CN101484482A - 两步细乳液工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产纳米颗粒的方法，和能通过该方法获得的纳米颗粒。本发明还涉及包括所述纳米颗粒的药物组合物和所述纳米颗粒治疗疾病和病症的应用，所述治疗要求药物试剂穿过一个或多个生理屏障。

Description

两步细乳液工艺
本发明涉及生产纳米颗粒的方法和可由该方法获得的纳米颗粒。本发明还涉及包括所述纳米颗粒的药物组合物和所述纳米颗粒用于治疗疾病和病症的应用，所述治疗需要药物试剂穿过一个或多个生理障碍。
发明背景
I.生物障碍
虽然许多药物能够穿过生物障碍，如bbb，但是其他药物不能有效地或完全不能穿过那些障碍，且仅在直接投药到靶组织时是有效的。因此，许多潜在有效的药物在临床上不是有效的，因为它们不能穿过生物障碍，如bbb。
现有技术中已经记述了许多用于提高药物通过生物障碍的渗透性的方法。
一种方法是改变障碍，例如bbb自身的功能。例如，渗透剂，在外周投药(诸如通过静脉注射)时，引起bbb的开放。此外，一些作用于CNS的药物能够改变bbb关于其他物质的渗透性；例如，已经报告了拟胆碱槟榔碱诱导药物经过bbb渗透性的改变_[Saija，A.，Princi，P.，De Pasquale，R.，Costa，G.，“槟榔碱而非氟哌啶醇在大鼠中产生血-脑屏障渗透性的改变”(＂Arecoline but not haloperidol produces changes in the permeability of theblood-brain barrier in the rat.＂)药学和药理学杂志(J.Pharm.Pha.)42：135-138(1990)]。
另一种方法属于修饰药物分子本身。例如，高分子，诸如蛋白质完全不能穿过bbb。例如，人们能够首先分离高分子的活性位点，即触发生物学理想事件的分子部分，并且然后仅使用这样的活性位点。由于尺寸是容许bbb渗透性的一个因素，所以使用减小的尺寸，以期待较小的分子现在能够穿过bbb。其他试图穿过bbb的高分子修饰包括使蛋白质糖化(glycating)，由此增强它们的bbb渗透性，或形成前药。
美国专利号5,260,308讨论了糖化蛋白质，而美国专利号4,933,324和WO 89/07938公开了前药的形成。这些前药由脂肪酸载体和神经活性药物组成，所述神经活性药物不能依靠其自身穿过bbb。WO89/07938中公开了类似的系统。
再一种方法是移植受控释放聚合物，所述聚合物将活性成分从基质-系统中直接释放到神经组织中。然而，该方法是侵入性的，且如果直接植入脑或脊髓则需要外科手术的介入[见Sabel等，美国专利号4,883,666；和Sabel等，美国专利号申请序列号07/407,930]。
为了克服这些限制，尝试了另一种方法，其中使用了药物载体系统，诸如脂质体、红细胞影、抗体-缀合物、和单克隆抗体缀合物。靶定药物递送中的主要问题之一是网状内皮系统(RES)，特别是肝和脾中的巨噬细胞对注射的载体的快速调理和吸收。在脂质体的情形中，该障碍可以通过引入所谓的“秘密”脂质，诸如磷脂酰肌醇、单唾液酰神经节苷脂、或硫酸半乳糖基酰基鞘氨醇而得到部分的克服。然而，所有这些系统具有缺乏允许在医学中广泛范围应用的多功能性。
II.纳米颗粒作为药物递送赋形剂
纳米颗粒为检测和治疗多种疾病，特别是癌症提供了新希望。因此，纳米颗粒为许多医学领域，特别是癌症治疗保持巨大的潜力。将肿瘤-杀伤药物直接递送到癌症细胞，由此将避免化学疗法的有害副作用的承诺已经在医学界中引起了许多关于纳米颗粒的兴趣。
WO 95/022963中公开了用于将药物携带并指引到理想的靶组织的方法。其中，公开了药物靶向系统，其包括由聚合物材料制成的纳米颗粒，所述纳米颗粒包括待递送到所述哺乳动物的药物以及覆盖于其上的表面活性剂涂层；和生理可接受载体和/或容许所述纳米颗粒在施用后传输到该哺乳动物体内靶标处的稀释剂。在该方法中，使用了包括聚合物颗粒的纳米颗粒，所述聚合物颗粒具有优选地<1，000nm的直径。
已经证明了烷基氰基丙烯酸酯(ACA，C1-C6)是对若干应用有价值的单体。除了广泛已知用作“超级胶水”外，它们用在关于伤口封闭的外科手术中(例如，
Figure A200780025126D00051
正-丁基氰基丙烯酸酯BCA)。这两种应用均基于这样的事实，即阴离子聚合作用容易受到痕量的亲核试剂的启动，所述痕量的亲核试剂如来自湿气和皮肤水的水，存在于皮肤蛋白质中的胺，醇或磷化氢。
近年来，在合成聚(烷基氰基丙烯酸酯)纳米颗粒中付出了相当大的努力。具体地，聚(烷基氰基丙烯酸酯)纳米颗粒是生物相容的、生物可降解的，并被报告显示出分别吸附截留生物活性化合物的明显倾向，这使得它们成为作为药物载体系统使用的有前途的候选者。已经使用大量不同的化合物作为“有效负荷”，其范围从无机晶体，例如磁铁矿{Arias，2001 #1}到不同的药物(甲氨蝶呤{Reddy，2004 #2}、多柔比星{Steiniger，2004 #4；Kattan，1992 #3；Gulyaev，1999 #5})和甚至是寡肽(dalargin{Alyautdin，1995 #6}，{Olivier，1999 #7})或蛋白质(胰岛素{Couvreur，1988 #10；Behan，2001 #8；Sullivan，2004 #9})。
在十九世纪70年代晚期，Couvreur{Couvreur，1979 #11}利用含有聚合非离子表面活性剂作为空间稳定剂的HCl-溶液(10-2-10-3mol·l-1)，向其中逐滴地加入烷基氰基丙烯酸酯单体，开发了第一个用于形成聚(烷基氰基丙烯酸酯)(纳米)颗粒的工艺。从那时开始，大量研究(见{Limouzin，2003 #12})报告了在具有或不具有表面活性剂条件下的分散体和乳剂技术的应用。所述颗粒表现出广泛的尺寸分布，其范围从低于100nm到超过1μm。颗粒尺寸、分散体的稳定性和聚合物的摩尔质量很大程度上依赖于连续相的pH{Behan，2001 #13}、{Lescure，1992 #14}、{El-Egakey，1983 #15}、{Douglas，1984 #16}和表面活性剂的类型和浓度{Douglas，1985 #17}、{Vasnick，1985#18}。
尽管非离子或聚合表面活性剂的乳剂聚合作用对制备聚(烷基氰基丙烯酸酯)纳米颗粒具有广泛的应用，但是存在着若干局限性，具体地，分散体的低聚合物含量(～1wt％)和与单体相比大量的表面活性剂(表面活性剂与单体的比是1：1或甚至更高，例如{Seijo，1990 #19}，{Alyautdin，1995 #6})。另外，可商购的单体中存在的稳定剂引起严重的问题。由于所应用的稳定剂是未知浓度的路易斯酸(MeSO3H，SO2)，所以能够预测对于颗粒特征的影响，并且不轻易地受控于迄今为止所应用的技术。已经报告了SO2的量影响颗粒尺寸{Labib，1991 #20}，{Lescure，1992 #14}，并且因此，如果使用不同批次的烷基氰基丙烯酸酯单体，则导致缺乏重复性。
直到现在，通过选择表面活性剂实现颗粒表面的修饰，所述表面活性剂物理吸附于，如例如聚山梨酸酯{Alyautdin，1995 #6}，{Olivier，1999 #7}，或者通过例如葡聚糖{Chauvierre，2004 #21}，{Douglas，1985 #17}或PEG{Peracchia，1997 #22}的羟基化学键合于颗粒表面。使用聚山梨酸酯的修饰容许颗粒渗透过血脑屏障，而PEG化的颗粒在循环系统中表现出长期的存留。
然而，难以实现从聚合物颗粒向特殊设计的表面特征的进一步化学官能化，因为表面活性剂分子占据了颗粒表面(由于使用了大量表面活性剂)且缺乏锚状-基团如COO-。需要这些基团，以通过EDC偶联状蛋白质(例如，抗体)缀合(生物)分子，从而寻找细胞响应的特异性受体。
III.由细乳液方法形成的纳米颗粒
由现有技术还已知，在细乳液中进行向聚合物的转化。细乳液是例如水、油相、和一种或多种表面活性剂的分散体，其中所述表面活性剂具有约50-500nm的小滴尺寸。认为细乳液是亚稳定的(cf.乳剂聚合和乳剂聚合物(Emulsion Polymerization and Emulsion Polymers)，编辑P A.Lovell和Mohamed S.El-Aasser，John Wiley和Sons，Chichester，纽约，Weinheim，1997，第700页以及下列等等；Mohamed S.El-Aasser，乳剂聚合和乳胶技术的发展(Advances in Emulsion Polymerization and Latex Technology)，第30届年度短期课程(30th Annual Short Course)，卷3，1999年6月7-11日，乳剂聚合物学院(Emulsion Polymers Institute)，Lehigh University，Bethlehem，Pa.，美国)。这些分散体在清洁产品、化妆品或身体护理产品中发现了广泛的应用。
例如，由国际专利申请WO 98/02466或由德国专利DE-A-196 28 143和DE-A-196 28 142已知，通过烯属不饱和单体的自由基细乳液聚合作用制备水性第一分散体。在这些已知方法的情形中，在不同的低分子量、寡聚或多聚疏水性物质的存在下，单体能够共聚合。
由WO 2006/029845已知一种制备纳米颗粒的方法，其包含下列步骤：
-提供反应系统，其包括O和w型液相、稳定剂、一种或多种药物制剂和可聚合单体，
-形成O/W型细乳液，和
-聚合所述单体，从而形成纳米颗粒。
WO 2006/029845具体使用了如在K.Landfester，“细乳液中的聚合反应(Polyreactions in Miniemulsions”，高分子快讯(Macromol.Rapid Comm.)2001，896-936.K.Landfester，N.Bechthold，F.Tiarks，和M.Antonietti，“可聚合细乳液的剂型和稳定性机制(Formulation and stability mechanisms ofpolymerizable miniemulsions)”中公开的细乳液法。该技术通过包括不同顺序的制造步骤而与众所周知的常规方法基本区别开：在该方法中，在亲水连续相中，含有分散的疏水性、含有单体的小滴的细乳液形成聚合的颗粒。在常规方法中，聚合物是直接由包含单体的溶液形成的。
然而，WO 2006/029845没有公开聚合作用是通过一个或多个(伯)胺起始的。
WO94/020106公开具有直径1-250μm的亲水性聚谷氨酸微胶囊对于体内分布是有效的。所述微胶囊意欲特异性靶向精确定义的组织。然而，WO94/020106没有使用细乳液法。
WO 03/026590涉及用于使氨基酸低聚物选择性结合于半导体和含有元素碳的物质的组合物和方法。一种形式是通过使特异性结合该物质的氨基酸低聚物与能够引起形成该物质的溶液相互作用，而控制半导体或含有元素碳的物质的颗粒尺寸的方法。相同的方法能够用于控制半导体物质的纳米晶体颗粒的长宽比。同样在此，然而，没有公开通过细乳液法形成纳米颗粒。
由“在非离子油包水细乳液中合成纳米尺寸的硅石：水/表面活性剂摩尔比和氨浓度的影响(Synthesis of Nanosize Silica in a Nonionic Water-in-OilMicroemulsion：Effects of the Water/Surfactant Molar Ratio and氨Concentration)”，胶体和界面科学杂志(Journal of Colloid and InterfaceScience)211，210-220(1999))，已知向细乳液中加入氨。然而，该出版物描述了通过称为
Figure A200780025126D0008140936QIETU
工艺的变体产生(通过缩聚作用)硅石。另外，加入非离子表面活性剂和环己烷，并生成30-70nm范围内的纳米尺寸硅石。注意到在小表面活性剂浓度下，当氨浓度增大时，颗粒尺寸增大。在较高的表面活性剂浓度下，当氨浓度增大时，形成最小颗粒尺寸。除此之外，该引用没有公开细乳液法的使用。
发明目的
本发明的目的是提供生产纳米颗粒的方法，其中相当多地降低表面活性剂的量并且可以引入官能团。
本发明的另一个目的是提供制造PACA纳米颗粒的改良方法，所述颗粒能够以高产率地、固体含量(solid content)获得，并且具有小颗粒尺寸和窄的、均匀的颗粒分布。
本发明的再一个目的是为药物制剂提供递送赋形剂，所述药物制剂能够特异地适合于理想的释放特征。具体地，本发明的目的是提供递送赋形剂，所述递送赋形剂适合用于改变医学状态，能够特异性地穿过动物或人体的主要生理或生物屏障，并且随后显示出修饰的释放特征，诸如药物靶组织中的持续不变的释放或延长释放。
此外，本发明的目的是提供制造药物递送赋形剂的方法，所述方法适合于大规模生产所述赋形剂。
发明概述
这些目的通过独立权利要求的主题实现。在从属权利要求中阐明了优选的实施方案。
发现了利用伯或仲胺(在本发明中将伯胺定义为也包括氨)起始细乳液法的聚合步骤在一方面形成具有窄尺寸分布的小PACA纳米颗粒，在另一方面导致使该纳米颗粒官能化的可能性。
已将两步细乳液工艺应用于制备PACA纳米颗粒，优选地，聚(正丁基氰基丙烯酸酯)(PBCA)纳米颗粒。作为实例，在第一步中，利用十二烷基硫酸钠作为表面活性剂，由盐酸溶液中的正丁基氰基丙烯酸酯制备细乳液。在第二步中，加入碱溶液，以起始聚合作用，并形成聚合颗粒。利用伯或中胺或氨基酸作为起始物容许对聚合物颗粒表面的方便的官能化作用。注意到进一步发现叔或季胺也能在本发明的情形中工作，只要它们能够起到亲核试剂的作用。然而，伯和仲胺是本发明中优选的。
已经研究了表面活性剂浓度和声波处理时间对颗粒尺寸和尺寸分布的影响，以及起始物的pH、浓度和量对颗粒尺寸和聚合物摩尔质量分布的影响。检测到的颗粒ζ-电势的pH-依赖性显示出在利用氨基酸起始后，颗粒表面上存在羧基基团。
作为结果，本发明公开了可重复地官能化和可负载的具有窄尺寸分布的PACA纳米颗粒，特别是PBCA纳米颗粒的制备，所述纳米颗粒在分散体中是稳定的。能够以这样的方式制备纳米颗粒，所述方式利用最小阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)获得了高于10重量％的固体含量。
达到这些要求的一个非常方便的方式是应用细乳液技术，其中在水中的稳定正丁基氰基丙烯酸酯细乳液形成后，起始了聚合作用，如同已经在利用细乳液技术的单峰试验中显示的那样，从而创建具有5％的固体含量的聚(烷基氰基丙烯酸酯)纳米颗粒{Limouzin，2003 #12}。
利用由疏水性试剂获得的细乳液的高稳定性，以防止奥斯特瓦尔德熟化，应该显示出可能甚至进一步增加分散的BCA-单体量，并因此使最终分散体中的固体含量达到大于l0％。在最简单的情形中，通过添加氢氧化物溶液起始聚合作用。已经研究了表面活性剂浓度和声波处理时间对颗粒尺寸和尺寸分布的影响，以及起始物溶液的pH、浓度和量对颗粒尺寸和聚合物摩尔质量分布的影响。应该显示出，应用单-或多官能胺作为起始物容许将官能团引入到聚合物中{Kulkarni，1971 #27}，{Leonard，1966 #28}，{Pepper，1978 #29}，并且由此引入到颗粒中。检测到的颗粒ζ-电势的pH-依赖性显示出在利用氨基酸起始后，颗粒表面上存在羧基基团。
发明详述
按照第一方面，本发明提供生产纳米颗粒的方法，其包括下列步骤：
a)制备O/W型细乳液，其包括O和W(水性)型液相，一种或多种稳定剂和可聚合ACA单体，
b)通过阴离子聚合作用聚合所述单体，并分离所产生的纳米颗粒，
其特征在于
步骤b)中的聚合作用是由一种或多种伯或仲胺起始的。
令人惊讶地，发现了为了起始单体的聚合而添加伯或仲胺引起所述纳米颗粒窄且均匀的尺寸分布，并且导致制造所述纳米颗粒所需表面活性剂量的显著减少。如以上还提到地，本发明不必然受限于使用伯或仲胺，并且也可以使用叔、季胺和其他试剂，只要它们是强亲核试剂。该发展的优势是明显的：纳米颗粒越小，则它们越能更好地适合于预想的应用，特别是为了穿过血脑屏障的体内应用。此外，制备纳米颗粒所需表面活性剂(或稳定剂)量的减少也应该减少表面活性剂对患者的体内负荷，并且应该容许将聚合物颗粒化学官能化为特殊设计的表面特征，因为避免了表面活性剂分子对颗粒表面的占据。在“实施例”一章中将更详细地描述优势。
术语“纳米颗粒”用于本文时通常指这样的载体结构，所述载体结构是生物相容的且有效地抵抗由使用的环境引起的化学和/或物理破坏，以使有效量的纳米颗粒在腹膜内或口服或静脉内的施用后进入人或动物体内后保持基本完整，以致能够达到需要的靶器官或组织，例如脑、肝、肾、肺等。
按照优选的实施方案，所述纳米颗粒具有直径1nm-20μm，优选地10nm-10μm，且最优选地50nm-1,000nm。
此外，如上定义的纳米颗粒优选地包括覆盖于其上的表面活性剂表层。
用适当表面活性剂的充分涂覆处理纳米颗粒容许被吸附的药物更好地穿过生理屏障，如bbb。引用了数篇公开了该作用的文献，特别是WO95/22963，将其作为整体引入本文。
所述一种或多种稳定剂的量是1-50％，优选地5-30％，和最优选地10-25％重量-％基于单体相。应该进一步注意到“稳定剂的量”用于本文时，还包括若干组合的稳定剂的总量。例如，10-25重量％的所述量可以由10％十二烷基硫酸钠和10％聚山梨酸酯80组成。
术语“稳定剂”用于本发明时应该包括任何能够稳定乳状液的物质。这些物质优选地是表面活性和/或两亲性物质，即表面活性剂。
所述表面活性剂表层和/或稳定剂优选地包括一种或多种下列物质：
甘油、山梨醇和其他单或多官能醇的脂肪酸酯，优选地苯甲醇，甘油单硬脂酸酯，失水山梨糖醇单月桂酸酯，或失水山梨糖醇单油酸酯；磷脂，磷酸酯，多糖，苯甲酸苄酯，聚乙二醇(PEG200，300，400，500，600)，聚乙二醇羟基硬脂酸酯，优选地，Solutol HS 15；泊洛沙胺(poloxamines)，优选地，泊洛沙胺904，908，或1508；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯；乙氧基化甘油三酯；乙氧基化酚和乙氧基化二酚；Genapol TM和Bauki系列的表面活性剂；聚氧乙烯蓖麻油，优选地，Cremophor ELP；磷脂酰胆碱，脂肪酸的金属盐，脂肪醇硫酸酯的金属盐(metal salts of fatty alcohol sulfates)；和磺基琥珀酸酯(sulfosuccinates)的金属盐；优选地聚山梨酸酯，更优选地，聚山梨酸酯20、60和最优选地，聚山梨酸酯80；优选地，泊洛沙姆，更优选地，泊洛沙姆188，338或407；优选地，聚乙二醇，更优选地，异构醇醚(Lutensol)50或80；本领域中已知的阴离子表面活性剂(见，例如，M.J.Rosen：“表面活性剂和界面现象”(＂Surfactants and interfacial phenomena＂)，Wiley & Sons公司，纽约奇切斯特布里斯班多伦多新加坡1989)，例如十二烷基硫酸钠；以及两种或更多种所述物质的混合物。
如上所示，聚山梨酸酯80是最优选的。
注意到，如果存在表面活性剂表层，则本发明还提供这样的方法，其中从获得的纳米颗粒至少部分地去除所述表层。这能够优选地通过透析或离心完成。意外地发现尽管制造方法本身需要稳定剂，但是可以在最终纳米颗粒形成后至少部分地去除稳定剂。换言之，可以去除“过量”的稳定剂，不需要它来维持纳米颗粒的稳定性，但是它能够引起体内应用的潜在风险。假设应该认为纳米颗粒中稳定剂可能的最低量具有最低的体内风险。
优选的聚合方法是如K.Landfester等开发的细乳液技术。
细乳液是临界稳定的、大小为50-500nm的油滴的分散体，是通过剪切包含油、水、表面活性剂和疏水物的系统而制备的。在该细乳液中的聚合作用导致具有与最初小滴大约相同尺寸的粒子(K.Landfester，细乳液中的聚合反应(Polyreactions in miniemulsions)，高分子快讯(Macromol.RapidComm.)2001，896-936.K.Landfester，N.Bechthold，F.Tiarks，和M.Antonietti，可多聚细乳液的配制和稳定机制(Formulation and stabilitymechanisms of polymerizable miniemulsions).高分子(Macromolecules)1999，32，5222.K.Landfester，细乳液中的近期发展——配制和稳定机制(RecentDevelopments in miniemulsions-Formation and Stability Mechanisms).高分子专题论文(Macromol.Symp.)2000，150，171)。
如上所述，如，例如Landfester等(见上)中所公开地，已知的细乳液技术能够用于制备细乳液。这可以，例如通过首先组合O相和W相中的单体和稳定剂(如上定义)完成。注意到，含水相可以包含其他成分，例如HCl，以调整合适的pH值。第二，可以通过例如均化器等混合反应系统，从而混合全部成分。
通过对反应系统应用高剪切力，例如通过超声波和高压均化器，进行细乳液自身的制备。此外，依赖于反应系统的尺寸和所使用的均化器，可以在一定时间范围内，例如1-10分钟内应用剪切力。基本上，认为2-4分钟的时间范围是充足的。然而，注意到制备纳米颗粒的细节和条件可以根据许多因素，如例如所使用的精确仪器等而变化。
超声波均化器可以具有大约60-100％的振幅，优选地，大约70-90％的振幅。
按照实施方案，该方法中所使用的温度优选地为-1-5℃，优选地为0℃。然而，温度范围不受此限制，且能够使用更宽的范围。
通常，O对W相的重量比是15-40％w/w，优选地，20-30％w/w，和更优选地，大约25％w/w。
按照优选的实施方案，所述胺是选自由氨、tris-碱，或由氨基酸，优选地苯丙氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、色氨酸、5-羟色氨酸或6-氨基己酸组成的组中之一。
在此，5-羟色氨酸或色氨酸是特别优选的，因为发现该氨基酸一方面适合作为聚合作用的起始物，且另一方面可以起到增强穿过bbb运输的分子的作用(也见下文)。假设在该情形中，色氨酸或5-羟色氨酸用作聚合作用的起始物，充足数量的那些分子也应该出现在纳米颗粒的表面上。因此，色氨酸或5-羟色氨酸可以另外地作为增强穿过bbb的运输的方式。
其他可以使用的氨基酸选自由丙氨酸、天冬酰胺、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、缬氨酸、和牛磺酸组成的组中之一。
注意到通过仅利用NaOH的常规方法的不能使用如上解释的本发明效果。
在本发明的方法中，优选地在W和/或在O相中含有一种或多种药物制剂，其优选地选自治疗剂或诊断剂。
注意到术语“药物”和“治疗剂”在本文中可交替使用。
治疗剂优选地选自这样的物质，所述物质在没有递送赋形剂或载体的条件下，不能或不能充分地够穿过生理屏障，其中所述生理屏障优选地选自由血-脑屏障(bbb)、血-气屏障，血-脑脊液屏障和口腔粘膜组成的组中之一。
按照优选的实施方案，本发明的递送赋形剂包括一种或多种治疗剂，所述一种或多种治疗剂选自由下列各项组成的组中之一：在突触位点和神经效应器连接位点处作用的药物；全面和局部止痛剂；催眠剂和镇静剂；用于治疗精神病学病症，如忧郁症和精神分裂症的药物；抗癫痫药剂和抗痉挛剂；用于治疗帕金森氏症和亨廷顿氏症、衰老和阿尔茨海默氏症的药物；抗肥胖药；兴奋性氨基酸拮抗剂，神经营养因子和神经再生剂；营养因子；针对CNS创伤或中风治疗的药物；用于治疗上瘾和药物滥用的药物；antacoids和消炎药；用于寄生虫感染和由微生物引起的疾病的化学治疗剂；免疫抑制剂和抗癌药；维生素；激素和激素拮抗剂；重金属和重金属拮抗剂；非金属毒性试剂的拮抗剂；用于治疗癌症的细胞生长抑制剂，优选地，多柔比星；核医学中使用的诊断物质；免疫活性和免疫反应性试剂；递质以及它们各自的受体激动剂和受体拮抗剂，它们各自的前体和代谢物；输送物抑制剂；抗生素；解痉药；抗组胺剂；止吐剂；弛缓剂；兴奋剂；有义和反义寡核苷酸；脑扩张剂；神经药物；抗狂躁药；脉管扩张剂和收缩剂；抗高血压药；用于偏头痛治疗的药物；催眠药；高血糖症和低血糖症药；平喘药；抗病毒剂；优选地，抗HIV药剂；适合于疾病的DNA或反义治疗的遗传物质；及其混合物。关于在上述制备纳米颗粒的方法中加入所述试剂，注意到可以优选地在聚合作用开始前加入疏水性试剂，其中可以在该步骤之前或之后加入亲水性试剂(通过吸附至纳米颗粒的表面)。
术语“DNA”用于本说明书时主要指本技术领域中可能想到的任何DNA。在优选的实施方案中，术语“DNA”有意包括两种DNA类型，即质粒DNA和反义寡核苷酸，一方面，所述质粒DNA，更优选地为，包含肿瘤抑制剂基因信息的质粒DNA，甚至更优选地，包含肿瘤抑制剂基因p53和pRB信息的质粒DNA，另一方面，所述反义寡核苷酸，更优选地为，针对癌基因的反义寡核苷酸，甚至更优选地，针对癌基因，如Bcl2的反义寡核苷酸。本发明可以使用一种DNA类型(和从而负载一种DNA类型的纳米颗粒)。备选地，可以使用两种或更多种DNA类型，从而导致大量负载了不同DNA类型并可以按照本发明使用的纳米颗粒类型。
令人惊讶地，DNA且尤其是上述两种类型的DNA能够吸附在纳米颗粒上，且能够将由此产生的DNA-纳米颗粒复合物接种到生物体中，尤其是患有癌症(特别地，但不仅限于，脑癌)的生物体中。随后，能够观察到肿瘤增殖的抑制，且甚至能够诱导肿瘤坏死和程序性细胞死亡。
在本发明优选的而非基本的实施方案中，能够将包含启动子的质粒DNA，更优选地包含可诱导的启动子的质粒DNA加载到纳米颗粒上。通过将含有可诱导启动子的DNA加载到纳米颗粒上并在细胞内对其进行表达的新步骤，能获得可诱导的启动子，以及从而获得相关基因表达的外部控制，并且能够随意地将基因开启或关闭。作为未预料到的超越现有技术的优势，能够控制基因/DNA表达的时刻。该控制能够减少连续基因表达的毒性副作用，和/或能够降低细胞对基因产品产生抗性，及由此产生负选择的可能性。
在本发明优选的实施方案中，将人乳头状瘤病毒上游调节区域(HPV-URR)用作可诱导的启动子。施用了地塞米松或其他诱导物或化合物后，诱导了肿瘤抑制剂的表达。通过该方法，能够实现肿瘤细胞程序性细胞死亡以及肿瘤的衰退。按照本发明可以使用的其他示范性启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。
此外，通过组合施用一种或超过一种含有DNA类型的纳米颗粒和含有一种或超过一种抑制细胞生长的有效物质的纳米颗粒，能够实现包括肿瘤衰退的强烈效果。
在优选的实施方案中，能够在接种含有抑制细胞生长的有效化合物的纳米颗粒复合体前注射肿瘤抑制剂DNA，所述肿瘤抑制剂DNA甚至更优选地在可诱导启动子之后。在甚至更优选的实施方案中，抑制细胞生长的有效化合物是多柔比星(doxorubicine)。
在DNA转染到细胞内的过程中，以及还有在向人或动物体内的靶器官施用DNA的过程中，第一步包括以如上定义的方式制备纳米颗粒。
为了获得更多的信息，明确地参考WO 2004/017945，并将其内容作为整体引入本文。
典型活性成分(例如，药物)可以是任何作用于神经系统或用于神经系统诊断测试的物质。这些记述在Gilman等(1990)，“古德曼和吉尔曼----治疗学的药理学基础”(＂Goodman and Gilman′s-The Pharmacological Basis ofTherapeutics＂)，Pergamon出版社，纽约中，并且包括下列试剂：
乙酰胆碱和合成的胆碱酯，天然存在的拟胆碱生物碱和它们合成的同类物，抗胆碱酯酶试剂，神经节兴奋剂，阿托品，东莨菪碱和相关的抗毒蕈碱药物，儿茶酚胺和拟交感神经药物，如肾上腺素，去甲肾上腺素和多巴胺，肾上腺素激动剂，肾上腺素受体拮抗剂，递质诸如GABA，甘氨酸，谷氨酸，乙酰胆碱，多巴胺，5-羟色胺，和组胺，神经活性肽；止痛剂和麻醉剂，诸如阿片样止痛剂和拮抗剂；前麻醉剂和麻醉药物，诸如苯二氮杂
Figure A200780025126D0015141231QIETU
类，巴比妥酸酯，抗组胺剂，吩噻嗪和苯丁酮(butylphenones)；阿片样物质，止吐剂；抗胆碱能药物，诸如阿托品，东莨菪碱或格隆铵盐(glycopyrrolate)；可卡因；氯醛衍生物；乙氯维诺；格鲁米特；甲乙哌酮；甲丙氨酯；副醛；戒酒硫；吗啡，芬太尼和纳洛酮；精神病学药物，诸如吩噻嗪，噻吨和其他杂环化合物(例如，halperiodol)；三环抗抑郁剂，诸如去丙米嗪(desimipramine)和丙米嗪；非典型抗抑郁剂(例如，氟西汀和曲唑酮)，单胺氧化酶抑制剂，诸如异卡波肼；锂盐；抗焦虑药，诸如chlordiazepoxyd和地西泮；抗癫痫药，包括3-甲基苯乙妥因，抗痉挛巴比妥酸酯，亚氨基锑化氢(iminostilbines)(如卡马西平)，琥珀酰亚胺，丙戊酸，噁唑烷二酮和苯二氮杂
Figure A200780025126D0015141231QIETU
类，抗帕金森症药物，诸如左旋多巴/卡比多巴，阿扑吗啡，amatadine，麦角灵，司来吉兰，累匹利洛，甲磺酸溴隐亭和抗胆碱药；抗痉挛药，诸如巴氯芬，地西泮和丹曲林；神经保护剂，诸如兴奋性氨基酸拮抗剂，神经营养因子，和脑来源的神经营养因子，睫状神经营养因子，或神经生长因子；神经营养因子(NT)3(NT3)；NT4和NT5；神经节苷脂；神经再生试剂；用于治疗上瘾和药物滥用的药物，包括阿片样拮抗剂和抗抑郁剂；自泌物和消炎药，诸如组胺，缓激肽，赖氨酰缓激肽(kailidin)和它们各自的激动剂和拮抗剂；用于寄生虫感染和微生物疾病的化学治疗剂；抗癌药，包括烷化剂(例如，亚硝基脲)和抗代谢物；氮芥，乙烯胺和甲蜜胺；烷基磺酸酯；叶酸类似物；嘧啶类似物，嘌呤类似物，长春生物碱；和抗生素。
再次强调用于本发明的最优选药物试剂是多柔比星，其由下式表示：
          
Figure A200780025126D00161
按照优选的实施方案，诊断剂选自由在核医学和放射治疗中用于诊断的诊断剂组成的组中之一。
在优选的实施方案中，O相包括亲脂性溶剂或疏水物，优选地正-己烷、十六烷、液体石蜡、维生素E、miglyol或甘油三酯的脂肪酸酯。疏水物的量通常相对小，且应该足以防止奥斯特瓦尔德熟化(基于O相总重的约2-20％w/w(还含有单体))。
优选地，O相中含有一种或多种药物试剂和单体。在这种情形中，将所述药物制剂精细地分配到由聚合步骤形成的纳米颗粒中。备选地，W相中存在一种或多种药物制剂，且O相中含有单体。发现也在这种情形中，将显著量的药物制剂引入到形成的纳米颗粒中。我们不希望受限于任何具体的理论，然而，假设W相中包含的药物制剂通过制备细乳液，例如通过应用高剪切力，与O相紧密接触，从而引起所述试剂也分配到O相中。
另外，可以使用溶液介质(solution mediator)将试剂引入到溶液中，所述试剂在正常情况下不以充分的量溶于该溶剂中。这组物质的实例是二甲亚砜、二甲基甲酰胺、聚山梨酸酯80、维生素E、聚乙二醇(PEG 200，300，400，500，600)、泊洛沙姆，聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor ELP)、聚乙二醇、聚乙二醇羟基硬脂酸酯(Solutol)、Labrafil、Labrasol、磷脂酰胆碱、丙二醇、苯甲酸苄酯、甘油或单-或多官能醇的脂肪酸酯或甘油三酯。
此外，如果需要，可以将一种或多种药物试剂加入到O和W相两相中。
在优选的实施方案中，所使用的稳定剂包含在W相中。W相优选地是水或包含酸、优选盐酸或磷酸的水性溶液。使用可聚合的单体，以形成聚合材料，其优选地选自由聚氰基丙烯酸酯，优选地聚烷基氰基丙烯酸酯，和其衍生物、共聚物和混合物组成的组中之一。术语“聚烷基氰基丙烯酸酯”在本文中被定义为优选地包括C1-C6烷基基团。
本发明中使用的(生产的)聚合材料优选地是可生物降解的。该术语表示已知适合于在有生命的个体体内使用的任何聚合材料，即，其是生物学惰性的和生理可接受的，无毒性，且在本发明的递送系统中，在使用环境中是生物可降解的，即能够被身体再吸收。
本发明的方法在优选的实施方案中包括使分子附着到纳米颗粒外表面的步骤，所述分子被主动转运穿过血-脑屏障，或其中使抗体附着于所述外表面，该抗体针对关于被主动转运穿过血-脑屏障的分子的脑内皮细胞受体是特异性的。
上述分子优选地选自色氨酸、5-羟色氨酸、运铁蛋白、胰岛素、褪黑激素、5-羟色胺、或胰岛素-样生长因子I和II。关于如何实现该附着的所述技术和机制，完全参考WO03039677和WO9104014的内容，将其引入本文作为参考。例如，该附着能够通过间隔分子或通过直接共价键完成。
口服摄取的5-羟色胺不进入中枢神经系统的5-羟色胺能途径，因为它不跨越血-脑屏障。然而，色氨酸和它的代谢物5-羟色氨酸(5-HTP)能够并且的确跨越了血-脑屏障，5-羟色胺是由所述5-羟色氨酸合成的。
褪黑激素本身能够容易地跨越细胞膜，且特别是血-脑屏障。
按照第二方面，本发明涉及可以由以上定义的方法获得的纳米颗粒和包括那些纳米颗粒和药用载体和/或稀释剂的药物组合物。
为了在实际实施方案中使用所述纳米颗粒，可以用蒸馏水或处于生理pH和摩尔渗透压浓度的正常盐水将它们重建成混悬液中。
典型地，所述纳米颗粒存在于可注射的混悬液中，其浓度范围是0.1mg纳米颗粒/ml混悬流体-100mg纳米颗粒/ml混悬流体。10mg纳米颗粒/ml是优选的。所用的纳米颗粒的量应该强烈依赖于各个纳米颗粒中包含的药物试剂的量，且负责的熟练技术人员或医师应该能够容易地使纳米颗粒的剂量适合具体的情况。
优选地，所述递送赋形剂或药物组合物显示出所述一种或多种药物制剂在体内的延长释放或持续不变的释放。按照本发明的原理制备的那些纳米颗粒在几小时-6个月或更长的一段时期内生物降解。
备选地，所述药物组合物可以采用传输本发明递送赋形剂到达和穿过其他生理屏障，例如达到和穿过血-气屏障所需的其他形式。然后，它可以，例如具有气雾剂等的形式，从而通过吸入向有问题的屏障递送所述组合物。
本发明还提供如本文所定义的递送赋形剂或药物组合物制造治疗疾病和病症的药物的应用，所述治疗需要药物试剂穿过一种或多种生理屏障。其特别用于治疗与上文中列出的药物相对应的疾病。
具体地，所述递送赋形剂应该在治疗与CNS有关的疾病中存在应用。此外，这包括AIDS的治疗，因为在许多患有晚期AIDS的人群中----可能1/3成年人和一半儿童----HIV也渗透并伤害脑，从而触发HIV-相关的痴呆。该病症的特点是不良的注意力、降低的记忆力和缓慢思考和运动。然而，要靶向脑中的病毒是特别困难的。在此，本发明还通过向脑递送抗-HIV试剂，开启了新的治疗成功之路。
将本文提及的全部出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过完全结合于此。在有冲突的情形中，以本说明书，包括定义为准。另外，物质、方法和实施例仅用于进行举例说明，而非意欲进行限制。
附图简述
图1：对于150s的声波处理时间，颗粒尺寸(空心圆)和Mw随表面活性剂的浓度的变化(虚线是为了指导视觉)。
图2：在4周的过程中，由BCA细乳液获得的GPC elugram和由PBCA分散体获得的洗脱时间的变化。
图3：利用SDS(样品S-10)、异构醇醚(Lutensol)AT50(样品L-10)和吐温20(样品T-10)制备的分散体的TEM-图像(图从左到右)；用异构醇醚(Lutensol)AT50和吐温20制备的分散体的图像只能在重新分散该颗粒后获得。
图4：与计算值相比较的pH的变化。选择各个NaOH溶液的体积，以产生关于最终分散体的计算的pH。在计算中忽略了反应过程中OH-的消耗(虚线是为了指导视觉)。
图5：获得的聚合物随着起始物(NaOH-溶液)体积(各部分右侧给出的数字)的变化，7天后冷冻颗粒。
图6：假定的解聚/重聚作用机制{Ryan，1996 #37}。
图7：洗脱体积随着起始物(氨水溶液)体积(各部分右侧给出的)的变化。制备后2天冷冻样品。
图8：洗脱体积随着起始物(tris碱溶液)体积(各部分右侧给出的)的变化。制备后2天冷冻样品。
图9：用0.5mol·l-1 6-氨基己酸起始(左图)和用甘氨酸溶液(右图)起始的颗粒尺寸变化(虚线是为了指导视觉)。右图图例中的数字表示溶液的摩尔浓度(破折号前)和pH(破折号后)。
图10：6-氨基己酸起始的样品的GPC洗脱体积：a)pH4.4b)pH5.5c)pH10。
图11：甘氨酸起始的样品的GPC洗脱体积：a)Gly 0.1pH3.4；b)Gly 0.5，pH3.4；c)Gly 2.0，pH3.4。
图12：透析前和后在pH3和10时的ζ-电势。
图13：NaOH-溶液(0.1mol·l-1，计算的pH7)起始的聚合物的1H-NMR-光谱。
图14：6-氨基己酸-溶液(pH4.4，0.5mol·l-1)起始的聚合物的1H-NMR-光谱。
图15：氨基酸L-亮氨酸(0.125mol/l)对包含10％ SDS和4.17％十六烷的NP-乳状液的颗粒尺寸的影响。
图16：氨基酸L-亮氨酸(0.125mol/l)对包含10％ SDS和4.17％十六烷的NP-乳状液ζ电势的影响。
图17：氨基酸L-亮氨酸(0.05mol/l)对包含10％ SDS和4.17％十六烷的NP-乳状液的颗粒尺寸的影响。
图18：氨基酸L-亮氨酸(0.05mol/l)对包含10％ SDS和4.17％十六烷的NP-乳状液ζ电势的影响。
图19：氨基酸L-亮氨酸(0.1mol/l)对包含10％ SDS和4.17％十六烷的NP-乳状液的颗粒尺寸的影响。
图20：氨基酸L-亮氨酸(0.1mol/l)对包含10％ SDS和4.17％十六烷的NP-乳状液ζ电势的影响。
图21：利用9ml0.05mol/l L-亮氨酸溶液起始的包含5％ Lutrol、2％ SDS和6％大豆油的PBCA混悬液的标准方法。
图22：氨基酸L-亮氨酸(0.1mol/l)对包含5％ Lutrol、2％ SDS和6％大豆油的NP-乳状液的颗粒尺寸的影响。
图23：氨基酸L-亮氨酸(0.1mol/l)对包含5％ Lutrol、2％ SDS和6％大豆油的NP-乳状液ζ电势的影响。
图24：氨基酸L-亮氨酸(0.125mol/l)对包含5％ Lutrol、2％ SDS和6％大豆油的NP-乳状液的颗粒尺寸的影响。
图25：氨基酸L-亮氨酸(0.125mol/l)对包含5％ Lutrol、2％ SDS和6％大豆油的NP-乳状液ζ电势的影响。
图26：氨基酸L-亮氨酸(0.05mol/l)对包含5％ Lutrol、2％ SDS和6％大豆油的NP-乳状液的颗粒尺寸的影响。
图27：氨基酸L-亮氨酸(0.05mol/l)对包含5％ Lutrol、2％ SDS和6％大豆油的NP-乳状液的影响。
实施例
材料
如接收那样使用正丁基氰基丙烯酸酯(BCA，
Figure A200780025126D00211
HenkelLoctide)。从默克(Merck)购买了盐酸(0.1mol·l-1)、氢氧化钠溶液(0.1mol·l-1)、tris-碱(tris-(羟甲基)-氨基甲烷)、氨水-溶液(25％)、十二烷基硫酸钠(SDS)和全部氨基酸(6-氨己酸、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys))，例外的是苯丙氨酸(Phe)购自奥德里奇(Aldrich)。吐温20购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。作为馈赠，从BASF AG接受了异构醇醚(Lutensol)AT50，即具有约50个单位的EO封闭长度的聚(环氧乙烷)-十六烷基醚。所有化学试剂如接收那样进行使用。
合成纳米颗粒
制备正丁基氰基丙烯酸酯细乳液的标准程序和随后聚合作用的起始
在即将声波处理之前，将在12.0g盐酸(0.1mol·l-1)中的0.3g SDS的溶液加入到在3.0g BCA中的0.125g十六烷的溶液中。在冰冷却的条件下，用Branson声波处理器W450(90％振幅，0.5英寸顶端)声处理该两-相混合物2.5分钟。声波处理后，获得乳白色乳状液。该标准程序中使用的量是变化的，保持所使用的反应物的比例。通过将该细乳液在搅拌下倒入氢氧化钠溶液(0.1mol·l-1)中起始聚合作用。
改变表面活性剂
为了确定表面活性剂类型的影响，以如上所述的方式，但使用不同的表面活性剂制备细乳液。除SDS以外，还使用了异构醇醚AT50和吐温20(见表1)。通过将该细乳液在搅拌下倒入12.0g氢氧化钠溶液(0.1mol·l-1)中起始聚合作用。
改变声波处理时间和表面活性剂的量
如上所述地，利用SDS作为表面活性剂制备细乳液。在90、120、150、和180s的声波处理时间后，取出500μl细乳液，并将其注射到375μl氢氧化钠溶液(0.1mol·l-1)中。
摩尔质量的时间依赖性
以如上所述的方式(BCA 9.0g、HD 0.375g、HCl 36.0g；SDS 0.9g)制备细乳液。在即将将该细乳液在搅拌下倒入36.0g氢氧化钠溶液(0.1mol·l-1)中之前，吸移500μl样品，并将其注射到浸没在液氮中的容器内。在第一个120s过程中，每10s取出500μl样品，并以如上述相同的方式对其进行处理。对该程序，其具有较长的取样间间隔，进行了超过两周。冷冻干燥冷冻的样品。通过GPC确定由此产生的聚合物粉末的摩尔质量。
改变起始物的类型和起始物的量
为了起始聚合，将500μl新鲜制备的细乳液以一次性注射的方式，注射到不同量的氢氧化钠溶液(0.1mol·l-1，见表2)、tris-碱溶液(0.1mol·l-1)、氨溶液(0.1mol·l-1)(均见表3)和不同的氨基酸溶液(见表4)中。
透析
利用Amicon超速离心机过滤器(30，000膜，Millipore)透析分散体。
表征
用Zetasizer Nano ZS确定颗粒尺寸和ζ电势。为了光子相关光谱法(PCS)测量，将35μl分散体吸移至一次性聚苯乙烯比色杯中，并用1.5ml去矿化水进行稀释。
为了ζ电势的测量，将50μl分散体稀释至总体积5ml和需要的pH。用0.1mol·l-1NaOH-和HCl-溶液调节pH。
使用凝胶渗透层析(GPC)确定纳米颗粒的聚(正丁基氰基丙烯酸酯)的重量平均分子量。聚合完成后，将样品冷冻在-22℃，并随后冻干。将由此产生的粉末溶解在1ml THF中，通过0.45μm注射器过滤器过滤溶液。该装备由热分离产物P2000泵和热分离产物AS100自动取样器组成，其中所述热分离产物P2000泵具有Waters聚苯乙烯型交联共聚物(Styragel)5μm颗粒、100nm孔尺寸、PSS SDV 5μm颗粒、1μm孔尺寸、PSS SDV 10μm孔尺寸柱。洗脱液是流速1ml·min-1的THF p.a.。用Waters 2410 RI-检测器(Waters 2410 RI-detector)和用Knauer可变波长监测UV-检测器(KnauerVariable Wavelength Monitor UV-detector)检测信号。相对于PS标准计算摩尔质量。
利用具有加速电流80kV的飞利浦TEM 400获得TEM图像。用5ml去矿化水稀释5μl分散体，将4μl的滴置于碳包被的铜格(200目)上，并进行空气-干燥。没有应用其他染色。
到目前为止，PBCA纳米颗粒主要是通过典型的乳状液工艺制备的。我们现在通过在盐酸中的微粒乳化作用制备了疏水BCA的稳定单体小滴作为连续相，因为已知强酸有效抑制ACA的聚合{Pepper，1978 #26}，{Pepper，1983 #29}，{Costa，1983 #30}。然后，在所述小滴制成后，通过将细乳液倒入NaOH-溶液中而起始阴离子聚合。通过利用脉冲超声波和冷却该系统可以最小化细乳液制备过程中单体的蒸发和聚合时分散体的加热。
阴离子表面活性剂SDS是稳定BCA细乳液和随后形成的PBCA分散体的第一选择。结果总结在表1中。考虑到BCA导致直径约300nm的稳定颗粒，SDS的使用容许利用1％表面活性剂配制具有10％固体含量的PBCA分散体。随着SDS浓度的增高，颗粒尺寸减小(也见图1)，且尺寸分布(PDI指数)变窄。
表1：样品相对于不同SDS量和声波处理时间
Figure A200780025126D00231
Figure A200780025126D00241
图1：对于150s的声波处理时间，颗粒尺寸(空心圆)和Mw随表面活性剂的浓度的变化(虚线是为了指导视觉)。
通过相对于分散相的量的表面活性剂的量，确定细乳液中小滴的平衡尺寸。该平衡是通过应用强剪切力如超声波获得的。在特定声波处理时间后，颗粒尺寸不能再减小了。应用更长的声波处理时间，尺寸分布还显示出稍微的变窄。图1显示作为其他声波处理时间的代表，经过150s的声波处理时间，颗粒尺寸的变化。
与NaOH溶液混合后2天时测量的聚合物(具有1％SDS)的重量平均分子量Mw显示出在约15,000g·mol-1处的单峰分布。随着增高表面活性剂的量，Mw值减小。这意味着2天后与较大颗粒相比，较小颗粒由具有较短链的聚合物组成。必须注意，在制备后2天时冷冻分散体。其他实验显示聚合物的摩尔质量在这段日子过程内改变，直到达到平衡分布。一周后冷冻的样品不再显示单峰质量分布，但显示长链聚合物的出现(见图2和以下讨论)。
用SDS制备的所有聚合物分散体显示出长期的稳定性。甚至制备后2个月，没有观察到相分离。应用阳离子表面活性剂，即季胺，当单体和水相混合时导致立即的聚合。剩余的伯和仲胺可能是其原因。
选择异构醇醚AT50和吐温20作为非离子表面活性剂，以产生处于理想的10％高固体含量的不稳定分散体(分别为样品L-10(声波处理时间＝120s，d＝908nm)和T-10(声波处理时间＝120s，d＝769nm))。这些表面活性剂甚至更高的量，即多于10％，不能有效地稳定乳胶分散体。制备后1小时，所有分散体已表现出相分离。
基于这些数据，为随后的实验选择了浓度10％的SDS和150s的声波处理时间。
图2：在4周过程中，由BCA细乳液获得的GPC elugram和由PBCA分散体获得的洗脱时间的变化。
图3显示来自三种选择的分散体的TEM显微照片。利用10wt％ SDS(150s声波处理，见表1中标记的样品)制备S-10，用10wt％异构醇醚AT50制备L-10，且用10wt％吐温20制备T-10。后两种样品只能在摇动沉淀的分散体以重新分散沉淀后制备。用SDS制备的颗粒的较小尺寸和更好的均匀性清晰可见。
图3：利用SDS(样品S-10)、异构醇醚AT50(样品L-10)和吐温20(样品T-10)制备的分散体的TEM-图像(图从左到右)；用异构醇醚AT50和吐温20制备的分散体的图像只能在重新分散颗粒后获得。
1.2 起始物NaOH的量对颗粒尺寸和分子量的影响
由不同BCA-乳状液的聚合实验已知，分散体介质的pH影响颗粒尺寸和分子量{Behan，2001 #8}，{Lescure，1992 #14}。
研究了pH对在细乳液中获得的PBCA颗粒特征的影响。通过提供不同量的NaOH起始聚合来调节聚合介质的pH(见表2)。已经假设细乳液的NaOH-溶液和HCl之间的中和反应与聚合作用的起始和生长步骤相比是快速的。在细乳液的情形中，能够将聚合pH增高至pH＝7。利用常规乳状液技术，聚合的pH不能在高于4-5的pH值处进行，因为在较高值处，聚合作用太快并形成凝结物{Behan，2001 #8}。
表2：用NaOH起始的分散体的总结
Figure A200780025126D00251
Figure A200780025126D00261
关于在细乳液中获得的分散体的pH，可以注意到，特别是考虑计算的高pH值时，该数值随着时间不断减小，1天后达到稳定值，该值低于预期值(图4)。这意味着，在反应过程中以出乎预料高的量消耗OH-(约l0-2mol·l-1)，其支持这样的假设，即OH-是起始分子，尽管不能完全排除Cl-也起到起始物的作用。对于全部pH的颗粒尺寸可以在150-220nm的窄范围内，不考虑微起始物的0-200μl的小体积(因为在此体积聚合作用太慢)，应该对所述起始物体积进行单独的讨论，其中不能观察到明显的依赖性。由于该数值在这7天过程中没有显著改变，所以能够假设所有分散体稳定直至凝结。
没有添加NaOH-溶液(0μl)的细乳液的数值显示出在“未受扰乱的”细乳液中颗粒尺寸随极端缓慢的聚合作用的变化。一旦制备后，当进行了第一次GPC测量时，则能直接合理地假设细乳液仍是乳状液且不是聚合物分散体，因为细乳液的pH具有未改变的数值pH1.0。随着为了GPC测量而稀释细乳液，将起始聚合作用，因此可能不能正确显示实际小滴尺寸。由于在给定pH(1.0)处的细乳液系统中正BCA的聚合率是未知的，所以不可能确定小滴的“固化”时间。由于第一天过程中小滴的明显生长和第一和第二天之间恒定的尺寸，能够将尺寸-稳定的聚合物颗粒的形成认为是在该时间后完成的。异相起始反应通过将OH-附着于单体，导致低聚物亲水性的增加，其结果是容许低聚物通过连续相扩散，并能够引起小滴的奥斯特瓦尔德熟化，从而解释小滴的生长。7天后，分散体中可见沉积作用。这导致更小的可检测颗粒尺寸(和更窄的分布)，因为该测量中不再包括大颗粒。关于100和200μl NaOH-溶液的数值，能够观察到相同的作用，但是较不明确。
由于以较高起始pH制备的颗粒不明显地显示出颗粒尺寸的这种减小，所以能够假设在几分钟后就完成了从小滴向颗粒的转化。
综上所述，对于pH>2，在起始和聚合过程中，颗粒尺寸似乎很大程度上不受连续相pH的影响。该pH以下，由小滴向颗粒转化的时间小于小滴生长(奥斯特瓦尔德熟化)的时间。
图4：与计算值相比较的pH的变化。选择各个NaOH溶液的体积，以产生关于最终分散体的计算的pH。在计算中忽略了反应过程中OH-的消耗
(虚线是为了指导视觉)。
图5中显示随着添加不同NaOH量获得的样品的GPC踪迹。由0，100和200μl起始物溶液产生的聚合物摩尔质量显示出具有非常低量高分子聚合物的窄质量分布(最大值4,000g·mol-1)。由体积为300-400μl的起始物(计算的pH为2.0和11.5)获得的聚合物显示出双峰质量分布，其具有在约4,000gmol-1处的一个最大值和在600,000g·mol-1处的一个最大值(针对PS标准给出)。具有极端之间的质量的聚合物级分仅以小量存在。相应的分散体具有pH<3，这略微低于计算的值。其余的样品对应于具有更高pH值的分散体，其显著低于计算的数值(计算的为11.9-12.6，对应于pH图表中的“平台期”)。在这些条件下形成的聚合物显示出单峰质量分布，其具有约10,000g·mol-1的最大值。
这些结果与Behan等{Behan，2001 #8}的那些相似，Behan等获得了使用葡聚糖作为空间稳定剂，通过常规乳状液聚合作用制备的颗粒。只要聚合作用是在初始为酸性的介质(pH2-3)中进行的，则获得具有相对低分子量的聚合物，而一旦聚合介质具有较高的初始pH(pH5)，则另外出现长链。尽管由Behan等{Behan，2001 #8}，{Behan，2000 #31}获得的数值低于这篇论文中出现的数值，但是一般趋势是相同的。
图5：获得的聚合物随着起始物(NaOH-溶液)体积(各部分右侧给出的数字)的变化，7天后冷冻颗粒。
必须强调，制备后7天时进行了冷冻分散体。这是非常重要的，因为能够显示对于一种pH(最初7)，最初质量分布在制备后的这些天内改变(见图2)。因此，制备了大量分散体。颗粒尺寸是125nm。
冷冻干燥的细乳液显示出在GPC elugram中的峰值为约33.3ml，对应于约1,400g·mol-1的质量(针对PS标准计算的)。这意味着在细乳液(可能由Cl-起始的)或在冷冻的细乳液中，已经起始了聚合作用，因为没有加入NaOH溶液。一旦将细乳液加入到NaOH溶液中后，立即形成具有约10,000g·mol-1的Mw最大值(洗脱体积约29ml)的聚合物。在48小时过程中，没有见到摩尔质量分布的变化。该时间后，开始形成高和低分子量的聚合物。形成的低聚物是正在进行解聚过程的标志。这些低聚物消失，而长链聚合物的量增加直到大约1周后达到最终分布。低分子量级分的最大值变为7,500g·mol-1的值(洗脱体积约30ml)。
这些观察是一致的，且能够由Ryan提出的pH依赖性解聚/重聚作用/重新起始机制解释，如图6中所示{Ryan，1996 #37}。
图6：假定的解聚/重聚作用机制{Ryan，1996 #32}。
胺起始物
由亲核试剂起始ACA的阴离子聚合。甚至“弱”亲核试剂如醋酸离子拥有起始ACA聚合的能力{Pepper，1992 #33}，{Johnston，1981 #34；Johnston，1981 #35；Johnston，1981 #36}。如上简单提及地，生长的聚合物通过起始物分子官能化。如果由所述官能化的聚合物形成纳米颗粒，且能够确保官能团(由于其亲水性)将会在颗粒的表面上，则该方法代表了制备具有官能化表面的PACA(纳米)颗粒的适宜方法。
纳米颗粒的表面修整巨大地增强它们对于生物医学应用的潜力。表面上存在官能团对利用生物活性配体如蛋白质或核苷酸的进一步化学修饰是必需的。除对于进一步化学反应的潜力外，引入带电基团如氨基或羧酸基团，影响颗粒表面的电荷。作为结果，这能够影响颗粒在分散体中的稳定性{Chem，2001 #37}和在细胞中的吸收行为{Lorenz，2006 #38}，{Holzapfel，2005 #39}。
随着应用极性亲水胺，生成的低聚物和聚合物应该具有表面活性剂样两亲性结构，其具有源自起始胺的亲水性头部，和疏水性尾部一(生长的)聚合物。由于该结构，聚合物亲水官能化末端能够存在于单体和水之间界面的水性一侧是非常可能的。
双官能胺容许进一步向颗粒表面引入官能团。由于生物医学应用的范围和蛋白质与颗粒的潜在缀合，氨基酸是作为起始物的合适候选者{Kulkami，1971 #27；Leonard，1966 #28}，因为它们结合“强”亲核试剂(-NH2)和“弱”亲核部分(-COOH)，其中所述“强”亲核试剂应该是分子的起始部分，所述“弱”亲核部分至少在其质子化形式中不可能起始聚合并因此可用于随后的化学反应。
如上所示，起始物OH-的量对聚合物摩尔质量是至关重要的，而颗粒尺寸处于关于所有应用的pH值的小范围内。在这个部分中将讨论不同量的胺起始物对这些参数的影响。
氨和Tris-碱
已经选择了氨和tris-碱(tris-(羟乙基)-氨基乙烷)作为模型胺。在不调节它们pH值(pH>9)的条件下，各制备了浓度为0.1mol·l-1的溶液。这意味着除溶液中的胺外，还存在OH-。因此，对于起始聚合作用，会存在胺和氢氧根离子之间的竞争。表3中总结了颗粒尺寸和PDI。选择了与使用OH-的实验中相同体积的起始物溶液。一些利用氨(600μl-1000μl)制备的样品在制备后显示出略微的黄色。这是由Leonard观察到的{Leonard，1966 #44}，并且已经将其解释为丁酯基团水解后的反应产物。
与利用NaOH-溶液制备的颗粒尺寸或多或少地不受起始物浓度的影响相反，能够观察到对胺起始物浓度的清楚的依赖性。利用两种胺溶液获得的聚合物颗粒的尺寸服从相同的模式；利用氨制备的颗粒小于利用tris-碱溶液制备的颗粒。各100μl样品表现出显著高于其余样品的颗粒尺寸。在急剧地减小后，在约400μl起始物溶液时数值达到最小值，并再增大。
利用100μl起始物体积和对于tris-碱还可以是200μl获得的同等大的颗粒能够如同关于OH-那样被解释，具有更长的颗粒固化时间。
由胺制备的颗粒的直径显著小于由NaOH-溶液制备的颗粒的直径。颗粒范围分别为60-100nm和100-140nm，而不是约200nm的值。这可能是由于聚合物的表面活性剂样结构引起的另外稳定性的结果。
表3：用氨和tris-碱溶液起始的分散体颗粒尺寸(聚合后测量的)。
Figure A200780025126D00301
氨-起始的聚合物的摩尔质量分布(见图7)区别于由OH--起始的聚合物获得数值。主要区别是在所有样品中出现高摩尔质量聚合物。其量在由100μl到306.8μl起始物溶液中增加。该分布很广，且在全部样品之间仅显示出微小变化。低摩尔质量级分(最大值为32ml洗脱体积，Mw～3,500g·mol-1)由100μl到382.4μl不断减少，其洗脱体积最大值改变为29ml(Mw～10,000g·mol-1)。随着应用更多起始物溶液，低分子量级分的量再增加，并在大约31ml处显示出其最大值(Mw～5,000g·mol-1)。
利用tris-碱溶液(见图8)起始的聚合物摩尔质量分布类似于OH--起始的聚合物样品以及氨-起始的聚合物样品的模式。仅在中等量的起始物时发现大量长链聚合物，这显示出具有这样的数值的广分布，所述数值低于在其他设置中获得的那些。在大约31ml发现低摩尔质量级分的最大值(Mw～5,000g·mol-1)。该组分的相对量从100μl到443.3μl不断降低，然后在1000μl起始物溶液时再增加达到最大值。
图7：洗脱体积随着起始物(氨水溶液)体积(各部分右侧给出的)的变化。制备后2天冷冻样品。
图8：洗脱体积随着起始物(tris碱溶液)体积(各部分右侧给出的)的变化。制备后2天冷冻样品。
氨基酸
对于利用氨基酸官能化聚合物，必须假设氨基酸是唯一的或至少主要的起始分子。因此氨基酸溶液的pH必须低，从而最小化氢氧根离子对聚合作用的起始。在另一方面，这将氨基基团质子化到一定程度，由其pKB决定，从而降低“活性”起始物，即具有去质子化的氨基基团的氨基酸分子的量。
利用酸性溶液中的苯丙氨酸、酸性以及碱性溶液中的甘氨酸和6-氨基己酸可以建立稳定的分散体。具有低于7的pH值的赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸溶液总是引起细乳液的凝结和沉淀。在碱性溶液中，没有形成凝结，但能够观察到透明黄色或橙色溶液的形成。溶解和显色是丁酯基团水解和水溶性聚氰基丙烯酸形成的明显标志。根据Leonard{Leonard，1966 #28}，该显色也是PACA降解的标志。
表5：利用0.5mol·l-1 6Ahex溶液，0.1、0.5、和2.0mol·l-1甘氨酸溶液起始的分散体组(第一个数值：z-平均直径，第二个数值：PDI)
Figure A200780025126D00321
可在表5中获得和在图9中显现的数据显示，颗粒尺寸包括大于350nm-低至70nm的数值的范围。几乎全部分散体显示出非常窄的分布，这由小于0.1或甚至更低的PDI表示。
与利用NaOH-溶液作为起始物并根据利用氨和tris-碱制备的颗粒结果的实验相反，能够观察到颗粒尺寸对“活性”起始物的量的明确的依赖性。起始物溶液的较高浓度、较高pH和较大量在几乎全部系列中导致较小的颗粒。
关于利用6-氨基己酸溶液制备的颗粒的尺寸，对起始物pH和一定程度上对起始物的量的依赖性是明显的(见图9左图)。颗粒尺寸随着起始物溶液pH增高而增高，其在pH4.4-5.4之间具有大影响，且在5.4-10.0之间影响较小。利用碱性(pH10)6-氨基己酸溶液制备的颗粒的尺寸显示出与利用tris-碱和氨溶液制备颗粒的数值一样的较小变化。在颗粒尺寸从100μl到200μl起始物溶液过程中降低后，曲线显示出稍微的增高，其在1000μl起始物溶液时具有最高值。从起始物溶液的最初到其后体积，利用其他6-氨基己酸溶液制备的颗粒也显示尺寸的降低。随后的数值保持几乎恒定。
利用甘氨酸溶液制备的颗粒的数值在大多数情形中符合以上提及的模式(见图9右图)。利用2mol·l-1甘氨酸溶液制备的颗粒看来最小，而利用0.1mol·l-1溶液制备的颗粒看来显示出最大尺寸值。在一种浓度中，颗粒尺寸随着从最低向最高应用的pH而减小，例外是0.5mol·l-1溶液。从100μl到1000μl起始物溶液能够观察到相同的倾向。曲线斜率随着增高甘氨酸溶液的pH和浓度，而变得具有更小的陡度。
图9：用0.5mol·l-16-氨基己酸起始(左图)和用甘氨酸溶液(右图)起始的颗粒尺寸变化(虚线是为了指导视觉)。右图图例中的数字表示溶液的摩尔浓度(破折号前)和pH(破折号后)。
认为由氨基酸和单体反应获得的低聚物是水溶性的，其原因在于氨基酸的高亲水性。因此，聚合不局限于一个小滴，并且所述小滴经历奥斯特瓦尔德熟化，而只要没有开始固化或PBCA链的疏水性占优势，且分子不再溶于水相中。利用小量起始聚合物链，固化作用会比存在较多生长链花费更长的时间。在该时间过程中，颗粒能够增大它们的尺寸。尽管该作用，但是对所有样品能够观察到窄颗粒尺寸分布。由表面活性剂样低聚物形成微团的可能事件可以甚至使颗粒形成过程复杂化。
如果聚合时间非常长，则小滴能够超过临界尺寸，这导致颗粒的凝结和随后聚合沉淀。因此，利用处于pH4.4的100μl 6-氨基己酸溶液和处于pH2.4的浓度0.5和2.0mol·l-1的甘氨酸溶液不能获得稳定的分散体。
尽管这种颗粒尺寸的变化，所有聚合物样品显示出几乎相同的分子质量(针对PS计算的最大值大约4,000g·mol-1)和质量分布，其很窄并且是单峰的。摩尔质量4,000g·mol-1时，聚合度是约P～26。这意味着单体和起始物之间的比接近1:25(见下1H NMR)。关于均匀的elugrams，这对全部样品一定都属实。与利用碱性起始物溶液(NaOH、NH3和tris-碱)制备的颗粒相反，随着起始物体积的变化，在样品之间不能观察到质量分布的显著变化。这暗示至少在测试的范围内起始物pH、浓度和体积的独立性。甚至在两种用于制备的氨基酸之间仅存在微小偏差。
图10：6-氨基己酸起始的样品的GPC洗脱体积：a)pH4.4b)pH5.5c)pH10。
图11：甘氨酸起始的样品的GPC洗脱体积：a)Gly 0.1 pH3.4；b)Gly 0.5，pH3.4；c)Gly 2.0，pH3.4。
如图12中所示，对于利用氨基酸制备的样品，ζ-电势的pH-依赖性是明确可见的。用氨基酸制备的颗粒的ζ-电势在酸性介质(pH3)中比在碱性介质(pH10)中高～10mV。用NaOH-溶液制备的颗粒也显示出具有微小pH-依赖性的ζ-电势。这并不意外，因为在碱性介质中，可能发生丁酯基团的水解。与用氨基酸溶液制备的颗粒相比，该作用不如其明显。
ζ-电势增高～50mV是由于去除了吸附在颗粒上的SDS(通过透析)。更彻底的透析导致进一步去除吸附的SDS，所述SDS使分散体不稳定，且导致沉淀的形成。对利用氨基酸溶液制备的样品，不能观察到该作用。相反，透析后发生ζ-电势稍微的降低。由于在透析过程中稀释分散体，所以分散体的pH升高且作为结果产生的酯基团水解能够在颗粒上形成另外的负电荷。
一旦颗粒表面上存在羧基，则ζ-电势的pH-依赖性应该是引人注目的。在碱性介质中，酸基团是去质子化的，由此在颗粒上留下负电荷，在酸性介质中，该负电荷不再存在，因为酸基团是质子化的。因此，在将稀释的分散体的pH分别调节到数值3和10之后，进行了ζ-电势测量。仍然存在氨基酸仅吸附到颗粒表面上的可能性。为了排除这种可能性，透析分散体，从而去除吸附的分子和一定程度的SDS。
图12：透析前和后在pH3和10时的ζ-电势。
图13和14显示从利用NaOH-溶液(0.1mol·l-1)和利用6-氨基己酸-溶液(pH4.4，0.5mol·l-1)起始的分散体获得的聚合物的1H-NMR光谱。能够鉴别图13中光谱的峰，并将其分配给该聚合物和十六烷。图14中出现的光谱显示两个另外的峰，其可能源自6-氨基己酸质子。由于6-氨基己酸在CDCl3中溶解性差，所以为了由NMR检测，酸必须共价结合于聚合物。峰的整数比a：3，其代表氨基酸与单体的比，是约1:22，这与由GPC值获得的1:25非常良好的一致。
图13：NaOH-溶液(0.1mol·l-1，计算的pH7)起始的聚合物的1H-NMR-光谱。
图14：6-氨基己酸-溶液(pH4.4，0.5mol·l-1)起始的聚合物的1H-NMR-光谱。
关于氨基酸附着于聚合物的直接证据提供了苯丙氨酸作为起始物的应用。由于pBCA显示出无UV活性，所以它仅能由GPC设置的RI-检测器，而不能由UV-检测器检测。UV-活性起始物苯丙氨酸的引入标记聚合物链，因此它能够由UV-检测器观察到。由于这两种检测器的信号对于苯丙氨酸起始的聚合物几乎相同，且能够假设UV信号源自苯丙氨酸，所以氨基酸必须与该聚合物共价结合。
不幸地，不可能直接通过电子显微镜观察到颗粒。颗粒在干燥过程中倾向于形成膜，这使得不可能制备TEM-样品。甚至在冷冻干燥过程中，膜形成过程也发生。代替获得细粉末，因为利用NaOH-溶液制备分散体是可能的，所以灰白色的胶状物质是试图冷冻-干燥利用氨基酸溶液制备的分散体的结果。
由官能化的聚合物或剩余单体{Behan，2001 #8}引起的低分子量、水的强吸收可能是该作用的原因。
结论
能够显示细乳液方法提供了非常有效和方便的用于生产具有官能化表面的pBCA纳米颗粒的工具。阴离子表面活性剂SDS的应用容许制备长期稳定的分散体，其具有10％或更高的固体含量，并导致“真正的”pBCA颗粒，其表面上无共价结合的葡聚糖或其他空间稳定剂。该两步工艺扩大聚合作用的pH，并因此容许获得同等高分子量的pBCA。获得的颗粒尺寸很大程度上不受到pH的影响，且能够存在于150-200nm之间。
利用胺溶液的起始提供向颗粒表面引入官能团的简单方法。氨基酸溶液作为起始物的应用产生使颗粒功能化和将颗粒尺寸调整到80-350nm范围内的可能性。通过ζ-电势测量和通过NMR证实了氨基酸的存在。初步实验显示使用该技术，荧光染料、维生素以及无机纳米颗粒的包封作用是可行的。
在不同浓度和pH值下利用L-亮氨酸起始聚合作用的两步细乳液工艺
制备两种单独的溶液。
溶液1：将4.8ml的0.1M H3PO4加入到烧瓶中(PP)。再向该溶液中加入120mg十二烷基硫酸钠(SDS)。搅拌由此生成的溶液直到SDS完全溶解。
溶液2：将49.76mg十六烷和1.05mL正丁基-α-氰基丙烯酸酯(BCA，Indermil)加入到烧瓶中。转动该烧瓶直到形成均匀的溶液。
将溶液2加入到溶液1中，并且通过超声波处理(振幅70％，0℃)由此生成的混悬液4分钟，立即形成细乳液。由L-亮氨酸起始聚合作用：
然后，制备了10种不同体积(100μl-1000μl)、3种不同pH-值(4，5，6)和3种不同摩尔浓度(0.125，0.05，0.1mol/l)的不同L-亮氨酸溶液(见表)。将500μl以上制备的BCA细乳液加入到这些溶液的每一种中。对由此生成的混合物进行短时间的搅动，并容许其在室温下静置30分钟。其后，确定了由此产生的纳米颗粒的颗粒尺寸、多分散指数(PDI)和ζ电势，如表6和图15-20中所记录的。
Figure A200780025126D00371
在不同浓度和pH值下利用L-亮氨酸起始由Lutrol和SDS稳定的纳米颗粒的聚合作用的两步细乳液工艺
制备两种单独的溶液。
溶液1：将9.0ml的0.1M H3PO4加入到烧瓶中(PP)。再向该溶液中加入0.045g十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1128g Lutrol F68。搅拌由此生成的溶液直到SDS和Lutrol完全溶解。
溶液2：将0.1353g大豆油和2.05mL(2.255g)正丁基-α-氰基丙烯酸酯(BCA，Indermil)加入到烧瓶中。转动该烧瓶直到形成均匀的溶液。
将溶液2加入到溶液1中，并且通过超声波处理(振幅70％，0℃)由此生成的混悬液4分钟，立即形成细乳液。由L-亮氨酸起始聚合作用：
利用9ml 0.05mol/l，pH值4和5的L-亮氨酸溶液起始了标准程序，见图21。然后制备了10种不同体积(100μl-1000μl)、不同pH-值(4，5，6)和不同摩尔浓度(0.125，0.05，0.1mol/l)的不同L-亮氨酸溶液(见表7)。将500μl以上制备的BCA细乳液加入到这些溶液的每一种中。对由此生成的混合物进行短时间的搅动，并容许其在室温下静置30分钟。其后，确定了由此产生的纳米颗粒的颗粒尺寸、多分散指数(PDI)和ζ电势，如表7和图22-27中所记录的。
Figure A200780025126D00391
表7
文献：
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38.Lorenz，M.R.；Holzapfel，V.；Musyanovych，A.；Nothelfer，K.；Walther，P；Frank，H.；Landfester，K.；Schrezenmeier，H.；
Figure A200780025126D0042142926QIETU
，V.生物材料(Biomaterials)2006，27，2820-2828.
39.Holzapfel，V.；Musyanovych，A.；Landfester，K.；Lorenz，M.R.；
Figure A200780025126D0042142926QIETU
，V.高分子化学和物理学(Macromol.Chem.Phys)2005，206，2440-2449.

Claims (15)

1.制备聚烷基氰基丙烯酸酯(PACA)纳米颗粒的方法，所述方法包括下列步骤：
a)制备O/W细乳液，其包括O和W型液相、稳定剂、和可聚合ACA单体，
b)通过阴离子聚合作用使所述单体聚合，并分离所产生的纳米颗粒，
其特征在于
步骤b)中的聚合作用是由一种或多种伯胺或仲胺引发的。
2.权利要求1的方法，其中所述伯胺或仲胺选自由氨、tris-碱或氨基酸组成的组。
3.权利要求2的方法，其中所述氨基酸选自苯丙氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、色氨酸、5-羟色氨酸或6-氨基己酸。
4.权利要求1-3的方法，其中在所述W和/或在所述O相中含有一种或多种药物试剂，所述药物试剂优选地选自治疗剂和诊断剂。
5.权利要求4的方法，其中所述治疗剂选自在没有递送赋形剂或载体的条件下不能或不能充分地穿过生理屏障的物质。
6.权利要求5的方法，其中所述生理屏障选自由下列各项组成的组：血-脑屏障(bbb)、血-气屏障，血-脑脊髓液屏障和口腔粘膜。
7.以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述O相包括亲脂性溶剂，优选地包括正己烷、十六烷、液体石蜡、维生素E、miglyol或甘油三酯的脂肪酸酯，和可聚合ACA单体。
8.以上权利要求中一项或多项的方法，其中由所述单体获得的聚合材料是可生物降解的，且包括形成固体或膜的聚合物，其选自由聚烷基氰基丙烯酸酯组成的组。
9.权利要求8的方法，其中所述聚烷基氰基丙烯酸酯是聚丁基氰基丙烯酸酯及其衍生物、共聚物和混合物。
10.以上权利要求中一项或多项的方法，其中所述稳定剂包括一种或多种下列物质：
甘油、山梨醇和其他单-或多官能醇的脂肪酸酯，优选苯甲醇，甘油单硬脂酸酯，失水山梨糖醇单月桂酸酯，或失水山梨糖醇单油酸酯；磷脂，磷酸酯，多糖，苯甲酸苄酯，聚乙二醇(PEG200，300，400，500，600)，聚乙二醇羟基硬脂酸酯，优选Solutol HS 15；泊洛沙胺(poloxamines)，优选泊洛沙胺904，908，或1508；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯；乙氧基化甘油三酯；乙氧基化酚和乙氧基化二酚；Genapol TM和Bauki系列的表面活性剂；聚氧乙烯蓖麻油，优选Cremophor ELP；磷脂酰胆碱，脂肪酸的金属盐，脂肪醇硫酸酯的金属盐；和磺基琥珀酸酯(sulfosuccinates)的金属盐；优选聚山梨酸酯，更优选聚山梨酸酯20、60和最优选聚山梨酸酯80；优选泊洛沙姆，更优选泊洛沙姆188，338或407；优选聚乙二醇，更优选异构醇醚(Lutensol)50或80；阴离子表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠；以及两种或更多种所述物质的混合物。
11.以上权利要求中一项或多项的方法，其中分子附着于所述纳米颗粒外表面，所述分子被主动转运穿过血-脑屏障，或者其中抗体附着于所述外表面，所述抗体针对关于被主动转运穿过血-脑屏障的分子的脑内皮细胞受体是特异性的。
12.权利要求11的方法，其中所述分子选自色氨酸、5-羟色氨酸、运铁蛋白、胰岛素、褪黑激素、5-羟色胺、或胰岛素-样生长因子I和II。
13.能由权利要求1-12中一项或多项的方法获得的纳米颗粒。
14.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求13的纳米颗粒和药用载体/或稀释剂。
15.权利要求13的纳米颗粒或权利要求14的药物组合物用于制备治疗疾病和病症的药物的应用，所述治疗要求药物试剂穿过一个或多个生理屏障，优选地穿过血-脑屏障。
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