CN101444230A - 一种新型茅苍术接种剂生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业种子领域，具体涉及一种利用茅苍术内生真菌或者益生菌生产茅苍术接种剂的方法。其方法具体是：将茅苍术内生真菌或益生菌活化，在含有马铃薯浸汁、茅苍术浸汁、葡萄糖液体培养基或者含有茅苍术秸秆的固体培养基上培养后，添加少量增稠剂或者保水剂，用于茅苍术种子浸种、移栽浸根或者直接添加到根际土壤中。本接种剂的生产不受环境影响，生产周期短，生产工艺简单，生产时间和产量易于控制，作用明显。采用浸泡种子，浸泡植物根或浇灌，以及直接添加于土壤的方法使其作用于植物，方法简单，易操作，用量少，成本低且均能收到良好效果。

Description

一种新型茅苍术接种剂生产方法

技术领域

本发明属于农业应用微生物技术领域，具体涉及一种茅苍术接种剂生产方法，该方法生产的菌剂能克服或消除茅苍术连作障碍。

背景技术

茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.)DC.是我国民间常用的菊科苍术属多年生药用植物，始载于《神农本草经》，性辛、苦、温、归脾、胃、肝经。具有燥湿健脾、祛风散寒、明目作用。茅苍术为江苏省著名地道药材，中医临床使用历史悠久，其活性成分主要是β-桉树醇、苍术酮、茅术醇以及聚乙炔类成分苍术素，主治脘腹胀满、泄泻、水肿、风湿痹痛、风寒感冒等。近年来，随着国际市场对苍术的需求量日益增加，茅苍术被掠夺性采挖，加之对茅苍术生态环境的人为破坏，造成茅苍术资源的枯竭，使其濒临灭绝。

一些植物，连续多年在同一田块上种植，常会出现黄化、僵苗、甚至大片植株死亡，严重地影响产量和品质的提高。这种现象在栽培学上被称为连作障碍。引起植物连作障碍的原因主要有土壤养分失衡、土壤微生物群落结构改变、植物毒素物质增加及土壤物理化学性质改变等。郭兰萍等通过苍术根茎及根际土水提物生物活性研究及化感物质的鉴定，提示自毒作用导致了栽培苍术连作障碍。同时通过对栽培苍术根际土壤微生物变化的研究，认为多年栽培苍术病虫害的发生，可能与其根际区土壤微生物数量和群落结构的改变所引起的连作障碍有关。

而为了挽救这一品种，近年来国家规划了大量项目，希望解决这一问题。同时我国近年来在茅苍术研究领域取得了许多重要成果。不少地方纷纷开始对苍术进行引种栽培，但由于不能解决茅苍术的连作障碍，茅苍术资源开发还是存在很多问题：(1)茅苍术种子的发芽率低，不能为大规模种植提供稳定的种源，(2)人工栽培有难度，茅苍术生长缓慢，茅苍术抗逆性差，喜阴凉，不耐热，不耐涝；(3)茅苍术栽培种植中病虫害严重，并随栽培年限增加，其发病率和死亡率均升高，王义勋等在中药材规范化种植(GAP)重要基地湖北省孝昌县和英山县调查发现苍术黑斑病的发生十分严重，一般田块减产约10％～15％，发病严重的田块产量损失高达90％以上。这给人工栽培造成了很大的困难。所以我们认为要解决苍术资源开发的问题必须要解决它的连作障碍。

内生菌是指存在于健康植物组织器官中，不形成明显致病性的一类微生物。目前研究表明，所有被研究过的植物中都有内生菌的存在。内生菌研究是提高种子发芽率，加快药材生长，提高抗逆性，促进有效物质积累维持药材品质从而解决连作障碍的一个有希望的方向。感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势，比未感染内生菌的植株更具生存竞争力。莫文萍等发现盐促生菌Rs1524处理棉花后，发芽率比对照提高了11.8％，叶小梅等发现经102菌稀释液处理的青菜、番茄种子的发芽率及根长显著提高，高玉葆等研究表明，内生菌可以促进黑麦草抗旱，抗逆境，陈晓梅等在离体培养条件下，还发现内生真菌与金钗石斛共生培养能影响金钗石斛的生长和总生物碱的含量，提高多糖的含量。有些内生真菌对自毒物质有一定的分解能力，因此利用内生真菌可以解决或缓解自毒作用。

江苏茅山地区的苍术，作为苍术道地药材，近年来已无法形成商品收购。而由于连作障碍导致的种子发芽率低、生长缓慢、抗逆性、抗病虫能力差、品质不稳定，栽培一直不能获得成功，无法大规模生产，而国内一直不能解决。我们实验表明了接种茅苍术内生真菌或者益生菌将是一个有效途径，用益生菌或者茅苍术的内生真菌制剂来克服或消除作障碍目前无人报道，该菌剂生产方法无专利。

发明内容

本发明的目的是提供一种茅苍术接种剂及制备方法，从而大规模栽培药用植物茅苍术，挽救这一濒危药用植物并使其正常生产。

我们通过实验发现从茅苍术分离到的内生菌极显著地提高发芽率，同时促进茅苍术的生长，提高抗逆性，抗病抗虫能力，刺激活性物质的更多的积累。我们认为从茅苍术分离到的内生菌可以通过改善土壤理化状况、培肥地力、提高土壤养分利用率、分解自毒物质、从而克服或消除连作障碍，可以有效减少农药等的使用，从而减少农业环境污染保护生态的作用，属于绿色农业，同时有驱避地下害虫的作用抵抗病原菌的作用。在多种植物上使用植物益生菌均表明，连作障碍可以通过其使用得到减轻。

本发明所说的一种茅苍术接种剂的制备方法，是将益生菌或茅苍术内生真菌活化，在含有茅苍术浸汁的液体培养基或者含有茅苍术秸秆的固体培养基上培养，得到接种剂。

上述方法中，菌种经活化、培养后，还可添加增稠剂或者保水剂，制得产品。

利用本发明方法可得到液体或固体的接种剂，其中液体的接种剂可以用于浸种、灌根或浸根，固体的接种剂用于移栽时直接添加到根部土壤中。

在接种剂制备过程中，添加有茅苍术浸汁或秸秆的目的是：增加菌种生长速度，提供菌种生长碳源，诱导菌种适应植物体内环境，有利于建立共生关系。

本发明中所说的液体培养基最好是按重量计含有20％马铃薯浸汁、茅苍术浸汁(1％)、蔗糖(2％)的培养基。

所说的增稠剂可以是按重量计的0.1％琼脂或者0.1％明胶或者0.1％多糖。

本发明的一个具体的技术方案是：从4℃冰箱取出菌种，转接到PDA斜面，25℃生长7天，倒入无菌水，刮取菌丝，转接入PDA液体培养基，25℃，150r/min发酵培养7天。接入固体发酵培养基(包含麸皮，茅苍术秸秆，少量稻壳，少量无机盐)，25-30℃培养7天。得到产品。用于直接加到茅苍术栽培土壤中。

本发明的另一个具体的技术方案是：从4℃冰箱取出菌种，转接到PDA斜面，25℃生长7天，倒入无菌水，刮取菌丝，转接入PDA液体培养基，25℃，150r/min发酵培养7天。作为发酵种子，接入发酵罐；5L罐装入3L发酵液，接种量：20％，25℃通气培养3d。用作茅苍术种子发芽时的浸泡接种。

本发明的另一个具体的技术方案是：从4℃冰箱取出菌种，转接到PDA斜面，25℃生长7天，倒入无菌水，刮取菌丝，转接入PDA液体培养基，25℃，150r/min发酵培养7天。作为发酵种子，接入发酵罐；5L罐装入3L发酵液，接种量：20％ 25℃通气培养3d。发酵结束加0.1％琼脂或明胶作为增稠剂，搅拌均匀。用于茅苍术移栽浸根。

所说的益生菌和茅苍术内生真菌，包括对茅苍术生长有益的真菌和从健康茅苍术内部分离的真菌。如：小菌核菌(Sclerotium sp.)、小克银汉霉(Cunninghamella sp.)、孔球孢霉(Gilmaniella sp.)等。本发明推荐以下菌种。

表1 部分内生菌目录

 

菌种名称	拉丁名	菌种来源
			刺孢小克银汉霉	Cunninghamella echinulata thaxter	中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)索取编号31576
孔球孢霉	Gilmaniella sp.	中国林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC)索取编号80868
			拟茎点霉	Phomopsis sp.	CFCC 81894
拟茎点霉	Phomopsis fukushii	CFCC 81338
			小菌核菌	Sclerotium delphinii	美国模式菌株保藏中心(ATCC)索取编号15200
孔球孢霉	Gilmaniella sp.	南京师范大学从茅苍术中分离并保藏，菌株编号AL12(广西植物，28(2)：252-260；2008年3月)
			小克银汉霉	Cunninghamella sp.	南京师范大学从茅苍术中分离并保藏，菌株编号AL4(广西植物，28(2)：252-260；2008年3月)
小菌核菌	Sclerotium sp.	南京师范大学从茅苍术中分离并保藏，菌株编号AL3(广西植物，28(2)：252-260；2008年3月)

表2 部分益生菌目录

 

菌种名称	拉丁名	菌种来源
			康氏木霉	Trichoderma koningii	美国模式菌株保藏中心(ATCC)索取编号201709
哈茨木霉	T.harzianum	ATCC 56678
			绿色木霉	T.viride	ATCC 20476
木素木霉	T.lignorum	ATCC 38500
			钩木霉	T.hamatum	ATCC 204435
长枝木霉	T.longibrachiat um	ATCC 18648
			多孢木霉	T.polysporum	ATCC 60004
枝顶孢霉	Acremonium sp	ATCC 11550
				A.coenophialum	ATCC 62374
拟茎点霉	Phomopsis sp.	南京师范大学从重阳木内部分离并保藏，菌株号B3(环境科学学报，第24卷第1期，2004年1月)

所说的连作障碍是指一些植物，连续多年在同一田块上种植，常会出现黄化、僵苗、甚至大片植株死亡，严重地影响产量和品质的提高。

所说的固体发酵培养基包含麸皮(或其它适合作为替代碳源和氮源的农业废弃物)，以及茅苍术秸秆，稻壳，少量无机盐。

本发明的方法采用益生菌或者茅苍术内生真菌生产茅苍术接种剂，通过发酵得到菌液，搅拌均匀得到接种剂，可以用于浸种、灌根或浸根。或把菌液在固体培养基发酵直接添加于土壤。我们的实验结果表明茅苍术真菌接种剂可以极显著地提高茅苍术种子的发芽率，同时促进茅苍术的生长，提高抗逆性，抗病抗虫能力，刺激活性物质的更多的积累。我们认为与茅苍术共生的真菌接种到根部可以通过改善土壤理化状况、培肥地力、提高土壤养分利用率、分解自毒物质、减小病害的作用、从而克服或消除连作障碍。

本接种剂的生产不受环境影响，生产周期短，生产工艺简单，生产时间和产量易于控制，作用明显。采用浸泡种子，浸泡植物根或浇灌，以及直接添加于土壤的方法使其作用于植物，方法简单，易操作，用量少，成本低且均能收到良好效果。益生菌或内生菌随凋落物等在植物和土壤中迁移定植，一段长的时期仍然存在和发挥作用，因此本接种剂作用持久，可以有效减少农药等污染环境的化学物质的使用，从而减少农业环境污染保护生态的作用，属于绿色农业。

附图说明

图1是本发明的简单工艺流程图

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并按照数据进一步详细地描述本发明。应理解这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何形式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源，商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均于首次比标明的内容相同。

以下实施例中的制备过程如图1所示。

实施例1：

菌种的活化与种子液的制备：菌种小菌核菌ATCC15200(Sclerotium delphinii)从4℃冰箱取出，转接到PDA斜面，25℃生长7天，倒入无菌水，刮取菌丝，转接入添加含1％重量茅苍术枝叶提取物的PDA液体培养基，25℃，摇床150r/min发酵培养7天。作为种子，利用GBCS-5型全自动发酵罐发酵罐发酵菌丝；5L罐装入3L发酵液，接种量：20％。培养4天，获得发酵液。

本发酵液用作种子发芽接种剂。

实施例2：

菌种拟茎点霉B3菌株(Phomsis sp.)从4℃冰箱取出，转接到PDA斜面，25℃生长7天，倒入无菌水，刮取菌丝，转接入PDA液体培养基，25℃，摇床150r/min发酵培养7天。接入固体发酵培养基(麸皮2％，茅苍术秸秆10％，稻壳47.5％，无机盐0.5％，水40％)，固体发酵10天左右，按干料1％重量的保水剂(高吸水性树脂)加入料中均匀混合。

本制品作为土壤中接种剂使用。

实施例3：

菌种刺孢小克银汉霉ACCC31576(Cunninghamella echinulatathaxter)从4℃冰箱取出，转接到PDA斜面，25℃生长7天，倒入无菌水，刮取菌丝，转接入添加少量茅苍术枝叶提取物的PDA液体培养基，25℃，摇床150r/min发酵培养7天作为发酵罐发酵种子。利用GBCS-5型全自动发酵罐；5L罐装入3L发酵液，接种量：20％。好氧发酵，发酵培养结束后加1％琼脂或明胶作为增稠剂，搅拌均匀。

本发酵液用于移栽浸根。

实施例4：

菌种孔球孢霉CFCC80868(Gilmaniella sp.)从4℃冰箱取出，转接到PDA斜面，25℃生长7天，倒入无菌水，刮取菌丝，转接入添加少量茅苍术枝叶提取物的PD液体培养基，25℃，摇床150r/min发酵培养7天。作为种子，利用GBCS-5型全自动发酵罐发酵菌丝；5L罐装入3L发酵液，接种量：20％。培养4天，获得发酵液。

本发酵液用作种子发芽接种剂。

实施例5：

菌种枝顶孢霉ATCC11550(Acremonium sp.)从4℃冰箱取出，转接到PDA斜面，25℃生长7天，倒入无菌水，刮取菌丝，转接入PDA液体培养基，25℃，摇床150r/min发酵培养7天。接入固体发酵培养基(麸皮2％，茅苍术秸秆10％，稻壳47.5％，无机盐0.5％，水40％)，固体发酵10天左右，按干料1％的保水剂(高吸水性树脂)加入料中均匀混合。

本制品作为土壤中接种剂使用。

实施例6：

菌种拟茎点霉CFCC81338(Phomopsis fukushii)从4℃冰箱取出，转接到PDA斜面，25℃生长7天，倒入无菌水，刮取菌丝，转接入添加少量茅苍术枝叶提取物的PDA液体培养基，25℃，摇床150r/min发酵培养7天作为发酵罐发酵种子。利用GBCS-5型全自动发酵罐；5L罐装入3L发酵液，接种量：20％。好氧发酵，发酵培养结束后加1％琼脂或明胶作为增稠剂，搅拌均匀。

本发酵液用于移栽浸根。

实施例7：

菌种哈茨木霉ATCC56678(Trichoderma harzianum)从4℃冰箱取出，转接到PDA斜面，25℃生长7天，倒入无菌水，刮取菌丝，转接入添加少量茅苍术枝叶提取物的PDA液体培养基，25℃，摇床150r/min发酵培养7天作为发酵罐发酵种子。利用GBCS-5型全自动发酵罐；5L罐装入3L发酵液，接种量：20％。好氧发酵，发酵培养结束后加1％琼脂或明胶作为增稠剂，搅拌均匀。

本发酵液用于移栽浸根。

实施例8：

将实施例2的拟茎点霉B3菌株(Phomsis sp.)固体发酵培养物(200公斤/亩)作为土壤中接种剂施入有连作障碍的土壤中。三个月后与对照相比，土壤微生物均发生了积极变化，土壤中总微生物数量增加，多样性增加，细菌数量显著增加，霉菌数量减少，放线菌基本稳定，土壤中细菌数/真菌数比增加。反映土壤微生物微生物区系发展平衡。土壤蔗糖酶比对照增加了50％，土壤脲酶比对照增加了38％。实验效果表明，栽种的茅苍术和对照相比长势良好，从而达到克服连作障碍的效果。

实施例9：

分别将实施例1小菌核菌(Sclerotium delphinii)和实施例4孔球孢霉(Gilmaniellasp.)发酵液作为种子发芽接种剂接种茅苍术种子，提高了发芽率，和对照相比分别提高了18.2％、8.05％。生长四个月后测量生长指标，和对照相比，小菌核菌(Sclerotium sp.)、孔球孢霉(Gilmaniella sp.)均促进了生长，鲜重分别提高了36.6％、13.3％，须根数分别提高了76.0％、65.9％。

实施例10：

分别将实施例3的刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata thaxter)接种剂、枝顶孢霉(Acremonium sp.)接种剂等在移栽时浸根。和对照相比，移栽成活率分别比对照提高了4.4％、3.2％。生长18个月后测量生长指标，和对照相比，干重分别提高了15.3％、20.2％，同时和对照相比单位挥发油含量分别提高了40.8％、31.3％。

实施例11：

将哈茨木霉(Trichoderma harzianum)在移栽时施加到根部土壤。生长18个月后测量生长指标，和对照相比，干重提高了5.6％，茅苍术灰斑病下降11.5％，根腐病下降9.6％。

Claims (4)

1、一种茅苍术接种剂的制备方法，其特征在于，将益生菌或茅苍术内生真菌活化，在含有茅苍术浸汁的液体培养基或者含有茅苍术秸秆的固体培养基上培养，得到接种剂。

2、根据权利要求1所说的茅苍术接种剂的制备方法；其特征在于，菌经活化培养后，添加增稠剂或者保水剂，得到接种剂。

3、根据权利要求2所说的茅苍术接种剂的制备方法；其特征在于，所说的增稠剂是按重量计的0.1％琼脂或者0.1％明胶或者0.1％多糖。

4、根据权利要求1所说的茅苍术接种剂的制备方法；其特征在于，所说的益生菌或者从茅苍术分离的内生真菌是：小菌核菌、小克银汉霉、孔球孢霉、枝顶孢霉、拟茎点霉。

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