CN101317837B - 一种冬凌草有效组分及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种冬凌草有效组分，主要含有化合物A：Coetsoidin F和化合物B：Coetsoidin C，其中化合物A的含量为70～90％，化合物B的含量为5～20％。药材通过加热提取，浓缩，硅胶柱分离，洗脱，洗脱液浓缩干燥，再用液相色谱继续分离，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。本发明提供的冬凌草有效组分可在制备治疗、预防肿瘤药物中的应用。本发明方法设计合理，能快速准确地得到有效成分，在生产中更易于药物的质量控制。

Description

一种冬凌草有效组分及制备方法和应用

技术领域

本发明属中药提取物，具体地说涉及从冬凌草中提取的有效组分，及其制备方法，以及该有效组分在制备治疗、预防肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。目前业内对恶性肿瘤的治疗主要还是以手术、放疗、化疗为主，但许多化学抗癌药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞，造成严重的副反应。植物药的遗传毒性不明显，中草药在抗癌抗突变方面有独特的优势和广阔的应用前景，而且中药在对肿瘤的辅助治疗中也起到不容忽视的作用。紫杉醇即是典型的从植物中获得的具有良好抗癌活性的天然化合物，现已开发为抗肿瘤药物。目前我国危害性最为严重的肿瘤为肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病及淋巴瘤等。特别是肝癌的发生率近年来有所增加。值得重视，这些肿瘤的病因学、发病学及其防治，均为我国肿瘤研究的重点。寻找高效低毒的抗癌药物以及抗癌辅助药物是当前肿瘤研究的重要内容。

我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药先导化学物，开发新药的天然宝库。目前，我国从天然产物中提取活性物质，用于开发成治疗肿瘤疾病、安全性好、毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活性物质，开发成具有抗肿瘤疗效的新药，具有重要应用价值和广阔发展前景。

冬凌草又名冰凌草、六月令，得名于冬天全株结满薄如蝉翼的银白色冰凌片，植物来源为唇形科香茶菜属植物碎米桠(Rabdosia rubescens(Hemls.)Hara)，广布于黄河、长江流域，主产地在河南济源太行山一带。河南、安徽、湖北、贵州等地均有产，其中以河南济源市产最佳。全草含有单萜、倍半萜、二萜等多种萜类化合物以及少量挥发油、生物碱，其中冬凌草素是含量较高的二萜类成分，具有很强的苦味。另外，还从中分离得到了水杨酸和三个黄酮类化合物——胡麻素、线蓟素和Pedalitin(李钦，等.冬凌草化学成分、药理作用及开发研究进展.河南中医学院.2003，6(18)：31-33)。

冬凌草味甘苦，性微寒，具清热解毒、消炎止痛、健胃活血及抗肿瘤之功效。冬凌草对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、乙型链球菌均有小剂量抑菌，大剂量杀菌作用，其中肺炎双球菌对之最敏感。另外，冬凌草醇提物对大鼠棉球肉芽肿有抑制作用，对小鼠有镇痛作用(段晓颖.复方冬凌草含片体外抗菌实验研究.河南中医药学刊，1997，12(3)：38-40)。研究表明，冬凌草甲素具有抑制肿瘤细胞增值、诱导肿瘤细胞调亡等作用(辛庆锋，等.冬凌草甲素抗肿瘤作用机制研究进展.医学综述.2008，14(3)：455-456)。冬凌草甲素还有抗突变作用(杨胜利，张巧.冬凌草甲素抗突变性研究.癌变·畸变·突变，2001，13(1)：8-10.)、β受体拮抗作用(李琦，刘洁.冬凌草甲素对家兔血流动力学的影响及机理研究[J].白求恩医科大学学报，1994，20(2)：128-129.)、抗氧化作用(张予，王筠.冬凌草甲素对活性氧自由基的清除作用.河南医学研究，1998，8(2)：100-104.)。冬凌草多糖在体外高浓度下可以抑制EAC肿瘤细胞的生长，小鼠体内进一步研究发现其能够抑制S180的生长，且对S180的抑瘤效应呈现出明显的量效关系。冬凌草多糖对体液免疫和细胞免疫均有增强作用(王一飞，江金花，王庆端，等.冬凌草多糖的抗肿瘤及其免疫增强作用.中国病理生理杂志，2002，18(11)：1341-1343.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种冬凌草有效组分，该有效组分主要含有化合物A：Coetsoidin F，化合物B：Coetsoidin C，其中化合物A的摩尔百分比含量为70～90％，化合物B的摩尔百分比含量为5～20％。

优选化合物A的摩尔百分比含量为75～85％，化合物B的摩尔百分比含量为8～15％。

化合物A的结构式为：

化合物B的结构式为：

本发明的另一目的是提供该冬凌草有效组分的制备方法，通过以下步骤实现：将冬凌草药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。

优选的冬凌草有效组分制备方法，包括下列步骤：将冬凌草药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(47～53∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(8～13∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9～11ml/min，柱温为室温，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。

最佳的冬凌草有效组分制备方法，包括下列步骤：将冬凌草药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液；将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(10∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相为70％的水溶液和30％的乙腈溶液；40分钟时，流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液；50分钟时，流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段7.1～15.5min收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。

本发明的再一个目的是提供该冬凌草有效组分在制备治疗、预防肿瘤药物中的应用。

本发明的冬凌草有效组分可以作为活性成分，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。

本发明的冬凌草有效组分还可以作为活性成分之一，加入其他抗肿瘤药物，加入药剂学上接受的药物赋形剂或载体，按照药剂学上记载的方法制成制剂。

所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、胶囊剂、胶丸剂。包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。

本发明的有益效果为：

1.本发明的提取分离工艺中使用了正相硅胶柱，能有效地除去糖、蛋白质、氨基酸等杂质，提高有效成分的含量，同时采用了制备色谱，能快速准确的得到有效成分。

2.本发明提供的冬凌草有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。

3.本发明提供的方法首次从冬凌草中得到A、B等几个成分的组合物，并首次将其在多种肿瘤细胞株上进行药效筛选，得到较好的药理活性。

具体实施方式

本发明结合下面实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例一冬凌草有效组分的制备

将200g冬凌草药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8)，加热提取1次得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(53∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(13∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段7.1～15.5min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分。经测定，化合物A的含量为70～86％，化合物B的含量为5～18％。

实施例二冬凌草有效组分的制备

将500g冬凌草药材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1.2)，加热回流1.2小时，提取3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(47∶1)作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改换氯仿和甲醇(8∶1)作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品；制备色谱的分离条件：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段7.1～15.5min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分。经测定，化合物A的含量为75～90％，化合物B的含量为8～20％。

实施例三冬凌草有效组分的制备

取冬凌草药材250g，将其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液。将提取液浓缩成浸膏，将浸膏和硅胶拌样，用正相硅胶柱进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作为流动相，得洗脱液I，然后改换氯仿和甲醇(10∶1)作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品。用制备液相色谱继续分离得到的样品。制备色谱的分离条件：色谱柱为Agient制备柱(Zorbax SB-C₁₈；21.2mm×250mm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相为70％的水溶液和30％的乙腈溶液；40分钟时，流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液；50分钟时，流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液；流速为10ml/min，柱温为室温。样品用100％乙醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段7.1～15.5min收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分。经测定，化合物A的含量为75～85％，化合物B的含量为8～15％。

实施例四冬凌草有效组分HPLC-ELSD分析

色谱条件色谱柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；采用梯度洗脱，流动相A相为0.2％冰醋酸水溶液，流动相B相为含0.2％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱程序如下：0分钟时，流动相A为90％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为10％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；10分钟时，流动相A为50％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为50％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；30分钟时，流动相A为5％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为95％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；35分钟时，流动相A为5％的0.2％冰醋酸水溶液、流动相B为95％的0.2％冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mL·min^-1；检测波长全波长；柱温30℃。

ELSD参数氮气流速：2.0L/min；漂移管温度105℃。

供试品溶液的制备称取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。

测定方法精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，依色谱分析条件测定，即得。

本发明中，化合物A的结构式为：

本发明中，化合物B的结构式为：

实施例五冬凌草有效组分制剂

滴丸的制备，取实施例三的冬凌草有效组分0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6～8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。

实施例六冬凌草有效组分制剂

冻干粉针的制备，取降香油1.5g，加入到13ml饱和的羟丙基β-环糊精中，搅拌溶解，滤过，滤液低温干燥，得降香油和羟丙基β-环糊精的包合物粉末。除上述降香油合羟丙基β-环糊精的包合物粉末外，再取实施例三的冬凌草提取物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸钙钠0.9g和蒸馏水2ml，上述组分混匀后，冷冻干燥，分装300支，即得。

实施例七冬凌草有效组分制剂

注射液的制备，取实施例三的冬凌草有效组分适量用40℃注射用水溶解，加入适量药用载体等渗剂，调节溶液的pH值为7.0-8.0，加注射用水至全量，用超滤器超滤除热源，测定pH值后，用膜过滤，分装后，高压灭菌，检验、包装，即得。

实施例八冬凌草有效组分制剂

胶丸的制备，取实施例三的冬凌草有效组分与花生油按2∶18的比例水溶式不锈钢搅拌灌中，同时加入适量明胶和甘油混合，放出再用胶体磨磨浆，磨出的混合液搅拌，制成药液；将甘油与蒸馏水在40-50℃温度下搅拌混溶，再将甘油液温至80-90℃，取明胶加入其中混合搅拌，直至全部溶化成胶液，然后在60℃温度下使胶液静置4小时，用制板机制成胶板供制丸工序使用；将上述制成的药液和胶板送入压丸机制丸，然后在22-25℃温度下吹风4小时作滚筒定型，又在25-30℃温度下吹风干燥16-20小时，检选合格胶丸，用95％乙醇清洗，在25-30℃下吹风干燥4小时，即得。

实施例九冬凌草有效组分制剂

片剂的制备，取实施例三的冬凌草有效组分适量与微晶纤维素混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，60℃干燥1小时，整粒，加入滑石粉适量，混匀，压片，即得。

实施例十冬凌草有效组分的药理实验

药理模型：HL 60肿瘤细胞

细胞培养与种板细胞培养：使用RPMI 1640(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90％，胎牛血清(四季青)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养HL60细胞，密度需低于10⁶个/mL。计算需要细胞总量N_T＝ρcell·mL^-1×V_T(ρ＝2×10⁴个/mL)，其中V_T＝0.1mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL，加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数N_L，则离心管中的细胞数N为：N_L/4×10⁴×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V₁mL，吹打，使细胞混匀，吸取V₂mL加入到细胞槽中，使V₂＝N_T/N×V₁。在细胞槽中再加入V_T-V₂mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μLPBS，以减少培养液的蒸发。

给药方案冬凌草有效组分用DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50ng/mL。孵育48h。每个浓度设4个平行复孔，每板设空白组(blank，只加培养液，不含细胞)，及阴性对照组(negative，细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200μL的培养液，将吸取0.88μLDMSO加入混匀)。SRB染色：细胞培养结束后，取出培养板，每孔加入40％(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)100μL固定细胞，室温放置5min，4℃冰箱中放置1h。培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去除TCA。在空气中干燥后，每孔加0.4％的SRB100μL(1％色谱纯乙酸溶解)，室温下放置20min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍，去除未结合的染料，空气中干燥后用10mmol/L Tris150μL/孔溶解，振荡5min，使用酶标仪(ELx800)测定，所用波长为490nm。

抑制率的计算抑制率按如下公式计算：

药效结果见表1。根据HL 60肿瘤细胞抑制率结果，冬凌草有效组分对抑制HL 60肿瘤细胞增殖有非常显著效果。

表1

	冬凌草组分	阴性	空白	阳性
					平均细胞存活数	0.11	0.60	0.07	0.11

抑制率(％)	90.59	0.00	100.00	91.79
					RSD(％)	8.53	1.87	8.60	4.80

2.2药理模型：K562肿瘤细胞

细胞培养与种板细胞培养：使用RPMI 1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氢钠]90％，小牛血清(赛乐)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养K 562细胞。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL^-1×VT(ρ＝8×103个/mL)，其中VT＝0.1mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL，加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2mL加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT-V2mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μL PBS，以减少培养液的蒸发。

给药方案冬凌草有效组分加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20℃。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50μg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200μL的培养液，将吸取0.88μL DMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4μg/mL)。SRB染色：细胞培养结束后，取出培养板，每孔加入40％(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)70μL固定细胞，4℃冰箱中放置1h。培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去除TCA。在空气中干燥后，每孔加0.4％的SRB100μL(1％色谱纯乙酸溶解)，室温下放置20min，弃去各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍，去除未结合的染料，空气中干燥后用10mmol/LTris150μL/孔溶解，振荡5min，使用酶标仪(ELx800)测定，所用波长为490nm。

抑制率的计算抑制率按如下公式计算：

药效结果见表2。根据K562肿瘤细胞抑制率结果，冬凌草有效组分对抑制K562肿瘤细胞增殖有非常显著效果。

表2

	冬凌草组分	阴性	空白	阳性
					平均细胞存活数	0.18	1.21	0.08	0.18
抑制率(％)	91.19	0.00	100.00	90.82

RSD(％)

6.14

3.40

5.65

5.52

2.3药理模型：MCF-7肿瘤细胞

细胞培养与种板细胞培养：使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90％，小牛血清(赛乐)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养MCF-7细胞。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL^-1×VT(ρ＝2×103个/mL)，其中VT＝0.1mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL，加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2mL加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT-V2mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μL PBS，以减少培养液的蒸发。

给药方案冬凌草有效组分根据所称量的药品的重量，加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20℃。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50μg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200μL的培养液，将吸取0.88μLDMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4μg/mL)。MTT比色法测定：取出培养板，去除每孔上清，加入培养液-MTT混合溶液(培养液∶MTT溶液＝10∶1)100μL，孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150μL的DMSO，振荡10min，550nm酶标仪(Elx800)测定。

抑制率的计算 抑制率按如下公式计算：

药效结果见表3。根据MCF-7肿瘤细胞抑制率结果，冬凌草有效组分对抑制MCF-7肿瘤细胞增殖有非常显著效果。

表3

	冬凌草组分	阴性	空白	阳性
					平均细胞存活数	0.11	0.24	0.09	0.14
抑制率(％)	84.34	0.00	100.00	65.60
					RSD(％)	9.17	3.93	6.70	5.43

2.4药理模型：KB肿瘤细胞

细胞培养与种板细胞培养：使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90％，小牛血清(赛乐)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养KB细胞。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL^-1×VT(ρ＝2×103个/mL)，其中VT＝0.1mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL，加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2mL加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT-V2mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μL PBS，以减少培养液的蒸发。

给药方案冬凌草有效组分根据所称量的药品的重量，加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20℃。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50μg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200μL的培养液，将吸取0.88μLDMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4μg/mL)。MTT比色法测定：取出培养板，去除每孔上清，加入培养液-MTT混合溶液(培养液∶MTT溶液＝10∶1)100μL，孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150μL的DMSO，振荡10min，550nm酶标仪(Elx800)测定。

抑制率的计算抑制率按如下公式计算：

药效结果见表4。根据KB肿瘤细胞抑制率结果，冬凌草有效组分对抑制KB肿瘤细胞增殖有非常显著效果。

表4

	冬凌草组分	阴性	空白	阳性
					平均细胞存活数	0.07	1.09	0.08	0.08
抑制率(％)	100.22	0.00	100.00	99.00
					RSD(％)	4.00	1.21	4.23	4.27

2.5药理模型：Hep G2肿瘤细胞

细胞培养与种板细胞培养：使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氢钠]90％，胎牛血清(四季青)10％，非必需氨基酸(Gibco)1％混合培养Hep G2细胞。计算需要细胞总量NT＝ρcell·mL^-1×VT(ρ＝2×103个/mL)，其中VT＝0.1mL×孔数+细胞槽剩余量。吹打培养瓶壁上的悬浮细胞，加入离心管中。取10μL，加10μL胎盘蓝稀释，计算计数板上活细胞数总数NL，则离心管中的细胞数N为：NL/4×104×2×V个，其中V为离心前离心管中的溶液体积。离心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培养液V1mL，吹打，使细胞混匀，吸取V2mL加入到细胞槽中，使V2＝NT/N×V1。在细胞槽中再加入VT-V2mL的培养液，用排枪吹打、混匀，取该液，每孔加入100μL，孵育24h。种板后选取4孔加入培养液作为空白对照，剩余孔加入100μL PBS，以减少培养液的蒸发。

给药方案冬凌草有效组分根据所称量的药品的重量，根据所称量的药品的重量，加入相应体积的DMSO溶解，浓度为约50mg/mL。震荡溶解，若有大量液滴粘壁，可适当离心。可储存-20℃。96孔板换液，每孔加入新鲜培养液150μL。在新的96孔板中加入220μL/孔的培养液，将吸取0.88μL药液加入混匀，稀释250倍，将上述稀释好的药物向种有细胞的孔每孔加入50μL，此时药物稀释1000倍，即终浓度为50μg/mL。孵育48h。每个浓度设4(2)个平行复孔，每板设阴性对照组(细胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200μL的培养液，将吸取0.88μL DMSO加入混匀)，阳性对照组(阿霉素终浓度4μg/mL)。MTT比色法测定：取出培养板，去除每孔上清，加入培养液-MTT混合溶液(培养液∶MTT溶液＝10∶1)100μL，孵育4h。吸弃培养液，每孔加入150μL的DMSO，振荡10min，550nm酶标仪(Elx800)测定。

抑制率的计算抑制率按如下公式计算：

药效结果见表5。根据Hep G2肿瘤细胞抑制率结果，冬凌草有效组分对抑制Hep G2肿瘤细胞增殖有非常显著效果。

表5

	冬凌草组分	阴性	空白	阳性
					平均细胞存活数	0.07	0.47	0.08	0.09
抑制率(％)	102.63	0.00	100.00	97.69
					RSD(％)	4.28	2.83	7.36	4.30

Claims (8)

1.一种冬凌草有效组分，其特征是：该有效组分主要含有化合物A：Coetsoidin F和化合物B：Coetsoidin C，其中化合物A的摩尔百分比含量为70～90％，化合物B的摩尔百分比含量为5～20％，

化合物A的结构式为：

化合物B的结构式为：

2.根据权利要求1所述的一种冬凌草有效组分的制备方法，其特征是通过以下步骤实现：将冬凌草药材粉碎后加入1∶0.8～1.2的乙酸乙酯和乙醇，加热回流0.8～1.2小时，提取1～3次，合并滤液得提取液，将提取液浓缩成浸膏，并将其与硅胶进行拌样，用正相硅胶柱对其进行分离，首先用47～53∶1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液I，弃之，再用8～13∶1的氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的目的物；制备色谱的分离条件为：色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为9～11ml/min，柱温为室温，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。

3.根据权利要求2所述的一种冬凌草有效组分的制备方法，其特征是：所述梯度洗脱程序为：0分钟时，流动相为70％的水溶液和30％的乙腈溶液；40分钟时，流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液；50分钟时，流动相为5％的水溶液和95％的乙腈溶液。

4.根据权利要求2所述的一种冬凌草有效组分的制备方法，其特征是：色谱分离后，在7.1～15.5min时间段收集溶液。

5.根据权利要求1所述的一种冬凌草有效组分在制备治疗、预防肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的一种冬凌草有效组分的应用，其特征是：所制备的药物还含有制剂允许的药物赋形剂或载体。

7.根据权利要求5所述的一种冬凌草有效组分的应用，其特征是：所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂。

8.根据权利要求7所述的一种冬凌草有效组分的应用，其特征是：所述药物的给药方式包括口服给药或注射给药。