CN101474264B - 一种白芍的有效组分及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种白芍的有效组分,通过加热提取,浓缩,硅胶柱分离,洗脱,洗脱液浓缩干燥,再用液相色谱继续分离,收集溶液,溶液经浓缩干燥后得到有效组分。本发明提供的白芍有效组分可在制备治疗、预防心血管疾病药物中的应用。本发明方法设计合理,能快速准确的得到有效成分,在生产中更易于药物的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗心血管疾病的中药提取物,具体地说涉及从白芍中提取的有效组分及其制备方法与用途。
背景技术
心血管疾病严重威胁人类的健康,近年来,随着我国人口老年化以及人们工作、生活、饮食结构及环境等的变化,冠心病等心脑血管疾病的发生率也逐年增多,严重威胁着人民的身心健康。天然产物中许多活性物质具有抗心肌缺血、缺氧作用,其中一些已开发成治疗冠心病和心绞痛的新药,如治疗冠心病的药物地奥心血康,它是由从中药中提取的8种甾体皂甙制成的纯中药制剂;心达康是以沙棘为原料提取加工而成的纯天然药物,其有效成分为沙棘总黄酮。因而从天然产物中寻找具有抗心肌缺血、缺氧生理活性的有效物质,是发现、开发新药的有效途径之一。我国药用生物资源十分丰富,其生理活性物质是研究和发现新药先导化学物,开发新药的天然宝库。目前,我国从天然产物中提取活性物质,用于开发成治疗冠心病、安全性好、毒性低的新药还很少,从天然产物中提取活性物质,开发成具有抗心肌缺血,用于治疗冠心病和心绞痛的新药,具有重要应用价值和广阔发展前景。
白芍(Pasonia lactiflora Pall)系毛莨科植物的去外皮干燥根,性微寒,味苦酸。有养血柔肝、缓中止痛、敛阴收汗的功能。我国民间用于治疗胸腹胁肋疼痛、泻痢腹痛、自汗、阴虚发热、月经不调、崩漏、带下。现代研究表明,白芍中主要含芍药苷(paeoniflorin)类化合物,还含有苯甲酸,β-谷甾醇,1,2,3,4,6-黄倍酰单宁,倍单宁,以及没食子鞣质,没食子酸、没食子酸乙酯,d-儿茶素等成分。
发明内容
本发明的目的是提供一种白芍的有效组分,通过以下制备方法获得:将白芍药材粉碎后加入乙醇溶液,加热回流提取得提取液,将提取液浓缩成浸膏,并将其与硅胶进行拌样,用正相硅胶柱对其进行分离,首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相,得洗脱液I,弃之,然后改换氯仿和甲醇作为流动相,得洗脱液II,弃之,然后再改换甲醇作为流动相,得洗脱液III,将洗脱液III浓缩干燥后得样品;用制备液相色谱继续分离得到的样品;制备色谱的分离条件:色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18;21.2mm×250mm),流动相为水(A)和乙腈(B),梯度洗脱程序如下:0分钟时,流动相为95%的水溶液和5%的乙腈溶液;45分钟时,流动相为75%的水溶液和25%的乙腈溶液;55分钟时,流动相为30%的水溶液和70%的乙腈溶液。流速为10ml/min,柱温为室温;样品用100%乙醇溶解,经制备液相色谱分离,在32.9~38.2min时间段收集溶液,减压浓缩,冷冻干燥,得有效组分一,在52.2~55.0min时间段收集溶液,减压浓缩,冷冻干燥,得有效组分二。
优选的白芍有效组分制备方法,包括下列步骤:将白芍药材粉碎后加入乙醇溶液(体积百分比50%~95%),加热回流0.8~1.2小时,提取1~3次,合并滤液得提取液,将提取液浓缩成浸膏,并将其与硅胶进行拌样,用正相硅胶柱对其进行分离,首先用石油醚和乙酸乙酯(体积比47~53∶1)作为流动相,得洗脱液I,弃之,然后改换氯仿和甲醇(体积比8~13∶1)作为流动相,得洗脱液II,弃之,然后改换甲醇作为流动相,得洗脱液III,将洗脱液III浓缩干燥后得样品;用制备液相色谱继续分离得到的样品;制备色谱的分离条件:色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18;21.2mm×250mm),流动相为水(A)和乙腈(B),梯度洗脱程序如下:0分钟时,流动相为95%的水溶液和5%的乙腈溶液;45分钟时,流动相为75%的水溶液和25%的乙腈溶液;55分钟时,流动相为30%的水溶液和70%的乙腈溶液。流速为10ml/min,柱温为室温;样品用100%乙醇溶解,经制备液相色谱分离,在32.9~38.2min时间段收集溶液,减压浓缩,冷冻干燥,得有效组分一,在52.2~55.0min时间段收集溶液,减压浓缩,冷冻干燥,得有效组分二。
最佳的白芍有效组分制备方法,包括下列步骤:将白芍药材粉碎后加入乙醇溶液(体积百分比70%~80%),加热回流1小时,提取2次,合并滤液得提取液;将提取液浓缩成浸膏,并将其与硅胶进行拌样,用正相硅胶柱对其进行分离,首先用石油醚和乙酸乙酯(体积比50∶1)作为流动相,得洗脱液I,弃之,然后改换氯仿和甲醇(体积比8∶1)作为流动相,得洗脱液II,弃之,然后改换甲醇作为流动相,得洗脱液III,用制备液相色谱继续分离得到的样品;制备色谱的分离条件:色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18;21.2mm×250mm),流动相为水(A)和乙腈(B),梯度洗脱程序如下:0分钟时,流动相为95%的水溶液和5%的乙腈溶液;45分钟时,流动相为75%的水溶液和25%的乙腈溶液;55分钟时,流动相为30%的水溶液和70%的乙腈溶液。流速为10ml/min,柱温为室温;样品用100%乙醇溶解,经制备液相色谱分离,在32.9~38.2min时间段收集溶液,减压浓缩,冷冻干燥,得有效组分一,在52.2~55.0min时间段收集溶液,减压浓缩,冷冻干燥,得有效组分二。
本发明的另一个目的是提供该白芍有效组分在制备治疗、预防心血管疾病药物中的应用。
本发明的白芍有效组分可以作为活性成分,加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体,按照药剂学上记载的方法制成制剂。
本发明的白芍有效组分还可以作为活性成分之一,还含有其他药物,加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体,按照药剂学上记载的方法制成制剂。
所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、胶囊剂、胶丸剂。包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。
通过本发明方法获得的白芍有效组分,具有显著的抗氧化活性,分可在制备治疗、预防心血管疾病药物中的应用。本发明方法设计合理,能快速准确的得到有效成分,在生产中更易于药物的质量控制。
具体实施方式
本发明结合下面实施例进一步详细说明本发明的实质内容,该实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
实施例一 白芍有效组分的制备
将200g白芍药材粉碎后加入乙醇溶液,加热提取得提取液,将提取液浓缩成浸膏10g,并将其与硅胶进行拌样,用正相硅胶柱对其进行分离,首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相,得洗脱液I,弃之,然后改换氯仿和甲醇作为流动相,得洗脱液II,弃之,然后改换甲醇作为流动相,得洗脱液III,将洗脱液III浓缩干燥后得样品2.3g;用制备液相色谱继续分离得到的样品;制备色谱的分离条件:色谱柱为制备柱,流动相为水和乙腈,梯度洗脱。样品用100%乙醇溶解,经制备液相色谱分离,在时间段32.9~38.2min收集溶液,浓缩干燥后得到有效组分一0.20g,在时间段52.2~55.0min收集溶液,浓缩干燥后得到有效组分二0.18g。
实施例二 白芍有效组分的制备
将500g白芍药材粉碎后加入体积百分数为90%乙醇,加热回流0.8~1.2小时,提取1~3次,合并滤液得提取液,将提取液浓缩成浸膏22.1g,并将其与硅胶进行拌样,用正相硅胶柱对其进行分离,首先用石油醚和乙酸乙酯(体积比47~53∶1)作为流动相,得洗脱液I,弃之,然后改换氯仿和甲醇(体积比8~13∶1)作为流动相,得洗脱液II,弃之,然后改换甲醇作为流动相,得洗脱液III,将洗脱液III浓缩干燥后得样品5.1g;用制备液相色谱继续分离得到的样品;制备色谱的分离条件:色谱柱为制备柱,流动相为水和乙腈,梯度洗脱,流速为9~11ml/min,柱温为室温。样品用100%乙醇溶解,经制备液相色谱分离,在时间段32.9~38.2min收集溶液,浓缩干燥后得到有效组分一0.42g,在时间段52.2~55.0min收集溶液,浓缩干燥后得到有效组分二0.38g。
实施例三 白芍有效组分的制备
取白芍药材250g,将其粉碎后加入体积分数为80%乙醇,加热回流1小时,提取1次,滤液合并得提取液。将提取液浓缩成浸膏得9.8g,将浸膏和硅胶拌样,用正相硅胶柱进行分离,首先用石油醚和乙酸乙酯(体积比50∶1)作为流动相,得洗脱液I,然后改换氯仿和甲醇(体积比10∶1)作为流动相,得洗脱液II,弃之,然后改换甲醇作为流动相,得洗脱液III,将洗脱液III浓缩干燥后得样品2.1g样品。用制备液相色谱继续分离得到的样品。制备色谱的分离条件:色谱柱为Agient制备柱(Zorbax SB-C18;21.2mm×250mm),流动相为水(A)和乙腈(B),梯度洗脱程序如下:0分钟时,流动相为95%的水溶液和5%的乙腈溶液;45分钟时,流动相为75%的水溶液和25%的乙腈溶液;55分钟时,流动相为30%的水溶液和70%的乙腈溶液。流速为10ml/min,柱温为室温。样品用100%乙醇溶解,经制备液相色谱分离,在时间段32.9~38.2min收集溶液,浓缩干燥后得到有效组分一0.41g,在时间段52.2~55.0min收集溶液,浓缩干燥后得到有效组分二0.38g。
实施例四 白芍有效组分的制备
取白芍药材250g,将其粉碎后加入体积分数为70%乙醇,加热回流1小时,提取2次,滤液合并得提取液。将提取液浓缩成浸膏得11.1g,将浸膏和硅胶拌样,用正相硅胶柱进行分离,首先用石油醚和乙酸乙酯(体积比50∶1)作为流动相,得洗脱液I,然后改换氯仿和甲醇(体积比10∶1)作为流动相,得洗脱液II,弃之,然后改换甲醇作为流动相,得洗脱液III,将洗脱液III浓缩干燥后得样品2.5g样品。用制备液相色谱继续分离得到的样品。制备色谱的分离条件:色谱柱为Agient制备柱(Zorbax SB-C18;21.2mm×250mm),流动相为水(A)和乙腈(B),梯度洗脱程序如下:0分钟时,流动相为95%的水溶液和5%的乙腈溶液;45分钟时,流动相为75%的水溶液和25%的乙腈溶液;55分钟时,流动相为30%的水溶液和70%的乙腈溶液。流速为10ml/min,柱温为室温。样品用100%乙醇溶解,经制备液相色谱分离,在时间段32.9~38.2min收集溶液,浓缩干燥后得到有效组分一0.44g,在时间段52.2~55.0min收集溶液,浓缩干燥后得到有效组分二0.42g。
实施例五 滴丸制剂的制备
取实施例三的白芍有效组分一0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀,加热熔融,化料后移至滴丸滴灌中,药液滴至6~8℃液体石蜡中,除油,制得滴丸400粒。
实施例六 片剂的制备
取实施例三的白芍有效组分二适量与微晶纤维素混合均匀,加3%聚维酮乙醇溶液制软材,过18目筛制颗粒,60℃干燥1小时,整粒,加入滑石粉适量,混匀,压片,即得。
实施例七 胶囊剂的制备
取白芍有效组分一与花生油按2∶18的比例水溶式不锈钢搅拌灌中,同时加入适量明胶和甘油混合,放出再用胶体磨磨浆,磨出的混合液搅拌,制成药液;将甘油与蒸馏水在40-50℃温度下搅拌混溶,再将甘油液温至80-90℃,取明胶加入其中混合搅拌,直至全部溶化成胶液,然后在60℃温度下使胶液静置4小时,用制板机制成胶板供制丸工序使用;将上述制成的药液和胶板送入压丸机制丸,然后在22-25℃温度下吹风4小时作滚筒定型,又在25-30℃温度下吹风干燥16-20小时,检选合格胶丸,用95%乙醇清洗,在25-30℃下吹风干燥4小时,即得。
实施例八 注射液的制备
取白芍有效组分一适量用40℃注射用水溶解,加入适量药用载体等渗剂,调节溶液的pH值为7.0-8.0,加注射用水至全量,用超滤器超滤除热源,测定pH值后,用膜过滤,分装后,高压灭菌,检验、包装,即得。
实施例九 冻干粉针制剂的制备
取降香油1.5g,加入到13ml饱和的羟丙基β-环糊精中,搅拌溶解,滤过,滤叶低温干燥,的降香油和羟丙基β-环糊精的包合物粉末。除上述降香油合羟丙基β-环糊精的包合物粉末外,再取实施例三的白芍有效组分二0.5g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml,上述组分混匀后,冷冻干燥,分装300支,即得。
实施例十 白芍有效组分的药理实验
药理模型:H9C2心肌细胞抗氧化模型
配药:用适量DMSO溶解提取物组分,浓度为约50mg/ml,最后作用于细胞的提取物组分浓度为50μg/ml。震荡溶解,若有大量液滴粘壁,可适当离心。储存-20℃。细胞培养:使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90%,胎牛血清(Gibco)10%,非必需氨基酸(Gibco)1%,双抗(青霉素,链霉素,浓度都是10万单位/ml)0.1%混合培养H9C2细胞。H9C2细胞种板:取96孔板,由于边缘效应,96孔板最外围一圈加150μl/孔PBS。其他孔按照1万/孔的细胞密度接种细胞,每孔150μl。同时留孔做空白对照,不接种细胞。把该96孔板置于细胞培养箱(37℃,95%空气+5%CO2)培养24小时。细胞加药:每个提取物组分筛选做3次平行操作。用H9C2细胞培养液稀释30%H2O2至200μmol/l浓度,混匀,记做A液。提取物组分稀释分两步:先精密移取50mg/ml的提取物组分1μl至200μlA液中。再精密移取该稀释液30μl至含120ulA液的H9C2接种板中。最后每孔体积为150μl。DMSO组,取1μl至200μlA液中。再精密移取该稀释液30μl至含120μlA液的H9C2接种板中。维生素C组,取50mmol/l的维生素C溶液1μl至200μlA液中。再精密移取该稀释液30μl至含120ulA液的H9C2接种板中。放置细胞培养箱(37℃,95%空气+5%CO2)培养24小时。MTT法测定细胞保护率:小心吸干净每孔中体液,加入100μl/孔,0.5mg/ml的MTT(将5mg/ml的MTT贮备液用H9C2细胞正常培养液稀释10倍)。放置于细胞培养箱(37℃,95%空气+5%CO2)培养4小时。之后拿出96孔板,吸去上清,尽量吸干净,加入150μl/孔DMSO,500rpm转速摇床混匀10分钟,使沉淀充分溶解。立即在酶标仪595nm波长下测定每孔OD值。治疗率=(加药孔OD值-加DMSO孔OD值)/(加DMSO孔OD值-空白孔OD值)×100%
Claims (6)
1.一种白芍有效组分,其特征在于:通过以下制备方法获得:将白芍药材粉碎后加入体积百分比为70%~90%的乙醇溶液,加热回流0.8~1.2小时,提取1~3次,合并滤液得提取液,将提取液浓缩成浸膏,并将其与硅胶进行拌样,用正相硅胶柱对其进行分离,首先用体积比为47~53∶1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相,得洗脱液I,弃之,然后改换体积比为8~13∶1的氯仿和甲醇作为流动相,得洗脱液II,弃之,然后再改换甲醇作为流动相,得洗脱液III,将洗脱液III浓缩干燥后得样品;用制备液相色谱继续分离得到的样品;制备色谱的分离条件:色谱柱为Zorbax SB-C18;21.2mm×250mm制备柱,流动相为水和乙腈,梯度洗脱程序为:0分钟时,流动相为95%的水溶液和5%的乙腈溶液,45分钟时,流动相为75%的水溶液和25%的乙腈溶液,55分钟时,流动相为30%的水溶液和70%的乙腈溶液;流速为9~11ml/min,柱温为室温;样品用100%乙醇溶解,经制备液相色谱分离,在32.9~38.2min时间段收集溶液,减压浓缩,冷冻干燥,得有效组分一,在52.2~55.0min时间段收集溶液,减压浓缩,冷冻干燥,得有效组分二。
2.根据权利要求1所述的一种白芍有效组分,其特征在于:制备方法中将白芍药材粉碎后加入体积百分比为70%~80%的乙醇溶液,加热回流1小时,提取2次,合并滤液得提取液;将提取液浓缩成浸膏,并将其与硅胶进行拌样,用正相硅胶柱对其进行分离,首先用体积比为50∶1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相,得洗脱液I,弃之,然后改换体积比为8∶1的氯仿和甲醇作为流动相,得洗脱液II,弃之,然后改换甲醇作为流动相,得洗脱液III,用制备液相色谱继续分离得到的样品;制备色谱的分离条件如权利要求1所述。
3.根据权利要求1-2任一项所述的一种白芍有效组分在制备治疗、预防心血管疾病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种白芍有效组分的应用,其特征是:所制备的药物还含有制剂允许的药物赋形剂。
5.根据权利要求3所述的一种白芍有效组分的应用,其特征是:所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂。
6.根据权利要求5所述的一种白芍有效组分的应用,其特征是:所述药物的给药方式包括口服给药、注射给药。
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