CN101470104A - 维生素k2类药物中顺式异构体的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种维生素K2类药物中顺式异构体的高效液相色谱检测方法，所述方法采用硅胶为填料的正相色谱柱以及由一种选自正己烷、正戊烷、石油醚、环己烷、异辛烷和正庚烷中的低极性溶剂和一种选自正丁醚、异丙醇、正戊醇、四氢呋喃、二氯甲烷和乙醇中的高极性溶剂组成的流动相。该方法具有更高的灵敏度和更好的专属性，操作程序简便，重现性好，有利于生产过程中对原料及制剂的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种维生素K2类药物杂质的检测方法，特别是涉及维生素K2类药物中顺式异构体的检测方法。
背景技术
随着人类寿命的延长，人口老龄化给人类健康带来了新的问题。骨质疏松症及其引起的骨折在当前常见疾病中位于第7位，严重威胁着中老年人的健康。
经研究确认，维生素K2类药物具有成骨作用，促进钙代谢，同时还能抑制破骨细胞引起的骨吸收，从而增加骨密度，防治骨质疏松。四烯甲萘醌作为维生素K2类药物的一种，具有强效促凝血作用(1972年已批准作为促凝血药上市)。四烯甲萘醌也具有促进成骨和抑制骨质吸收两方面作用，它不仅能活化成骨细胞、促进钙化，而且能抑制破骨细胞的分化，进而抑制破骨细胞的骨质吸收能力，从而抑制骨质疏松，能够作为改善骨组织代谢不均衡导致的骨质疏松症的药物。
顺式异构体作为维生素K2类药物中的已知杂质，是该类药品质量控制中的重要指标。现有的检测顺式异构体杂质的方法多为薄层色谱法，如《日本药局方》中四烯甲萘醌顺式异构体的检查就采用薄层色谱法。但是，该方法的局限性表现为：专属性差，精密度低，无法进行准确检测和定量，因而无法准确控制药品中顺式异构体的含量。因此，在开发维生素K2类药物的同时，需要建立更完善的检测顺式异构体的方法。
发明内容
本发明的目的是由下述技术方案来实现的：
一种维生素K2类药物中顺式异构体的高效液相色谱检测方法，所述方法采用硅胶为填料的正相色谱柱以及由一种选自正己烷、正戊烷、石油醚、环己烷、异辛烷和正庚烷中的低极性溶剂和一种选自正丁醚、异丙醇、正戊醇、四氢呋喃、二氯甲烷和乙醇中的高极性溶剂组成的流动相。
在上述检测方法中，所述维生素K2类药物为具有下式所示结构的化合物：
其中，n的范围为1-10，优选为四烯甲萘醌(n＝4)。
在上述检测方法中，所述流动相的组成为：按体积比，低极性溶剂:高极性溶剂＝100-60:0-40；优选地，按体积比，低极性溶剂:高极性溶剂＝99-70:1-30。所述流动相的组成可以为：按体积比，正己烷:正丁醚＝100-60:0-40；或者按体积比，石油醚:正戊醇＝99-70:1-30。
所述检测方法中采用二极管阵列检测器，检测波长为200nm-380nm，优选为270nm。所采用的色谱柱可以是但不限于以下色谱柱中的任意一种：迪马公司硅胶柱Inertsil SIL-100A(5μm 4.6×250mm)；迪马公司氰基Inertsil CN-3(5μm 4.6×250mm)；Therm公司硅胶柱Hypersil Silica(5μm4.6×150mm)或安捷伦公司硅胶柱Agilent Prep-SIL(5μm 4.6×250mm)。所述检测方法应采用避光操作，进样量小于0.8μg。
本发明的检测方法比《日本药局方》中四烯甲萘醌顺式异构体的检测方法具有更高的灵敏度和更好的专属性。它使用市场上容易获到的高效液相色谱仪和色谱柱，HPLC分析的操作程序和数据处理方法又是药物分析技术人员所熟知的，因而便于推广使用以及实验室间数据的比较与重现，也有利于生产过程中对原料及制剂的质量进行监控。
附图说明
图1四烯甲萘醌反式异构体和顺式异构体HPLC分离色谱图。
具体实施方式
实施例1
HPLC分析条件：高效液相色谱分析采用配有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪Waters 2695_996，以及安捷伦公司的Agilent Prep-SIL(5μm4.6×250mm)硅胶柱。流动相为正己烷-正丁醚(体积比为95:5)，检测波长为270nm，使用自动进样器，每次进样20μl。
各取四烯甲萘醌反式异构体和顺式异构体适量，准确称重，用上述流动相配制成浓度为1mg/ml的溶液，采用上述仪器和条件进行分析，获得HPLC色谱图，如图1所示。在该色谱条件下，四烯甲萘醌反式异构体的保留时间为22.863min，四烯甲萘醌顺式异构体的保留时间为19.958min，两者的分离度大于1.5，可达到基线分离。
实施例2
取3份四烯甲萘醌产品作为样品，按照实施例1中的HPLC分析条件进行分析，根据获得的液相色谱图中顺式异构体峰面积以及对照溶液峰面积，通过外标法计算顺式异构体的含量。表1显示了3份样品的检测结果。由表1可知，它们中的顺式异构体含量差别不大，但均低于《日本药局方》中“四烯甲萘醌顺式异构体检查”所要求的检测限(2％)。
表1 样品中的顺式异构体含量
实施例3
取1mg/ml的四烯甲萘醌样品溶液，分别加盐酸溶液、氢氧化钠溶液、过氧化氢溶液进行酸、碱、氧化破坏反应。取1mg/ml的四烯甲萘醌样品溶液，水浴加热，进行热破坏反应。取1mg/ml的四烯甲萘醌样品溶液，光照若干小时，进行光破坏反应。采用实验例1中的HPLC分析条件，对上述反应液进行分析。
本试验的目的是考察样品对酸、碱、氧化、热、光的敏感性及顺式异构体的含量变化，进而确定所用色谱条件能否准确检测顺式异构体含量从而全面控制产品的质量，试验结果见表2。由结果可知，四烯甲萘醌溶液在酸、碱、氧化和热破坏反应中稳定，顺式异构体含量保持不变；但在光照破坏反应中不稳定，顺式异构体含量明显增加。因此实验中应谨慎避光操作，以免引起顺式异构体含量异常增加。
表2 破坏反应中顺式异构体含量变化
实施例4
取同一个批号的四烯甲萘醌样品，用无水乙醇配成1mg/ml的溶液5份，采用实验例1中的HPLC分析条件，在避光放置的24小时内分别进行测定。
本试验的目的是考察样品在常温避光放置条件下的稳定性和试验重复性，试验结果见表3。由结果可知，样品溶液在24小时内基本稳定，重复性误差约2％。
表3 稳定性试验中顺式体含量变化
实施例5
取四烯甲萘醌顺式异构体样品用无水乙醇配制成5个浓度的标准溶液，采用实验例1中的HPLC分析条件分别测定，根据峰面积和进样浓度进行线性回归。
本试验的目的是考察四烯甲萘醌顺式异构体的测定浓度范围，结果可知，在0-0.8μg进样浓度下，线性关系很好，回归方程是y＝666.35x-2.11，线性指数R＝0.99997。
实施例6
本发明中所采用的四烯甲萘醌顺式异构体或反式异构体，除了通过定向合成直接制备获得之外，还可以利用液相制备的方法、由顺反异构体混合物分离得到，本试验即用该方法制得顺式异构体和反式异构体，并对其进行了结构分析。
操作步骤：
1、取四烯甲萘醌顺、反式异构体混合物以实施例1所述流动相配制成浓度为10～200mg/ml的溶液。根据按照实施例1中的HPLC分析条件获得的HPLC色谱图，分别收集对应的色谱峰的洗脱液，挥干溶剂得两份样品。
2、高效液相色谱/二极管阵列检测器分析
采用配有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪Waters 2695_996，按实施例1中的HPLC分析条件，对步骤1中制备的样品进行测定。通过二极管阵列检测器确定两种样品的吸收波长。由实验结果可知，两种样品的紫外吸收谱线完全一致。
3、高效液相色谱/质谱检测器分析
仪器：Thermo Finnigan TSQ Quantum液相色谱/质谱联用仪
测定条件：流动相为甲醇∶水(90∶10)；流速为0.4ml/min；ESI源，正离子检测，喷射电压4kv，毛细管柱温度300℃；用甲醇溶解样品，进样器进样10μl。
测定结果：在四烯甲萘醌反式异构体样品的一级质谱图中，m/z445是准分子离子峰[M+H]+，出现了m/z462[M+NH4]+，m/z467[M+Na]+准分子离子峰，在四烯甲萘醌的二级质谱图中，m/z187是其主要碎片离子峰；
在四烯甲萘醌顺式异构体样品的一级质谱图中，m/z445是准分子离子峰[M+H]+，出现了m/z462[M+NH4]+，m/z467[M+Na]+准分子离子峰，在顺式异构体样品的二级质谱图中，m/z187是其主要碎片离子峰；与反式异构体样品的质谱图一致，参见表4。
表4 高效液相色谱/质谱检测器分析
| 物质 | 准分子离子峰 | 碎片离子(归属) |
| 四烯甲萘醌反式异构体 | 445[M+H]+462[M+NH4]+467[M+Na]+ | m/z363、295、253、225、187、149、135、109等一系列碎片离子峰，m/z187是基峰。 |
| 四烯甲萘醌顺式异构体 | 445[M+H]+462[M+NH4]+467[M+Na]+ | m/z363、295、253、227、187、149、135、109等一系列碎片离子峰，m/z187是基峰。 |
4、高分辨质谱分析
仪器：Bruker公司APEX II型傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICR-MS)
质谱方法：P-SIMS(正离子二次离子质谱)，基质为甘油或间-硝基苄醇。
测试单位：北京质谱中心
测定结果：在四烯甲萘醌反式异构体的质谱图中，m/z446是准分子离子峰[M+2H]+，分子式为C31H42O2，分子量为446.32，m/z186、187是其主要碎片离子峰；在其顺式异构体的质谱图中，m/z446是准分子离子峰[M+2H]+，m/z186、187是其主要碎片离子峰，与反式异构体的质谱图一致。见表5。
表5 高分辨质谱分析
Claims (10)
1.一种维生素K2类药物中顺式异构体的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述方法采用硅胶为填料的正相色谱柱以及由一种选自正己烷、正戊烷、石油醚、环己烷、异辛烷和正庚烷中的低极性溶剂和一种选自正丁醚、异丙醇、正戊醇、四氢呋喃、二氯甲烷和乙醇中的高极性溶剂组成的流动相。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述维生素K2类药物为具有下式所示结构的化合物：
其中，n的范围为1-10。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述维生素K2类药物为四烯甲萘醌。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的组成为：按体积比，低极性溶剂：高极性溶剂＝100-60：0-40；优选地，按体积比，低极性溶剂：高极性溶剂＝99-70：1-30。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的组成为：按体积比，正己烷：正丁醚＝100-60：0-40。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的组成为：按体积比，石油醚：正戊醇＝99-70：1-30。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中采用二极管阵列检测器。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的检测波长为200nm-380nm，优选为270nm。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用避光操作。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的进样量小于0.8μg。
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