CN101477046B - 基于表面等离子体共振传感的细胞分层检测方法及系统 - Google Patents

Abstract

基于表面等离子体共振传感的细胞分层检测方法及系统，属于细胞生物学检测技术领域。本发明利用两种或更多不同波长的光同时激发固定有细胞的传感芯片上的表面等离子体共振，获得在同一生物反应过程的两个或多个表面等离子体共振信号，并提出一种数据解析方法，实时解析信号，有效获取细胞近膜区域的分子之间相互作用的信息，提供给分子生物学家、细胞生物学家以及药学家解析，阐明有关生命机理和发现新药。

Description

基于表面等离子体共振传感的细胞分层检测方法及系统

技术领域

本发明涉及一种双波长或多波长表面等离子体共振传感的细胞分层检测方法及其系统，属于细胞生物学检测技术领域。

背景技术

人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来，为药物发现与开发提供了丰富的信息库和先进的技术，可以在分子层次上开展研究，包括基因组学和蛋白质组学。用高通量扫描方法进行分子水平的药物筛选，可以获得亲合力、特异性以及动力学参数等特征数据，发现新药。生物体是复杂的系统，疾病的发生是由于外界对生物体作用的结果，最早在分子水平表现出来。细胞是生物体的基本生命单元，生物分子处在细胞中，受到细胞内部环境的影响和制约。当细胞中的有关分子发生变化时，往往通过网络发生作用，不仅影响其它生物分子，而且还会引起该细胞对周围的其它细胞的影响，直至影响到组织与个体。因此，只从分子水平进行体外研究是不完全和不充分的，要真正理解药物的作用位点及其机制，除在分子水平进行外，还必须在更高层次开展研究，包括细胞和组织，甚至是个体。在一定条件下，细胞水平的研究能基本反映生物体的真实情况，有助于阐明疾病发生和发展的机制，也有利于药物作用点的确定和药靶的筛选。基于细胞的生物传感，不仅便于营造类似其所处的生物体内的环境，检测时可获取更可信的信息，而且有利于实时观察和分析分子水平的变化与细胞状态的关系。不仅如此，还可以监测细胞受病原体和污染物作用的状况，以及细胞受到其它生物分子或药物刺激后的生理变化。这些变化，或者可以通过荧光、发光或色度上差异来显示，或者由阻抗或电位来显现，还可以以其它物理或化学的特征来表现。可见，在分子和细胞结合的层面进行研究，寻找新的检测方法，开发新的检测仪器，检测细胞的分子特征以及发生在其中的生物分子相互作用，获得细胞的特异表型差异，即获得细胞分子表型信息，对于肿瘤细胞的诊断以及药物的筛选都具有重要科学意义。

目前，在细胞层次研究生物分子相互作用，主要是采用荧光蛋白标记，通过显微镜能实时观察到有关变化。这种方法直观，可是无法量化，尤其是无法获得特异性、亲和力以及动力学常数，这些参数对药物研究却是至关重要的，因而难以满足要求。表面等离子体共振(surface plasmon resonance，简称SPR)传感是一种高灵敏度的光学检测方法，可以对分子间的相互作用进行无标记的实时检测，已广泛应用于DNA-DNA，DNA-蛋白质，蛋白质-蛋白质等之间的相互作用。近来，已有研究人员尝试将SPR应用于细胞及细胞层次的分子相互作用研究。有的是研究细胞外表面与传感表面的接触情况，从而分析细胞的迁移，显然这仅仅涉及细胞行为。有的采用红外光来激发SPR，增大了探测深度，可以检测到细胞内一定深度的变化，然而红外光的波长一定，对应的探测到的细胞深度也是一定的，且检测到的是这一深度内的综合效应，即平均效应，无法实现如同CT断层扫描那样分层检测。很明显，这些方法都不能满足在细胞层次上进行生物分子相互作用研究的要求，迫切需要发明一种新的方法。

发明内容

针对这一问题，本发明提出了一种基于表面等离子体共振传感的细胞分层检测的系统和检测方法，利用两种或更多不同波长的光同时激发固定有细胞的传感芯片上的表面等离子体共振，获得在同一生物反应过程的两个或多个表面等离子体共振信号，并提出一种数据解析方法，实时解析信号，得到细胞近膜区域分子间相互作用的信息以及细胞其他层面内的信息，提供给细胞生物学研究。需要强调的是，细胞膜及膜上蛋白的相互作用机制在细胞的生命和功能上占有很重要的地位，这种方法尤其适合对这些细胞近膜区域内的反应进行检测。

本发明的技术方案如下：

本发明提出了一种基于表面等离子体共振传感的细胞分层检测系统，其特征在于：该系统由混合光源、入射臂、生物传感单元、反射臂和计算机组成，所述的混合光源包括至少两种不同波长的稳频激光器和光开关，所述的入射臂包括起偏器、准直器、扫描反射镜和第一成像透镜，所述的生物传感单元由柱面或球面棱镜、折射率匹配层、细胞芯片及样本池构成，所述的细胞芯片由玻璃基片、金膜、以及用作探针的细胞构成，所述的反射臂包括第二成像透镜和光电接收器，不同激光器发出的光分别经耦合器耦合后进入光纤中，通过由计算机控制的光开关选通，某一时刻只有一种波长的光出射，出射光依次经过起偏器和准直器，照射到由计算机控制的绕中心轴摆动的扫描反射镜上，再透过第一成像透镜、柱面或球面棱镜和折射率匹配层，射到细胞芯片的玻璃基底与金膜的界面上。光由此反射，经过第二成像透镜，射在光电接收器上，进行光电转换，并输入计算机处理。

本发明所述的细胞芯片的玻璃基片材料与所述的柱面或球面棱镜材料一致，均为BK7光学玻璃，所述的折射率匹配层的折射率与BK7光学玻璃的折射率一致。

本发明所述的的光电接收器的光谱响应范围为500～1800nm。

本发明提出的基于表面等离子体共振传感的细胞分层检测方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

1)采用至少两种不同波长的稳频激光器组成混合光源，使不同光源发出的光束分别耦合到各自对应的光纤中，然后分别与光开关的输入端连接，由计算机控制光开关的选通，使某一时刻只有某一波长的光通过；

2)混合光源发出的光束经过准直器和起偏器，成为一束线偏振的平行光，调整起偏器，使所述的平行光成为p光；

3)使所述的p光入射到扫描反射镜的旋转中心上；

4)所述的扫描反射镜在计算机的控制下，以10～1000Hz的频率绕中心轴摆动，摆动的角度范围为±16°；

5)所述的入射到扫描反射镜上的p光从镜面上反射，透过成像透镜后射到柱面或球面棱镜的表面，并保证不同角度的入射光均能会聚在柱面棱镜的中心线上；

6)所述的细胞芯片置于柱面棱镜或球面的平面上，中间放置一层折射率匹配层，所述的柱面或球面棱镜的中心线正好位于细胞芯片的玻璃基片与金膜之间的界面上；

7)所述的不同角度的入射光发生反射，经过第二成像透镜，投射在光电接收器件上，由所述的光电接受器将接收到的光强信号转换成电信号，并经A/D转换后输入计算机；

8)所述的不同波长的光在不同的角度下，在细胞芯片的金膜和细胞的界面上激发表面等离子体共振，反射光的光强最小的点的位置各不同，并且同一波长的光在细胞芯片表面分子相互作用过程中的光强最小的点的位置每时每刻也不同；

9)实时记录所述的反射光的光强最小的点的位置变化，同时得到至少两个不同的表面等离子体共振信号Δθ_j，其中j＝1，2，…m.，用来表征同一生物反应过程；

10)获得的至少两个表面等离子体共振信号，利用数据解析方法进行解析，从中获得到细胞的不同层次内的折射率变化Δn_i，其中i＝1，2，…m.，实现细胞的分层检测。

本发明所述的数据解析方法基于以下数值模型：

Δθ₁＝S_1-1Δn₁+S_2-1Δn₂+…+S_m-1Δn_m

Δθ₂＝S_1-2Δn₁+S_2-2Δn₂+…+S_m-2Δn_m

Δθ_m＝S_1-mΔn₁+S_2-mΔn₂+…+S_m-mΔn_m

所述的模型中，Δθ_j(j＝1，2，…m.)为测得的不同波长的SPR信号值；Δn_i(i＝1，2，…m.)为不同层区域的折射率变化量；S_i-j(i，j＝1，2，…m.)为不同波长在不同区域中的灵敏度，通过实验标定得到。

利用本发明所述的系统和检测方法，可以对细胞不同层区域内的生命过程进行检测，有效获取细胞近膜区域的分子之间相互作用的信息，提供给分子生物学家、细胞生物学家以及药学家解析，阐明有关生命机理和发现新药。

附图说明

图1为本发明所述的双波长SPR传感系统示意图。

图2为本发明所述的多波长SPR系统中的混合光源示意图。

图3为本发明所述的细胞芯片结构示意图。

图4为本发明所述的表征同一生物反应过程的两种SPR信号示意图。

图5为本发明所述的双波长SPR系统可检测的细胞两层区域示意图。

图6为本发明所述的双波长SPR系统数据解析流程图。

图7为本发明所述的多波长SPR系统可检测的细胞多层区域示意图。

1-1-第一稳频激光器；1-2-第二稳频激光器；1-m-第m稳频激光器；2-1-第一耦合器；2-2-第二耦合器；2-m-第m耦合器；3-光开关；4-输出光纤；5-起偏器；6-准直器；7-扫描反射镜；8-第一成像透镜；9-柱面棱镜；10-折射率匹配层；11-细胞芯片；12-样本池；13-第二成像透镜；14-光电接收器；15-计算机；16-玻璃基片；17-金膜；18-细胞样本；18-a-细胞近膜区域；18-b-细胞内部区域；18-1-细胞区域一；18-2-细胞区域二；18-m-细胞区域m。

具体实施方式

下面根据附图，对本发明所述的基于表面等离子体共振传感的细胞分层检测方法及其系统进行详细的说明。

先以双波长SPR传感系统为例。本发明所述的双波长SPR传感系统，由混合光源系统、入射臂、生物传感单元、反射臂及计算机等几部分组成，如图1所示。

混合光源系统由两种不同波长的稳频激光光源1-1、1-2，光纤耦合器2-1、2-2，光开关3及传导光纤4组成。各个光源发出的光分别经过耦合器耦合后进入光纤，2根光纤再通过接头与光开关3的输入端连接，光纤4与光开关3的输出端相连。光开关3由计算机15控制选通，保证某一时刻只有一种波长的光通过。

所述的入射臂由起偏器5、准直器6、扫描反射镜7以及第一成像透镜8构成。混合光源系统发出的光经过起偏器5后成为p方向偏振的线偏振光，再通过准直器6成为平行光，射在扫描反射镜7的旋转中心上；扫描反射镜7在计算机15的控制下以10～1000Hz的频率绕中心轴摆动，摆动的角度范围为±16°，将所述的p光反射，经过第一成像透镜8照射到生物传感单元表面，激发SPR。

生物传感单元自下而上，分别由柱面或球面棱镜9，折射率匹配层10，细胞芯片11以及样本池12构成。扫描反射镜7中心与柱面或球面棱镜9的中心线关于第一成像透镜共轭，当扫描反射镜在一定角度范围内摆动时，不同角度的入射光均可照射在细胞芯片11的同一位置上。细胞芯片11自下而上，分别由玻璃基片16、金膜17及细胞样本18构成，不同角度的入射光的焦点刚好位于细胞芯片的玻璃基片与金膜之间的界面上，也即柱面或球面棱镜9的中心线上，如图3所示，其中玻璃基片16的材料与柱面或球面棱镜9的材料一致，均为BK7光学玻璃，其折射率与折射率匹配层10的折射率一致。SPR现象发生在金膜17与细胞样本层18的界面。某种蛋白质或药物溶液注入样本池12中，当其与细胞发生相互作用时，引起细胞芯片11上的折射率发生变化；不同波长的光，在不同的入射角下激发SPR现象，使反射光的光强几乎接近0，即产生光强最小点；相互作用不断发生，折射率随之不断变化，每种波长的共振角(产生光强最小点的入射角位置)也对应改变。

所述的反射臂由第二成像透镜13和光电接收器14构成。每种波长探测一定深度内折射率的变化所引起的反射光强变化，经由第二成像透镜13，被光电接收器14接收，将光强信号转换成电信号，并经过A/D转换后输入计算机15处理。光电接收器14具有500～1800nm的光谱响应范围，可实时接收每种波长的反射光的强度。

不同波长的光，对应激发表面等离子体共振的入射角不同，即分别在不同的入射角下可检测到反射光强最暗点，即SPR共振峰。扫描反射镜7摆动一个周期，每种波长即可得到表征生物反应过程中某一时刻的一个SPR共振峰。生物反应不断进行，传感层(SPR探测深度内的细胞样本层)内的折射率不断改变，共振角的位置也会发生Δθ的移动，即所述的SPR信号。不同波长对应不同的SPR信号。

计算机15控制光开关3，在扫描反射镜7摆动到某个角度时切换一次光源波长，则可分别得到两种波长的SPR信号。所述的光开关3的转换频率和扫描反射镜7的扫描频率较快，尽管得到的两种波长的SPR信号之间有时间差，扫描反射镜7摆动一个周期也需时间，但是生物反应速度较慢，所以此时间差可忽略不计。因此，可以认为在生物反应的任一时刻，都可同时得到两种SPR信号Δθ_I和Δθ_II，如图4所示。

利用这2种SPR信号，可以实现两层区域的细胞信号提取，如图5所示，分别为细胞近膜区域18-a和细胞内部区域18-b。细胞的重要生命活动很大部分都发生在细胞膜附近。在细胞近膜区域18-a发生蛋白质相互作用等生物过程时，引起该区域的折射率变化为Δn_m。由于细胞本身的复杂性，细胞内部的物质运动也会引起细胞内部区域18-b的折射率变化Δn_c。这两部分变化都会包含在每一种波长所测得的SPR信号中。将获得的两种SPR信号Δθ_I与Δθ_II用数据解析方法进行解析，即可得到两部分区域的折射率变化Δn_m和Δn_c，实现两部分信息的区分和提取。

数据解析方法基于数据解析模型，最佳近似模型的选择流程图如图6所示。

首先选择如下的线性近似模型：

Δθ_I＝S_m-IΔn_m+S_c-IΔn_c

Δθ_II＝S_m-IIΔn_m+S_c-IIΔn_c

其中S_m-I、S_c-I、S_m-II和S_c-II分别为两种不同波长的光在细胞近膜区域18-a和细胞内部区域18-b的灵敏度，这4个灵敏度均可以通过标定实验获得。

标定4个线性灵敏度后，用确定折射率变化量的反应过程进行验证实验，得到两种SPR信号，将两层的折射率变化量和4个灵敏度代入到该线性模型中，并将结果与这两种SPR信号进行对比，如果误差较小，则证明该线性模型可用来对实际情况进行近似，选择该线性模型进行数据解析。如果存在较大误差时，则对该模型进行修订，增加相关项，采用以下非线性近似模型：

Δθ_I＝S_m-IΔn_m+S_c-IΔn_c+S′_IΔn_mΔn_c

Δθ_II＝S_m-IIΔn_m+S_c-IIΔn_c+S′_IIΔn_mΔn_c

相关项S′_IΔn_mΔn_c或S′_IIΔn_mΔn_c中的2个相关灵敏度S′_I、S′_II的数值，可以通过进一步标定实验获得。

确定最佳近似模型后，将两种SPR信号代入，即可求得两部分区域的折射率变化量，实现细胞的分层检测，为细胞生物学的研究提供信息。

本发明所述的多波长SPR传感系统，可在双波长SPR传感系统上进行扩展，换用耦合有更多种波长的光的混合光源，以及相应响应范围的光电接收器件，并对计算机中相应的控制程序进行修改即可。适合多波长SPR传感系统的混合光源如图2所示，多个具有不同中心波长的激光器1-1，1-2，……1-m发出的光，分别通过耦合器2-1，2-2，……2-m进入光纤中，并分别与多选一光开关3的输入端连接，经输出光纤4输出。

多波长SPR传感系统可实现对细胞内多层区域的检测，如图7所示。同时得到多个SPR信号Δθ_j(j＝1，2，…m.)后，通过标定实验，获得不同波长在所需要的不同区域如18-1，18-2，…，18-m中的灵敏度S_i-j(i，j＝1，2，…m.)，代入到如下数值模型中

Δθ₁＝S_1-1Δn₁+S_2-1Δn₂+…+S_m-1Δn_m

Δθ₂＝S_1-2Δn₁+S_2-2Δn₂+…+S_m-2Δn_m

Δθ_m＝S_1-mΔn₁+S_2-mΔn₂+…+S_m-mΔn_m

求得细胞不同厚度的区域内的折射率变化量Δn_i(i＝1，2，…m.)，实现细胞的多层信息提取。

Claims (4)

1.一种基于表面等离子体共振传感的细胞分层检测系统，其特征在于：该系统由混合光源、入射臂、生物传感单元、反射臂和计算机组成，所述的混合光源含有至少两种不同波长的稳频激光器(1-1、1-2、……1-m)和光开关(3)；所述的入射臂包括起偏器(5)、准直器(6)、扫描反射镜(7)和第一成像透镜(8)，所述的生物传感单元由柱面或球面棱镜(9)、折射率匹配层(10)、细胞芯片(11)及样本池(12)构成，所述的细胞芯片由玻璃基片(16)、金膜(17)以及用作探针的细胞(18)构成，所述的反射臂包括第二成像透镜(13)和光电接收器(14)；不同激光器发出的光分别通过耦合器耦合后进入光纤(4)中，通过由计算机控制的光开关(3)选通，某一时刻只有一种波长的光出射，出射光依次经过起偏器和准直器，照射到由计算机控制的绕中心轴摆动的扫描反射镜(7)上，再依次透过第一成像透镜(8)、柱面或球面棱镜(9)和折射率匹配层(10)，射到细胞芯片(11)的玻璃基片与金膜的界面上，光由此反射，经过第二成像透镜(13)，射在光电接收器(14)上进行光电转换，并输入计算机(15)处理。

2.根据权利要求1所述的基于表面等离子体共振传感的细胞分层检测系统，其特征在于：细胞芯片的玻璃基片材料与所述的柱面或球面棱镜材料一致，均为BK7光学玻璃，所述的折射率匹配层的折射率与BK7光学玻璃的折射率一致。

3.根据权利要求1所述的基于表面等离子体共振传感的细胞分层检测系统，其特征在于：所述的光电接收器的光谱响应范围为500～1800nm。

4.基于如权利要求1所述的系统的细胞分层检测方法，其特征在于：该方法按如下步骤进行：

1)采用至少两种不同波长的稳频激光器组成混合光源，使不同波长的稳频激光器发出的光束分别耦合到各自对应的光纤中，然后分别与光开关的输入端连接，由计算机控制光开关的选通，使某一时刻只有某一波长的光通过；

2)混合光源发出的光束经过准直器和起偏器，成为一束线偏振的平行光，调整起偏器，使所述的平行光成为p光；

3)使所述的p光入射到扫描反射镜的旋转中心上；

4)所述的扫描反射镜在计算机的控制下，以10～1000Hz的频率绕中心轴摆动，摆动的角度范围为±16°；

5)所述的入射到扫描反射镜上的p光从镜面上反射，透过第一成像透镜后射到柱面或球面棱镜的表面，扫描反射镜中心与柱面或球面棱镜的中心线关于第一成像透镜共轭，保证不同角度的入射光均能会聚在柱面或球面棱镜的中心线上；

6)所述的细胞芯片置于柱面或球面棱镜的平面上，中间放置一层折射率匹配层，所述的 柱面或球面棱镜的中心线正好位于细胞芯片的玻璃基片与金膜之间的界面上；

7)所述的不同角度的入射光发生反射，经过第二成像透镜，投射在光电接收器件上，由所述的光电接收器将接收到的光强信号转换成电信号，并经A/D转换后输入计算机；

8) 不同波长的光在不同的角度下，在细胞芯片的金膜和细胞的界面上激发表面等离子体共振，反射光的光强最小的点的位置各不同，并且同一波长的光在细胞芯片表面分子相互作用过程中的光强最小的点的位置每时每刻也不同；

9)实时记录所述的反射光的光强最小的点的位置变化，同时得到至少两个不同的表面等离子体共振信号Δθ_j，其中j＝1，2，…m，用来表征同一生物反应过程；

10)获得的至少两个表面等离子体共振信号，利用数据解析方法进行解析，从中获得到细胞的不同层次内的折射率变化Δn_i，其中i＝1，2，…m，实现细胞的分层检测；所述的数据解析方法基于以下数值模型：

Δθ₁＝S_1-1Δn₁+S_2-1Δn₂+…+S_m-1Δn_m

Δθ₂＝S_1-2Δn₁+S_2-2Δn₂+…+S_m-2Δn_m

.

.

.

Δθ_m＝S_1-mΔn₁+S_2-mΔn₂+…+S_m-mΔn_m

所述的模型中，Δθ_j为测得的不同波长的SPR信号值，其中j＝1，2，…m；Δn_i为不同层区域的折射率变化量，其中i＝1，2，…m；S_i-j为不同波长在不同区域中的灵敏度，其中i，j＝1，2，…m，通过实验标定得到。 

Images