por exemplo, Galderisi et al. (1999) J. Cell.Physiol. 181 :251-57; Sioud (2001) Curr. Mol. Med. 1 :575-88; Knauert eGlazer (2001) Hum. Mol. Genet. 10:2243-51 ; Bass (2001) Nature 41 1 :428-29).

Os polinucleotídeos inibitórios anti-sentido ou ribozima dainvenção podem ser complementares a um filamento de codificação completode uma seqüência IRES relacionada com a invenção, ou a somente umaporção da mesma. Alternativamente, os polinucleotídeos inibitórios podemser complementares a uma região de não codificação do filamento decodificação de uma seqüência IRES relacionada com a invenção. Ospolinucleotídeos inibitórios da invenção podem ser construídos usandoreações de síntese química e/ou ligação enzimática usando procedimentosbem conhecidos na técnica. AS ligações de nucleosídeos dos polinucleotídeosquimicamente sintetizados podem ser modificadas para melhorar suacapacidade de resistir à degradação mediada por nuclease, assim como paraaumentar sua especificidade de seqüência. Estas modificações de ligaçãoincluem, mas não são limitadas a ligações fosforotioato, metilfosfonato,fosforoamidato, boranofosfato, morfolino, e ácido nucleico peptídeo (PNA)(Galderisi et al, supra; Heasman (2002) Dev. Biol. 243:209-14; Mickelfield(2001) Curr. Med. Chem. 8: 1 157-79). Alternativamente, moléculas anti-sentido podem ser produzidas biologicamente usando um vetor de expressãoem que um polinucleotídeo da presente invenção foi subclonado em umaorientação anti-sentido (isto é, reversa).

Em ainda outra forma de realização, a molécula depolinucleotídeo anti-sentido da invenção é uma molécula de polinucleotídeoα-anomérica. Uma molécula de polinucleotídeo α-anomérica forma híbridosde filamento duplo específicos com RNA complementar em que, contrário àsβ-unidades comuns, os filamentos correm paralelos uns aos outros. Amolécula de polinucleotídeo anti-sentido também pode compreender um 2'-o-metilribonucleotídeo ou um análogo RNA-DNA quimérico, de acordo com astécnicas que são bem conhecidas.

Os oligonucleotídeos inibitórios formadores de triplex (TFOs)englobados pela presente invenção ligam na ranhura principal do DNA duplexcom alta especificidade e afinidade (Knauert e Glazer, supra). A expressãodos genes da presente invenção pode ser inibida por marcação de TFOscomplementares às regiões regulatórias dos genes (isto é, as seqüências depromotor e/ou melhorador) para formar estruturas helicais triplas que evitam atranscrição dos genes.

Em uma forma de realização da invenção, os polinucleotídeosinibitórios da presente invenção são de moléculas RNA interferência curta(siRNA) (ver, por exemplo, Galderisi et al. (1999) J. Cell Physiol 181 :251-57; Sioud (2001) Curr. Mol. Med. 1 :575-88). Estas moléculas de siRNA sãomoléculas de RNA de filamento duplo curtas (preferivelmente 19-25 nucleotídeos, mais preferivelmente 19 ou 21 nucleotídeos) que causam adegradação específica da seqüência do mRNA marcado. Esta degradação éconhecida como RNA interferência (RNAi) (por exemplo, Bass (2001) Nature411 :428-29). Originalmente identificado em organismos inferiores, RNAi foiefetivamente aplicado a células de mamíferos e foi recentemente verificado como evitando a hepatite fulminante em camundongos tratados commoléculas de siRNA marcadas para Fas mRNA (Song et al. (2003) Nat. Med.9:347-51). Além disso, siRNA intratecalmente distribuído foi recentementerelatado como bloqueando respostas de dor em dois modelos (modelo de dorinduzida por agonista e modelo de dor neuropática) no rato (Dorn et al. (2004)Nucleic Acids Res. 32(5):e49).

A estrutura duplex das moléculas de siRNA da invenção podecompreender um ou mais filamentos de RNA polimerizado, isto é, a estruturaduplex pode ser formada por um filamento de RNA auto-complementar únicocompreendendo uma alça em forma de grampo de cabelo ou dois filamentos complementares. As seqüências de siRNA com inserções, deleções, emutações de ponto único com relação à seqüência marcada também foramverificados como efetivos na inibição da expressão da seqüência marcada(Fire et al, patente US 6 506 559). Assim, prefere-se que as moléculas desiRNA da invenção compreendam uma seqüência nucleotídica comidentidade de seqüência substancial para pelo menos uma porção do mRNAcorrespondendo ao DRES marcado. Por exemplo, a região duplex de umamolécula de siRNA da invenção pode ter mais do que 90% de identidade deseqüência, e preferivelmente 100% de identidade de seqüência , para pelomenos uma porção do mRNA correspondendo ao IRES marcado.

Alternativamente, a identidade de seqüência substancial pode ser definidacomo a capacidade de pelo menos um filamento da região duplex da moléculade siRNA hibridizar a pelo menos uma porção do IRES marcado sob pelomenos, por exemplo condições estringentes como definido nas condições G-Lna tabela 1, acima. Em uma forma de realização preferida, a molécula desiRNA hibridiza a pelo menos uma porção do IRES marcado sob condiçõesaltamente estringentes, por exemplo as que são pelo menos tão estringentescomo, por exemplo, condições A-F na tabela 1 acima. Porque 100% deidentidade de seqüência entre pelo menos um filamento da região duplex deuma molécula de siRNA da invenção e pelo menos uma porção de umaseqüência marcada não é requerido, siRNAs dirigidos para, por exemplo, umaseqüência IRES tendo e/ou consistindo essencialmente de SEQ ID NO: 1,também pode inibir a expressão de qualquer região codificando proteínalocalizada em um transcrito de mRNA que compreende uma seqüência comIRES que difere da SEQ ID NO: 1 devido a mutações, polimorfismos, aredundância do código genético, divergência evolucionária, etc (ver Fire et al,supra). O comprimento da seqüências de nucleotídeos substancialmenteidênticas pode ser pelo menos de 10, 15, 19, 21 , 23, 25, 27, 50, 100, 200,300, 400, ou 500 nucleotídeos, é preferivelmente 19-27 nucleotídeos, e é omais preferivelmente 19 ou 21 nucleotídeos (ver Fire et al., supra).

Os polinucleotídeos inibitórios da invenção podem serprojetados com base em critérios bem conhecidos na técnica (por exemplo,Elbashir et al. (2001) EMBO J. 20:6877-88) e/ou por uso de algoritmos bemconhecidos (por exemplo, algoritmos conhecidos publicamente). Porexemplo, a porção de marcação de um polinucleotídeo inibitório da invenção(por exemplo, a região duplex de uma molécula de siRNA)

preferivelmente deve começar com AA (o mais preferido),TA, GA, ou CA; uma molécula de siRNA da invenção preferivelmente devecompreende uma se assim a relação de GC é 45-55%; uma molécula desiRNA da invenção preferivelmente não deve conter três dos mesmosnucleotídeos em uma fileira; e uma molécula de siRNA da invençãopreferivelmente não deve conter sete G/Cs mistos em uma fileira. Com basenestes critérios, ou em outros critérios conhecidos (por exemplo, Reynolds et al. (2004) Nat. Biotechnol. 22:326-30), moléculas de siRNA da presenteinvenção que marcam um IRES, por exemplo, o EMCV-IRES tendo e/ouconsistindo essencialmente de uma seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1,podem ser projetadas por um versado na técnica. Por exemplo, em uma formade realização, uma molécula de siRNA da invenção pode ter e/ou consistir essencialmente de uma seqüência nucleotídica selecionada dentre o grupoconsistindo da seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 2, a seqüêncianucleotídica de SEQ ID NO: 3, e a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 4.Nesta forma de realização, uma molécula de siRNA da invenção aindacompreende o complemento da seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:2, o complemento da seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:3, e o complementoda seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:4, respectivamente.

Por exemplo, as moléculas de siRNA da presente invençãopode ser geradas por anelamento de duas molécula de RNA de filamentoúnico complementares juntas (Fire et al., supra) ou através do uso de umaúnica molécula de RNA em forma de grampo de cabelo que duplica de novoem si mesma para produzir a requerida porção de filamento duplo (Yu et al.(2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99:6047-52). As moléculas de siRNApodem ser quimicamente sintetizadas (Elbashir et al. (2001) Nature 411 :494-98) ou produzidas por transcrição in vitro usando gabaritos de DNA defilamento único (Yu et al., supra). Alternativamente, as moléculas de siRNApodem ser produzidas biologicamente, ou transientemente (Yu et al., supra;Sui et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99:5515-20) ou estavelmente(Paddison et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99: 1443-48), usando umvetor (es) de expressão, por exemplo, como descrito abaixo, compreendendopolinucleotídeos relacionados com a presente invenção em orientação sentidoe/ou anti-sentido com relação ao seu promotor A polimerase de RNArecombinante pode ser usada para transcrição in vivo ou in vitro, oupolimerase de RNA endógena de uma célula modificada pode mediar atranscrição in vivo. Recentemente, a redução de níveis de mRNA alvo emcélulas humanas primárias, em um modo eficiente e específico de seqüência,foi demonstrado usando vetores adenovirais que expressam RNAs em formade grampo de cabelo, que são ainda processadas em moléculas de siRNA(Arts et al. (2003) Genome Res. 13:2325-32).

Os polinucleotídeos inibitórios da invenção podem serconstruídos usando reações de síntese química e ligação enzimática incluindoprocedimentos bem conhecidos na técnica. As ligações de nucleosídeos depolinucleotídeos quimicamente sintetizados podem ser modificadas paramelhorar sua capacidade de resistir a degradação mediada por nuclease, evitaruma resposta de pânico geral em alguns organismos que é gerada pelo RNAduplex, e/ou aumentar sua especificidade de seqüência. Estas modificações deligação incluem, mas não são limitadas a ligações de fosforotioato,metilfosfonato, fosforoamidato, boranofosfato, morfolino, e peptídeo ácidonucleico (PNA) (Galderisi et al., supra; Heasman, supra; Micklefield, supra).

Como descrito acima, os polinucleotídeos isolados, ou porçõescontínuas dos mesmos, relacionados com a invenção, podem ser ligadosoperativamente em orientação sentido ou anti-sentido a uma seqüência decontrole de expressão e/ou ligado em um vetor de expressão para expressãorecombinante dos polinucleotídeos inibitórios (por exemplo moléculas desiRNA) da invenção. Os métodos gerais da expressão recombinante depolinucleotídeos inibitórios são bem conhecidos na técnica.

Um vetor de expressão, como usado aqui, se destina a fazerreferência a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácidonucleico ao qual ele foi ligado. Um tipo de vetor é um plasmídeo, que serefere a uma alça de DNA de filamento duplo circular em que segmentos deDNA adicional podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, emque segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral.Alguns vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeiraem que eles são introduzidos (por exemplo vetores bacterianos tendo umaorigem de replicação bacteriana e vetores de mamíferos epissomais). Outrosvetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem serintegrados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução nacélula hospedeira e, assim, são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, alguns vetores são capazes de dirigir a expressão doispolinucleotídeos inibitórios aos quais eles são ligados operativãmente. Estesvetores são referidos aqui como vetores de expressão recombinantes (ousimplesmente vetores de expressão). Em geral, os vetores de expressão deutilidade em técnicas de DNA recombinante estão com freqüência na formade plasmídeos. No presente relatório, plasmídeo e vetor podem ser usados demodo interpermutável com o plasmídeo é a forma mais comumente usada devetor. No entanto, a invenção se destina a incluir outras formas de vetores deexpressão, como vetores virais (por exemplo retrovírus defeituosos nareplicação, adenovírus e vírus adeno-associados) que servem a funções equivalentes.

Um versado na técnica saberá como criar um vetor deexpressão a partir do qual um polinucleotídeo inibitório da invenção pode sertranscrito. Primeiro, um versado na técnica saberá que uma região regulatória(por exemplo promotor, melhorador, silenciador, doador de emenda,aceitador, etc) pode ser usada para transcrever um filamento de RNA oufilamentos de RNA de um polinucleotídeo inibitório da invenção a partir deuma construção de expressão. Segundo, um versado irá reconhecer que, porexemplo, na criação de uma molécula de siRNA duplex da invenção, osfilamentos sentido e anti-sentido da porção marcada do IRES marcado podemser transcritos como dois filamentos de RNA separados que irão anelar juntos,ou como um filamento de RNA único que irá formar uma alça em forma degrampo de cabelo e anelar com a mesma. Por exemplo, um versado saberácomo criar uma construção de expressão assim a porção marcada de um IRESmarcado é inserida entre dois promotores (por exemplo, dois promotores debacteriófago T7 ou dois promotores diferentes) como que a transcrição ocorrebidirecionalmente e irá resultar em filamentos de RNA complementar quepodem subseqüentemente anelar para formar um siRNA inibitório dainvenção. Alternativamente, uma porção marcada de um IRES marcado podeexistir como uma primeira e segunda resina de codificação juntas em umvetor de expressão único, em que a primeira região de codificação da porçãomarcada de um IRES marcado está em uma orientação sentido com relação aseu promotor de controle, e em que a segunda região de codificação da porçãomarcada de um IRES marcado está em uma orientação anti-sentido comrelação a seu promotor de controle. Um versado na técnica irá reconhecer quese a transcrição das regiões de codificação sentido e anti-sentido da porçãomarcada do IRES marcado ocorre a partir de dois promotores separados, oresultado será os dois filamentos de RNA separados que podemsubseqüentemente anelar para formar um siRNA inibitório da invenção. Poroutro lado, se a transcrição da porção marcada sentido e anti-sentido do IRESmarcado for controlada por um único promotor, o transcrito resultante seráum filamento de RNA de forma de grampo de cabelo único que é auto-complementar, isto é formar um duplex por duplicação em si mesmo paracriar uma molécula de siRNA da invenção. Na última configuração, umversado irá também reconhecer que um espaçador, por exemplo, denucleotídeos, entre as regiões de codificação sentido e anti-sentido da porçãomarcada do IRES marcado irá melhorar a capacidade do RNA de filamentoúnico de formar uma alça em forma de grampo de cabelo, em que a alça emforma de grampo de cabelo compreende o espaçador. Em uma forma derealização preferida, o espaçador compreende um comprimento denucleotídeos de pelo menos cerca de 5, 9, 11 ou 15 nucleotídeos. Finalmente,um versado irá reconhecer que as regiões de codificação sentido e anti-sentidoda porção marcada de IRES marcado pode estar, cada, em um vetor deexpressão separado e sob o controle de seu próprio promotor.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podemtransportar seqüências adicionais, como seqüências que regulam a replicaçãodo vetor em células hospedeiras (por exemplo origens de replicação) e genesmarcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção decélulas hospedeiras em que o vetor foi introduzido. Por exemplo, tipicamente,o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, como G418,higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira em que o vetor foiintroduzido. Os genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o genedihidrofolato reductase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr- comseleção/ amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418).

Os vetores apropriados podem ser selecionados ouconstruídos, contendo seqüências regulatórias apropriadas, incluindoseqüências de promotor, seqüências de terminador, seqüências depoliadenilação, seqüências de melhorador, genes marcadores e outras seqüências, por exemplo seqüências que regulam a replicação do vetor nascélulas hospedeiras (por exemplo origens de replicação), como apropriado. Osvetores podem ser plasmídeos ou viral, por exemplo fago, ou fagemídeo,como apropriado. Para outros detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning:a Laboratory Manual: 2a. ed., Sambrook et al., Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989. Muitas técnicas conhecidas e protocolos paramanipulação de ácido nucléico, por exemplo na preparação de construções deácido nucléico, mutagenese, sequenciamento, introdução de DNA em célulase expressão de genes, e análise de proteínas, são descritas em detalhes emCurrent Protocols in Molecular Biology, 2a. ed., Ausubel et al. eds., JohnWiley & Sons, 1992.

Em uma forma de realização, um vetor recombinante dainvenção compreende o EMCV-IRES tendo e/ou consistindo essencialmentede uma seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:l e seu complemento, ouporções contínuas da mesma, para a transcrição dos polinucleotídeosinibitórios da invenção como descrito acima. Por exemplo, um vetor deexpressão da invenção pode compreender uma ou duas cópias do DNA defilamento duplo, em que o primeiro filamento de DNA compreende aseqüência nucleotídica selecionada dentre o grupo consistindo da seqüêncianucleotídica de nucleotídeos 27-46 de SEQ ID NO: 1 , a seqüêncianucleotídica de nucleotídeos 347-366 de SEQ ID NO: 1, a seqüêncianucleotídica de nucleotídeos 472-491 de SEQ ID NO: 1, e subseqüências ouporções das mesmas, e em que o DNA de segundo filamento compreende aseqüência nucleotídica complementar a uma seqüência nucleotídica do DNAde primeiro filamento. Um versado na técnica irá reconhecer que estaconstrução pode produzir um polinucleotídeo inibitório da invenção tendo ouconsistindo essencialmente de uma seqüência nucleotídica selecionada dentre

O grupo consistindo da seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:2, a seqüêncianucleotídica de SEQ ID NO:3, a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:4, esubseqüências das mesmas, respectivamente. Assim os nucleotídeos 27-46 deSEQ ID NO: 1 (isto é, SEQ ID NO:2), nucleotídeos 347-366 de SEQ ID NO:1 (isto é, SEQ ID NO: 3), e nucleotídeos 472-491 de SEQ ID NO: 1 (isto é,SEQ ID NO:4) representam sítios de marcação de siRNA exemplares.Células hospedeiras - organismosUm outro aspecto da presente invenção provê um método demodificação de uma célula hospedeira ou organismo com um polinucleotídeoinibitório da invenção. Adicionalmente, a presente invenção provê uma célulahospedeira ou organismo compreendendo um polinucleotídeo inibitório comodescrito aqui.

Várias linhagens de células podem atuar como célulashospedeiras apropriadas para a introdução ou expressão recombinante dospolinucleotídeos inibitórios da presente invenção. Os polinucleotídeosinibitórios da presente invenção (ou vetor(s) de expressão dos quais opolinucleotídeo inibitório da invenção é transcrito) podem ser introduzidosem, por exemplo, uma linhagem de células derivada de um tecido de plantaou animal. Um versado na técnica irá reconhecer que um polinucleotídeoinibitório da invenção (ou vetor(s) de expressão dos quais o polinucleotídeoinibitório da invenção é transcrito) é preferivelmente introduzido em umacélula hospedeira que compreende um polinucleotídeo com IRES relacionadocom a invenção, por exemplo, SEQ ID NO: 1, e mais preferivelmente em umacélula hospedeira que foi modificada para compreender um polinucleotídeocom IRES relacionado com a presente invenção. Um versado na técnica iráreconhecer que, como parte da invenção, células hospedeiras de mamíferosdevem ser modificada para compreender um polinucleotídeo com IRES viralrelacionado com a invenção para evitar a inibição inadvertente dos genesendógenos quando um polinucleotídeo inibitório da invenção marcando opolinucleotídeo com IRES é introduzido na célula hospedeira modificada. Nocaso em que a célula hospedeira não é derivada de uma célula de mamífero,as seqüências com IRES derivadas de genes de mamíferos podem serpreferíveis. Apesar destas formas de realização preferidas, um versado natécnica também irá reconhecer que um polinucleotídeo inibitório da invenção(ou vetor(s) de expressão dos quais o polinucleotídeo inibitório da invenção étranscrito) pode ser introduzido em células hospedeiras não compreendendoum polinucleotídeo com IRES relacionado com a invenção, por exemplo parafins de controle.

As linhagens de células hospedeiras de mamíferos incluem,por exemplo, células COS, células CHO, células 293, células A431, células3T3, células CV-I, células HeLa, células L, células BHK21, células HL-60,células U937, células HaK, células Jurkat, assim como as cepas de célulasderivadas de cultura in vitro de explantes primários e tecido primário. Aslinhagens de células hospedeiras de plantas incluem, mas não são limitadas acélulas de plantas de milho, tabaco, Arabidopsis, semente de colza, e deLemna.

Alternativamente, pode ser possível expressarrecombinantemente os polinucleotídeos inibitórios da presente invenção emeucariotes inferiores, como levedura ou em procariotes. As cepa de levedurapotencialmente apropriadas incluem as cepas de Saccharomyces eerevisiae,Schizosaceharomyees pombe, Kluyveromyces strains, e Candida . As cepasbacterianas potencialmente apropriadas incluem Eseheriehia eoli, Bacillussubtilis, e Salmonella typhimurium.

Os polinucleotídeos inibitórios da presente invenção podemser também expressados recombinantemente por ligação operativa dospolinucleotídeos isolados da presente invenção em seqüências de controleapropriadas em um ou mais vetores de expressão de insetos, como vetores debaculovírus, e empregando um sistema de expressão de célula de insetos. Osmateriais e métodos para sistemas de expressão de baculovírus/Sf9 sãocomercialmente disponíveis em forma de kits (por exemplo, o kit MAXBAC,Invitrogen, Carlsbad, CA).

Qualquer técnica disponível para a introdução dospolinucleotídeos inibitórios da invenção (ou vetor(es) de expressão dos quaiso polinucleotídeo inibitório da invenção é transcrito) em células hospedeirasou organismos será bem conhecida dos versados e pode ser usada.Por exemplo, se sintetizados quimicamente ou por sínteseenzimática in vitro, os polinucleotídeos inibitórios da invenção podem serpurificados antes da introdução em uma célula hospedeira ou organismo. Porexemplo, RNA pode ser purificado a partir de uma mistura por extração comum solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou umacombinação destes. Alternativamente, o RNA pode ser usado sem ou comuma purificação mínima para evitar perdas devido ao processamento daamostra. O RNA pode ser secado para armazenamento ou dissolvido em umasolução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover oanelamento e/ou estabilização de filamentos duplex. Após a purificação, ospolinucleotídeos inibitórios da invenção (ou vetor(es) de expressão dos quaisos polinucleotídeos inibitórios são transcritos) podem ser introduzidosdiretamente na célula, introduzidos extracelularmente em uma cavidade ouespaço intersticial ou na circulação de um organismo, introduzido oralmente,ou introduzido por banhos de uma célula ou organismo em uma soluçãocompreendendo os polinucleotídeos inibitórios da invenção. Os métodosfísicos de introdução de ácidos nucleicos incluem injeção de uma soluçãocompreendendo os polinucleotídeos inibitórios da invenção, bombardeio porpartículas cobertas pelos polinucleotídeos inibitórios, embebimento ou banhoda célula ou organismo na solução ou eletroporação.

Para células eucarióticas, as técnicas apropriadas para aintrodução de um vetor(es) de expressão que codificam para umpolinucleotídeo inibitório da invenção, podem incluir transfecção com fosfatode cálcio, DEAE- dextrano, eletroporação, transfecção mediada porlipossoma, e transdução usando retrovírus ou outros vírus, por exemplovacínia, ou para células de insetos, baculovírus. Em uma forma de realizaçãopreferida, uma construção viral embalada em uma partícula viral irá obtertanto uma introdução eficiente de uma construção (s) de expressão dainvenção na célula como a transcrição dos polinucleotídeos inibitórios dainvenção que é codificada pela(s) construção (ões) de expressão. Para célulasbacterianas, as técnicas apropriadas podem incluir transformação com cloretode cálcio, eletroporação e transfecção usando bacteriófagos. Um versado iráreconhecer que para células de plantas, técnicas bem conhecidas similares àsusadas para células eucarióticas (por exemplo transformação mediada porAgrobacterium e métodos de "pistola de genes" usando partículas de ouropara introduzir fisicamente o DNA plasmídeo no tecido da planta) podem serusados. Além disso, os polinucleotídeos inibitórios da invenção podem serintroduzidos junto com componentes que realizam uma ou mais das seguintesatividades: melhora da absorção pela célula, promoção do anelamento defilamentos duplex, estabilização da hibridização de filamentos anelados, ou deoutra forma aumentar a marcação dos IRES marcados. Finalmente, aintrodução pode ser seguida por causar ou permitir a expressão do ácidonucleico, por exemplo, por cultivo de células hospedeiras sob condições paraexpressão do gene.

A expressão de um polinucleotídeo inibitório da presenteinvenção em um organismo pode ser também obtida através da criação deplantas ou animais transgênicos não humanos em que, nos genomas, ospolinucleotídeos com IRES relacionados com a presente invenção, ou porçõescontínuas dos mesmos, foram introduzidos. Estes animais ou plantastransgênicos incluem os que tem cópias múltiplas de um polinucleotídeoinibitório da presente invenção. A (s) seqüência (s) regulatória(s) específica(s)de tecido pode ser ligada operativamente a um polinucleotídeo com IRES, ouporção contínua do mesmo, para dirigira a expressão de um polinucleotídeoinibitório da presente invenção a células particulares ou a um estágiodesenvolvimental particular. Os métodos para gerar plantas transgênicas (porexemplo via introdução física do nucleotídeo inibitório) ou para gerar animaistransgênicos (por exemplo via manipulação do embrião e microinjeção,incluindo, mas não limitado a animais como camundongos, cabras,nematódes, etc) se tornaram convencionais e são bem conhecidos na técnica(por exemplo, Ma et al. (1995) Science 268:716-19; Smith e Glick (2000)Biotechnol. Adv.. 18:85-89; Peeters et al. (2001) Vaccine 19:2756-61 ;Bockamp et al. (2002) Physiol. Genomics 11 : 115-32).

Métodos da invenção

Em vez do isolamento consumidor de tempo e laborioso demutantes por triagem genética tradicional, a função dos genes nãocaracterizados pode ser determinada por emprego dos polinucleotídeosinibitórios da invenção para inibir a expressão de um gene de interesse (porexemplo, gene endógeno, transgene, etc.). Esta inibição da expressão pode serusada, por exemplo, para reduzir a quantidade e/ou para alterar o tempo daatividade do gene de interesse. A invenção pode ser usada na determinação dealvos potenciais para fármacos, compreensão de eventos normais epatológicos associados com o desenvolvimento, determinação de vias desinalização responsáveis pelo desenvolvimento pós-natal / envelhecimento, esemelhantes. Como um exemplo não limitativo, um simples teste podeconsistir em modificar uma célula hospedeira para expressar um transgene deinteresse (ou de função conhecida ou desconhecida) de modo que a região decodificação de proteína é transcrita dentro de um transcrito de mRNAcompreendendo a seqüência correspondendo a um IRES marcado, e entãousar os polinucleotídeos inibitórios da invenção que marca o IRES marcadopara inibir (reduzir, regular de modo negativo, nocautear, suprimir , etc.) aexpressão do transgene de interesse. Em outra forma de realização nãolimitativa, os polinucleotídeos inibitórios da invenção são usados comocontroles positivos em testes de triagem, por exemplo, testes de triagem desiRNA.

A inibição da expressão refere-se a uma diminuiçãoobservável no nível de produtos de gene (por exemplo, mRNA e/ou proteína),e pode ser detectada por exame das propriedades visíveis externas da célulahospedeira ou organismo, ou por técnicas bioquímicas como reações dehibridização (por exemplo, análise de Northern blot, testes de proteçãoRNase, análises de micro-arranjos, etc.), transcrição reversa e reações decadeia polimerase, reações de ligação (por exemplo, Western blots, ELISA,FACS, etc.), testes repórter, testes de resistência a fármacos, etc. Dependendodo método de detecção, mais do que 5%, 10%, 33%, 50%, 90%, 95% ou 99%de inibição da expressão de um gene de interesse por uma célula hospedeiraou organismo tratado com um polinucleotídeo inibitório da invençãocomparado com uma célula hospedeira não tratada ou organismo podem seresperados. Adicionalmente, o tratamento de uma população de célulashospedeiras de acordo com o método aqui provido pode resultar em umafração das células (por exemplo, pelo menos 2%, 5%, 10%, 20%, 50%, 75%,90%, 95%, ou 99% de células tratadas) exibindo uma expressão inibida de umgene de interesse. O aumento da dose dos polinucleotídeos inibitórios podeaumentar a quantidade de inibição detectada. Um versado irá reconhecer queporque os polinucleotídeos inibitórios são dirigidos contra um IRES marcado,e não um gene de interesse, a quantificação de expressão do gene de interessena(s) célula (s) tratada (s) ou organismo (s) pode mostrar níveis dissimilaresde inibição ao nível de mRNA comparado com o nível de proteína. Com umexemplo, a eficiência da inibição pode ser determinada por detecção do nívelde mRNA do gene de interesse, por exemplo, por análise Northern blot, ummétodo preferido de determinação do nível de inibição sendo por detecção donível de proteína.

Os polinucleotídeos inibitórios da invenção podem serintroduzidos em uma célula hospedeira ou organismo, como descrito acima,em quantidades suficientes para permitir a introdução de pelo menos umacópia de um polinucleotídeo inibitório na célula. Doses maiores (por exemplo,pelo menos 5, 10, 100, 500, ou 1000 cópias por célula) de um polinucleotídeoinibitório podem fornecer uma inibição mais efetiva.Regulação de modo negativo de um transgene de interesse.

A presente invenção provê um método de inibição daexpressão de um transgene de interesse, cuja região de codificação de proteínaé transcrita por uma célula hospedeira ou organismo dentro de um transcritode mRNA compreendendo a seqüência nucleotídica correspondendo a umIRES marcado. O método compreende a introdução de um polinucleotídeoinibitório da invenção que marca um IRES marcado na célula hospedeira ouorganismo compreendendo o transgene de interesse, em que o transgene étranscrito em um transcrito de mRNA compreendendo uma seqüênciacorrespondendo ao IRES marcado. Um versado na técnica irá reconhecer queapesar das moléculas inibitórias da invenção especificamente marcarem oIRES, a introdução dos polinucleotídeos inibitórios da invenção irá tambémresultar na regulação de modo negativo de qualquer região de codificação deproteína localizada no mesmo transcrito de mRNA que o IRES.

Assim, os polinucleotídeos inibitórios da invenção sãoparticularmente utilizáveis porque eles podem ser usados para inibir aexpressão de mais do que o IRES marcado, isto é, eles podem ser usados paranocautear as expressões de transgenes com seqüências nucleotídicas quediferem, isto é, que não correspondem à seqüência dos polinucleotídeosinibitórios (ver Exemplo 1). Qualquer transgene pode ser inibido usando ospolinucleotídeos inibitórios da invenção desde que a transcrição do transgeneresulte em sua região de codificação de proteína estando dentro de umtranscrito de mRNA compreendendo a seqüência nucleotídicacorrespondendo a uma seqüência com IRES relacionado com a invenção.

Testes de triagem

Como descrito acima, os polinucleotídeos inibitórios dapresente invenção que marcam um IRES marcado podem ser usados parainibir a expressão de um gene, por exemplo um transgene que é transcritocomo parte de um transcrito de mRNA compreendendo uma seqüênciacorrespondendo ao IRES marcado. Em pelo menos uma outra forma derealização, os polinucleotídeos inibitórios da invenção são usados comocontrole positivos nos métodos de triagem de bibliotecas de polinucleotídeosinibitórios dirigidos para um gene particular (incluindo genes endógenos,transgenes, etc).

Os polinucleotídeos inibitórios da invenção são utilizáveiscomo controles positivos em métodos de triagem de uma biblioteca depolinucleotídeos inibitórios , por exemplo, moléculas de siRNA, parapolinucleotídeos inibitórios que otimamente inibem a expressão de um genede interesse. Para testes de alta produção, um controle positivo em cada placade teste pode ser usado para validar os resultados de cada placa.

Por exemplo, um transgene de interesse pode ser colocado emum vetor de expressão de modo que sua região de codificação de proteína étranscrita como parte de um transcrito de mRNA compreendendo a seqüêncianucleotídica correspondendo a um IRES marcado. O vetor de expressão podeser então usado para modificar uma célula hospedeira. As células hospedeirasmodificadas podem ser então submetidas a uma biblioteca de polinucleotídeosinibitórios dirigidos contra o transgene de interesse, em que a bibliotecacompreende como um controle positivo pelo menos um polinucleotídeoinibitório da invenção que marca o IRES marcado.

Em outra forma de realização da invenção, os polinucleotídeosinibitórios da invenção são usados como controles positivos para triar, ouotimizar uma biblioteca dos polinucleotídeos inibitórios dirigidos contra umgene endógeno de interesse. Por exemplo, uma célula hospedeira pode sermodificada com um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleicorepórter, em que a região de codificação de proteína do ácido nucleicorepórter é parte de um transcrito de mRNA compreendendo a seqüêncianucleotídica correspondendo a um IRES marcado. Nesta forma de realização,o(s) polinucleotídeo(s) inibitório(s) da invenção é utilizável como umcontrole(s) positivo(s) por inibição da expressão do ácido nucleico repórter. Adetecção desta inibição da atividade do ácido nucleico repórter via testes comrepórter bem conhecidos serve como uma validação do protocolo de triagem.

Uso dos polinucleotídeos inibitórios da invenção em métodosde regulação de modo negativo da expressão de um ácido nucleico repórterpode ser utilizável para a triagem de uma biblioteca de polinucleotídeosinibitórios dirigidos contra um gene endógeno de interesse, e/ou para atriagem de biblioteca de transgenes para seqüências que podem induzir novosfenótipos. A função dos polinucleotídeos inibitórios no último método se origina da capacidade dos polinucleotídeos inibitórios da invenção de regularde modo negativo a expressão de qualquer gene que é transcrito em umtranscrito de mRNA compreendendo a seqüência que corresponde a um IRES.For exemplo, uma biblioteca pode compreender uma pluralidade de vetoresde expressão, em que cada vetor de expressão compreende uma seqüência detransgene singular, um IRES, e um ácido nucleico repórter, de modo que cadaserá transcrito no mesmo mRNA policistrônico. A biblioteca pode ser entãousada para modificar uma pluralidade de uma célula hospedeira, em cadacélula hospedeira da pluralidade é modificada com um vetor de expressãodiferente. O fenótipo de cada célula hospedeira modificada pode ser então observado. O transgene produzindo um fenótipo de interesse pode ser entãoainda analisado (por exemplo, sua expressão pode ser inibida) usando ospolinucleotídeos inibitórios da invenção, em que a regulação de modonegativo do ácido nucleico repórter irá servir como uma indicação positivaque um reverso observado no fenótipo está correlacionado com a regulação de modo negativo do transgene.

Nos testes acima descritos, muitos dos ácidos nucleicosrepórter bem conhecidos e testes relacionados podem ser usados. Em umaforma de realização, o ácido nucleico repórter é proteína fluorescente verde.Em uma segunda forma de realização, o repórter é β-galactosidase. Em outrasformas de realização, o ácido nucleico repórter é fosfatase alcalina, β-lactamase, luciferase, ou cloranfenicol acetiltransferase.

A presente invenção pode ser usada sozinha, ou como umcomponente de um kit tendo pelo menos um dos reagentes necessários pararealizar a introdução dos polinucleotídeos inibitórios da invenção para testaramostras, isto é células hospedeiras, ou organismos. Este kit também podeincluir instruções para permitir ao usuário do kit praticar a invenção.

Os conteúdos completos de todas as referências, patentes, epedidos de patente citados em todo este pedido são aqui incorporados porreferência.

EXEMPLO

Os seguintes exemplos provêem formas de realizaçãoilustrativas da invenção e não limitam de nenhum modo a invenção. Umversado na técnica irá reconhecer que numerosas outras formas de realizaçãosão englobadas no escopo da invenção.

EXEMPLO 1

Nocaute de expressão de genes usando siRNA dirigido contra EMCV-IRESExemplo 1.1: Materiais e métodos

O algoritmo de projeto siRNA Dharmacon publicamentedisponível (ver www.dharmacon.com/sidesign/; ver também Reynolds et al.,supra) foi usado para projetar moléculas de siRNA (a seguir "siRNAs")dirigidos contra EMCV-IRES. Três porções da seqüência IRES foramidentificadas pelo algoritmo Dharmacon como as seqüências otimamentemarcadas (IRES1, IRES2, IRES3), e foram selecionadas para serem marcadaspor moléculas de siRNA (FIG. 1). Em particular, siRNA 1, siRNA2, e siRNA3foram sintetizados por Dharmacon (Lafayette, CO) para marcar IRESl ,IRES2, e IRES3, respectivamente (FIG. 1).

As três moléculas de siRNA sintetizadas foram usadas paratransfectar uma linhagem de células CHO que foi modificada de modo estávelpara expressar um anticorpo recombinante. A linhagem de células CHO foimodificada com um vetor de expressão que codificou a cadeia pesada doanticorpo e um vetor de expressão que codificou a cadeia leve do anticorpo.

Os vetores de expressão transcreveram ou a cadeia pesada ou leve em ummRNA policistrônico, que compreendia a cadeia pesada ou leve da região decodificação de proteína a montante da seqüência que corresponde ao EMCV-IRES, e um marcador selecionável diferente a jusante da seqüência quecorresponde ao EMCV-IRES. Foi esperado que o nocaute mediado porsiRNA de transcritos contendo EMCV-IRES iria resultar em abate daexpressão do anticorpo recombinante (isto é, ou um ou ambos os genes decadeia pesada e leve a montante do IRES). Este nocaute da expressão éfacilmente avaliado por monitoração da expressão do anticorpo monoclonalrecombinante no meio condicionado, por exemplo, via métodos de westernblotting, ELISA, ou métodos de captura/ detecção à base de "adaptador emforma circular" automatizado (por exemplo testes de base IGEN (RocheDiagnostics, Alameda, CA)). As células de CHO modificadas foramtransfectadas com cada siRNA individualmente, ou com um laço de todos ostrês siRNAs, em testes de secreção de 72 horas e 144 horas (n = 3 cada). Otítulo de anticorpo e números de células foram avaliados usando um teste àbase de IGEN a 72 horas (3 dias) e 144 horas (6 dias) para estimar aprodutividade específica de células (título/ número de células/ dia), quenormaliza os dados do título para diferenças em densidade de semente ecrescimento da célula durante a experiência.

Exemplo 1.2- Resultados

As figuras 2A e 2B demonstram que todos os três siRNAspodem mediar o nocaute de expressão de transgene do anticorpo monoclonalno meio condicionado. As moléculas de siRNA dirigidas contra IRES2 eIRES3 parecem ser mais efetivas do que a molécula de siRNA dirigida contraIRES1, e a alça de moléculas de siRNA foi muito efetiva para nocautear aexpressão. O nocaute foi observado em tanto 72 h como 144 h após atransfecção. Este efeito foi observado em várias linhagens de células CHOexpressando diferentes anticorpos monoclonais (dados não mostrados. Apresente invenção demonstra que IRES siRNAs podem ser usados com umalinhagem de células que usa um IRES no vetor de expressão. A capacidade demonitorar o nocaute da expressão do gene produto usando um teste à base dotítulo também elimina a necessidade de desenvolver outros testes devalidação, como PCR em tempo real.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Wyeth

<120> DDPLEXES DE BNA DE CURTA INTERFERÊNCIA MARCANDO DMA SEQÜÊNCIAIRES E USOS PARA OS MESMOS

<130> 01997.039500

<150> 60/792,968

<151> 2006-04-19

<160> 7

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 548

<212> DNA

<213> Encephalomyocarditis virus

<400> 1

taaegttaet ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt 60ttecaceata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt 120gaegageatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt 180egtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct 240ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt 300ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt 360ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa 420ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta 480gtcgaggtta aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa 540acacgatt 548

<210> 2<211> 20<212> DNA

<213> Encephalomyocarditis virus<400> 2

aataaggccg gtgtgcgttt 20

<210> 3<211> 20<212> DNA

<213> Encephalomyocarditis virus<400> 3

agttggatag ttgtggaaag 20

<210> 4<211> 20<212> DNA

<213> Encephalomyocarditis virus<400> 4

atgtgtttag tcgaggttaa 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primeiro filamento de siBNAl (como na Fig. 1)

<220>

<221> misc_RNA<222> CD--(21)

<400> 5

auaaggccgg ugugcguuut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primeiro filamento de siBNA2 (como na Fig. 1)

<220>

<221> misc_RNA<222> (1)..(21)

<400> 6

guuggauagu uguggaaagt t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primeiro filamento de siBNA3 (como na Fig. 1)

<220>

<221> misc_RNA<222> Cl)..(21)

<400> 7

uguguuuagu cgagguuaat t 21

Claims (25)

1. Polinucleotídeo inibitório, caracterizado pelo fato de serdirigido contra um IRES.

2. Polinucleotídeo inibitório de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o IRES tem a seqüência nucleotídica de SEQID NO: 1.

3. Polinucleotídeo inibitório de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo inibitório compreende umprimeiro filamento de um siRNA.

4. Polinucleotídeo inibitório de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que o primeiro filamento do siRNA tem oequivalente de RNA de uma seqüência nucleotídica selecionada dentre ogrupo consistindo da seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1, uma porçãoda seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1, o complemento da seqüêncianucleotídica de SEQ ID NO: 1, e uma porção do complemento da seqüêncianucleotídica de SEQ ID NO: 1.

5. Polinucleotídeo inibitório de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o primeiro filamento do siRNA está entre 5 e-548 nucleotídeos em comprimento.

6. Polinucleotídeo inibitório de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o primeiro filamento do siRNA tem oequivalente de RNA de uma seqüência nucleotídica selecionada dentre ogrupo consistindo da seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:2, a seqüêncianucleotídica de SEQ ID NO:3, a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:4, e aseqüência nucleotídica de subseqüências da mesma.

7. Polinucleotídeo inibitório de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o primeiro filamento do siRNA é auto-complementar e ainda compreende uma alça em forma de grampo de cabelo.

8. Polinucleotídeo inibitório de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o primeiro filamento do siRNA aindacompreende o RNA equivalente de uma seqüência nucleotídica selecionadadentre o grupo consistindo da seqüência nucleotídica complementar to aseqüência nucleotídica de SEQ ID NO:2, a seqüência nucleotídicacomplementar a uma seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:3, e a seqüêncianucleotídica complementar a uma seqüência nucleotídica de SEQ ID NO:4.

9. Polinucleotídeo inibitório de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo inibitório é uma moléculaanti-sentido.

10. Polinucleotídeo inibitório de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo inibitório ainda compreendeum segundo filamento do siRNA que é complementar ao primeiro filamentodo siRNA.

11. Molécula de DNA isolado, caracterizada pelo fato de quecodifica o polinucleotídeo inibitório como definido em uma dasreivindicações 1-9.

12. Molécula de DNA isolado de acordo com a reivindicação11, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA é ligadaoperativamente a pelo menos uma seqüência de controle de expressão.

13. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de sertransformada ou transfectada com a molécula de DNA isolada como definidana reivindicação 12.

14. Microorganismo, caracterizado pelo fato de que contémDNA que codifica o polinucleotídeo inibitório como definido em uma dasreivindicações 1-9.

15. Animal transgênico não humano, caracterizado pelo fatode que as células somáticas e germinais contém DNA que codifica opolinucleotídeo inibitório como definido em uma das reivindicações 1-9.

16. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de que ascélulas somáticas e germinais contém DNA que codifica o polinucleotídeoinibitório como definido em uma das reivindicações 1-9.

17. Molécula de DNA isolado, caracterizada pelo fato de quecodifica o segundo filamento do siRNA como definido na reivindicação 10.

18. Molécula de DNA isolado de acordo com a reivindicação-17, caracterizada pelo fato de que a molécula de DNA é ligadaoperativamente a pelo menos uma seqüência de controle de expressão.

19. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de sertransformada ou transfectada com a molécula de DNA isolado como definidana reivindicação 18.

20. Microorganismo, caracterizado pelo fato de que contémDNA que codifica o segundo filamento do siRNA como definido nareivindicação 10.

21. Animal transgênico não humano, caracterizado pelo fatode que as células somáticas e germinais contém DNA que codifica o segundofilamento do siRNA como definido na reivindicação 10.

22. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de que ascélulas somáticas e germinais contém DNA que codifica o segundo filamentodo siRNA como definido na reivindicação 10.

23. Kit, caracterizado pelo fato de compreender opolinucleotídeo inibitório como definido na reivindicação 1.

24. Método para regular de modo negativo a expressão de umtransgene por uma célula hospedeira, em que o transgene é transcrito comoparte de um transcrito de mRNA compreendendo a seqüência nucleotídicacorrespondendo a um IRES, caracterizado pelo fato de compreender a etapa deintroduzir na célula hospedeira um polinucleotídeo inibitório que marca o IRES.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que o IRES consiste essencialmente de uma seqüêncianucleotídica de SEQ ID NO: 1.