CN101443049A - 表现出内皮细胞特异性的启动子和使用其调节血管生成的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了表现出内皮细胞特异性启动子活性的分离多核苷酸序列、新顺式调节元件及其使用方法，所述方法使得能够治疗特征为异常新血管形成或细胞生长的疾病。

Description

表现出内皮细胞特异性的启动子和使用其调节血管生成的方法
发明领域和背景
本发明涉及可用于在受试者的特定组织区域中调节血管生成的核酸构建体、药物组合物和方法。更具体地讲，本发明涉及表现出内皮细胞特异性启动子活性的分离多核苷酸序列及其使用方法，再更具体地讲，涉及在内皮细胞中表现出增加的活性和特异性的修饰型前内皮素原-1(PPE-1)启动子以及核酸构建体，它们可用于在特定细胞亚型中激活细胞毒性，由此使得能治疗特征在于异常新血管形成或细胞生长的疾病，或者可用于诱导新血管生长，由此使得能治疗局部缺血疾病。本发明进一步涉及PPE启动子的修饰，所述修饰增强其响应于包括低氧和血管生成在内的生理条件的表达，并涉及新血管生成内皮特异性联合疗法。
血管生成：
血管生成指新血管的生长，这是一个主要依赖于毛细血管内皮细胞的运动、增殖和管形成的过程。在血管生成期间，内皮细胞从其静息状态摆脱并迅速增殖。尽管尚不知晓负责将细胞转变成血管生成表型的分子机制，但导致形成新血管的事件次序已有充分的文件记载[Hanahan，D.，Science 277，48-50，(1997)]。血管生长需要内皮萌芽[Risau，W.，Nature386，671-674，(1997)]或套叠[Patan，S.等；Microvasc.Res.51，260-272，(1996)]。在第一条途径中，可发生以下顺序的事件：(a)血管基底(通常是毛细血管后小静脉)和间质基质溶解；(b)内皮细胞向刺激物迁移；(c)尾随前导内皮细胞之后的内皮细胞增殖；(d)在内皮索(array)/芽中形成腔(成管)；(e)通过芽的汇合性吻合形成分支和回路，以允许血液流动；(f)周细胞(即内皮周细胞和平滑肌细胞)包被血管；和(g)在不成熟血管周围形成基底膜。新血管还可经第二条途径形成：将间质组织柱插入预先存在的血管的腔中。这些柱随后的生长及其稳定化导致血管腔分隔和局部血管网络重建。
血管生成在低氧浓度(局部缺血和肿瘤转移等)条件下发生，且因此在新血管形成中可能是一个重要的环境因素。包括促红细胞生成素、转铁蛋白及其受体、大多数葡萄糖转运和糖酵解途径基因、LDH、PDGF-BB、内皮素-1(ET-1)、VEGF和VEGF受体在内的几种基因的表达在低氧条件下被低氧诱导型因子(HIF-1)与调节这些基因转录的低氧反应元件(HRE)的特异性结合所诱导。这些基因响应低氧条件的表达，使细胞能够在低氧条件下发挥作用。
血管生成过程受到由肿瘤细胞或正常细胞分泌的血管生成生长因子以及胞外基质组合物和内皮酶活性的调节(Nicosia和Ottinetti，1990，Lab.Invest.，63，115)。在血管生成初期，内皮细胞芽通过预先存在的血管基底膜中的间隙露出(Nicosia和Ottinetti，1990，参见上文；Schoefl，1963，Virehous Arch，Pathol.Anat.337，97-141；Ausprunk和Folkman，1977，Microvasc.Res.14，53-65；Paku和Paweletz，1991，Lab.Invest.63，334-346)。当新血管生成时，它们的基底膜经历复杂的结构和组成变化，这些变化被认为影响血管生成反应(Nicosia等，1994，Exp Biology.164，197-206)。
血管生成和病理学：
有多种血管生成因子掌控血管生成过程。据了解，在病变期间，促血管生成因子和抗血管生成因子之间的精密平衡被破坏，由此引起非自限性的内皮细胞和内皮周细胞增殖。尽管在正常条件下血管生成是高度受调节的过程，但许多疾病(特征为“血管生成性疾病”)由持续不受调节的血管生成引起。在这样的病状中，不受调节的血管生成或者可直接引起特定疾病，或者可使现有的病理状况恶化。例如，眼新血管形成已被指是失明的最主要病因，且是大约20种眼病的病理学基础。在某些预先存在的状况如关节炎中，新形成的毛细血管侵入关节并破坏软骨。在糖尿病中，在视网膜中形成的新毛细血管侵入玻璃体液，从而引起出血和失明。直到最近，对在眼新血管形成疾病、关节炎、皮肤病和肿瘤中出现的血管生成仍难以在治疗上进行抑制。
不平衡的血管生成以各种病理状况为典型特征，且通常支持病理状态的演进。例如，在实体瘤中，血管内皮细胞以快达正常组织中的那些细胞约35倍的速度分裂(Denekamp和Hobson，1982Br.J.Cancer 46：711-20)。这样的异常增殖是肿瘤生长和转移所必需的(Folkman，1986Cancer Res.46：467-73)。
血管内皮细胞增殖在慢性炎症疾病例如类风湿性关节炎、牛皮癣和滑膜炎中也是重要的，其中这些细胞响应于在炎症部位中释放的生长因子而增殖(Brown和Weiss，1988，Ann.Rheum.Dis.47：881-5)。
在动脉粥样硬化中，血管中内皮细胞的单克隆扩增触发动脉粥样硬化斑块的形成(Alpern-Elran 1989，J.Neurosurg.70：942-5)。此外，在糖尿病性视网膜病中，失明被认为是由眼内基底膜变化所引起的，眼内基底膜的变化刺激不受控的血管生成和视网膜消耗(West和Kumar，1988，Lancet 1：715-6)。
内皮细胞还参与移植排斥。在同种异体移植物排斥发作中，内皮细胞表达促粘附决定簇，其指导白细胞运输到移植部位。据认为，白细胞粘附分子对移植物中的内皮细胞的诱导可以被局部释放的细胞因子所诱导，正如已知在炎性损害中所发生的。
另一方面，消除的血管生成在疾病发展例如动脉粥样硬化诱发的冠状动脉阻塞(如心纹痛)、意外损伤或外科手术后的坏死损害、或胃肠损害如溃疡中也是一个主要因素。
因此，调节或改变血管生成过程在限制该过程促成潜在病状的病理演进方面以及提供研究其病因学的有价值方法方面可具有重要的治疗作用。
最近，在开发内皮调节剂(无论是设计为抑制性的还是刺激性的)方面已取得显著进步。例如，施用在置于成年大鼠腹膜腔中的、胶原蛋白包被基质内的βFGF蛋白，导致产生充分血管形成并正常灌注的结构(Thompson等，PNAS 86：7928-7932，1989)。据报道，将βFGF蛋白注射到冠状动脉闭塞期间的成年犬冠状动脉中，导致心肌功能障碍减轻、心肌梗塞缩小和血管分布增加(Yanagisawa-Miwa等，Science 257：1401-1403，1992)。业已报道在心肌局部缺血动物模型中使用βFGF蛋白获得了相似结果(Harada等，J Clin Invest 94：623-630，1994，Unger等，AmJ Physiol 266：H1588-H1595，1994)。
然而，对于长期功能性血管的大量形成，需要重复或长期递送上述蛋白因子，从而限制了它们在临床情形中的应用。此外，除与血管生成调节因子生产相关的高成本之外，这些因子的有效递送需要使用待置入冠状动脉内的导管，从而进一步增加了治疗的费用和难度。
因此，所有抗血管生成治疗的基本目标都是使增殖微血管的病灶回复到其正常静息状态，并阻止其再生长[Cancer：Principles & Practice ofOncology，第五版，Vincent T.DeVita，Jr.，Samuel Hellman，Steven A.Rosenberg编辑，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia.(1997)]。同样，促血管生成治疗不仅涉及恢复所需要的血管生成因子，而且涉及重建它们之间的正确平衡(Dor等，Ann NY Acad Sci 2003；995：208-16)(关于促血管生成治疗和抗血管生成治疗的详尽综述参见Zhang等，Acta Biochand Biophys Cinica，2003：35：873-880，和Mariani等，MedGenMed 2003，5：22；和Folkman，Semin.Onc 2002，29：15-18)。
抗血管生成治疗：
鉴于抗血管生成治疗可延缓肿瘤生长演进(例如视网膜病、良性的和恶性的血管生成性肿瘤)，其是强有力的临床方法。
一般来说，每一种由不受控毛细血管生长引起的疾病，如糖尿病性视网膜病、牛皮癣、关节炎、血管瘤、肿瘤生长和转移，都是抗血管生长治疗的标靶。
例如，超过临床上潜伏大小(例如几mm3)的实体瘤的进行性生长需要连续的新血管生成，即已知为肿瘤血管生成的过程。肿瘤生长和转移是血管生成依赖性的。肿瘤必须连续地刺激新毛细血管的生长，以递送营养和氧供肿瘤自身生长。因此，抗血管生成肿瘤治疗的基础在于阻止肿瘤血管生成或者选择性地破坏肿瘤中已存在的血管(血管靶向疗法)。
最近，已开发出过多抗血管生成剂来治疗恶性疾病，其中一些已处于临床试验中(关于综述，参见Herbst等(2002)Semin.Oncol.29：66-77，和Mariani等，MedGenMed 2003；5：22)。
研究的大部分肿瘤抗血管生成治疗标靶是在人中调节血管生成的主导过程，即血管内皮生长因子(VEGF)与其受体(VEGFR)的相互作用。调节VEGFR的促血管生成作用的试剂包括(i)针对VEGF蛋白本身或其受体的抗体(例如rhuMAb VEGF，阿瓦斯丁(Avastin))；(ii)针对VEGFR酪氨酸激酶的小分子化合物(例如，ZD6474和SU5416)；(iii)靶向VEGFR的核酶。
其它新的血管生成抑制剂包括具有独特的抗肿瘤和抗血管生成特性的雌二醇的天然代谢物2-甲氧雌二醇(2-ME2)，以及分别为纤溶酶原和胶原蛋白XVIII的蛋白酶剪切片段的制管张素和内皮抑制素。
尽管在临床前模型中有前景，但迄今为止在临床试验测试的所有抗血管生成剂的全身施用都显示出有限的成功率和相当大的毒性，包括血小板减少症、白细胞减少和咯血。这些结果提示，目前的肿瘤抗血管生成剂作为晚期恶性肿瘤疗法的用途可能有限。O′Reilly等已经表明，在抗血管生成治疗开始至抗肿瘤作用出现之间的潜伏期可能导致在对治疗起反应之前的初期肿瘤演进[O′Reilly S等，(1998)Proc Am Soc ClinOncol 17：217a]。而且，最近的研究提示，毛细血管床之间的血管生成调节可能不同，从而提示抗血管生成治疗可能需要基于器官/组织特异性来最优化[Arap等(1998)Science 279：377-380]。
有趣的是，当对冠状动脉病患者的心肌局部缺血实施针对平滑肌细胞增殖的抗血管生成疗法(例如肝素、肝素-肽治疗)时，获得的效果也不理想[Liu等，Circulation，79：1374-1387(1989)；Goldman等，Atherosclerosis，65：215-225(1987)；Wolinsky等，JACC，15(2)：475-481(1990)]。与利用这些试剂治疗心血管疾病有关的各种限制包括：(i)对心血管疾病患者产生不可耐受的风险水平的全身毒性；(ii)妨碍外科手术后的血管伤口愈合；(iii)可能损害周围的内皮和/或其它中间平滑肌细胞。
因此，这些以及其它与全身施用抗血管生成因子相关的固有障碍(即基于所需体外不稳定性和高剂量的制造限制；和归咎于次最佳效应的单次快速静脉施用的峰动力学)限制了血管生成因子在新血管形成相关疾病治疗中的有效使用。
用于癌症的抗血管生成治疗
在原发性肿瘤以及转移中的肿瘤细胞增殖由于营养供应受限导致凋亡速率增加而被抵消。只要发生“血管生成转变”和营养供应对肿瘤大小足够，休眠的原发性或转移性肿瘤就开始发展成转移。
血管生成转变可经几种机制发生：
1.通过癌基因上调促血管生成基因，例如VEGF和bFGF，或下调血管抑制物(angio-suppressor)，例如血小板反应蛋白。
2.通过肿瘤相关的低氧条件活化低氧诱导型因子-1(HIF-1)。
3.肿瘤细胞诱导的肿瘤床成纤维细胞的促血管生成蛋白分泌。
4.骨髓内皮先祖(progenitor)运输入肿瘤。
表1：肿瘤血管生成的内源性调节物
Figure A200780014285D00201
·血管内皮生长因子(VEGF)        ·P53
·成纤维细胞生长因子1(FGF1)     ·血小板反应蛋白-1*
·成纤维细胞生长因子2(FGF2)     ·血小板反应蛋白-2
·血小板衍生生长因子(PDGF)      ·组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)
·促血管生成素2*                ·制管张素
·促血管生成素1**               ·内皮抑制素
·转化生长因子-β*(TGF-β)        ·抗血管生成抗凝血酶III
·肿瘤坏死因子-α*(TNF-α)        ·血管生成抑制性C-X-C趋化因子
·白细胞介素-8(IL-8)            (PF4、IP-10、MIG)
·血小板衍生内皮细胞生长因子    ·色素内皮衍生因子(PEDF)
(PD-ECGF)                       ·白细胞介素-12(IL-12)
·肝细胞生长因子(HGF)           ·干扰素(INF)-αβγ
                  *剂量依赖性
                  **弱血管生成活化剂
血管生成的活化剂和抑制剂(参见上文的表1)之间的相对平衡对将肿瘤保持在静息状态是重要的。降低抑制剂水平或增加活化剂水平改变了平衡，且导致肿瘤血管生成和肿瘤生长。
当肿瘤组织距最近血管的厚度超过150-200μm时，向肿瘤组织的氧扩散是不够的。所以，根据定义，超过这些尺寸的所有肿瘤已经打开血管生成。肿瘤细胞增殖率与血管供应无关。但是，血管生成转变一发生，凋亡速率就降低达1/3-1/4(24)。而且，营养供应和分解代谢物释放并不是血管生成性血管对肿瘤凋亡减退的唯一影响因素。微血管系统内皮细胞还分泌进一步抑制肿瘤细胞凋亡的抗凋亡因子、促分裂原和存活因子，例如b-FGF、HB-EGF、IL-6、G-CSF、IGF-1和PDGF。
肿瘤细胞由于高突变率而在遗传上不稳定，这为它们提供了超越天然细胞的优势。例如，p53基因中的突变抑制凋亡率。而且，促血管生成或血管生成抑制剂控制的癌基因改变(例如ras癌基因)可诱导血管生成转变。但是，高突变率不是癌症遗传不稳定性的唯一机制。有证据表明肿瘤细胞吞噬“凋亡体”，从而导致非整倍性和遗传不稳定性的进一步增加。总而言之，癌症依赖于血管生成。由于遗传不稳定性，癌症可配合促血管生成细胞因子平衡，该平衡抑制其凋亡率并可实现转移接种。
人脉管系统包含一兆(trillion)以上的内皮细胞。正常静息内皮细胞的寿命超过1000天。尽管参与肿瘤发展的血管生成内皮细胞迅速增殖，但它们因其基因组稳定性、及由此产生的最小的药物抗性和发展出突变克隆的低可能性而与肿瘤细胞不同。而且，因为肿瘤发展的限速因素是血管生成，所以针对血管生成性内皮细胞的治疗能产生高效治疗模式。实际上，几种抗血管生成物质可用作全身治疗的潜在候选物。但是，由于这些试剂是蛋白，且其施用因此有赖于频繁的静脉内施用，其应用提出了严重的生产和保持难题。递送抗血管生成基因为持续的蛋白分泌提供了潜在的解决方法。
随着调节血管生成过程的新基因的鉴定，人们一直试图采用体基因治疗来突破这些限制。虽然投入了很大的努力致力于开发癌症、心血管和外周血管疾病的基因治疗方法，但有效且特异性的基因递送仍存在很大障碍[关于综述参见Feldman AL.(2000)Cancer 89(6)：1181-94]。通常使用重组病毒载体作为穿梭载体、利用目标基因进行基因治疗的主要限制因素是将目标基因特异性地导向靶组织的能力。
克服这些限制的努力包括使用缀合至细胞毒性基因的组织特异性启动子。例如，Jagger等已描述了处于内皮特异性启动子控制下表达的细胞毒性基因靶向内皮细胞，他们利用KDR或E-选择蛋白启动子以在内皮细胞中特异性地表达TNFα[Jaggar RT.等Hum Gene Ther(1997)8(18)：2239-47]。Ozaki等用von-Willebrand因子(vWF)启动子将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)递送到HUVEC[Hum Gene Ther(1996)7(13)：1483-90]。但是，这些启动子仅仅显示出微弱的活性，并且不允许高水平表达。
几种内皮细胞特异性启动子在现有技术中已有描述。例如，Aird等[Proc.Natl.Acad.Sci.(1995)92：7567-571]分离出可赋予组织特异性体内表达的人von Willebrand因子基因的5′和3′调节序列。然而，这些序列仅可介导一种不均一形式的报告转基因表达。在转基因小鼠中处于von Willebrand调节元件调节之下的细菌LacZ报告基因揭示出在卵黄囊和成体脑中的内皮细胞亚群中的转基因表达。然而，在脾、肺、肝、肾、心脏、睾丸和主动脉的血管床中以及在血栓调节蛋白基因座中没有检测到表达。
Korhonen J等[Blood(1995)96：1828-35]分离出促进转基因在小鼠胚胎的整个血管系统中均匀表达的人和小鼠TIE基因启动子。然而，在成体中的表达局限于肺和肾的血管，而在心脏、脑和肝中没有检测到表达。Schlaeger M等获得了相似的结果，他们分离出TIE-2启动子的1.2kb5′侧翼区，并且表明转基因表达限于胚胎小鼠的内皮细胞[Schlaeger TM等，(1995)Development 121：1089-1098]。
因此，这些序列中没有一个在所有发育阶段或成年动物的所有内皮细胞中均一地起作用。此外，这些序列中的一些序列并不局限于内皮。
由Kong和Crystal提出了一种替代方法，该方法包括抗血管生成因子的肿瘤特异性表达。然而，迄今为止，尽管在临床前模型中一些合成的抗血管生成剂与毒性相关，但重组体形式的内源抗血管生成剂的毒性还没有被证实[Kong和Crystal(1998)J.Natl.CancerInst.90：273-76]。
制管张素也已被用作可能的抗血管生成剂(Folkman等，Cell 1997Jan 24；88(2)：277-85)，但由于肿瘤中涉及血管生成调节的因子过多，所以单独的制管张素治疗应非常难以奏效。
迄今为止，有前景的临床实验已表明，像Avastin或Bay-43906
Figure A200780014285D0022093510QIETU
的抗血管生成治疗可通过限制肿瘤周围血管的新生长而减慢转移进展。但是，在其中需要显著的抗血管生成作用来破坏大部分或全部现有血管生成性血管并诱导肿瘤坏死的癌症病理学中，抑制新血管生成和/或部分地破坏它们可能不足够。
前内皮素原-1(PPE-1)启动子
Masaki等在1988年发现的内皮素(ET)由ET-1、ET-2和ET-3这3个基因组成。内皮素-1(ET-1)为21个氨基酸的肽，首先被描述为有效的血管收缩剂和平滑肌细胞促分裂原，由内皮细胞合成。ET-1在血管内皮中表达，尽管在其它细胞如平滑肌细胞、呼吸道和胃肠上皮、神经元和肾小球系膜细胞中也有一些表达。其表达在各种病理生理状况下被诱导，例如低氧、心血管疾病、炎症、哮喘、糖尿病和癌症。内皮素-1触发血管生成因子如VEGF和PDGF的生产并与其相互作用，且因此在血管生成过程中起作用。
Hu等鉴别出位于内皮素-1启动子反义链上的低氧反应元件(HRE)。该元件是低氧诱导型因子-1结合位点，是低氧正调节(人、大鼠和鼠基因的)内皮素-1启动子所必需的。低氧是有效信号，诱导几种基因表达，包括促红细胞生成素(Epo)、VEGF和各种糖酵解酶。核心序列(8个碱基对)在响应于低氧条件的所有基因中都是保守的，且侧翼区与其它基因不同。ET-1低氧反应元件位于GATA-2和AP-1结合位点之间。
Bu等在鼠PPE-1启动子(mET-1)中鉴别出复杂的调节区，其似乎赋予内皮细胞特异性转录活性，并结合局限于内皮细胞的蛋白或蛋白复合物。该区域称为内皮特异性正转录元件，由位于鼠PPE-1启动子的-364bp至-320bp之间的至少3个功能元件组成。全部3个元件都是完整活性所必需的。当将一个或三个拷贝构建入最小mET-1启动子中时，内皮细胞中的体外报告基因表达相比于无元件的最小启动子增加至2-10倍。
美国专利5,747,340讲述了鼠PPE-1启动子及其部分的应用。然而，该专利既没有暗示也没有证明内皮特异性增强子可用于增加用PPE启动子实现的表达水平而同时保留内皮特异性。此外，该专利也没有讲述在低氧条件下PPE-1启动子被诱导至较高的转录水平。
基因指导的酶前药治疗(GDEPT)：
该策略也称为“自杀基因治疗”。其包括将惰性前药在癌细胞中转变为活性细胞毒性试剂。在GDEPT中最广泛使用的两种基因是偶联更昔洛韦(GCV)施用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和偶联5-氟胞嘧啶(5FC)施用的大肠杆菌(E.coli)胞嘧啶脱氨酶(CD)。HSV-TK/GCV系统已经历了广泛的临床前评价以及临床实验。迄今为止，HSV-TK/GCV系统已表现出不显著的副作用，例如发热、GCV全身毒性、骨髓抑制和轻至中度肝毒性。
HSV-TK/GCV系统首先由Kraiselburd等在1976年描述。用含HSV-TK的质粒转染的细胞或用含HSV-TK的载体转导的细胞对包括阿昔洛韦、更昔洛韦(GCV)、伐昔洛韦和泛昔洛韦在内的药物超家族正变得敏感起来。鸟苷类似物GCV在基因疗法的配置中是最有效的药物。HSV-TK阳性细胞产生病毒TK，其将GCV磷酸化成单磷酸GCV(GCV-MP)的效力为人TK的3个数量级高。GCV-MP随后由天然胸苷激酶磷酸化为二磷酸GCV，且最后磷酸化为三磷酸GCV(GCV-TP)。
GCV-TP是有效的DNA聚合酶抑制剂，其通过掺入新生链导致DNA合成终止，从而终止DNA延伸并最终引起细胞死亡。因为GCV主要影响HSV-TK阳性细胞，所以其副作用最小且罕有，且主要包括血小板减少症、嗜中性白细胞减少症和中毒性肾损害。而且，因为GCV毒性基于DNA合成，所以其主要影响增殖细胞。HSV-TK/GCV系统近来已广泛用于癌基因治疗的临床实验。不过，结果令人失望，主要受限于体内低转导百分率。
近期研究已表征了HSV-TK/GCV细胞的细胞毒性机制。他们揭示细胞周期由于G2-M DNA损伤检查点的活化而停滞于S晚期或G2期。发现这些事件导致不可逆的细胞死亡以及与细胞死亡相关的旁观者效应。极度的细胞增大在施用HSV-TK/GCV系统的细胞中是公知的形态学变化。这些形态学变化归因于特异性细胞骨架重排。应激肌动蛋白纤维和粗中间丝网出现在细胞周期停滞之后。
HSV-TK/GCV系统使用称为“旁观者效应”的放大潜力。旁观者效应代表了HSV-TK阳性细胞借助其诱导HSV-TK阴性细胞杀伤的现象。
旁观者效应：旁观者效应首先由Moolten等描述，他们发现HSV-TK阳性细胞和HSV-TK阴性细胞分别为1:9的混合物在加入GCV之后导致完全的细胞杀伤。业已描述了旁观者效应的几种特征：
1.发现旁观者效应高度依赖于细胞-细胞接触。
2.其程度在不同细胞类型中不同。
3.其不限于同质细胞类型，也不限于不同细胞类型的混合物。
4.发现较高水平的HSV-TK表达与较高的旁观者效应相关联。
Culver等首先在体内模型中证实了旁观者效应。他们证实当以不同比率植入HSV-TK阳性肿瘤细胞时肿瘤消退。与体外模型不同，未发现细胞-细胞接触是体内旁观者效应必需的。Kianmanesh等通过在不同的肝叶中植入其中仅有一些为HSV-TK阳性的肿瘤细胞证实了远距离旁观者效应。HSV-TK阳性和阴性病灶都消退。还在不同来源的细胞之间体内证实了旁观者效应。总而言之，当在基因递送系统中实施时，HSV-TK及其旁观者效应利于肿瘤抑制的有效手段。但是，迄今为止，临床研究仅证实了有限的结果。
因此，对于获得高度特异性的、可靠的血管生成特异性启动子和核酸构建体，从而在受试者的特定组织区域中提供有效调节血管生成的新方法，同时避免毒性副作用和表征现有技术抗血管生成方法的有限成功，存在着广泛认可的需求，并且将是高度有利的。
发明概述
按照本发明的一个方面，提供含顺式调节元件的分离多核苷酸，所述顺式调节元件包含共价连接至至少部分SEQ ID NO：16所示序列的至少部分SEQ ID NO：15所示序列，所述分离的多核苷酸能够在真核细胞中指导在转录上与其连接的多核苷酸序列的转录。还提供含该分离多核苷酸的核酸构建体、含本发明的核酸构建体的细胞以及接种了所述细胞的支架。
按照所述优选实施方案的其它特征，提供还含有处于顺式调节元件的调节控制之下的核酸序列的核酸构建体。所述核酸序列还可编码血管生成调节物。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述核酸序列选自VEGF、p55、促血管生成素-1、bFGF和PDGF-BB。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述支架由合成聚合物、细胞粘附分子或胞外基质蛋白组成。
按照所述优选实施方案的其它特征，合成聚合物选自聚乙二醇(PEG)、羟基磷灰石(HA)、聚乙醇酸(PGA)、用编织聚-1-交酯加固的ε-己内酯和1-乳酸[KN-PCLA]、织物(WV-PCLA)、互连多孔羟基磷灰石钙陶瓷(IP-CHA)、聚D，L-乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)、不饱和聚酯(丙二醇-富马酸)共聚物(PPF)、交酯-乙交酯共聚物(PLAGA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)和聚磷腈。
按照所述优选实施方案的其它特征，细胞粘附分子选自整联蛋白、细胞间粘附分子(ICAM)1、N-CAM、钙粘着蛋白、生腱蛋白、gicerin和神经损伤诱导蛋白2(ninjurin2)。
按照所述优选实施方案的其它特征，胞外基质蛋白选自血纤蛋白原、胶原蛋白、纤连蛋白、波形蛋白、微管相关蛋白1D、神经突增生因子(NOF)、细菌纤维素(BC)、层粘连蛋白和明胶。
按照本发明的再一方面，提供在真核细胞中表达目标核酸序列的方法，该方法通过向受试者施用包含目标核酸序列的核酸构建体实施，所述目标核酸序列处于顺式调节元件转录控制之下，所述顺式调节元件含共价连接至至少部分SEQ ID NO：16所示序列的至少部分SEQ ID NO：15所示序列。
按照本发明的又一方面，提供在组织中调节血管生成的方法，该方法通过在所述组织中表达核酸构建体实施，所述核酸构建体包含：(a)内皮细胞特异性启动子；(b)至少一个拷贝的SEQ ID NO：5所示的低氧反应元件；和(c)编码血管生成调节物的核酸序列，所述核酸序列处于所述启动子和所述低氧反应元件调节控制之下。
按照本发明的另一方面，提供在组织中调节血管生成的方法，所述方法通过在所述组织中表达核酸构建体实施，所述核酸构建体含编码血管生成调节物的核酸序列，所述核酸序列处于顺式调节元件调节控制之下，所述顺式调节元件含共价连接至至少部分SEQ ID NO：16所示序列的至少部分SEQ ID NO：15所示序列，由此在所述组织中调节血管生成。
按照所述优选实施方案中的其它特征，施用通过选自以下的方法实施：全身性体内施用、先体外后体内(ex vivo)施用由受试者机体取出的细胞并将细胞随后再导入受试者体内；以及局部体内施用。
按照所述优选实施方案中的其它特征，所述组织是天然组织或工程化组织。
按照所述优选实施方案中的其它特征，所述核酸序列编码促血管生成因子，且调节血管生成为上调血管生成。
按照所述优选实施方案中的其它特征，所述核酸序列编码血管生成抑制剂，且调节血管生成为下调血管生成。
按照本发明的再一方面，提供核酸构建体，其包含：(a)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和(b)第二多核苷酸区，其编码能够在特定组织或细胞中指导所述嵌合多肽表达的顺式调节元件。选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于特定组织或细胞中的配体结合，而所述配体与配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的效应物结构域。还提供用本发明的核酸构建体转化的真核细胞。
按照所述优选实施方案中的其它特征，所述顺式调节元件是选自以下的内皮细胞特异性启动子或内皮周细胞特异性启动子：PPE-1启动子、PPE-1-3x启动子、TIE-1启动子、TIE-2启动子、内皮糖蛋白启动子、vonWillerband启动子、KDR/flk-1启动子、FLT-1启动子、Egr-1启动子、ICAM-1启动子、VCAM-1启动子、PECAM-1启动子和主动脉羧肽酶样蛋白(ACLP)启动子。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述配体结合结构域是细胞表面受体的配体结合结构域。细胞表面受体可选自：受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸激酶、受体苏氨酸激酶、细胞粘附分子和磷酸酶受体。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述细胞毒性分子选自Fas、TNFR和TRAIL。
按照本发明的另一方面，提供在受试者组织中下调血管生成的方法，该方法通过给所述受试者施用核酸构建体实施，所述核酸构建体设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生细胞毒性。所述核酸构建体包含：(a)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和(b)第二多核苷酸区，其编码在血管生成细胞亚群中指导所述嵌合多肽表达的顺式调节元件。选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给血管生成细胞亚群的配体结合，且所述配体与配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的效应物结构域，由此下调所述组织中的血管生成。
按照本发明的再一方面，提供在受试者组织中下调血管生成的方法，该方法如下实施：(a)在受试者的组织中表达设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生细胞毒性的核酸构建体，所述核酸构建体包含：(i)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域，其中选择所述效应物结构域，从而使其在配体与配体结合结构域结合后被活化；和(ii)第二多核苷酸区，其编码在血管生成细胞亚群中指导所述嵌合多肽表达的顺式作用调节元件；和(b)给所述受试者施用配体，由此在所述组织中下调血管生成。
按照本发明的又一方面，提供在受试者组织中下调血管生成的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的核酸构建体和药学上可接受的载体，所述核酸构建体设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生细胞毒性。所述核酸构建体包含：(a)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和(b)第二多核苷酸区，其编码在血管生成细胞亚群中指导所述嵌合多肽表达的顺式调节元件，其中选择能够结合存在于特定组织或细胞中之配体的配体结合结构域，以使所述配体与所述配体结合结构域的结合活化细胞毒性分子的效应物结构域。
按照本发明的再一方面，提供治疗与过度新血管形成相关的疾病或状况的方法。该方法通过施用治疗有效量的核酸构建体实施，所述核酸构建体设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生细胞毒性，所述核酸构建体包含：(i)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和(ii)第二多核苷酸区，其编码在血管生成细胞亚群中指导所述嵌合多肽表达的顺式作用调节元件；且其中选择能够结合存在于或提供给血管生成细胞亚群的配体的配体结合结构域，且所述配体与所述配体结合结构域的结合活化细胞毒性分子的效应物结构域，由此在所述组织中下调血管生成，并治疗与过度新血管形成相关的疾病或状况。还提供在受试者中治疗肿瘤的方法，该方法通过施用治疗有效量的核酸构建体实施，所述核酸构建体设计并构建用于在肿瘤细胞中产生细胞毒性。
按照本发明的另一方面，提供治疗与局部缺血相关的疾病或状况的方法，该方法通过施用治疗有效量的核酸构建体实施，所述核酸构建体设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生血管生成，由此在所述组织中上调血管生成，且治疗与局部缺血相关的疾病或状况。所述核酸构建体包含：(i)编码促血管生成因子的第一多核苷酸区；和(ii)第二多核苷酸区，其编码在血管生成细胞亚群中指导促血管生成因子的表达的顺式调节元件。
按照所述优选实施方案的其它特征，与局部缺血相关的疾病或状况选自伤口愈合、缺血性中风(ischemic stroke)、缺血性心脏病和胃肠损害。
按照本发明的再一方面，提供在受试者的组织中下调血管生成的方法，该方法如下实施：(a)在所述组织中表达设计并构建用于在血管生成细胞中的细胞毒性的核酸构建体，所述核酸构建体包含：(i)编码自杀基因的第一多核苷酸区；和(ii)第二多核苷酸区，其编码能够在血管生成细胞中指导所述自杀基因表达的顺式作用调节元件；和(b)给所述受试者施用治疗量的前药，所述量在前药被自杀基因转变为毒性化合物时足以造成所述组织的细胞凋亡，由此在所述组织中下调血管生成。
按照本发明的又一方面，提供在受试者的组织中下调血管生成的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的核酸构建体和药学上可接受的载体，所述核酸构建体设计并构建用于在血管生成细胞中产生细胞毒性。所述核酸构建体包含：(a)编码自杀基因的第一多核苷酸区，所述自杀基因能够将前药转变为毒性化合物；和(b)第二多核苷酸区，其编码能够在血管生成细胞中指导所述自杀基因表达的顺式作用调节元件。
按照本发明的另一方面，提供核酸构建体，其包含：(a)编码自杀基因的第一多核苷酸区，所述自杀基因能够将前药转变为毒性化合物；和(b)第二多核苷酸区，其编码能够在血管生成细胞中指导所述自杀基因表达的顺式调节元件。还提供用本发明的核酸构建体转化的真核细胞。
按照本发明的再一方面，提供在受试者组织中下调血管生成的方法，该方法通过给受试者施用核酸构建体实施，所述核酸构建体设计并构建用于在血管生成细胞中产生细胞毒性。所述核酸构建体包含：(a)编码自杀基因的第一多核苷酸区；和(b)第二多核苷酸区，其编码能够在血管生成细胞中指导所述自杀基因表达的顺式调节元件，其中选择能够将前药转变为能够引起细胞毒性作用的毒性化合物的自杀基因，由此下调所述组织中的血管生成。按照本发明的又另一方面，提供治疗与过度新血管形成相关的疾病或状况的方法，该方法通过施用治疗有效量的本发明核酸构建体实施，所述核酸构建体设计并构建用于血管生成细胞中的细胞毒性，由此在所述组织中下调血管生成，并治疗与过度新血管形成相关的疾病或状况。
按照本发明的另一方面，提供治疗受试者中的肿瘤的方法，该方法通过施用治疗有效量的核酸构建体实施，所述核酸构建体设计并构建用于在肿瘤细胞中产生细胞毒性，所述核酸构建体包含：(i)编码自杀基因的第一多核苷酸区；和(ii)编码能够在肿瘤细胞中指导所述自杀基因表达的顺式作用调节元件的第二多核苷酸区，其中选择能够将前药转变为能够在肿瘤细胞中引起细胞毒性作用的毒性化合物的自杀基因。
按照本发明的另一方面，提供产品，其包含包装材料、本发明的核苷酸构建体和至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述内皮特异性启动子的活性，其中所述包装材料包括标签或包装插页，它们指示所述核酸构建体和所述血管生成调节剂用于治疗受试者中血管生成有关的疾病或状况。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述自杀基因选自单纯疱疹病毒胸苷激酶、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶和细菌胞嘧啶脱氨酶。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述前药选自更昔洛韦、阿昔洛韦、1-5-碘尿嘧啶FIAU、5-氟胞嘧啶、6-甲氧基嘌呤阿糖胞苷及其衍生物。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶，且所述前药是更昔洛韦、阿昔洛韦、FIAU或其衍生物。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述自杀基因是细菌胞嘧啶脱氨酶，且所述前药是5-氟胞嘧啶或其衍生物。
按照所述优选实施方案的其他特征，所述自杀基因是水痘带状疱疹病毒胸苷基因，且所述前药是6-甲氧基嘌呤阿糖胞苷或其衍生物。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述方法还包括以联合形式给受试者施用至少一种额外治疗模式，选定的额外治疗模式能够以协同方式进一步增强所述细胞毒性。所述至少一种额外治疗模式可选自：化学疗法、放射疗法、光线疗法和光动力疗法、外科手术、营养疗法、切除疗法、联合的放射疗法和化学疗法、臂疗法(brachiotherapy)、质子射束疗法、免疫疗法、细胞疗法和质子射束放射外科手术疗法。
按照下述本发明优选实施方案的其它特征，所述核酸序列包含含顺式调节元件的分离多核苷酸，所述顺式调节元件包含共价连接至至少部分SEQ ID NO：16所示序列的至少部分SEQ ID NO：15所示序列，所述分离多核苷酸能够在真核细胞中指导在转录上与其连接的多核苷酸序列的转录。在所述顺式调节元件中，至少部分SEQ ID NO：15所示序列可位于至少部分SEQ ID NO：16所示序列的上游，或者至少部分SEQID NO：16所示序列可位于至少部分SEQ ID NO：15所示序列的上游。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述顺式调节元件还包含至少一个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列，或至少两个拷贝的SEQ ID NO：6。至少两个拷贝的SEQ ID NO：6可为连续的。
按照所述优选实施方案的其它特征，至少部分SEQ ID NO：15所示序列经接头多核苷酸序列共价连接至至少部分SEQ ID NO：16所示序列。接头多核苷酸序列可为启动子和/或增强子元件。
按照所述优选实施方案中的其它特征，所述分离多核苷酸包含至少一个拷贝的SEQ ID NO：1所示序列。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述分离多核苷酸还包含低氧反应元件，所述低氧反应元件优选包含至少一个拷贝的SEQ ID NO：5所示序列。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述顺式调节元件如SEQ IDNO：7所示。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述核酸构建体还包含条件复制型腺病毒。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述顺式调节元件是选自以下的内皮细胞特异性启动子或内皮周细胞特异性启动子：PPE-1启动子、PPE-1-3x启动子、TIE-1启动子、TIE-2启动子、内皮糖蛋白启动子、vonWillerband启动子、KDR/flk-1启动子、FLT-1启动子、Egr-1启动子、ICAM-1启动子、VCAM-1启动子、PECAM-1启动子和主动脉羧肽酶样蛋白(ACLP)启动子。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述方法另外包含给所述组织或所述受试者施用至少一种选择的能增加腺病毒的拷贝数和/或增强血管生成调节物的表达的化合物。
按照所述优选实施方案的其它特征，其它化合物是皮质类固醇和/或N-乙酰半胱氨酸。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述方法另外包含给所述组织或所述受试者施用至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强顺式调节元件或内皮特异性启动子的活性。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述至少一种血管生成调节剂是内皮素受体拮抗剂。所述内皮受体拮抗剂可以是双重A-形式和B-形式内皮素受体拮抗剂，或B-形式特异性的拮抗剂。
按照所述优选实施方案的其它特征，B-形式特异性的内皮素受体拮抗剂选自：A192，621；BQ788；Res 701-1和Ro 46-8443。
按照所述优选实施方案的其它特征，所述内皮受体拮抗剂是除波生坦以外的内皮素受体拮抗剂。
应当理解，包含顺式调节元件、本发明的分离多核苷酸的核酸构建体可以用于生产药物，所述药物用于治疗与内皮细胞中过度或不足的血管生成有关的多种病症、疾病和状况，例如肿瘤、转移疾病和局部缺血性疾病。按照所述优选实施方案的其它特征，所述药物与选择的血管生成调节剂联合应用，该调节剂能以协同方式进一步增强顺式调节元件或内皮特异性启动子的活性，和/或与选择的至少一种化合物联合应用，该化合物能增加腺病毒的拷贝数和/或增强血管生成调节物的表达。
本发明通过提供含具有新增强子元件的顺式调节元件的分离多核苷酸序列及其使用方法，成功解决了目前已知配置的缺点。新增强子元件可用于制备核酸构建体和药物组合物，它们用于组织特异性地调节转基因表达以及通过基因疗法用于治疗多种病症、疾病和状况。具体地说，本发明的顺式调节元件、分离多核苷酸和药物组合物可连同选定的转基因一起在内皮细胞中用于特异性地上调和/或下调血管生成，由此治疗肿瘤、转移疾病和局部缺血性疾病。
附图简述
本文仅作为实例参考附图描述本发明。现在具体地参考附图的细节，要着重强调的是，所显示的详细资料仅仅作为实例以及用于说明性地论述本发明的优选实施方案，并且提供这些详细资料是为了提供被认为对本发明的原理和概念方面最有用和最容易理解的描述。在这方面，并未试图以比基本上理解本发明所必需的更为详细的方式来显示本发明的结构细节，连同附图的说明使本领域技术人员显而易见如何实际上实施本发明的几种形式。
在附图中：
图1a-b是由TNFR1胞外区和Fas的跨膜区和胞内区构建并克隆到pcDNA3质粒(a)中或腺病毒载体(b)中的Fas嵌合体基因的示意图。
图2a-b说明促凋亡基因-Fas嵌合体和TNFR1的凋亡活性。图2a—说明用pcDNA-3-TNFR1(下图)或者对照空载体(上图)和编码GFP的表达质粒转染的牛主动脉内皮细胞(BAEC)。图2b—说明用pcDNA-3-Fas-c(下图)或者对照空载体(上图)和编码GFP的表达质粒转染的293细胞。利用荧光显微镜术显现转染细胞，且从形态学上确定凋亡活性。
图3a-f是用促凋亡基因转染的BAEC细胞的电子显微镜术图像。转染后24小时，将BAEC细胞在2.5％戊二醛中固定并进行加工。显示的是处于凋亡过程连续阶段的细胞。
图4是定量转染的BAEC和293细胞中指示的促凋亡基因的凋亡活性的直方图。
图5a表示AdPPE-Fas-c的PCR分析。泳道1-2—用包含PPE-1启动子和Fas-c基因的引物获得的PCR产物。泳道3-4—用Fas-c引物获得的PCR产物。泳道5-6—在无模板DNA的情况下获得的PCR产物。
图5b是AdPPE-Fas-c转染的BAEC细胞的蛋白质印迹分析。蛋白样品经SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜上，且用针对TNFR1胞外部分的多克隆抗体探测。泳道1-2—pcDNA3-Fas-c BAEC转染细胞(阳性对照)。泳道3-4—用指示MOI的AdPPE-Fas-c病毒转染的BAEC细胞。泳道5—非转染细胞。泳道6-7—用指示MOI的AdPPE-Luc转染的BAEC细胞。
图6a-d是说明Fas-嵌合体超表达对内皮细胞凋亡的作用的显微照片。用下述物质转染BAEC细胞：Ad-PPE-1-3x-Fas-嵌合体(图6a)；Ad-PPE-1-3x-萤光素酶(图6b)；Ad-PPE-1-3x-Fas-嵌合体和Ad-PPE1-3x-GFP(图6c)；Ad-PPE-1-3x-萤光素酶和Ad-PPE-1-3x-GFP，各为MOI 1000(图6d)。显微照片是在感染后72小时拍摄的，x10放大。
图7是说明Ad-PPE-1-3x-Fas-嵌合体对内皮细胞的凋亡特异性作用的直方图。在用Ad-PPE-1-3x-Fas-嵌合体或对照(萤光素酶)病毒感染后72小时通过结晶紫染色，定量内皮细胞(BAEC、HUVEC)和非内皮细胞(正常皮肤成纤维细胞-NSF)的生存力。
图8显示施用TNFα对Fas-嵌合体介导的凋亡的剂量反应作用。用Ad-PPE-1-3x-Fas-c感染BAEC。感染后48小时，向生长培养基中(以指示的剂量)添加TNF。24小时后通过结晶紫测定确定生存力。
图9a-e是说明由TNFα配体和Fas-c受体的协同作用介导的内皮细胞特异性凋亡的显微照片。所指示的细胞在存在或不存在TNFα(10ng/ml)的情况于Ad-PPE-1-3x-Fas-c感染后48小时下温育；结晶紫染色在感染后72小时进行。
图10a是说明Ad-CMV-Fas-c对内皮细胞的TNFα依赖性凋亡作用的剂量反应曲线。用指示MOI的Ad-CMV-Fas-嵌合体感染的BAEC细胞的生存力在与TNFα温育后确定。
图10b-d表示TNFα配体和Ad-CMV-Fas-嵌合体对非内皮细胞NSF的凋亡作用。图10b—经对照病毒感染的NSF。图10c—经Ad-CMV-Fas-嵌合体感染的NSF。图10d—经Ad-CMV-Fas-嵌合体感染并与TNF(10ng/ml)温育的NSF。
图11a-c说明Ad-PPE-1-3x-Fas-c的体内抗肿瘤作用。当肿癌可触知时，用Ad-PPE-1-3x-Fas-c、Ad-CMV-Fas-嵌合体、对照病毒或盐水静脉内注射接种有B16黑素瘤细胞的小鼠。
图11a—在治疗时间段期间测量的肿瘤面积。图11b—治疗时间段结束时的肿瘤重量。图11c—图示Ad-PPE-1-3x-Fas-c治疗小鼠和对照小鼠中的肿瘤状态。
图12是直方图，说明使用B2B细胞系(表达内皮素的支气管细胞系)作为对照时本发明的增强子元件对牛内皮细胞系和人内皮细胞系中的萤光素酶表达的作用。
图13是直方图，说明腺病毒载体中的本发明启动子对各种细胞系中的萤光素酶表达的内皮特异性。
图14A-B是显微照片，表明了在BAEC细胞系中由本发明的Ad5PPE-1-3X(14A)和Ad5CMV(14B)对照构建体控制的GFP表达。
图15是在内皮细胞和非内皮细胞中由pACPPE-1-3Xp55、pACPPE-1-3X萤光素酶和pCCMVp55诱导的凋亡百分比的直方图。
图16是直方图，说明将本发明的增强子元件导入启动子构建体中对低氧应答的作用。
图17是直方图，说明将本发明的增强子元件导入腺病毒载体构建体的启动子中对低氧应答的作用。
图18是直方图，说明将本发明的增强子元件导入启动子中对表达内皮素的牛和人内皮细胞系中的表达水平的作用。
图19是直方图，说明在注射含有内皮启动子(PPE-1)或对照(CMV)启动子的腺病毒构建体后在各种器官中观察到的报告基因的表达水平。
图20A-B是两张显微照片，说明Ad5CMVGFP构建体(图20A)和Ad5PPE-1-GFP构建体(图20B)在注射所述构建体的小鼠肝组织中的细胞表达。
图21是直方图，说明将本发明的增强子元件导入启动子中对内皮细胞系和非内皮细胞系中的表达水平的作用。
图22是直方图，说明将本发明的增强子元件导入启动子中对内皮细胞系和非内皮细胞系中的表达水平的作用。
图23A-C是显微照片，分别说明Ad5PPE-1-3XGFP转导细胞、Ad5PPE-1GFP转导细胞和Ad5CMVGFP转导细胞中的GFP表达。
图24A-B说明了分别用moi-1的Ad5PPE-1-3XGFP和Ad5CMVGFP转导的SMC中的GFP表达。
图25A-B显示在HeLa细胞中进行的与图24A-B的实验相似的实验的结果。
图26A-B显示在HepG2细胞中进行的与图24A-B的实验相似的实验的结果。
图27A-B显示在NSF细胞中进行的与图24A-B的实验相似的实验的结果。
图28A-B是显微照片，说明在分别注射Ad5PPE-1GFP构建体和Ad5PPE-1-3XGFP构建体的小鼠血管内衬的内皮细胞中的GFP表达。
图29A-C是显微照片，说明得自经注射的小鼠肾组织的结果。注射Ad5CMVGFP的小鼠(图29A)；注射Ad5PPE-1GFP的小鼠(图29B；在血管壁中可见略高的GFP表达；箭标所指)和注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠(图29C)。
图30A-C说明在脾组织切片上进行的、与图29A-C中描绘的实验相似的实验。
图31A-D说明注射盐水的对照小鼠(图31A)、注射Ad5CMVGFP的小鼠(图31B)、注射Ad5PPE-1GFP的小鼠(图31C)和注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠(图31D)的转移肺中的GFP表达。抗Cd31免疫染色(图31C′-31D′)证实在每种转移组织中GFP表达和CD31表达共定位。
图32是直方图，说明用含有鼠PPE-1启动子的质粒转染的BAEC中的萤光素酶活性(光单位/μg蛋白)在转染细胞于低氧条件下温育时明显更高。
图33是与图32相同的直方图，不同的只是使用Ad5PPE-1Luc和Ad5CMVLuc。
图34是与图33相同的直方图，说明在不同细胞系中的低氧效应。
图35是直方图，说明本发明的3X序列对BAEC细胞中PPE-1低氧应答的作用。细胞用Ad5PPE-1Luc和Ad5PPE-1-3Xluc转导。
图36是直方图，显示在股动脉结扎后PPE-1-Luc转基因小鼠各种组织中的萤光素酶表达水平。
图37A-B是结合本发明使用的构建体的质粒图谱。
图38A-F说明Ad5PPE-1-3XVEGF和Ad5CMVVEGF对小鼠局部缺血肢体的血液灌注和血管生成的作用。图38A-D是结扎后21天捕获的各种治疗组小鼠局部缺血肢体的代表性超声(US)血管造影灌注图像。黄色信号代表强灌注。该图像的右侧代表肢体远端。图38A—Ad5PPE-1-3XVEGF治疗小鼠；图38B—Ad5CMVVEGF治疗小鼠；图38C—对照，盐水治疗小鼠；图38D—对照，正常肢体。图38E-F是直方图，说明：各种治疗组US图像的平均信号强度(图38E)；根据各种治疗组中CD31+细胞数目/mm2测量的平均毛细血管密度(图38F)。
图39是直方图，说明在用Ad5PPE-1Luc(空心条)和Ad5CMVLuc(黑色条)转导的增殖和静息牛主动脉内皮细胞(BAEC)中的萤光素酶活性。
图40是直方图，说明用Ad5PPE-1Luc转导的BAEC在正常增殖期间、静息状态和加入VEGF后的快速增殖期间的萤光素酶活性。
图41A-B是直方图，说明在正常注射Ad5PPE-1Luc和Ad5CMVLuc的C57BL/6小鼠主动脉(图41A)和肝(图41B)中的萤光素酶活性(光单位/μg蛋白)。注射后1天(n＝13)、5天(n＝34)、14天(n＝32)、30天(n＝20)和90天(n＝11)测定活性。
图42A-B是直方图，说明在正常注射的BALB/C小鼠中注射Ad5PPE-1Luc(空心条)或Ad5CMVLuc(黑色条)后5天(图42A)和14天(图42B)(每个时间点均为n＝10)检测的相对萤光素酶活性(光单位/μg蛋白)。活性以每只动物全身萤光素酶表达的百分比表示。
图43是描绘由ApoE缺陷型小鼠解剖的主动脉通过苏丹(Sudan)-IV着色的现有技术图像。胸主动脉含有较少的着红色的动脉粥样硬化病变，而腹区包含许多着红色的动脉粥样硬化病变。(摘自Imaging of Aorticatherosclerotic lesions by125I-HDL and125I-BSA.A.Shaish等，Pathobiology 2001；69：225-29)。
图44是直方图，说明给ApoE缺陷型小鼠全身注射Ad5PPE-1Luc(空心条；n＝12)或Ad5CMVLuc(黑色条；n＝12)后5天检测的绝对萤光素酶活性(光单位/μg蛋白)。从腹主动脉观测的萤光素酶活性含高病变水平，而从胸区观测的萤光素酶活性(低病变水平)。
图45是直方图，说明给诱发伤口愈合的C57BL/6小鼠全身注射Ad5PPE-1Luc(黑色条)或Ad5CMVLuc(空心条)后5天的绝对萤光素酶活性(光单位/μg蛋白)。
图46是直方图，说明诱发Lewis肺癌的小鼠的正常肺、转移肺和原发性肿瘤中的萤光素酶活性。通过给原发性肿瘤模型的背部和转移模型的爪垫注射D122-96细胞诱发Lewis肺癌。全身注射Ad5PPE-1Luc(n＝9；空心条)或Ad5CMVLuc(n＝12；黑色条)后5天测量萤光素酶活性。活性以光单位/μg蛋白表示。
图47A-D是显微照片，说明在肿瘤内注射Ad5PPE-1GFP后在带有LLC的小鼠肺和肿瘤中的GFP表达和组织形态学。将组织在OCT中冷冻，然后用恒冷切片机切成10μm的切片。所有照片都在放大25倍的情况下拍摄。图47A—肺转移的血管生成性血管中的GFP；图47B—图47A中所拍摄切片的CD31抗体免疫染色；图47C—原发性肿瘤血管中的GFP表达；图47D—说明血管的C切片的相差。
图48是直方图，说明注射Ad5CMVLuc、Ad5PPE-1Luc和Ad5PPE-1-3X-Luc的诱发的Lewis肺癌小鼠的正常肺和转移肺中的萤光素酶表达。通过给转移模型的爪垫注射D122-96细胞诱发Lewis肺癌。全身注射Ad5CMVLuc(n＝7；黑色条)、Ad5PPE-1Luc(n＝6；灰色条)或Ad5PPE-1-3XLuc(n＝13；褐色条)后5天测量萤光素酶活性。活性以光单位/μg蛋白表示。
图49是直方图，说明注射Ad5CMV、Ad5PPE-1Luc和Ad5PPE-1(3X)的诱发的Lewis肺癌小鼠的正常肺和肺转移中以肝活性的百分比表示的萤光素酶活性(其中肝中的活性为100％)。
图50A-B是显微照片，说明注射Ad5PPE-1-3X-GFP的LLC肺转移小鼠中GFP表达(图50A)和CD31免疫染色(图50B)共定位。
图51是直方图，说明股结扎后2天、5天、10天和18天和对照(未结扎动物—第0天；每组n＝8)的PPE-1萤光素酶转基因小鼠肌肉(局部缺血和正常)中的萤光素酶活性(光单位/μg蛋白)。
图52是直方图，说明股结扎后5天(n＝6)、10天(n＝6)和18天(n＝8)以及对照(未结扎动物—第0天)的PPE-1萤光素酶转基因小鼠的肝、肺和肌肉主动脉(局部缺血和正常)中的萤光素酶活性(光单位/μg蛋白)。
图53是直方图，说明在原发性肿瘤中注射Ad5CMVLuc(黑色条)或Ad5PPE-1Luc(空心条)的LLC小鼠肝、肺和原发性肿瘤中检测的萤光素酶活性(光单位/μg蛋白)。
图54A-H是原位杂交图像，说明各种转基因的组织特异性表达或组成型表达的组织分布。图54A-C说明与以下的代表性局部缺血肌肉上的VEGF特异性反义探针的原位杂交：A，Ad5PPE-1-3XVEGF治疗小鼠；B，Ad5CMVVEGF治疗小鼠；C，盐水治疗小鼠；D，Ad5CMVVEGF治疗小鼠的肝切片。箭标表示阳性染色细胞。图54E-G说明与来自以下的代表性局部缺血肌肉的PDGF-B特异性反义探针的原位杂交：E，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治疗小鼠：F，Ad5CMVPDGF-B治疗小鼠：G，盐水治疗小鼠；H，Ad5CMVPDGF-B治疗小鼠的肝切片。
图55A-B是直方图，说明Ad5PPE-1-3XVEGF或Ad5CMVVEGF对小鼠局部缺血肢体中的血液灌注和血管生成的长期作用。A，股动脉结扎后50天各种治疗组US图像中的平均信号强度。B，股动脉结扎后70天根据各种治疗组中CD31+细胞数目/mm2测量的平均毛细血管密度。
图56A-D是直方图，说明Ad5PPE-1-3XPDGF-B对小鼠局部缺血肢体新血管形成的早期作用和长期作用。图56A-B—通过US成像测量的平均灌注强度(56A，股动脉结扎后30天；56B，股动脉结扎后80天)。图56C-D—根据各种治疗组中CD31+细胞数目/mm2测量的平均毛细血管密度(56C，股动脉结扎后35天；56D，股动脉结扎后90天)。
图57A-G说明单独或联合使用处于内皮特异性启动子或组成型启动子调节之下的PDGF-B和VEGF的血管生成疗法对小鼠局部缺血肢体的新血管形成和血流的长期作用。A，股动脉结扎后80天各种治疗组US图像中的平均信号强度。B，股动脉结扎后90天根据各种治疗组CD31+细胞数目/mm2测量的平均毛细血管密度。图57C-G是股动脉结扎后90天募集到局部缺血肢体肌肉成熟血管内的平滑肌细胞。平滑肌细胞用抗α-SM肌动蛋白抗体进行免疫染色(着红色，X20)。C，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治疗的小鼠：D，联合疗法治疗的小鼠；E，Ad5PPE-1-3XVEGF治疗小鼠；F，对照，Ad5PPE-1-3XGFP治疗小鼠；G，正常对侧肢体(注意到仅大血管被染色)。
图58说明动脉结扎后50天单独的或与促血管生成因子VEGF联用的PDGF-B对小鼠局部缺血肢体血液灌注的作用。
图59是基因定向酶前药治疗(gene-directed enzyme prodrugtherapy)(GDEPT)基本原理的示意图。
图60A-B是代表质粒pEL8(3x)-TK构建的示意图。图60A是代表质粒pEL8(3x)-TK构建的示意图。图60B是质粒pACPPE-1(3x)-TK的图谱。
图61是通过UV荧光显现的AdPPE-1(3x)-TK载体PCR产物的琼脂糖凝胶分离。使用两种引物：正向引物5′-ctcttgattcttgaactctg-3′(前内皮素原启动子序列中的455-474bp)(SEQ ID NO：9)和反向引物5′-taaggcatgcccattgttat-3′(HSV-TK基因序列中的1065-1084bp)(SEQ IDNO：10)。其它载体的特异性引物未产生PCR产物。观察到1kb条带，证实在AdPPE-1(3x)-TK病毒中存在PPE-1(3x)启动子和HSV-TK基因。泳道1：100bp大小的大小标记梯。泳道2：pACPPE-1(3x)-TK质粒。泳道3：AdPPE-1(3x)-TK病毒。泳道4：无DNA。
图62A-C显示了载体AdPPE-1(3x)-TK(图62a)、AdPPE-1(3x)-Luc(图62b)和AdCMV-TK(图62c)的线性示意图。
图63是一系列显微照片，说明处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK的优良内皮细胞细胞毒性。用0.1、1、10、100和1000感染复数(m.o.i.)的AdPPE-1(3x)-TK、AdCMV-TK和AdPPE-1(3x)-Luc转导牛主动脉内皮细胞(BAEC)。在转导后4小时加入GCV(1μg/ml)。对照是用无GCV的载体或无载体的GCV转导的细胞。实验在96孔板中进行两次，每组12个孔。两个对照都不诱导细胞死亡(未列出数据)。以显著低于AdCMV-TK的m.o.i.在AdPPE-1(3x)+GCV处理细胞中明显观察到细胞毒性特有的形态学变化(细胞扩大、延伸和膨胀)和细胞毒性(汇合丧失)。用AdPPE-1(3x)-Luc转导的细胞保持健康(小尺寸、圆形并汇合)。
图64图示了处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK的内皮细胞细胞毒性。BAEC在96孔板中制备，并如图13转导，接着在转导后4小时加入1μg/ml GCV。加入载体后10天，使用结晶紫染色测定细胞生存力。观察到AdPPE-1(3x)+GCV在高m.o.i.时的优良细胞毒性。
图65是一系列显微照片，说明在PPE-1(3x)启动子控制之下的TK和更昔洛韦施用的内皮细胞细胞毒性的优良协同作用。如上文所述用感染复数(m.o.i.)为10的AdPPE-1(3x)-TK、AdCMV-TK和AdPPE-1(3x)-Luc转导牛主动脉内皮细胞(BAEC)，并使其接触在转导后4小时加入的浓度渐增的GCV(如所示的0.001-10μg/ml)。对照为用无GCV的载体或无载体的GCV转导的细胞。实验在96孔板中进行两次，每组12个孔。两个对照都不诱导细胞死亡(未列出数据)。在显著低于接触AdCMV-TK的细胞的GCV浓度，于AdPPE-1(3x)+GCV处理细胞中明显观察到细胞毒性特有的形态学变化(细胞扩大、延伸和膨胀)和细胞毒性(汇合丧失)。
图66图示了在PPE-1(3x)启动子控制之下的TK和更昔洛韦施用的内皮细胞细胞毒性的协同作用。BAEC在96孔板中制备，并如图65转导，接着在转导后4小时加入渐增浓度(0.0001-10μg/ml)的GCV。加入载体后10天，使用结晶紫染色测定细胞生存力。与AdCMV-TK的强组成型TK表达相比，观察到AdPPE-1(3x)+GCV在高于0.01μg/ml的GCV浓度时的优良细胞毒性。
图67是一系列显微照片，说明处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK和更昔洛韦施用的特异性协同内皮细胞毒性。内皮细胞[牛主动脉内皮细胞(BAEC)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)]和非内皮细胞[人肝癌细胞(HepG-2)、人正常皮肤成纤维细胞(NSF)]用m.o.i.为10的AdPPE-1(3x)-TK、AdPPE-1(3x)-Luc或AdCMV-TK转导，接着在转导后4小时施用1μg/ml GCV。实验在96孔板中进行两次，每组12个孔。转导后4天用显微镜检测细胞毒性和细胞形态学变化。观察到BAEC和HUVEC培养物中AdPPE-1(3x)-TK+GCV的优良细胞毒性作用[细胞毒性特有的形态学变化(细胞扩大、延伸和膨胀)和细胞毒性(汇合丧失)]，及这种作用在HepG-2和NSF培养物中不存在(细胞保持小尺寸、圆形和汇合)。AdPPE-1(3x)-Luc+GCV对所有细胞类型都无毒性。
图68是直方图，代表处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK和更昔洛韦施用的特异性协同内皮细胞细胞毒性。内皮细胞(BAEC和HUVEC)和非内皮细胞(HepG-2和NSF)在96孔板中制备，并如图67转导，接着在转导后4小时加入浓度渐增(1μg/ml)的GCV。加入载体后10天，使用结晶紫染色测定细胞生存力。与AdCMV-TK+GCV的非特异性细胞毒性相比，观察到AdPPE-1(3x)+GCV的优良内皮特异性细胞毒性。
图69是一系列直方图，说明处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK和更昔洛韦施用在极端感染复数时的内皮选择性细胞毒性。如在图66中一样，以较高m.o.i.100的AdPPE-1(3x)-TK、AdPPE-1(3x)-Luc或AdCMV-TK转导非内皮细胞(NSF)，接着在转导后4小时施用1μg/mlGCV。实验在96孔板中进行两次，每组12个孔。转导后4天用显微镜检测细胞毒性和细胞形态学变化。与AdCMV-TK+GCV的非特异性细胞毒性相比，观察到AdPPE-1(3x)-TK+GCV对NSF细胞形态学没有作用。
图70是一系列照片，说明处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用对转移生长的协同抑制。在14周龄雄性C57BL/6小鼠(n＝77)中通过将LLC肿瘤细胞接种入左爪垫诱发Lewis肺癌(LLC)肺转移，该爪垫在原发性肿瘤一达到7mm大小时就截除。5天后，将1011PFU的腺病毒载体[AdPPE-1(3x)-TK+GCV；AdCMV-TK+GCV；无GCV的AdPPE-1(3x)-TK]注射入尾静脉，接着注射100mg/kgGCV达14天。在载体注射后第24天时处死小鼠，取出肺进行检查和分析。对照小鼠接受盐水和GCV。与AdCMV-TK+GCV；无GCV的AdPPE-1和无腺病毒的GCV治疗的小鼠肺相比，在AdPPE-1(3x)+GCV治疗的小鼠肺中观察到程度显著降低的转移扩散。
图71是直方图，说明处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用对转移生长的协同抑制。如上文所述在C57BL/6小鼠中诱发肺转移，且用1011PFU的腺病毒载体[AdPPE-1(3x)-TK+GCV；AdCMV-TK+GCV；无GCV的AdPPE-1(3x)-TK]和GCV(100mg/kg)治疗小鼠。在载体注射后第24天时处死小鼠，且取出肺进行肺转移评价。对照小鼠接受盐水和GCV。与无GCV(超过85％)和AdCMV-TK+GCV以及盐水+GCV对照(超过75％)中的转移块相比，在AdPPE-1(3x)+GCV治疗小鼠中观察到对转移块的显著抑制。
图72a-72c是肺转移的代表性组织病理学切片，说明处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用对转移病理的协同抑制。如上文所述在C57BL/6小鼠中诱发肺转移，且用1011PFU的腺病毒载体[AdPPE-1(3x)-TK+GCV；AdCMV-TK+GCV；无GCV的AdPPE-1(3x)-TK]和GCV(100mg/kg)治疗小鼠。在载体注射后第24天时处死小鼠，且制作肺转移组织(图72a和72b)或肺组织(图72c)的切片，并用苏木精和伊红染色。在施用AdPPE-1(3x)+GCV的肺转移中观察到大范围的中心坏死和众多单核浸润物簇(图72a和72b)。
图73a-73b是肺转移的TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色的诱发性LLC肺转移的代表性组织病理学切片，说明处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用对肿瘤凋亡的协同增强作用。对如图71a-71b所述诱发和制备的LLC肺转移的切片进行固定并包埋在石蜡中，通过使用Klenow-FragE1(Oncogene，Cambridge，MA)的脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)测定(图73a)和抗胱天蛋白酶-3特异性免疫组织病理学(73b)分析凋亡指示物。在静脉内AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠的肺转移中观察到凋亡增强。
图74a和74b是用肺转移的TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色的诱发性LLC肺转移的代表性组织病理学切片，说明处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用对肿瘤凋亡的内皮特异性协同增强作用。如图73a-73b所述对诱发和制备的LLC肺转移的切片进行固定并包埋在石蜡中，且通过使用Klenow-FragE1(Oncogene，Cambridge，MA)的脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)测定(图74a)和抗胱天蛋白酶-3特异性免疫组织病理学(74b)分析凋亡指示物。黑色箭标指示红细胞，红色箭标指示凋亡的内皮细胞，而白色箭标指示凋亡肿瘤细胞。在静脉内AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠的肺转移的血管(内皮)区中观察到凋亡增强。
图75a-75d是鼠肺癌组织的代表性免疫组织病理学切片，说明处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用对血管生成的内皮特异性协同抑制作用。如图73a-73b所述对诱发和制备的LLC肺转移(图75a)、肝(图75c)和正常肺组织(图75b)的切片进行固定并包埋在石蜡中，且通过抗CD-31免疫荧光分析血管生成指示物。在AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠的肺转移中观察到短的、模糊的血管，没有连续性或分支。图75d是直方图，显示了肺转移血管形成(血管生成)的基于计算机的血管密度评价(Image Pro-Plus，Media CyberneticksIncorporated)。左条：AdPPE-1(3x)TK+GCV；右条：无GCV的AdPPE-1(3x)TK。
图76是鼠肝组织的代表性组织病理学切片，说明在处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用中没有肝脏毒性。如图73a-73b所述诱发和制备的带有LLC肺转移的小鼠肝切片进行固定并包埋在石蜡中，且用苏木精和伊红染色。与用组成型表达的AdCMV-TK+GCV(右图)治疗小鼠肝中的显著细胞毒性相比，在AdPPE-1-TK+GCV(3x)(左图)治疗小鼠肝中没有观察到细胞毒性指示物。
图77描述了RT-PCR分析，说明了处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK表达和更昔洛韦(GCV)施用的器官特异性表达。如图73a-73b所述，在9只15周龄的C57BL/6雄性小鼠中诱发和制备LLC肺转移。在原发性肿瘤去除后14天静脉内递送腺病毒载体[AdPPE-1(3x)-TK和AdCMV-TK]和盐水对照。在注射载体后6天处死小鼠，且收获器官。如下文所述提取不同器官的RNA，且用PPE-1(3x)启动子引物和HSV-TK基因引物通过RT-PCR PCR扩增PPE-1(3x)和HSV-TK转录物。观察到处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK的内皮特异性表达(中部，底部图)。
图78a和78b图示了Balb/c鼠结肠癌肿瘤模型中的亚治疗和无毒辐射范围。用CT-26结肠癌细胞接种入20只8周龄Balb/c雄性小鼠的左股，且其在肿瘤直径已达到4-6mm时在全身麻醉下接受0、5、10或15Gy的局部辐射。对于肿瘤体积(76a)，按照式V＝π/6×α2×β(α是短轴，且β是长轴)计算肿瘤轴。5Gy剂量仅诱导部分的、非统计学显著的肿瘤发展延迟(图78a)，且没有显著的体重减轻(图78b)。
图79a-79g说明联合亚治疗放疗与处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK表达和更昔洛韦(GCV)施用在鼠结肠癌中协同抑制肿瘤生长。用CT-26结肠癌肿瘤细胞接种100只8周龄的雄性Balb/C小鼠。肿瘤轴一达到4-6mm，就将1011PFU的病毒载体[AdPPE-1(3x)-TK或AdCMV-TK]静脉内注射入尾静脉，接着按指示每日腹膜内注射GCV(100mg/kg体重)达14天。载体施用后3天，用局部5Gy剂量辐射小鼠。按照式V＝π/6×α2×β(α是短轴，且β是长轴)评价肿瘤体积。图79a显示了载体注射后14天时的平均肿瘤体积±S.E.。图79b显示了放疗治疗组中随时间变化的平均肿瘤体积进展。图79c显示了AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠中随时间变化的平均肿瘤体积进展。图79d显示了AdCMV-TK+GCV治疗小鼠中随时间变化的平均肿瘤体积进展。图79e显示了对照盐水+GCV治疗小鼠中随时间变化的平均肿瘤体积进展。图79f显示了无GCV的AdPPE-1(3x)-TK治疗小鼠中随时间变化的平均肿瘤体积进展。图79g是处死当天Balb/C小鼠中CT-26原发性肿瘤总病理学的代表性示例。与非靶向载体AdCMV-TK(p＝0.04)(图79c-79f)相比，观察到放疗仅显著加强血管生成性内皮细胞转录靶向的载体AdPPE-1(3x)-TK。在没有放疗的情况下，采用所有病毒载体的治疗方案都是无效的。
图80a-80b是原发性CT-26肿瘤的代表性组织病理学切片，表明亚治疗放疗与处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK表达和更昔洛韦(GCV)施用联合在鼠结肠癌中协同诱导肿瘤坏死。对如图79a-79g所述诱发和制备的CT-26结肠癌肿瘤切片进行固定并包埋在石蜡中，且用苏木精和伊红染色。观察联合的AdPPE-1(3x)+GCV+低剂量放疗情况下的坏死区域(图80a)和肉芽组织区域(图80b)。
图81a-81b是用TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色的诱发原发性结肠癌肿瘤的代表性组织病理学切片，说明放疗与处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用联合协同增强内皮细胞和肿瘤的凋亡。对如图77a-77g所述诱发和制备的CT-26原发性结肠癌肿瘤切片进行固定并包埋在石蜡中，且通过使用Klenow-FragE1(Oncogene，Camb ridge，MA)的脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)测定(图81a)和抗胱天蛋白酶-3特异性免疫组织病理学(81b)测定凋亡指示物。在用联合的放疗和静脉内AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠的肿瘤中观察到大范围的凋亡(图81a)和胱天蛋白酶-3阳性内皮细胞(81b)。
图82是用抗胱天蛋白酶-3染色的诱发原发性结肠癌肿瘤的代表性组织病理学切片，表明放疗与处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用联合协同增强内皮细胞和肿瘤的凋亡。对如图79a-79g所述诱发和制备的CT-26原发性结肠癌肿瘤切片进行固定并包埋在石蜡中，且通过抗胱天蛋白酶-3特异性免疫组织病理学测定凋亡指示物。黑色箭标指示红细胞，红色箭标指示凋亡内皮细胞，且白色箭标指示凋亡肿瘤细胞。观察到GCV依赖性凋亡作用。
图83a和83b是用抗CD-31染色的肝组织和诱发的原发性结肠癌肿瘤的代表性组织病理学切片，说明放疗与处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用联合协同增强对肿瘤血管形成的抑制。对肝组织(83b)和如图79a-79g所述诱发和制备的CT-26原发性结肠癌肿瘤(83a)切片进行固定并包埋在石蜡中，且与内皮特异性抗CD-31反应，用于免疫组织病理分析。黑色箭标指示红细胞，红色箭标指示凋亡内皮细胞，且白色箭标指示凋亡肿瘤细胞。与肝细胞中的正常血管形成(83b)相比，观察到放疗和静脉内AdPPE-1(3x)-TK+GCV联合治疗小鼠肿瘤中的广泛血管破坏(83a)。
图84是小鼠肝组织的代表性组织病理学切片，表明放疗与处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK表达和更昔洛韦(GCV)施用的组织特异性细胞毒性。对接触单独及联合的载体(AdPPE-1(3x)-TK和AdCMV-TK)和GCV的小鼠肝切片进行固定，并包埋在石蜡中，且用苏木精和伊红染色。观察到AdCMV-TK和更昔洛韦(左图)的典型轻微肝脏毒性，在AdPPE-1(3x)-TK治疗的肝中(右图)没有血管异常。
图85a和85b图示了C57Bl/6肺癌转移模型中的亚治疗和无毒辐射范围。用Lewis肺癌(LLC)细胞接种入35只8周龄C57Bl/6雄性小鼠的左爪垫，并在去除原发性肿瘤后8天在全身麻醉下以0、5、10或15Gy接受辐射到胸壁内。在去除肿瘤后28天时处死小鼠。体重减轻指示转移性疾病。5Gy剂量不是治疗性的(图85a)，也不是有毒的(图85b)。
图86a-86d说明了亚治疗放疗与处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK表达和更昔洛韦(GCV)施用联合在鼠肺癌中协同抑制转移性疾病。将LLC细胞接种入180只8周龄雄性Balb/C小鼠的左爪垫中。一发展原发性肿瘤就在全身麻醉下截除该爪。截除后5天，将1010PFU载体[AdPPE-1(3x)-TK或AdCMV-TK]注射入尾静脉，接着每日腹膜内注射GCV(100mg/kg)达14天。载体注射后3天，在全身麻醉下施用针对小鼠胸壁的单次5Gy剂量放疗。图86a显示了在55天内辐射过的、无载体治疗的小鼠的存活。图86b显示了AdPPE-1(3x)-TK治疗小鼠的存活。图86c显示了AdCMV-TK治疗小鼠的存活。图86d显示了盐水治疗的对照小鼠的存活。与非靶向载体AdCMV-TK(图86b-86d)相比，观察到放疗仅显著增强血管生成内皮细胞转录靶向的载体AdPPE-1(3x)-TK。在没有放疗的情况下使用所有病毒载体的治疗方案都是无效的。
图87a-87c是一系列直方图，显示了在CMV启动子控制之下的Fas-c的内皮细胞细胞毒性。牛主动脉内皮细胞(BAEC)在用100(左)、1000(右)和10000(左下)moi的CMV-FAS(黑色)或CMV-LUC(灰色，阴性对照)转导后72小时和在以不同浓度加入人TNF-α配体后24小时用结晶紫染色。观察到在高moi和TNF-α浓度时BAE细胞的生存力下降。
图88是噬斑发展图，表明相比于CMV-LUC(红色正方形)，用CMV-FAS(蓝色菱形)增强了293细胞中病毒复制的扩散。CMV-FAS和CMV-LUC的CsCl带状原液的滴度如下文所述通过PFU测定来测定。数据按照对数比例以每2-3天噬斑测定观察到的噬斑数作图。
图89a和89b是一系列293细胞培养物的照片，说明与CMV萤光素酶相比，采用CMV-FAS-c的病毒感染的细胞-细胞扩散(噬斑形成)速率较高。转染后4天，拍摄相同稀释度的CMV-FAS(左图)和CMV-LUC(右图)的噬斑照片。CMV-FAS的噬斑明显大于CMV-LUC的噬斑，从而表明可能由凋亡诱导的细胞-细胞扩散速率较高。
图90是直方图，说明在PPE-1(3x)启动子控制之下的Fas-c和阿霉素施用的特异性协同内皮细胞毒性。BAE细胞在载体(PPE-1(3x)-FAS)转导(103moi)后48小时接触100nM阿霉素。Dox+PPE-fas＝阿霉素+PPE-1(3x)-Fas-c(橙色)；Dox＝单独的阿霉素(绿色)；PPE-FAS＝PPE-1(3x)-FAS(红色)；未处理＝黑色。细胞在载体转导后96小时用结晶紫染色，且显微镜评价细胞生存力。观察到AdPPE-1(3x)-Fas-c和阿霉素之间有内皮细胞毒性的显著协同作用。
图91a-91b图示说明了处于内皮素(PPE-13X)控制之下的VEGF对工程化组织构建体中的血管生成的优良诱导作用。组织工程化构建体(未公开的程序)在培养基有或没有补加VEGF(50ng/ml)的情况下生长。用Ad5PPEC-1-3x VEGF病毒或对照Ad5PPEC-1-3x GFP腺病毒(对照病毒)感染平行构建体(达4小时)。在培养2周后固定构建体，包埋、制作切片并染色。血管形成表示为血管数/mm2和切片中血管形成的面积百分比。图91a表明，用Ad5PPEC-1-3x VEGF感染细胞对在工程化构建体中形成的血管样结构的数目和大小具有诱导作用。与接触培养基中的VEGF(VEGF培养基)的构建体相比，观察到Ad5PPEC-1-3x VEGF转导的组织构建体(VEGF病毒)中血管形成的两个参数急剧增加(4-5X)。图91b是LUC发光强度的直方图，说明与Ad5PPEC-1-3x GFP对照相比，与Ad5PPEC-1-3x VEGF感染的细胞一起生长的植入组织构建体的存活和血管形成较好。
图92是野生型鼠PPE-1启动子DNA序列。所述启动子包含内源内皮特异性正转录元件(黑色斜体)、NF-1反应元件(粉色斜体)、GATA-2元件(红色斜体)、HIF-1反应元件(蓝色斜体)、AP-1位点(绿色斜体)、CAAT信号(橙色斜体)和TATA框(紫色斜体)。
图93是修饰型鼠前内皮素原-1启动子的3x片段序列。所述片段包含2个完整内皮细胞特异性正转录元件(红色)和两个作为反向的半个原始序列定位的部分(蓝色)：SEQ ID NO：15(转录元件SEQ ID NO：6的3′部分的核苷酸)和SEQ ID NO：16(转录元件SEQ ID NO：6的5′部分的核苷酸)。
图94是直方图，说明了在转基因小鼠中在PPE-1(3x)启动子控制之下的LUC基因表达的组织特异性的、波生坦诱导的增强。
图95a和95b是直方图，说明根据ELISA测量的，不存在针对PPE-1(3x)启动子控制下表达的转基因的宿主免疫应答。与在PPE-1(3x)Fas-c治疗小鼠中引起的最小抗TNF-R1应答(图95b)相比，观察到非特异性的抗腺病毒载体(adenovector)应答(图95a)。
图96是直方图，说明了内皮细胞中在PPE-1启动子控制下的LUC基因表达的ET-B特异性的增强。如上文所述，用PPE-1-萤光素酶构建体(pEL-8)瞬时地转染牛主动脉内皮细胞。用不同浓度的内皮素拮抗剂处理后1小时，计算相对萤光素酶活性。将相对萤光素酶活性计算为光单位与β-半乳糖苷酶单位的比，β-半乳糖苷酶活性源自组成型活性的lacZ构建体的共转染。相对于未处理的细胞表达值(浓度0μM＝100％)。值代表着一式三份的平均值±标准差。*相对于未处理的细胞，P<0.05(斯氏t检验)。注意到BQ788对LUC表达的剂量依赖性的、ET-1B特异性的增强(灰色条)，和ET-1A特异性的抑制剂BQ123的增强的缺乏(黑色条)。
图97A和97B是直方图，说明了双重ET-1A和ET-1B抑制剂波生坦转基因小鼠前内皮素原合成和分泌的增强。用波生坦(100mg/kg)处理表达在前内皮素原-1(PPE-1)启动子控制下的LUC基因的转基因小鼠30天。图97A显示了从转基因动物肺提取的总RNA的直方图。图97B显示了前内皮素原-1mRNA水平的直方图(通过半定量RT-PCR测量)。将这些值标准化为β-肌动蛋白，且然后以任意单位图形显示。图97B显示了对照(空心条)或波生坦-处理的小鼠(灰色阴影条)中的免疫反应性的内皮素-1(ET-1)水平。将结果表达为与对照未处理的小鼠相比，5只小鼠的平均值±标准差(斯氏t检验)。
图98是直方图，说明了皮质类固醇对腺病毒载体转化的内皮细胞中重组蛋白表达的增强。将BAEC暴露于3μM地塞米松(灰色条)或无类固醇(黑色条)48小时，然后以10-104的MOI，用含有在组成型CMV启动子控制下的LUC基因的腺病毒构建体转染。将重组基因表达表示为％萤光素酶/μg细胞总蛋白。注意到在所有MOI，皮质类固醇对表达的一致增强，在1000的MOI最高达300％。
图99是荧光显微照片，说明了皮质类固醇对内皮细胞中在PPE-1启动子控制下的重组蛋白的表达的增强。在用AdPPE-GFP感染(在100的MOI，48小时)之前48小时，将BAEC暴露于地塞米松(3μM)。显微照片是2个代表性孔的照片，各自是对照(上面)和地塞米松-处理的(下面)BAEC。注意到在地塞米松处理的细胞中显著更强的绿色荧光信号。
优选实施方案的描述
本发明是表现出内皮细胞特异性启动子活性的多核苷酸序列及其使用方法。更具体地说，本发明涉及一种在内皮细胞中表现出增加的活性和特异性的修饰型前内皮素原-1(PPE-1)启动子和核酸构建体，所述核酸构建体可用于在特定细胞亚群中活化凋亡，由此使得能够治疗特征在于异常新血管形成或细胞生长的疾病。本发明还涉及PPE启动子的修饰，所述修饰响应于包括低氧和血管生成在内的生理条件而增强其表达，并涉及新血管生成内皮特异性联合疗法。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解的是，本发明在其应用方面不限于在以下描述中叙述的或实施例例举的细节。本发明能够具有其它实施方案或以各种方式实施或进行。同样，要理解的是，本文所用的短语和术语仅用于说明目的，且不应被认为是限制性的。
失衡的血管生成为各种病理状况的典型特征，且通常支持病理状态的进展。例如，在实体瘤中，血管内皮细胞的分裂进度是正常组织中的那些细胞的约35倍(Denekamp和Hobson，1982 Br.J.Cancer 46：711-20)。这样的异常增殖是肿瘤生长和转移所必需的(Folkman，1986 Cancer Res.46：467-73)。血管内皮细胞增殖在慢性炎性疾病例如类风湿性关节炎、牛皮癣和滑膜炎中也是重要的，其中这些细胞响应于在炎症部位中释放的生长因子而增殖(Brown和Weiss，1988，Ann.Rheu m.Dis.47：881-5)。另一方面，在局部缺血状况如心脏缺血、外周血管疾病、伤口愈合、灼伤瘢痕形成和同类疾病中，血管生成的诱导具有治愈作用(Thompson等，PNAS 86：7928-7932，1998)，且因此是有益的。
因此，调节或修饰血管生成过程在限制该过程对基础性疾病状态的病理进展的影响以及为研究这种疾病的病因学提供有价值方法方面可具有重要的治疗作用。最近，在开发无论是设计成抑制性的还是刺激性的内皮调节剂方面都已取得显著进展(关于综述参见Mariani等GenMedGen 2003，5：22)。然而，对于促血管生成应用和持久功能性血管的大量形成，需要重复或长期递送上述蛋白因子，从而限制了它们在临床情形中的应用。此外，除与血管生成调节因子生产相关的高成本之外，这些因子的有效递送也需要使用待植入冠状动脉内的导管，这进一步增加了治疗的费用和难度。
迄今为止，有前景的临床实验已表明，如同Avastin
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或Bay-43906
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的抗血管生成治疗可通过限制肿瘤周围的新血管生长而减弱转移进展。但是，在其中需要显著的抗血管生成作用来破坏大部分或全部现有血管生成性血管并诱导肿瘤坏死的癌症病理学中，抑制新血管生成和/或部分破坏它们可能并不足够。此外，尽管在临床前模型中有前景，但迄今为止在临床试验中测试的所有抗血管生成剂的全身施用都显示出有限的成功率和相当大的毒性，包括血小板减少症、白细胞减少症和咯血。因此，治疗剂的内皮特异性靶向对促血管生成治疗和抗血管生成治疗是必需的。本领域业已描述了内皮特异性启动子，实例包括flk-1、Flt-1Tie-2VW因子和内皮素-1(参见Gu等的美国专利第6,200,751号；Williams等的美国专利第5,916,763号和Harats等的美国专利第5,747,340号，这些专利全部都在此引入作为参考)。本领域还已经描述了在内皮特异性启动子控制下表达的治疗基因的内皮细胞靶向。例如，Jagger等使用KDR或E-选择蛋白启动子在内皮细胞中特异性表达TNFα[Jaggar RT.等，Hum Gene Ther(1997)8(18)：2239-47]，而Ozaki等使用von-Willebrand因子(vWF)启动子向HUVEC递送单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)[HumGene Ther(1996)7(13)：1483-90]。尽管这些启动子被认为是内皮细胞特异性的，但研究已表明，这些启动子中有许多在将表达导向内皮细胞方面是无效的，没有所需的严格特异性，仅表现出微弱活性，且未允许高水平表达。
一种构建更有效和特异性的治疗用内皮启动子的方法一直以来都是鉴别和包含组织特异性增强子元件。例如，Bu等(J.Biol Chem.(1997)272(19)：32613-32622)先前已描述了内皮细胞特异性的增强子元件，他们证实，3个拷贝的PPE-1增强子元件(含有元件ETE-C、ETE-D和ETE-E)在体外赋予启动子序列内皮细胞特异性。但是，未能证实增强子元件的体内应用。
如下文的实施例部分清晰阐述的，本发明已证实了适用于体内治疗用途的增强子元件。通过生成独特的、修饰型三次重复的(3x)增强子元件(SEQ ID NO：7)并在体外和体内评价其指导内皮特异性基因表达的活性，本发明的发明人进一步构建了高度活性的增强子元件，其包含新的、重排方向的3x增强子元件序列的部分。此修饰型增强子元件表现出对参与血管生成的增殖性内皮细胞的增强特异性，而在正常内皮细胞中的体内活性可忽略。因此，本发明的发明人首次鉴别了在重构时赋予邻近的启动子序列优良活性的增强子元件的部分。
因此，按照本发明的一个方面，提供含顺式调节元件的分离多核苷酸，所述顺式调节元件能够在真核细胞中指导在转录上与其连接的多核苷酸序列的转录。所述分离多核苷酸包含共价连接至至少部分SEQ IDNO：16所示序列的至少部分SEQ ID NO：15所示序列。在一个优选实施方案中，在所述顺式调节元件中，所述至少部分SEQ ID NO：15所示序列位于所述至少部分SEQ ID NO：16所示序列的上游。在另一个优选实施方案中，在所述顺式调节元件中，至少部分SEQ ID NO：16所示序列位于所述至少部分SEQ ID NO：15所示序列的上游。
SEQ ID NO：15是代表鼠内皮特异性增强子元件(SEQ ID NO：6)的核苷酸坐标27-44的多核苷酸序列，在3′末端连接一个额外的鸟苷酸，且SEQ ID NO：16是代表鼠内皮特异性增强子元件(SEQ ID NO：6)的核苷酸坐标1-19的多核苷酸序列。
对本说明书和所附权利要求书来说，术语“增强子”指优选但非排它性地以组织特异性方式增加启动子转录活性的任意多核苷酸序列。本文使用的术语“组织特异性增强子”指以组织依赖性或背景序列依赖性(context-dependent)方式增加启动子转录活性的增强子。应当认识到，这样的“组织特异性启动子”在不相容的组织或环境中降低、抑制或甚至沉默启动子的转录活性。
按照本发明的一些实施方案，分离多核苷酸包含邻接拷贝的至少部分SEQ ID No：15和16。这样的序列优选以头-尾方向定位，但可构建本领域众所周知的其它方向，例如反向方向(尾-尾或头-头)、互补方向(用“t”取代“a”、用“a”取代“t”、用“c”取代“g”以及用“g”取代“c”)、反向互补方向等。所述至少部分SEQ ID NO：15所示序列可直接共价连接至所述至少部分SEQ ID NO：16所示序列，或在优选实施方案中，两个序列可通过接头多核苷酸序列连接。本文使用的术语“接头多核苷酸”指在两个或更多个侧翼多核苷酸(例如SEQ ID No：15和16)之间连接的多核苷酸序列。一种这样的优选接头序列例如为三核苷酸序列“cca”，其是如SEQID NO：7的55-57位中的核苷酸所示的接头序列。其它合适的接头序列可包括天然或人工的完整附加增强子元件，例如多拷贝的SEQ IDNO.15、SEQ ID NO：16、PPE-1的1×增强子元件、附加的完整启动子、低氧反应元件(例如SEQ ID NO：5)等。
本文使用的术语“部分SEQ ID NO：15所示序列......”或“部分SEQID NO：16所示序列......”定义为代表指明序列的5′末端、3′末端或其间任意序列的至少8个邻接核苷酸的序列。因此，例如，代表SEQ ID NO：15的核苷酸坐标1-8、1-9、1-10、1-11......累加1个核苷酸直至核苷酸坐标1-17的序列皆构成了本发明的部分SEQ ID NO：15，代表SEQ IDNO：15的核苷酸坐标2-9、2-10、2-11......至2-17的全部序列也如是，代表SEQ ID NO：15的核苷酸坐标3-10、3-11、3-12......至3-17的全部序列也如是，直至包含代表SEQ ID NO：15的核苷酸坐标10-17的序列。同样，代表SEQ ID NO：16的核苷酸坐标1-8、1-9、1-10、1-11......累加1个核苷酸直至核苷酸坐标1-19的序列皆构成了本发明的部分SEQID NO：16，代表核苷酸坐标2-9、2-10......的序列也如是，如上文所述。
在将本发明付诸实施时，揭示出修饰型增强子PPE-1(3x)包括连接至SEQ ID NO：16所示序列的SEQ ID NO：15所示序列，紧在其上游和下游侧接鼠内皮特异性增强子元件拷贝(1×)(参见SEQ ID NO：7)。因此，在一个优选实施方案中，本发明的顺式调节元件还包含至少一个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列。在更优选实施方案中，所述顺式调节元件包含至少两个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列。在最优选实施方案中，本发明的顺式调节元件如SEQ ID NO：7所示。
优选分离多核苷酸还包含内皮细胞特异性启动子序列元件。对本说明书和所附权利要求书来说，术语“启动子”指能够介导下游目标序列的RNA转录的任意多核苷酸序列。内皮特异性启动子元件可包括例如至少一个拷贝的PPE-1启动子。本发明的核酸构建体可使用的适宜启动子/增强子的实例包括内皮特异性启动子：前内皮素原-1，PPE-1启动子(Harats D，J Clin Invest.1995 Mar；95(3)：1335-44)，PPE-1-3x启动子[PCT/IL01/01059；Varda-Bloom N，Gene Ther 2001 Jun；8(11)：819-27]，TIE-1(S79347，S79346)和TIE-2(U53603)启动子[Sato TN，Proc NatlAcad Sci U S A 1993 Oct 15；90(20)：9355-8]，内皮糖蛋白启动子[Y11653；Rius C，Blood 1998 Dec 15；92(12)：4677-90]，von Willebrand因子[AF152417；Collins CJ Proc Natl Acad Sci U S A 1987 Jul；84(13)：4393-7]，KDR/flk-1启动子[X89777、X89776；Ronicke V，Circ Res 1996Aug；79(2)：277-85]，FLT-1启动子[D64016 AJ224863；Morishita K，：JBiol Chem 1995 Nov 17；270(46)：27948-53]，Egr-1启动子[AJ245926；Sukhatme VP，Oncogene Res 1987 Sep-Oct；1(4)：343-55]，E-选择蛋白启动子[Y12462；Collins T J Biol Chem 1991 Feb 5；266(4)：2466-73]；内皮粘附分子启动子：ICAM-1[X84737；Horley KJ EMBO J 1989 Oct；8(10)：2889-96]，VCAM-1[M92431；Iademarco MF，J Biol Chem 199 2Aug15；267(23)：16323-9]，PECAM-1[AJ313330 X96849；CD31，Newman PJ，Science 1990 Mar 9；247(4947)：1219-22]，血管平滑肌特异性元件：CArG框X53154和主动脉羧肽酶样蛋白(ACLP)启动子[AF332596；Layne MD，Circ Res.2002；90：728-736]和主动脉优先表达基因-1[Yen-Hsu Chen J.Biol.Chem.，276卷，第50期，47658-47663，2001年12月14日]。其它合适的内皮特异性启动子在本领域众所周知，例如EPCR启动子(Gu等的美国专利第6,200,751号)和VEGF启动子(Williams等的美国专利第5,916,763号)。
本文使用的术语“血管生成调节剂”定义为能抑制或增强组织中的血管生成的分子或化合物。这样的血管生成调节剂可以是抗血管生成因子，例如血管生成的重要靶的拮抗剂，例如，内皮素受体，或血管生成因子，从而造成内皮特异性启动子活性的上调或下调。
要认识到的是，其它非内皮启动子也可掺入到上述分离多核苷酸中，以在多种组织中指导所需核酸序列表达。适用于本发明构建体的启动子在本领域众所周知。这些启动子包括但不限于病毒启动子(例如逆转录病毒ITR、LTR、立即早期病毒启动子(IEp)(例如疱疹病毒IEp(例如ICP4-IEp和ICP0-IEp)和巨细胞病毒(CMV)IEp)以及其它病毒启动子(例如晚期病毒启动子、潜伏期活性启动子(LAP)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和鼠白血病病毒(MLV)启动子))。其它合适的启动子是真核启动子，其包括增强子序列(例如兔β-珠蛋白调节元件)、组成型活性启动子(例如β肌动蛋白启动子等)、信号和/或组织特异性启动子(例如诱导型和/或阻遏型启动子，例如TNF或RU486反应性启动子、金属硫蛋白启动子、PSA启动子等)和肿瘤特异性启动子，例如端粒酶、丝束蛋白(plastin)和己糖激酶启动子。
优选地，分离的多核苷酸还包含低氧反应元件，例如至少一个拷贝的SEQ ID NO：5所示序列。
本发明的分离核酸序列可用于在真核组织中调节基因表达，且具体地说是在增殖性内皮细胞(例如涉及血管生成的内皮细胞)中调节基因表达，或者可用于在静息内皮细胞中沉默(抑制)基因表达。
因此，在一些情况下，可提供本发明的分离多核苷酸序列，作为核酸构建体的部分，所述核酸构建体还包含处于本发明的分离多核苷酸调节控制之下的核酸序列。本发明的核酸构建体还可包含另外的多核苷酸序列，例如编码选择标记或报告多肽的序列、编码细菌中的复制起点的序列、允许由单个mRNA翻译几种蛋白的序列(IRES)、用于启动子-嵌合多肽编码区的基因组整合的序列和/或一般包含在哺乳动物表达载体中的序列，所述哺乳动物表达载体例如为可得自Invitrogen的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1；可得自Promega的pCI；可得自Stratagene的pBK-RSV和pBK-CMV；可得自Clontech的pTRES，以及它们的衍生物。这样的核酸构建体优选构建用于哺乳动物细胞表达，且可为病毒来源的。适用于哺乳动物表达的核酸构建体的众多实例是本领域已知的；以下的实施例部分提供了几个此种构建体的其它细节。
对本说明书和所附权利要求书来说，术语“处于......调节控制之下的核酸序列”指具有被RNA聚合酶转录的能力的任意多核苷酸序列，其转录可由顺式调节元件指导，例如本发明的顺式调节元件。该定义包括可翻译为多肽的编码序列以及反义RNA、结合DNA的RNA、核酶和并非注定会经历翻译的其它分子部分的序列。本发明构建体可使用的核酸序列的实例为例如血管生成的正和负调节物，例如VEGF、FGF-1、FGF-2、PDGF、促血管生成素-1和促血管生成素-2、TGF-β、IL-8(关于血管生成调节物的广泛清单，参见上文表1)；细胞毒性药物；报告基因等。在优选实施方案中，所述核酸序列选自血管生成调节物VEGF、p55、促血管生成素-1、bFGF和PDGF-BB。适于本发明的顺式调节元件控制的其它可转录核酸序列提供于下文和以下的实施例部分。
下文提出的实施例表明，在全身体内施用后，本发明的新顺式调节元件可以在局部缺血和/或血管生成(增殖)性内皮组织中优先的方式将报告基因(GFP和LUC)表达可靠地引导至内皮组织。更有意义的是，所述实施例还表明，本发明的分离多核苷酸可用于在肿瘤、转移、局部缺血组织和/或血管生成组织中优先表达治疗基因，从而提供有关本发明的顺式调节元件及其衍生物在治疗应用中的重要性的直接证据。
在一个实施方案中，本发明的核酸构建体用于上调组织中的血管生成，及治疗或预防与局部缺血相关的疾病或状况。这些应由增强的血管生成获益的疾病和状况在本领域众所周知，例如伤口愈合、缺血性中风、缺血性心脏病和胃肠损害。
本文使用的术语“下调血管生成”指减缓或阻止导致新血管生成的血管生成过程。术语“上调血管生成”指增强休眠的或起最低作用的内皮细胞血管生成活化剂的表达。
因此，本发明可用于基因治疗。本文使用的基因治疗指将目标遗传材料(例如DNA或RNA)转移至宿主中，以治疗或预防遗传性或获得性疾病或状况或表型。目标遗传材料编码期望其在体内生产的产物(例如蛋白、多肽、肽、功能性RNA、反义序列)。例如，目标遗传材料可编码有治疗价值的激素、受体、酶、多肽或肽。关于综述，一般参见教科书“Gene Therapy”(Advanced in Pharmacology 40，Academic Press，1997)。
已发展出基因治疗的两种基本方法：(1)先体外后体内和(2)体内基因治疗。在先体外后体内基因治疗中，从患者取出细胞，在培养的同时体外处理。一般来说，经合适的基因递送载体/方法(转染、转导、同源重组等)和符合需要的表达系统将功能替代基因导入细胞中，然后在培养物中扩增修饰型细胞，并将其返回宿主/患者中。业已表明，这些经遗传再植的细胞原位表达转染的遗传材料。
在体内基因治疗中，不从受试者取出靶细胞，而是将待转移的遗传材料原位(即处于接受者内)导入到接受者生物细胞中。在替代实施方案中，如果宿主基因是缺陷型的，则所述基因原位被修复(Culver，1998.(摘要)Antisense DNA & RNA based therapeutics，1998年2月，Coronado，CA)。
业已表明，这些基因改造细胞原位表达转染的遗传材料。
基因表达载体能够将异源核酸递送/转移入宿主细胞中。表达载体可包含以本领域已知的细胞选择性方式控制核酸的靶向、表达和转录的元件。应当指出的是，经常可用表达载体的5′UTR和/或3′UTR替换所述基因的5′UTR和/或3′UTR。因此，本文使用的表达载体根据需要可不包含待转移的实际基因的5′UTR和/或3′UTR，而仅包含特定的氨基酸编码区。
表达载体可包含控制异源材料转录的启动子，且可为组成型或可诱导启动子以允许选择性转录。任选地，可包括获得必需的转录水平可能需要的增强子。增强子一般为这样的任意非翻译DNA序列，其与编码序列邻接(以顺式方式)而起作用，以改变启动子控制的基础转录水平。表达载体还可包括如下文所述的选择基因。
可通过本领域的多种已知方法中的任一种将载体导入细胞或组织中。这样的方法一般可见于Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York 1989，1992)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland 1989)；Chang等，Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，MI 1995)；Vega等，Gene Targeting，CRC Press，Ann Arbor MI(995)，Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，Butterworths，Boston MA 1988)；和Gilboa等(Biotechniques 4(6)：504-512，1986)中的描述，且包括例如稳定或瞬时转染、脂转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外，参见关于涉及中枢神经系统的载体的美国专利4,866,042，还参见关于正-负选择方法的美国专利5,464,764和5,487,992。
通过感染导入核酸提供了几种超越其它列出方法的优势。由于其感染特性可获得较高效率。而且，病毒是非常特化的，且通常在特定细胞类型中感染和繁殖。因此，其天然特异性可用于将载体靶向体内或组织中或混合细胞培养物中的特定细胞类型。还可用特异性受体或配体修饰病毒载体，以通过受体介导的事件改变靶向特异性。
导入并表达重组序列的DNA病毒载体的具体实例是腺病毒衍生载体Adenop53TK。该载体表达用于正或负选择的疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因和所需重组序列的表达盒。该载体可用于感染具有腺病毒受体的细胞，包括大部分上皮起源的癌症以及其它癌症。该载体以及表现出相似所需功能的其它载体可用于处理混合的细胞群，且其可包括例如体外或先体外后体内细胞培养物、组织或人受试者。
还可包括限制特定细胞类型表达的特征。这样的特征包括例如对所需细胞类型特异性的启动子和调节元件。
另外，重组病毒载体可用于所需核酸的体内表达，因为它们提供了诸如侧向感染(lateral infection)和靶向特异性的优势。侧向感染是例如逆转录病毒生活周期中固有的，是单个感染细胞产生许多子代病毒体、而这些病毒体出芽并感染邻近细胞的过程。结果是大面积被快速感染，其中大部分开始时未被原始病毒颗粒感染。这与垂直型感染相对照，在垂直型感染中，感染因子仅通过子代传播。还可产生不能侧向传播的病毒载体。如果所需目的是将特定基因导入仅局部化的大量靶细胞中，则该特征可能有用。
如上所述，病毒是高度特化的感染因子，其在许多情况下已进化得能避开宿主防御机制。通常，病毒在特定细胞类型中感染和繁殖。病毒载体的靶向特异性利用其天然特异性，以特异性地靶向预定的细胞类型，且由此将重组基因导入被感染细胞中。本发明方法使用的载体取决于被靶向的所需细胞类型，且将是本领域技术人员已知的。例如，如果要治疗乳腺癌，则应使用对此种上皮细胞特异性的载体。同样，如果要治疗造血系统的疾病或病理状况，则应使用对血细胞及其前体特异性的病毒载体，优选对特定类型的造血细胞特异性的病毒载体。
可构建逆转录病毒，以起感染性颗粒的作用，或仅进行单次初始感染轮次。在前一种情况下，修饰病毒基因组，从而使得其保持合成新病毒蛋白和RNA的全部必需基因、调节序列和包装信号。一旦合成了这些分子，宿主细胞就将RNA包装成新病毒颗粒，新病毒颗粒能够进行更多轮的感染。还对载体基因组进行工程改造，以编码和表达所需重组基因。对非感染性病毒载体来说，通常使载体基因组突变，以破坏将RNA被囊化到病毒颗粒中所需要的病毒包装信号。如果没有此信号，形成的任何颗粒都将不含基因组，且因此不能进行至随后轮次的感染。载体的具体类型取决于预期用途。实际的载体也是已知的，且在本领域容易获得，或者可由本领域技术人员使用众所周知的方法构建。
重组载体可以几种方式施用。例如，如果使用病毒载体，则所述程序可利用其靶向特异性，并因此不必在患病部位局部施用。但是，局部施用可提供更快速和更有效的治疗，施用还可通过例如静脉内或皮下注射入患者中实施。将病毒载体注射入脊髓液也可用作施用模式，尤其是对神经变性疾病而言。在注射后，病毒载体将循环，直至它们识别具有适宜的感染靶向特异性的宿主细胞。
在现有技术中基因治疗规程遇到的最常见问题是效力差和宿主对载体的免疫应答。效力差可能起因于所递送的材料不能进入细胞中、不能整合入基因组中或不能以合适水平表达。另外，随着时间推移应答经常较差。这意味着可能有利的再施用经常由于上述免疫应答而成问题。
这样的治疗应用包括靶组织中的血管生成的增强和抑制。根据针对本发明顺式调节元件指导的核酸序列优先表达的细胞反应，可产生导致血管生成增强的内皮细胞增殖，或导致血管生成下降和局部缺血的内皮细胞增殖抑制。
因此，在本发明的核酸构建体中包含其表达有细胞毒性的核酸序列，提供了在例如肿瘤的血管生成血管中将细胞死亡靶向快速增殖内皮细胞的方法。因为这样的载体可全身施用，所以其可用于在发展中的转移病灶中有效诱导细胞死亡，优于任何目前可获得的鉴别和定位这种转移扩散病灶的能力。
这些可与本发明的构建体一起用于癌症基因治疗的治疗性核酸序列经常分类为目标在于恢复突变基因活性和控制的矫正性基因治疗、目标在于敏化抗癌细胞之免疫系统的免疫调节性基因治疗以及目标在于通过前药或毒性剂(自杀基因治疗)、促凋亡基因、抗血管生成基因或增强化疗或放疗来杀伤癌细胞的细胞减少性基因治疗。适于与本发明的顺式调节元件一起用于矫正性基因治疗的核酸序列包括但不限于：p53基因(GenBank登记号BC018819)，其表达在癌细胞中受到抑制的抗瘤性DNA稳定基因；Cip/Kip(p21，GenBank登记号NM000389；和p27，GenBank登记号NM004064)和Ink4(p14，GenBank登记号NM058197)，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。适于与本发明的顺式调节元件一起用于抑制癌基因功能的核酸序列包括但不限于：干扰癌基因(例如ras、myc、erbB2和bc1-2)转录和翻译的反义寡核苷酸以及干扰其翻译的催化性核酶。抗癌基因反义多核苷酸和核酶多核苷酸的合成和使用方法在本领域众所周知，且详述于例如Roth等的美国专利第6,627,189号、Bennet等的美国专利第6,265,216号和Calabretta等的美国专利第5,734,039号，所有这些专利都完整地在此引入作为参考。制备和使用催化性抗癌基因核酶的方法描述于例如Leopold等的美国专利第5,635,385号，该专利完整地在此引入作为参考。
在本发明的再一个实施方案中，在本发明的顺式调节元件控制下表达的核酸序列涉及免疫调谐基因表达，设计用于防止肿瘤细胞和转移细胞逃避免疫监视。编码适于与本发明的顺式调节元件一起使用的免疫调谐因子的核酸序列是细胞因子基因，用于增强细胞毒性T细胞识别肿瘤抗原和外源外来免疫原的胞内分子基因(以诱导非特异性局部免疫反应)。合适的免疫刺激因子包括但不限于人IL-2、干扰素如人α、β或γ干扰素、人T细胞粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、人肿瘤坏死因子(TNF)和淋巴毒素(TNF-b)。人IL-2基因已克隆并测序，且可作为例如pBC12/HIV/IL-2(可得自美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，保藏号67618)的0.68kB BamHI-HinDIII片段获得。此外，人β干扰素、人GM-CSF、人TNF和人淋巴毒素的序列是已知的并可获得的。具体地说，人γ干扰素的序列是已知的(Fiers等，(1982)Philos.Trans.R.Soc.Lond.，B，Biol.Sci.299：29-38)，且已登录于GenBank，登记号M25460。人GM-CSF的序列是已知的(Wong等(1985)Science 228：810-815)，且已登录于GenBank，登记号M10663。人TNF序列业已描述(Wang等，(1985)Science228：149-154)，且登录于GenBank，登记号M10988。人淋巴毒素(TNF-b)的序列也已公开(Iris等，(1993)Nature Genet.3：137-145)，且登录于GenBank，登记号Z15026。
在又一个实施方案中，在本发明的顺式调节元件控制下表达的核酸序列涉及细胞减少性基因治疗或通过直接或间接基因递送杀伤靶细胞。在一个优选实施方案中，核酸序列是细胞毒性基因，例如但不限于自杀基因，如p53和egr-1-TNF-α，用于药物易感性治疗的细胞毒性前药/酶，例如更昔洛韦/胸苷激酶和5-氟胞嘧啶/胞嘧啶脱氨酶，以及抗转移基因，如5E1A。具体细胞毒性构建体的实例详述于以下的实施例部分。
在另一个实施方案中，在本发明的顺式调节元件控制下表达的核酸序列可涉及遗传放射性同位素治疗：将放射性标记的儿茶酚胺I131-间碘苄基胍摄取入表达去甲肾上腺素受体(NAT)的细胞中，是已确立的用于嗜铬细胞瘤、成神经细胞瘤、类癌瘤和甲状腺髓样癌的治疗形式。或者，钠碘同向转运蛋白(symporter)(NIS)介导碘摄取入正常和恶性甲状腺细胞中。业已报道，NIS基因作为转基因在体外和体内模型中抑制前列腺癌。
可使用相反的方法使组织再血管形成，例如在动脉粥样硬化患者中或在由于疾病或损伤(例如糖尿病)而罹患显著的外周循环损伤的患者中。在此情况下，可使用AdPPE-1-3X-GF型构建体，其中GF是生长因子(例如细胞因子)或其修饰物(例如AdPPE-1-SEQ ID NO：7-GF)。用于本文上下文的合适生长因子包括但不限于VEGF(GenBank登记号M95200)和大鼠PDGF-BB(GenBank登记号；与mus-AF162784具有99％同一性)和EGR-1(GenBank登记号M22326)、FGF(包括但不限于GenBank登记号XM 003306)及其组合。
要认识到的是，优选按照本发明的该方面使用超过一种血管生成因子，以避免已表明与单独施用VEGF相关的血管不成熟和血管退化的问题(关于进一步的细节，参见实施例部分的实施例27和31)。联合治疗可模拟内皮通道出芽的第一阶段，且随后募集平滑肌细胞以稳定新生血管[Richardson DM等，(2001)Nat.Biotechnol.19：1029-1034]。本发明该方面的联合治疗可通过将目标多核苷酸克隆在相同核酸构建体上实施，所述目标多核苷酸的每一个都处于本发明的分离核酸调节之下。备选地或优选地，目标多核苷酸的每一个都可分别克隆入本发明的核酸构建体中，由此使得能够对诱导的血管生成过程更紧密地调节。
低氧反应元件(例如SEQ ID NO：5)掺入到本发明的启动子序列中也可用于本发明，以进一步增强对局部缺血组织的表达选择性，由此导致选定组织的新血管形成。随着血液供应改善，局部缺血减轻，低氧反应元件不再被诱导，GF水平下降，且新血管形成过程被停止。
应当认识到，使用本发明的核酸构建体对内皮组织进行基因治疗，提供了用不能靶向血管生成内皮细胞的其它方法不可达到的时序协调。如以下的实施例部分所阐述的，含本发明的新增强子元件[例如PPE-1(3x)]的顺式调节元件特异性地引导在经历血管增殖的组织中的重组基因表达增加，同时防止重组基因在其它非血管生成组织中表达(参见实施例12、14、16、19、20、23、27、29、34和35)。在本发明的顺式调节元件和构建体转录控制下的治疗基因表达与基因产物所针对的细胞过程(血管生成性生长过程)的活化相一致，从而允许更高的效力和治疗所需的有效剂量显著下降。
因此，预期含本发明的顺式调节元件的构建体在基因治疗背景中的使用可将向肿瘤的递送最大化，同时使对周围正常组织的毒性作用最小化。有意义的是，如在以下实施例部分中阐述的，即便在周围组织含内皮组分的情况下也是如此。这是因为即便在PPE-1启动子背景下，本发明的顺式调节元件也极大地提高了快速增殖的内皮组织中的表达水平，如实施例16所证实的。
尽管下文提供的实施例具体涉及了本发明的顺式调节序列连同PPE-1启动子的用途，但预期本发明的增强子元件在与其它真核启动子序列一起使用时也将发挥其细胞特异性作用。
这样的预期基于现有技术的观察结果，该结果表明，增强子元件经常是可移动的，即它们可由一个启动子序列转移至另一个不相关的启动子序列并仍保持活性。例如，参见D.Jones等.(Dev.Biol.(1995)171(1)：60-72)；N.S.Yew等，(Mol.Ther.(2001)4：75-820)和L.Wu.等，(GeneTher.(2001)8；1416-26)。实际上，Bu等(J.Biol Chem.(1997)272(19)：32613-32622)的早期工作强有力地表明，与本发明的那些增强子元件(例如含SEQ ID No.15和16或SEQ ID NO：6的增强子)相关的增强子元件，可与组成型启动子如SV-40启动子一起使用。同样，对于经修饰含本发明增强子序列的真核启动子，包含其的构建体、使用其的方法和包含其的分离多核苷酸，完全属于要求保护的本发明的范围。
因此，假定本发明增强子元件的最小配置是含共价连接至至少部分SEQ ID NO：16所示序列的至少部分SEQ ID NO：15所示序列的分离多核苷酸。预期该增强子与各种各样的启动子一起起作用，所述启动子包括但不限于内皮特异性启动子(例如PPE-1；SEQ ID NO.：1)和组成型启动子，例如病毒启动子，如来源于CMV和SV40的启动子。此增强子应当能够向各种各样的启动子赋予内皮特异性。所述增强子元件可被增大，例如通过加入一个或多个拷贝的SEQ ID NO：6所示序列。这些额外的序列可邻接或非邻接地加入到SEQ ID NO：8序列中。
本发明还包括在内皮细胞中表达目标核酸序列的方法，该方法使用依赖于增强子元件和启动子的构建体，所述增强子元件含共价连接至至少部分SEQ ID NO：16所示序列的至少部分SEQ ID NO：15所示序列，以将目标序列高水平表达特异性地导向内皮细胞。
本文所用的“对从受试者身体取出的细胞先体外后体内施用并随后将所述细胞再导入所述受试者身体内”具体包括干细胞的应用，如在(Lyden等(2001)Nature Medicine 7：1194-1201)中所描述的。
尽管在下文给出的实施例中描述的实验中使用腺病毒，但是本领域普通技术人员可容易地使本发明的构建体适合于其它病毒递送系统。
含有内皮细胞特异性启动子的病毒载体也可以与其它方法联合使用，以增强所述病毒载体的靶向。这样的方法包括短肽配体和/或双特异性或双功能性分子或双抗体(Nettelbeck等，Molecular Therapy 3：882；2001)。
要指出的是，在基因治疗背景下针对组织中表达的治疗性转基因的宿主免疫应答，在开发和设计有效的基因治疗规程方面是重要考虑因素。针对重组转基因产物的不利免疫应答既可干扰药物递送的效力，又可导致炎症、细胞毒性和疾病。因此，所表达的重组治疗性分子的抗原性潜力在基因治疗中极为重要。
在将本发明付诸实施时，出乎意料地揭示出：作为Ad5PPE-1(3x)核酸构建体的部分表达的人多肽(TNF-R1)(实施例41，图95b)在小鼠中没有抗原性，且在宿主中不诱导显著的免疫应答，尽管明显存在针对施用处于CMV启动子控制下的Fas-c嵌合基因的抗TNF-R1应答(图95)。因此，本发明的分离多肽可用于降低或消除针对一种或多种内源表达的重组转基因产物的宿主免疫应答，这可通过在细胞中表达处于本发明的顺式调节元件转录控制下的重组转基因(或基因)来实现。优选地，所述顺式调节元件是PPE-1(3x)启动子。
在将本发明付诸实施时，令人惊奇地揭示出血管生成内皮特异性启动子PPE-1(3x)响应于抗血管生成治疗的额外增强。图94表明，响应于施用双重内皮素受体(ETA和ETB)拮抗剂波生坦，在携带核酸构建体的转基因小鼠的高度血管形成器官(主动脉、心脏、肺、气管和脑)中的萤光素酶表达优先增强，其中所述核酸构建体含处于PPE-1(3x)控制下的LUC报告转基因。抗血管生成治疗与处于本发明的顺式调节元件控制下的治疗性重组基因的转基因表达组合的这种协同作用，提供了先前未公开的药物靶向和降低的抗血管生成治疗剂量需求的可能性。尽管不希望受限于单一假设，但认为针对抗血管生成治疗的内源组织反应，在经自分泌环活化内皮素启动子诱导物时，实际上增强了本发明核酸构建体的内皮素启动子元件。因此，在一个实施方案中，包含本发明的顺式调节元件的构建体与附加的抗血管生成治疗联合施用，其中选定的抗血管生成治疗能够诱导内皮特异性启动子活性的内源增强子。抗血管生成治疗在本领域众所周知，包括但不限于内皮素受体拮抗剂如波生坦、VEGF受体拮抗剂、制管张素和内皮抑制素以及抗血管生成抗体，例如贝伐单抗(Bevacizumab)和Novast。
另外，应当理解，包含本发明的顺式调节元件或具有内皮特异性启动子活性的其它顺式调节元件的构建体的施用，和能诱导内皮特异性启动子活性的这些附加疗法的组合，可以用于增加包含促血管生成序列的构建体的表达，从而增强血管生成活性，例如，在局部缺血状况的治疗中。
在将本发明进一步付诸实施时，表明与B-形式特异性内皮素受体拮抗剂(BQ788)温育牛主动脉内皮细胞(BAEC)诱导内皮特异性启动子[PPE-1(3X)]活性的增强，而暴露于A-形式内皮素受体激动剂(BQ123)对内皮素启动子活性没有作用(图96)。使用表达在PPE-1启动子控制下的萤光素酶基因的转基因小鼠的进一步实施已经表明，BQ-788对B-形式内皮素受体的阻断导致增加的内皮素转录和循环血浆内皮素的增加(图97A和97B)。
因而，在一个实施方案中，与附加疗法相组合地施用包含本发明的顺式调节元件的构建体，其中所述附加疗法是B-形式内皮素受体的阻断。这样的阻断可以通过非选择性的内皮素受体拮抗剂，例如、但不限于：波生坦；A-186086；Ro-61-6612；SB-209，670；SB-217，243；PD142，893；和PD 145，065，或通过选择性的B亚型内皮素受体拮抗剂，例如、但不限于：A192，621；BQ788；Res 701-1和Ro 46-8443(Sigma-Aldrich，Inc.StLouis，MO)。
应当理解，宿主细胞对腺病毒载体感染的响应的减弱，可以提高在这样的载体中递送的编码重组蛋白的构建体的表达。最近，已经表明，皮质类固醇(地塞米松)施用可以预防有些免疫-和细胞凋亡-有关的重组腺病毒感染的内皮的损伤(Murata，等人Arterioscler Thromb Vasc Biol2005；25：1796-803)，从而抑制促炎基因表达和最优化体外和体内重组基因表达效率。显示了皮质类固醇对腺病毒中转基因表达的增强作用是特异性的，在内皮细胞中比在有些肿瘤细胞系中更显著。
另外，最近已经表明，用N-乙酰半胱氨酸处理细胞(Jornot等人，Journal of Genetic Medicine 2002；4：54-65)增强腺病毒-处理的内皮细胞中的转基因表达和病毒穿入。
在将本发明付诸实施时，发现皮质类固醇治疗增强腺病毒介导的瞬时表达中转基因的表达。在用表达在组成型CMV启动子控制下的萤光素酶的腺病毒构建体(Ad-CMV-LUC)感染之前用3μM地塞米松处理过的BAEC细胞中按照每μg总蛋白的萤光素酶百分比测得的萤光素酶表达增加了超过3倍。另外，在用在内皮特异性启动子PPE-1控制下的携带报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒构建体感染之前用3μM地塞米松处理过的BAEC中的重组基因表达与未处理的对照相比显著增强(参见下文实施例42)。
因而，在另一个实施方案中，与用于增加病毒颗粒的拷贝数和/或增强转导细胞中的转基因表达的其它一种或多种化合物组合地施用包含本发明的顺式调节元件的病毒构建体，其中所述其它一种或多种化合物是皮质类固醇(例如，例如地塞米松)和/或N-乙酰半胱氨酸(NAC)。
本发明的构建体和方法尤其适用于组织工程改造。VEGF和PDGF常用于诱导血管形成，但是，这些因子以有效方式施用的方法仍不是最佳的。在体外，将所述生长因子加入到生长培养基中。在这种方法中需要相对较高的浓度。在体内，工程化组织构建体需要快速血管形成和诱导植入部位的血管生成。本发明的顺式调节元件和核酸构建体可用于体内和先体外后体内的组织新血管形成，例如用于组织工程改造、伤口愈合处理等。在将本发明付诸实施时，首次证实处于PPE-1(3x)调节控制下的血管生成因子优先在血管形成的体外工程化组织中表达，且在体外和体内工程化组织中提供优良的新血管形成。
用Ad5PPEC-1-3x VEGF感染细胞对在工程化构建体中形成的血管样结构的数目和大小具有诱导作用，从而导致与向培养基中加入VEGF相比，Ad5PPEC-1-3x VEGF病毒处理样品中的血管数目和血管面积百分比增加至4-5倍(图91a)。在体内研究中，分析基于植入支架的组织构建体的存活、分化、整合和血管形成。与对照构建体相比，用Ad5PPEC-1-3xVEGF病毒感染的构建体显示血管结构增加。
因此，在一个优选实施方案中，本发明的核酸构建体用于调节组织中的血管生成，所述组织是天然组织或工程化组织。
使用基于萤光素酶的成像系统，本发明的发明人揭示，用Ad5PPEC-1-3x VEGF感染的植入构建体具有比仅用AAV-萤光素酶感染的对照构建体更高的信号，从而表明用Ad5PPEC-1-3x VEGF体外感染可提升所植入的工程化组织构建体的存活和血管形成(图91b)。此外，含用本发明的腺病毒构建体转导的细胞的这种工程化组织构建体可经细胞裂解，构成用于周围组织的治疗性的重组病毒颗粒来源。
因此，按照本发明的一个方面，提供含本发明的核酸构建体的细胞。按照本发明的另一方面，这些细胞用于接种待用支架，例如用于组织工程改造。使用支架进行组织工程改造的方法在本领域众所周知(参见例如美国专利第6,753,181、6,652,583、6,497,725、6,479,064、6,438,802、6,376,244、6,206,917、6,783,776、6,576,265、6,521,750、6,444,803、6,300,127、6,183,737、6,110,480、6,027,743和5,906,827号，以及美国专利申请第0040044403、0030215945、0030194802、0030180268、0030124099、0020160510、0020102727号，这些文献在此引入作为参考，所有这些文献都讲述了组织支架上工程化组织的产生)。合适的支架可由合成聚合物、细胞粘附分子或胞外基质蛋白组成。
本发明使用的细胞粘附/ECM蛋白可为任何细胞粘附和/或胞外基质蛋白，包括但不限于血纤蛋白原、胶原蛋白、整联蛋白(Stefanidakis M等，2003；J Biol Chem.278：34674-84)、细胞间粘附分子(ICAM)1(van deStolpe A和van der Saag PT.1996；J.Mol.Med.74：13-33)、生腱蛋白、纤连蛋白(Joshi P等，1993；J.Cell Sci.106：389-400)、波形蛋白、微管相关蛋白1D(Theodosis DT.2002；Front Neuroendocrinol.23：101-35)、gicerin、神经突增生因子(NOF)(Tsukamoto Y等，2001；Histol.Histopathol16：563-71)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、细菌纤维素(BC)、明胶和/或神经损伤诱导蛋白2(ninjurin 2)(Araki T和Milbrandt J.2000；J.Neurosci.20：187-95)。
本发明使用的合成聚合物可为聚乙二醇(PEG)、羟基磷灰石(HA)、聚乙醇酸(PGA)(Freed LE，Biotechnology(N Y).1994 Jul；12(7)：689-93.)、用聚-1-交酯编织加固的ε-己内酯和1-乳酸[KN-PCLA](OzawaT等，2002；J.Thorac.Cardiovasc.Surg.124：1157-64)、织物(WV-PCLA)[Ozawa，2002(出处同上)]、互连多孔羟基磷灰石钙陶瓷(IP-CHA)、聚D，L，-乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)(Kaito T等，2005；Biomaterials.26：73-9)、不饱和聚酯(丙二醇-富马酸)共聚物(PPF)(Trantolo DJ等，2003；Int.J.Oral Maxillofac.Implants.18：182-8)、交酯-乙交酯共聚物(PLAGA)(Lu HH等，2003；J.Biomed.Mater.Res.64A(3)：465-74)、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)和/或聚磷腈(Cohen S等，1993；Clin.Mater.13(1-4)：3-10)。
在将本发明付诸实施时，本发明的发明人已揭示，将促凋亡试剂的组织特异性表达与特异性活化组合能够选择性地使参与血管生成的细胞凋亡，而不使非靶组织或细胞接触这些试剂，从而避免了现有技术中的治疗方法特有的毒性副作用和冗余现象。
因此，按照本发明的一个方面，提供在受试者组织中下调血管生成的方法。此处所用的短语“下调血管生成”指减缓或者阻止导致新血管生成的血管生成过程。
本发明该方面的方法通过向受试者施用经设计并构建用于血管生成细胞亚群中的细胞毒性的核酸构建体来实现。此处所用的短语“血管生成细胞”指参与或有助于血管生成过程的任何细胞。因此，血管生成细胞包括但不限于内皮细胞、平滑肌细胞。
本文使用的术语“细胞毒性”指化合物或过程以潜在不可逆的方式破坏细胞的正常代谢、功能和/或结构、更经常导致细胞死亡的能力。“细胞毒性分子”在本文定义为在限定条件下具有在细胞中产生细胞毒性或诱导细胞毒性过程或途径的能力的分子。这样的细胞毒性分子包括细胞毒性药物，例如但不限于抗代谢物，如氨甲蝶呤、核苷类似物、氮芥化合物、蒽环类、凋亡诱导物如胱天蛋白酶以及编码细胞毒性药物和细胞毒性过程的其它诱导物的基因例如Fas-c嵌合基因。细胞毒性药物和分子可为绝对细胞毒性的，与其它因子无关，例如抗代谢药物；或者可为条件型细胞毒性的，依赖于其它细胞毒性或非细胞毒性因子的相互作用。产生细胞毒性的结构域定义为细胞毒性分子中能够诱导或启动细胞毒性的部分，例如细胞毒性基因的编码序列。细胞毒性途径尤其包括凋亡和坏死。
在本发明的一个优选实施方案中，细胞毒性剂的表达针对血管生成细胞亚群。为了将细胞毒性剂的特异性表达引导至血管生成细胞亚群，本发明的核酸构建体包含编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含配体结合结构域，其例如可为受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸激酶、受体苏氨酸激酶、细胞粘附分子或磷酸酶受体的细胞表面受体结构域，该细胞表面受体结构域融合至细胞毒性分子(例如Fas、TNFR和TRAIL)的效应物结构域。
这样的嵌合多肽可包括融合至任意细胞毒性结构域的任何配体结合结构域，只要配体结合结构域的活化(即经配体结合)通过细胞毒性分子的效应物结构域触发细胞毒性。
配体结合结构域和与之融合的产生细胞毒性的结构域的选择根据被靶向用于凋亡的血管生成细胞类型受影响。例如，当靶向特定的内皮细胞亚群(例如增殖的内皮细胞或表现出肿瘤表型的内皮细胞)时，嵌合多肽所包含的配体结合结构域能够结合天然存在于该内皮细胞的环境中并优选不存在于其它非靶向组织的内皮细胞中的配体(例如TNF、VEGF)。这样的配体可由内皮细胞分泌(自分泌)、由邻近的肿瘤细胞分泌(旁分泌)或特异性地靶向这些内皮细胞。
在上文、以及以下的实施例部分的实施例7和33-36中提供了合适的嵌合多肽的实例。优选地，嵌合多肽为详述于以下的实施例部分的实施例7-9中的Fas-c嵌合体，或描述于实施例33-36的HSV-TK基因。业已表明，Fas-c嵌合体的表达经FADD介导的Fas死亡途径的活化来诱导凋亡。HSV-TK转基因的表达导致转导细胞对药物(例如更昔洛韦和阿昔洛韦)的超敏感性，从而导致凋亡和坏死性细胞死亡。
使用这样的嵌合多肽是特别有利的，因为如后文的实施例部分所示，其使得能在特定的血管生成细胞亚群中有效和有力地活化细胞毒性，同时避免在其它不被细胞死亡靶向的细胞亚群中活化。
如在以下的实施例部分的实施例33-38中所阐述的，体外和体内施用本发明的核酸构建体(包括处于PPE-1(3x)启动子元件的转录控制之下的HSV-TK基因)，产生优良的、更昔洛韦依赖性的内皮细胞细胞毒性。细胞毒性限于血管生成内皮细胞，在肿瘤和转移中产生选择性的凋亡性和坏死性细胞死亡。
因此，本发明的核酸构建体可用于递送能够将前药转变为毒性化合物的自杀基因。在一个优选实施方案中，所述核酸构建体包括编码此自杀基因的第一多核苷酸区和编码能够引导所述自杀基因在血管生成细胞中表达的顺式作用调节元件的第二多核苷酸区。
在本发明的构建体和方法中，治疗性核酸序列或“自杀基因”是编码产物的核酸，其中所述产物通过其自身或在其它化合物存在下引起细胞死亡。要认识到的是，上述构建体仅代表自杀构建体的一个实例。其它实例是水痘带状疱疹病毒胸苷激酶和可将5-氟胞嘧啶转变为高度毒性的化合物5-氟尿嘧啶的细菌基因胞嘧啶脱氨酶。
本文使用的“前药”指可用于本发明方法的、可转变为毒性产物(即对肿瘤细胞有毒性)的任意化合物。所述前药通过用于本发明方法的载体中的治疗性核酸序列(自杀基因)的基因产物转变为毒性产物。此前药的代表性实例是更昔洛韦，其通过HSV-胸苷激酶在体内转变为毒性化合物。更昔洛韦衍生物随后对肿瘤细胞有毒性。前药的其它代表性实例包括阿昔洛韦、FIAU[1-(2-脱氧-2-氟-β-D-呋喃型阿糖基)-5-碘尿嘧啶]、用于VZV-TK的6-甲氧基嘌呤阿糖胞苷以及用于胞嘧啶脱氨酶的5-氟胞嘧啶。优选的自杀基因/前药组合是细菌胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶及其衍生物、水痘带状疱疹病毒TK和6-甲基嘌呤阿糖胞苷及其衍生物、HSV-TK和更昔洛韦、阿昔洛韦、FIAU或其衍生物。制备和使用自杀基因/前药构建体的方法详述于Woo等的美国专利第6,066,624号以及下文的实施例部分。
在一个优选实施方案中，顺式作用调节元件是内皮或内皮周特异性启动子。因为用条件复制型腺病毒载体转导细胞明显在靶细胞裂解和病毒感染传播方面更有效，所以核酸构建体优选包括条件复制型腺病毒。本发明的这种CRAD构建体详述于以下的实施例部分。
优选地，本发明的核酸构建体通过例如全身施用途径或经口、直肠、跨粘膜(尤其是经鼻)、肠或肠胃外施用途径施用于受试者。全身施用包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内注射或瘤内施用。
优选地，所述受试者是哺乳动物，更优选是人，最优选是患有特征为过度或异常新血管形成的疾病的人，所述疾病例如为以肿瘤生长、增生性糖尿病性视网膜病、关节炎等为特征的疾病。
本发明的核酸构建体可以自身或作为药物组合物的部分(活性成分)施用于受试者。
现有技术讲述了多种递送策略，可用于向多种细胞类型有效递送裸的或载体提供的多核苷酸(参见例如Luft(1998)J Mol Med 76(2)：75-6；Kronenwett等，(1998)Blood 91(3)：852-62；Rajur等，(1997)BioconjugChem 8(6)：935-40；Lavigne等，(1997)Biochem Biophys Res Commun237(3)：566-71和Aoki等，(1997)Biochem Biophys Res Commun 231(3)：540-5)。
本文所用的“药物组合物”指本文所述的一种或多种活性成分或试剂与其它化学成分(如生理学适宜的载体或赋形剂)的制剂。药物组合物的目的在于便于将化合物施用于生物。
在下文中，短语“生理学可接受的载体”和“药学可接受的载体”可互换使用，指不对生物造成明显刺激、且不取消所施用的核酸构建体之生物活性和特性的载体或稀释剂。佐剂包含在这些短语之中。
术语“赋形剂”在本文中指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
药物的配制和施用技术可参见“Remington′s PharmaceuticalSciences，”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版，其在此引入作为参考。
适宜的施用途径可包括例如经口、直肠、跨粘膜(尤其是经鼻)、肠或肠胃外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
或者，人们可将所述药物组合物以局部方式而非全身方式施用，例如经由将所述药物组合物直接注射到患者的组织区域内。在本发明上下文中，直接施用于肿瘤组织是局部施用的相关实例。
本发明的药物组合物可以利用本领域已知的方法制造，例如通过传统的混合、溶解、造粒、裹覆糖衣(dragee-making)、研磨、乳化、被囊化、包载或冻干方法。
因此，按照本发明使用的药物组合物可通过传统方式用一种或多种生理学可接受的、含斌形剂和助剂的载体配制，所述载体有助于将活性成分加工到药学可用的制剂中。适当的制剂取决于所选的施用途径。
对于注射，药物组合物的活性成分可配制在水溶液中，优选地配制在生理学相容的缓冲液中，比如Hank氏溶液、林格液或生理盐缓冲液。对于跨粘膜施用，在制剂中应用适合于待透过屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域通常是已知的。
对于经口施用，所述药物组合物可容易地通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体组合配制。所述载体使得能够将药物组合物配制成片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆、悬浮液等用于由病人口服。经口使用的药学制剂可利用固体赋形剂制造，任选地将所得混合物研磨，在根据需要加入适当助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣核。适宜的赋形剂具体地说是填料，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学可接受的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要时可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐，如藻酸钠。
为糖衣核提供适当的包衣。为此目的，可使用浓缩糖溶液，其任选地可包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波泊尔凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和适当的有机溶剂或溶剂混合物。可向片剂或糖衣片包衣添加着色剂或色素，以鉴别或表征不同的活性化合物剂量的组合。
可经口使用的药物组合物包括由明胶制成的推入契合(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的密封软胶囊。推入契合胶囊可包含活性成分，其与填料(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合。在软胶囊中，所述活性成分可溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可添加稳定剂。所有经口施用的制剂都应为适于选定施用途径的剂量。
对于口腔含化施用，所述组合物可采用以常规方式配制的片剂或糖锭形式。
对于经鼻吸入施用，按照本发明使用的活性成分可方便地以气溶胶喷雾剂形式递送，所述气溶胶喷雾剂由加压包装或喷雾器使用适当的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳提供。对于加压气溶胶，剂量单位可通过提供阀确定以递送计量的量。分配器中所用的胶囊和药筒(例如明胶)可配制成包含所述化合物和适当的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
本文所述的药物组合物可被配制成用于肠胃外施用，例如快速浓注或连续输注。注射用制剂可以单位剂型提供，例如在安瓿中或多剂容器中，任选地添加防腐剂。所述组合物可为在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂，且可包含例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制试剂。
用于肠胃外施用的药物组合物包括为水溶性形式的活性制剂水溶液。另外，活性成分的悬浮液可制成合适的油性或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可包含增加悬浮液粘性的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，所述悬浮液还可包含合适的稳定剂或增加活性成分溶解性的试剂，以使得可以制成高浓缩溶液。
或者，所述活性成分可为粉末形式，用于在使用前用适当的载体如无菌无致热原水基溶液进行构建。
还可以利用例如传统的栓剂基材如可可脂或其它甘油酯将本发明的药物组合物配制成直肠组合物，例如栓剂或滞留型灌肠剂。
适用于本发明上下文的药物组合物包括其中含有有效实现预期目的的量的活性成分的组合物。更具体地说，治疗有效量指有效阻止、减轻或改善疾病症状(例如进行性骨量损失)或延长治疗受试者存活的活性成分(例如反义寡核苷酸)量。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内，尤其是在依照本文提供的详细公开内容的情况下。
对于用于本发明方法的任何制剂，所述治疗有效量或治疗有效剂量首先可由体外和细胞培养测定估测。例如，可在动物模型如骨硬化病的鼠Src缺陷模型中配制剂量(Boyce等，(1992)J.Clin.Invest.90，1622-1627；Lowe等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，4485-4489；Soriano等，(1991)Cell 64，693-702)，以达到所需的浓度或滴度。这样的信息可用于更准确地确定人中的有用剂量。
本文所述的活性成分的毒性、细胞毒性和治疗功效可通过标准的药学程序在体外、细胞培养物或实验动物中确定。从这些体外和细胞培养测定以及动物研究中获得的数据可用于配制一系列人用剂量。所述剂量可根据所用剂型和所用施用途径变化。精确的制剂、施用途径和剂量可由个别医师根据病人的情况选择。(参见例如Fingl等，1975，载于“ThePharmacological Basis of Therapeutics”，第一章第1页)。
剂量和间隔可被单独调整到足以阻碍肿瘤进展的活性成分水平(最低有效浓度，MEC)。MEC随各个制剂变化，但可由体外数据估测。达到MEC所必需的剂量取决于个体特征和施用途径。可利用检测测定确定血浆浓度。
根据被治疗状况的严重性和反应性，给药可以是单次或多次施用，疗程持续几天到几周或实现疾病状态减轻。
所施用组合物的量当然将取决于治疗受试者、病痛严重程度、施用方式、处方医师的判断等等。
需要时，本发明的组合物和组合物的组合可以以制品提供，例如包装或分配装置，例如经FDA核准的试剂盒，其可包括含有一种或多种活性成分的一个或多个单位剂型。例如，所述包装可包括金属或塑料箔，例如泡罩包装。所述包装或分配器装置可随附施用说明书。所述包装或分配器还可提供有管理药品生产、使用或销售的政府机构规定形式的伴随容器的通知书，该通知书反映了该政府机构对所述组合物形式或人或兽医施用的批准。此通知书例如可为经美国食品和药品管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准的处方药标签，或者可为批准产品的插页。还可以制备含有在相容药学载体中配制的本发明制剂的组合物，其放置在合适的容器中，且标识出治疗指定状况，如上文的进一步详述一样。也可以制备包含配制在适合的药用载体中的本发明的肽的组合物，置于适当容器中，标记上指定状况的治疗或预防或希望的事件的诱导。标签上的合适适应症可以包括血管生成有关的疾病或状况、与过度的新血管形成有关的疾病或状况的治疗和/或预防，肿瘤形成或生长的治疗和/或预防，与局部缺血、血管生成的下调有关的疾病或状况的治疗和/或预防，癌症、转移性疾病、过度增殖疾病(例如类风湿性关节炎和牛皮癣)和伤口愈合等的治疗和/或预防。
本发明的药物组合物可进一步包括任何附加成分，所述附加成分可改善细胞对所述核酸构建体的摄取，提升由所述核酸构建体编码的嵌合多肽或自杀基因在细胞中的表达，或提升所表达的嵌合多肽或自杀基因产物的活性。在一个实施方案中，所述附加成分可以是能增加腺病毒的拷贝数或增强血管生成调节物(例如皮质类固醇和/或N-乙酰半胱氨酸和/或内皮素受体拮抗剂、尤其B-形式特异性内皮素受体拮抗剂)的表达的化合物，如在下面的实施例部分所显示的。
例如，用工程化抗体或小肽处理载体可提高EC细胞对腺病毒载体的摄取。这样的“腺体(adenobody)”治疗显示出将腺病毒构建体有效导向细胞上的EGF受体(Watkins等，1997，Gene Therapy 4：1004-1012)。另外，Nicklin等已表明，通过噬菌体展示分离的小肽增加了载体在内皮细胞中的特异性和效率，且降低了在培养物肝细胞中的表达(Nicklin等，2000，Circulation 102：231-237)。在最近的研究中，FGF再靶向的腺病毒载体降低了tk在小鼠中的毒性(Printz等，2000，Human Gene Therapy 11：191-204)。
业已表明，低剂量辐射主要在G2/M期引起DNA链断裂，引起细胞膜损伤，从而增强旁观者效应，且由此在联合施用时可加强其它细胞毒性和抗瘤治疗。血管内皮细胞尤其适合于这样的联合或附加治疗，因为已证实低剂量辐射特异性地靶向微血管内皮细胞的凋亡系统(Kolesnick等，Oncogene 2003；22：5897-906)。业已表明制管张素加强低剂量辐射的疗效(Gorski等，Can Res 1998；58：5686-89)。但是，对辐射的作用仍了解不多，因为也已经表明辐射增加促血管生成性“组织修复因子”(Itasaka等，Am Assoc Canc Res，2003；摘要115)。类似地，已表明某些化疗剂活化特定细胞毒性和凋亡途径[阿霉素、顺铂和丝裂霉素C诱导Fas受体、FADD和FADD/MORT-1途径中的其它促凋亡信号累积(Micheau等，BBRC 1999 256：603-07)]。在将本发明付诸实施时，令人惊奇地揭示出，低剂量辐射治疗对核酸构建体(包括处于PPE-1(3x)控制下的TK和更昔洛韦施用)的抗肿瘤和抗转移有效性具有明显的协同作用(实施例35和36，图79-86)。这在本发明上下文中是特别有关联的，因为已证实这样的低剂量辐射可活化TK表达和疗效，可特异性地加强阿霉素化疗作用，并已知活化FADD/MORT-1凋亡途径(Kim等，JBC2002；277：38855-62)。
此联合治疗的效力的进一步证据描述于实施例37，该实施例阐述了在内皮细胞(BAEC)中联合施用阿霉素和AdPPE-1(3x)-Fas-c嵌合构建体的协同作用(图91)。因此，对于与异常血管生成相关的疾病或状况，可使用本发明的核酸构建体和含其的药物组合物单独地或与一种或多种针对该疾病的其它确立的或实验性治疗方案联合进行治疗。适于与本发明的核酸构建体或编码其的多核苷酸联合的治疗癌症的治疗方案包括但不限于化学疗法、放射疗法、光线疗法和光动力学治疗、外科手术、营养疗法、切除疗法、联合的放射疗法和化学疗法、臂疗法(brachiotherapy)、质子射束疗法、免疫疗法、细胞疗法和质子射束放射外科手术疗法。
可与本发明的化合物共同施用的抗癌药物包括但不限于异噁唑醋酸(Acivicin)、阿柔比星(Aclarubicin)、盐酸阿可达唑(AcodazoleHydrochloride)、阿克罗宁(Acronine)、亚得里亚霉素(Adriamycin)、阿多来新(Adozelesin)、阿地白介素(Aldesleukin)、六甲密胺(Altretamine)、丙氨肽霉素(Ambomycin)、阿美坦醌(Ametantrone Acetate)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、安吖啶(Amsacrine)、阿那曲唑(Anastrozole)、氨茴霉素(Anthramycin)、天冬酰胺酶(Asparaginase)、曲林菌素(Asperlin)、氮杂胞苷(Azacitidine)、阿扎替派(Azetepa)、阿佐霉素(Azotomycin)、巴马司他(Batimastat)、苯佐替派(Benzodepa)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、盐酸比桑郡(Bisantrene Hydrochloride)、二甲磺酸双奈法德(BisnafideDimesylate)、比折来新(Bizelesin)、硫酸博来霉素(Bleomycin Sulfate)、白瑞夸尔钠(Brequinar Sodium)、溴匹利明(Bropirimine)、白消安(Busulfan)、放线菌素C(Cactinomycin)、卡鲁睾酮(Calusterone)、卡拉酰胺(Caracemide)、卡贝替姆(Carbetimer)、卡铂(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、盐酸卡米诺霉素(Carubicin Hydrochloride)、卡折来新(Carzelesin)、西地芬戈(Cedefingol)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、西罗里霉素(Cirolemycin)、顺铂(Cisplatin)、克拉屈滨(Cladribine)、甲磺酸克雷斯托(Crisnatol Mesylate)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、放线菌素D(Dactinomycin)、盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride)、脱氧氮杂胞苷(Decitabine)、右奥马铂(Dexormaplatin)、地扎胍宁(Dezaguanine)、甲磺酸地扎呱宁(Dezaguanine Mesylate)、地吖醌(Diaziquone)、多西他赛(Docetaxel)、阿霉素(Doxorubicin)、盐酸阿霉素(Doxorubicin Hydrochloride)、屈洛西芬(Droloxifene)、柠檬酸屈洛西芬(Droloxifene Citrate)、丙酸2-甲氢睾酮(DromostanolonePropionate)、偶氮霉素(Duazomycin)、依达曲沙(Edatrexate)、盐酸艾佛鸟氨酸(Eflornithine Hydrochloride)、依沙芦星(Elsamitrucin)、恩络铂(Enloplatin)、恩普氨酯(Enpromate)、依匹哌啶(Epipropidine)、盐酸表阿霉素(Epirubicin Hydrochloride)、厄布洛唑(Erbulozole)、盐酸去羟阿霉素(Esorubicin Hydrochloride)、雌莫司汀(Estramustine)、雌莫司汀磷酸钠(Estramustine Phosphate Sodium)、依他硝唑(Etanidazole)、依托泊苷(Etoposide)、磷酸依托泊苷(EtoposidePhosphate)、氯苯乙嘧胺(Etoprine)、盐酸法罗唑啉(FadrozoleHydrochloride)、法扎拉滨(Fazarabine)、芬维A胺(Fenretinide)、氟尿苷(Floxuridine)、磷酸氟达拉滨(Fludarabine Phosphate)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟西他宾(Flurocitabine)、磷喹酮(Fosquidone)、福司曲辛钠(Fostriecin Sodium)、吉西他滨(Gemcitabine)、盐酸吉西他滨(Gemcitabine Hydrochloride)、羟基脲(Hydroxyurea)、盐酸去甲柔毛霉素(Idarubicin Hydrochloride)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、伊莫佛新(Ilmofosine)、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、异丙铂(Iproplatin)、盐酸伊立替康(IrinotecanHydrochloride)、生长妥林(Lanreotide Acetate)、来曲唑(Letrozole)、醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate)、盐酸利阿唑(Liarozole Hydrochloride)、洛美曲索钠(Lometrexol Sodium)、洛莫氮芥(Lomustine)、盐酸洛索蒽醌(Losoxantrone Hydrochloride)、马丙考(Masoprocol)、美登素(Maytansine)、盐酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)、醋酸甲地孕酮(MegestrolAcetate)、醋酸美仑孕酮(Melengestrol Acetate)、美法仑(Melphalan)、美洛格端(Menogaril)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)、氯苯氨啶(Metoprine)、四甲尿烷亚胺(Meturedepa)、米汀多酰胺(Mitindomide)、米托克星(Mitocarcin)、丝裂红素(Mitocromin)、丝裂吉菌素(Mitogillin)、丝裂马菌素(Mitomalcin)、丝裂霉素(Mitomycin)、丝裂帕菌素(Mitosper)、米托坦(Mitotane)、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)、麦考酚酸(Mycophenolic Acid)、洛可达唑(Nocodazole)、诺加拉霉素(Nogalamycin)、奥马铂(Ormaplatin)、奥昔舒仑(Oxisuran)、紫杉醇(Paclitaxel)、培加帕酶(Pegaspargase)、培利霉素(Peliomycin)、戊氮芥(Pentamustine)、硫酸培来霉素(PeplomycinSulfate)、哌磷酰胺(Perfosfamide)、哌泊溴烷(Pipobroman)、哌泊舒凡(Piposulfan)、盐酸必散特隆(Piroxantrone Hydrochloride)、普卡霉素(Plicamycin)、普洛美坦(Plomestane)、卟吩姆钠(Porfimer Sodium)、泊非罗霉素(Porfiromycin)、松龙苯芥(Prednimustine)、盐酸丙卡巴肼(Procarbazine Hydrochloride)、嘌呤霉素(Puromycin)、盐酸嘌呤霉素(Puromycin Hydrochloride)、吡唑霉素(Pyrazofurin)、利波腺苷(Riboprine)、吡鲁米特(Rogletimide)、沙芬戈(Safingol)、盐酸沙芬戈(SafingolHydrochloride)、司莫司汀(Semustine)、双曲秦(Simtrazene)、斯帕磷酸钠(Sparfosate Sodium)、司帕素霉素(Sparsomycin)、盐酸锗螺胺(Spirogermanium Hydrochloride)、螺施氮芥(Spiromustine)、顺螺铂(Spiroplatin)、链黑霉素(Streptonigrin)、链脲霉素(Streptozocin)、磺氯苯脲(Sulofenur)、他利霉素(Talisomycin)、他克唑(Taxol)、替可加兰钠(Tecogalan Sodium)、喃氟啶(Tegafur)、盐酸替洛蒽醌(TeloxantroneHydrochloride)、替莫泊芬(Temoporfin)、替尼泊苷(Teniposide)、台罗西隆(Teroxirone)、睾内酯(Testolactone)、硫唑鸟嘌呤(Thiamiprine)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、噻替派(Thiotepa)、噻唑呋林(Tiazofuirin)、替拉扎明(Tirapazamine)、盐酸拓扑替康(Topotecan Hydrochloride)、柠檬酸托瑞米芬(Toremifene Citrate)、醋酸7-甲诺酮(Trestolone Acetate)、磷酸曲西瑞宾(Triciribine Phosphate)、曲美沙特(Trimetrexate)、三甲曲沙葡糖醛酯(Trimetrexate Glucuronate)、曲普瑞林(Triptorelin)、盐酸九布洛唑(Tubulozole Hydrochloride)、尿嘧啶氮芥(Uracil Mustard)、乌瑞替哌(Uredepa)、伐普肽(Vapreotide)、维替泊芬(Verteporfin)、硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate)、硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate)、长春地辛(Vindesine)、硫酸长春地辛(Vindesine Sulfate)、硫酸长春匹定(VinepidineSulfate)、硫酸长春甘酯(Vinglycinate Sulfate)、硫酸长春素(VinleurosineSulfate)、长春瑞宾(Vinorelbine Tartrate)、硫酸异长春碱(VinrosidineSulfate)、硫酸长春氮芥(Vinzolidine Sulfate)、伏罗唑(Vorozole)、折尼拉汀(Zeniplatin)、净司他丁(Zinostatin)、盐酸佐柔比星(ZorubicinHydrochloride)。其余的抗瘤剂包括公开于Antineoplastic Agents(PaulCalabresi和Bruce A.Chabner)第52章和其中的引言、Goodman和Gilman的“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第8版，1990，McGraw-Hill，Inc.(Health Professions Division)的1202-1263中的那些抗瘤剂。
应当认识到，尽管优选靶向接触配体或细胞毒性前药的细胞，但本发明还设想本发明的核酸构建体在不接触配体或细胞毒性前药或者天然不受其影响的细胞中表达。在此情况下，本发明的方法包括将此配体或前药施用于转化细胞的步骤。这样的施用可通过使用任一种上述施用方法实现。优选地，所述配体或前药使用例如抗体缀合的靶向以细胞靶向的方式施用，从而使得细胞毒性的活化是高度特异性的。细胞毒性或凋亡活化的这种方法详述于以下的实施例部分。
因此，本发明提供核酸构建体、含此种构建体的药物组合物和使用此种构建体在以过度或异常血管生成为特征的组织区中下调血管生成的方法。
由于本发明使得能够在特定细胞亚群中靶定表达，所以本发明还可进行修改并用于治疗各种肿瘤。
因此，按照本发明的另一方面，提供治疗肿瘤的方法。
本发明该方面的方法通过在肿瘤细胞中表达上述嵌合多肽或自杀基因来实施。
因此，根据本发明的这一方面，所述多肽嵌合体或自杀基因的表达由肿瘤特异性元件指导，所述肿瘤特异性元件例如但不限于胃泌素释放肽(GRP)启动子[AF293321S3；Morimoto E Anticancer Res 2001年1月-2月；21(1A)：329-31]、hTERT启动子[AH007699；Gu J，Gene Ther 2002年1月；9(1)：30-7]、己糖激酶II型启动子[AF148512；Katabi MM，HumGene Ther.1999年1月20日；10(2)：155-64]或L丝束蛋白启动子[L05490，AH002870，MMU82611；Peng XY，Cancer Res.2001年6月1日；61(11)：4405-13]。
多肽嵌合体(例如Fas-c)或自杀基因在肿瘤细胞中的表达激活这些细胞中的细胞毒性和/或凋亡，并从而导致细胞死亡，这进而引起肿瘤生长减缓或停滞，并有可能引起肿瘤收缩。
在检查以下的非限制性实施例后，本发明的其它目的、优点和新特征对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。另外，上文叙述的和下文权利要求书部分所要求保护的本发明各种实施方案和方面的每一个都在以下实施例中得到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，连同以上的描述一起，以非限制性方式阐述本发明。
一般而言，本文所用的命名法以及本发明中所用的实验室程序包括分子技术、生物化学技术、微生物学技术和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽解释。参见例如“Molecular Cloning：A laboratoryManual”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”I-III卷，Ausubel，R.M.编辑，(1994)；Ausubel等，“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley & Sons，NewYork(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等(编辑)“Genome Analysis：A Laboratory ManualSeries”，1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；在美国专利第4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057号中叙述的方法；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”，I-III卷Cellis，J.E.编著(1994)；“Current Protocols in Immunology”I-III卷Coligan J.E.编辑，(1994)；Stites等(编辑)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，“SelectedMethods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中有全面描述，参见例如美国专利第3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521号；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.编辑，(1984)；“Nucleic AcidHybri dization”Hames，B.D.和Higgins S.J.编辑，(1985)；“Transcription andTranslation”Hames，B.D.和Higgins S.J.编辑，(1984)；“Animal CellCulture”Freshney，R.L.编辑，(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRLPress，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”1-317卷，Academic Press；“PCR Protocols：AGuide To Methods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有这些文献均如同在本文完整叙述一样引入到本文中。其它通用参考文献贯穿于本文件提供。其中的程序一般认为是本领域众所周知的，且仅为方便读者而提供。其中所包含的所有信息都在此引入作为参考。
具体地说，结合下文提及的实施例进行的实验使用以下方法和材料：
材料和方法
细胞培养
使Lewis肺癌细胞-(D122-96)、人胚肾细胞(293)和HeLa细胞在补加了10％胎牛血清(FCS)、50U/ml青霉素、50？g/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的4.5gr/l DMEM(Biological industries，Belt-Haemek，以色列)中生长。使牛主动脉内皮细胞-BAEC、正常皮肤成纤维细胞-NSF、HepG2和人脐内皮细胞-HUVEC-304(ATCC，USA)在补加了5％ FCS、50U/ml青霉素、50？g/ml链霉素和2mM谷氨酰胺的1.0gr/l DMEM(Biologicalindustries，Beit-Haeme k，以色列)中生长。给BAEC细胞补加完全成纤维细胞生长因子(Sigma，St.Louis.MO.)。使RINr1046-38(RIN-38)在补加了5％ FCS(Biological Industries，Beit-Haemek，以色列)、50U青霉素/ml、50？g链霉素/ml和2mM谷氨酰胺的199Earle氏盐(5.5mM葡萄糖)培养基中生长。
本文所用的“HepG2”指ATCC-HB-8065。
本文所用的“HeLa”指ATCC-CCL-2。
本文所用的“人支气管上皮细胞”和“B2B”指ATCC-CRL-9609。
本文所用的“HUVEC”和“人脐静脉内皮细胞”指ATCC-CRL-1730。
本文所用的“CHO”和“中国仓鼠卵巢”指ATCC-61。
低氧诱导
转染或转导后26小时，将细胞在分离的室中温育，用以N2平衡的含有0.5％ O2、5％ CO2的气流洗涤30分钟。将该分离的室置于5％ CO2、37℃湿润培养箱中。
细胞和组织中的萤光素酶活性
为了定量测定PPE-1启动子的体外和体内活性，使用萤光素酶基因表达系统试剂盒(Promega Corp.，Madison，WI)。转染或转导后48小时，洗涤细胞，加入200？l裂解缓冲液达15分钟。收集细胞裂解液，于4℃离心15分钟(14,000rpm)。随后，加入10？l上清液至50？l萤光素酶测定缓冲液中。用发光计测量20秒时间段内的所述活性。
为了测定实体组织中的萤光素酶活性，切取20mg样品，且在1ml匀浆溶液中匀浆，并于4℃离心15分钟(14,000rpm)，如上所述测定10ml上清液中的萤光素酶活性。结果以萤光素酶光单位/1？g蛋白表示。蛋白质采用Bradford测定测量，以牛血清清蛋白(BSA)为标准。
体外和体内GFP活性
为了测试GFP的体外表达，细胞用PBS洗涤两次，并用新鲜制备的4％低聚甲醛的PBS溶液固定30分钟。固定后，通过荧光显微镜术进行检查。
为了测试所递送基因的体内细胞分布，将组织在新鲜制备的溶于0.1M磷酸盐缓冲液的4％低聚甲醛中于4℃固定6小时，在30％蔗糖中于4℃浸泡过夜，然后在OCT化合物(Sakura，USA)中冷冻。用恒冷切片机将组织块切成10？m厚的切片，然后直接在荧光显微镜(FITC滤光片)下观察。
增殖细胞和静息细胞
为了比较增殖和静息BAEC中的PPE-1启动子活性，将细胞分成两组：1.增殖细胞—在10％ FCS培养基中生长和感染。2.静息细胞—转导前72小时内开始在无血清培养基中生长和感染。
使所有细胞皆在5％ CO2、37℃湿润培养箱中生长。
重组复制缺陷型腺病毒的制备
构建几个重组复制缺陷型腺病毒(5型)。包含鼠前内皮素原-1(PPE-1)启动子(SEQ ID NO：1)的表达盒位于萤光素酶基因(来源于pGL2-basic，GenBank登记号X65323)上游，且将SV40聚腺苷酸化位点(来源于pGL2-basic，GenBank登记号X65323)连接到pPAC.plpA(无启动子构建体)的BamHI限制位点。将GFP基因(来源于pEGFP，GenBank登记号AAB02572)于NotI限制位点与PPE-1启动子连接。按照Becker，T.C.等(Methods Cell biol.43；Roth M.(编著)New York.Academic Press，1994，161-189页)所述，通过将pPACPPE-1Luc或Ad5PPE-1GFP与腺病毒质粒pJM17共转染，制备被称为Ad5PPE-1Luc或Ad5PPE-1GFP的复制缺陷型重组腺病毒，然后收获重组病毒体。
制备大规模生产用病毒。将浓度为109-1012噬斑形成单位/ml(pfu/ml)的病毒原液于4℃贮存。按照对PPE-1病毒载体的描述制备供大规模制备用的含有巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子(GenBank登记号U47119)的病毒Ad5CMV-Luc和Ad5CMV-GFP(Quantum biotechnologies，Carlsbad，加拿大)，并将其用作非组织特异性对照。
PPE启动子的修饰
通过将Bu等(J.Biol Chem.(1997)272(19)：32613-32622)发现的正转录元件的三个拷贝插入到位于43个碱基对内源正元件(-364至-320bp)下游(-286bp)的NheI限制酶位点，开发修饰型鼠PPE-1启动子。
本文称为“3X”的增强子片段是鼠PPE-1启动子中存在的内源序列元件(SEQ ID NO：1的核苷酸坐标407-452)的三重拷贝。先前已经表明，血管内皮细胞中PPE-1启动子活性的诱导依赖于该元件的存在(Bu等，J.Biol Chem.(1997)272(19)：32613-32622)。通过用长度为96个碱基对的两条互补单链DNA链(BioTechnology industries；Nes Tziona，以色列)(SEQ ID NO：2和3)合成3X片段。使所述两个单链DNA片段退火，且用克列诺(Klenow)片段(NEB)填补；所得的双链DNA长145个碱基对，并包含Nhe-1限制位点(SEQ ID NO：4)。
用T4连接酶，将所述3X片段连接到内源Nhe-1位点下游的鼠PPE-1启动子中。让所得的构建体在DH5感受态细胞中繁殖，且用大量制备Qiagene试剂盒生产大规模质粒制剂。
其余质粒
野生型PPE-1启动子
含有1.4kb鼠前内皮素原-1(PPE-1)启动子、具有SV40聚腺苷酸化信号(GenBank登记号X 65323)位点的萤光素酶基因和鼠ET-1基因的第一内含子的PPE-1-萤光素酶盒(5249bp)来源于Harats等(J.Clin.Inv.(1995)95：1335-1344)使用的pEL8质粒(8848bp)。用BamHI限制酶从pEL8质粒中提取PPE-1-萤光素酶盒，然后用提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从1％琼脂糖凝胶中提取DNA片段。
无启动子pPAC.plpA质粒
含有腺病毒5型序列的无启动子pPAC.plpA质粒(7594bp)来源于pPACCMV.pLpA(8800bp)。用NotI限制酶除去CMV启动子、多克隆位点和SV40聚腺苷酸化位点(1206bp)，从1％琼脂糖凝胶中提取片段化DNA。该线性质粒(7594bp)通过克列诺片段填补，且用快速DNA连接试剂盒将BamHI接头与两个粘性末端连接。该线性质粒用T4DNA连接酶再连接，并转化到DH5α感受态细胞中，以扩增具有BamHI限制位点的pPAC.plpA。制备供大规模制备用的质粒，并用大量制备DNA纯化试剂盒纯化。
pPACPPE-1萤光素酶质粒
通过用T4DNA连接酶，将PPE-1-萤光素酶盒插入到pPAC.plpA质粒的BamHI限制位点中，构建pPACPPE-1萤光素酶质粒。随后用该质粒转化DH5α感受态细胞。制备大规模制备用质粒(12843bp)，并用大量制备DNA纯化试剂盒纯化。
pPACPPE-1GFP质粒
通过用T4DNA连接酶，将位于PPE-1启动子下游的GFP基因(来源于pEGFP，GenBank登记号AAB02572)亚克隆到NotI限制位点中，构建pPACPPE-1GFP质粒。
随后用该质粒转化DH5α感受态细胞。制备大规模制备用质粒(11,801bp)，并用大量制备DNA纯化试剂盒纯化。
pACPPE-13X萤光素酶质粒和pACPPE-13X GFP质粒
通过将经BamHI限制酶消化由含有Luc或GFP的pEL8-3X(图26B)获得的PPE-1-3XLuc盒或PPE-1-3XGFP盒插入到pPAC.plpA质粒的BamHI限制位点中，构建pPACPPE-1-3X萤光素酶和pPACPPE-1-3XGFP。pEL8-3X含有位于BamHI和NotI之间的修饰型鼠PPE-1启动子(1.55kb)(红色)，所述启动子含有位于两个NheI位点之间的三重内皮特异性增强子3X(如SEQ ID NO：7所示)。所述启动子、萤光素酶基因或GFP基因、SV40聚腺苷酸化位点和内皮素-1基因的第一内含子，它们一起被称为PPE-1修饰性启动子盒，如材料和方法中所述，用BamHI限制酶对其进行消化和提取。制备供大规模制备用的质粒(12843bp)，并通过大量制备DNA纯化试剂盒纯化。
SV40-萤光素酶报道质粒(Promega Gmbh，Manheim，德国)用作BAEC实验中的非选择性启动子对照。
体外实验、DNA转导-转导前24小时，将细胞接种到24孔或96孔皿中。对样品孔内的分汇合(subconfluent)细胞进行计数。然后，吸出各孔中的生长培养基，且将指定病毒载体以指定的感染复数(MOI)在感染培养基(DMEM或RPMI1640，2％ FBS)中稀释并加入到单层中。将细胞在室温下温育4小时。然后，加入完全培养基，且将该细胞在37℃、5％ CO2下温育72小时。
动物
所有动物程序都得到Sheba Medical Center，Tel-Hashomer的“Animal Care and Use Committee”批准。
使用以下的不同小鼠品系：
(i)3月龄雄性野生型C57BL/6小鼠(Harlan farms，Jerusalem，以色列)。
(ii)3月龄雄性BALB/C小鼠(Harlan farms，Jerusalem，以色列)。
(iii)6月龄雄性和雌性ApoE基因缺陷型、C57BL/6xSJ129小鼠的小鼠杂种(Plump AS.等，Cell(1991)71：343-353)。
(iv)3月龄雄性和雌性小鼠，该小鼠超表达处于鼠PPE-1启动子控制之下的萤光素酶基因(5.9Kb)，由Harats等产生(J.Clin.Inv.(1995)95：1335-1344)。
所有小鼠都在脂质和动脉粥样硬化研究所(Lipids andAtherosclerosis Research Institute)生长。
正常小鼠中的组织基因表达
为了测定效率和组织特异性，如上文所述，将1010pfu/ml的Ad5PPE1Luc或Ad5CMVLuc(作为非组织特异性对照)悬浮于100？l生理盐水中，然后注射到小鼠尾静脉内。注射后1天、5天、14天、30天和90天测定萤光素酶活性。为了定位所表达报告基因的细胞分布，将Ad5PPE-1GFP或Ad5CMVGFP(1010pfu/ml，在100μl生理盐水中)注射到3月龄正常雄性C57BL/6小鼠尾静脉内。注射后5天检测GFP表达。所有小鼠看来都健康，并且在肝或其它组织中未见毒性或炎症。
组织中的GFP活性
为了测试所递送基因的体内细胞分布，将取自注射小鼠的组织样品在新鲜制备的溶于0.1M磷酸盐缓冲液的4％低聚甲醛中于4℃固定6小时，在30％蔗糖中于4℃浸泡过夜，然后在OCT化合物(Sakura，California，USA)中冷冻。将组织块切成10？m厚的切片，且直接在荧光显微镜(FITC滤光片)下观察。
肿瘤植入：
用胰蛋白酶/EDTA收获Lewis肺癌细胞(LLC)，用PBS洗涤3次，且用0.1％锥虫蓝(Biological industries，Beit-Haemek，以色列)计数，以评价其生存力。为了测试小鼠肿瘤血管生成中的PPE-1启动子活性的活性水平，使用两种不同的肿瘤膜型。
在原发性肿瘤膜型中，将细胞(1×106细胞/ml，在100？l生理盐水中)皮下注射入小鼠背部(n＝17)。注射后21天，将Ad5PPE-1、Ad5PPE-1GFP、Ad5CMV或Ad5CMVGFP(1010pfu/ml)注射到肿瘤组织(IT)中或进行静脉内注射，且如上所述检测其活性。
在转移性肿瘤模型中，给小鼠爪垫(n＝12)注射细胞(5×105细胞/ml，在50？l生理盐水中)。当肿瘤组织的直径达到0.7mm大小时，在麻醉和无菌条件下切除爪垫(带有原发性肿瘤)。外科手术后14天，给小鼠尾静脉内注射病毒(Ad5PPE-1、Ad5PPE-1GFP、Ad5CMVLuc或Ad5CMVGFP)。
在这两种肿瘤实验模型中，注射病毒后5天处死小鼠，切下其组织，且测试萤光素酶活性或GFP活性。
伤口愈合模型
通过皮下注射戊巴比妥钠(6mg/kg)麻醉3月龄雄性C57BL/6小鼠。剃下其背上的毛，且作5cm直切口。立即用4/0无菌丝线将切口缝合。通过H&E和抗von-Willibrand抗体免疫组织化学染色，每两天检查愈合伤口中的血管生成过程。
作切口后10天，尾静脉全身注射1010pfu/ml的Ad5PPE-1Luc或Ad5CMVLuc。注射后5天，处死小鼠，且如上所述测定切口部位皮肤和作为对照的正常对侧部位中的萤光素酶活性。
组织学检查-为了评价肿瘤和转移组织中血管生成的程度，将组织切成5μm厚的切片，且用苏木精和伊红(H&E)染色。用抗CD31(大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体，Pharminogen，NJ，USA)抗体分析肿瘤模型中的新血管形成。
用于VEGF和PDGF-B转基因表达的质粒和腺病毒载体-重组复制缺陷型腺病毒血清型5如Varda-Bloom，N.等[Tissue-specific gene therapydirected to tumor angiogenesis.(2001)Gene Ther 8，819-27]所述构建。简而言之，对pACCMV.pLpA质粒进行修饰，以包含处于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子调节之下的鼠VEGF165(GenBank登记号M95200)或大鼠PDGF-B(GenBank登记号AF162784)的cDNA。用相同的cDNA序列构建pACPPE-1-3X质粒，其中CMV启动子被修饰型鼠前内皮素原-1(PPE-1-3X)启动子取代。每种质粒与pJM17质粒共转染到HEK293细胞中，以产生各种重组腺病毒。让病毒在HEK293细胞中繁殖并降至1010PFU/ml的浓度。对照载体用类似地产生。
小鼠后肢局部缺血模型和基因治疗-至少12周龄的雄性和雌性C57Bl6小鼠(Harlan Laboratories Ltd.，以色列)按照Animal Care and UseCommittee of Sheba Medical Center的指南进行维持。根据先前介绍的规程[Couffinhal，T.等，Mouse model of angiogenesis.Am J Pathol 152，1667-79.(1998)]，诱导后肢局部缺血。简而言之，用戊巴比妥钠(40mg/kg，IP)麻醉动物。剃掉肢体软毛后，对邻近隐动脉和腘动脉分叉处的右股动脉进行结扎。结扎后5天，静脉内施用109PFU的各种腺病毒载体。
超声波成像-采用Synergy超声波系统(General Electric，USA)，于7.5MHz以血管造影方式，在结扎后以7天的间隔，进行超声波成像。在成像时让动物苏醒并受约束。让动物在常规条件下适应最高达90天。
免疫组织化学-将处死的局部缺血小鼠的两个后肢骨胳肌和肝组织在OCT化合物中冷冻，并进行冷冻切片。内皮细胞用大鼠单克隆抗CD31抗体(PharMingen，San Diego，CA)进行免疫染色。平滑肌细胞用小鼠多克隆抗-α-SMactin抗体(SIGMA，St.Louis，MO)进行免疫染色。背景用苏木精染色。
原位杂交-由局部缺血动物的两个后肢制备5μm骨胳肌切片。用有义或反义DIG-标记探针对VEGF165或PDGF-B进行原位杂交，然后用抗DIG-AP缀合物(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，德国)检测洋地黄毒苷(DIG)。背景用甲基绿染色。
图像加工-运用Image-Pro Plus软件工具(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)处理超声波图像。计算出每幅图像说明最强灌注的着色像素数。
血管生成的调节剂-给转基因小鼠饲喂正常食物饮食或补加了波生坦(Actelion Ltd.，Allschwil，瑞士)，双重ET-1A/B受体拮抗剂的饮食。假定一只动物每天消耗4g食物，给每只小鼠施用100mg波生坦/kg体重，持续30天。处死动物，并检测萤光素酶活性，肺ET-1 mRNA水平和irET-1血清水平。
统计学分析
运用t-检验ANOVA或Mann-Whitney秩检验，对各组间统计学显著性差异进行分析。数据以平均值+SE表示。
实验结果
实施例1
内皮细胞(BAEC)和293细胞中促凋亡基因活性的体外测定
在癌症治疗中，抗血管生成治疗靶向滋养生长中的肿瘤的发展中脉管系统[Folkman J.N Engl J Med(1995)333(26)：1757-63]。随着凋亡或程序性细胞死亡研究的进展，已鉴定出了众多编码选择性和有效的细胞死亡调节剂的基因[Strasser等，Annu Rev Biochem(2000)69：217-45]。
本研究筛选了几种促凋亡基因，以鉴别最适于抗血管生成治疗的试剂。经PCR扩增几种促凋亡基因，包括MORT1(FADD-Fas相关死亡结构域蛋白，GenBank登记号NM_003824)、RIP(受体-相互作用-蛋白，GenBank登记号U25995)、CASH(c-FLIP，GenBank登记号AF010127)、MACH(胱天蛋白酶8GenBank登记号X98172)、CPP32(胱天蛋白酶3，GenBank登记号U13737)、胱天蛋白酶9(U60521)和先前描述的两个“死亡受体”的融合体Fas-嵌合体(Fas-c)，其是由TNFR1的胞外区和Fas的跨膜区和胞内区域构建的[Boldin MP等，J Biol Chem(1995)270(14)：7795-8，参见图1a]，并利用众所周知的现有克隆技术克隆入pcDNA3(Invitrogen，Inc.)哺乳动物表达载体中。
这些促凋亡基因构建体随pGFP一起在BAEC(牛主动脉内皮细胞)和用作非内皮对照细胞的293细胞中共表达。转染后24小时，利用荧光显微镜术分析细胞。用荧光显微镜术根据典型形态学(即小而圆的形状)鉴别凋亡细胞(图2a-b)。用电子显微镜术实施凋亡表型的进一步评价(图3a-f)。凋亡作用的定量表明，MORT1、TNFR1和Fas-嵌合体在BAEC和293细胞中诱导最高的凋亡活性(图4a-b)。在这方面，胱天蛋白酶3和9效力较低，这可能是因为它们为无活性酶原形式。根据这些结果，选择Fas-嵌合体(Fas-c)基因来产生用于抗血管生成治疗的腺病毒载体。
实施例2制备编码处于修饰型PPE-1启动子(PPE-1(3x))控制下的Fas-嵌合体的重组腺病毒
将编码全长Fas-嵌合体的cDNA亚克隆到包含修饰型前内皮素原1启动子的质粒pPACPPE1-3x中(参见图1b)。通过将该质粒与pJM17质粒共转染到人胚肾293细胞中制备重组腺病毒。通过PCR扩增验证成功的病毒克隆(图5a)。
为了测定Fas-c在靶细胞中的表达，用指示滴度的Ad-PPE-1(3x)-Fas-c转导内皮BAEC细胞。转导后72小时裂解细胞，并用非还原性SDS-PAGE凝胶分离细胞蛋白。用抗TNFR1抗体(Sc-7895，Santa-Cruz Biotech)进行蛋白质印迹分析。如图5b所试实的，于45kD处迁移的主条带非常明显，且其表达是剂量依赖性的，提示所述嵌合蛋白正确折叠和表达。相反，在非转导内皮细胞或用对照空病毒载体转导的细胞中没有明显的对应条带。因此，这些结果证实，腺病毒介导的Fas-c基因转移导致靶细胞中的转基因表达。
实施例3
Ad-PPE-1(3x)-Fas-c表达诱导内皮细胞凋亡
测定Ad-PPE-1(3x)-Fas嵌合体诱导内皮细胞凋亡的能力。如图6a-b所示，前内皮素原指导的、腺病毒介导的内皮细胞转导导致明显且大量细胞死亡；用Ad-PPE-1(3x)-Fas-c(103MOI)感染的HUVEC和BAEC有经受凋亡的粘附细胞的形态特征，包括膜起泡、变圆和皱缩以及脱离培养皿。相反，用对照病毒以相同MOI感染的细胞维持正常外观和生长速率。用100MOI转导的细胞仅表现出最低程度的细胞死亡(数据未显示)。
通过在表达受PPE-1启动子控制的报告基因GFP的细胞中表达此病毒，对Ad-PPE-1(3x)-Fas-c的细胞毒性特性实施进一步评价。如从图6c-d中明显可见，大部分转导细胞在转导后72小时获得典型凋亡外观，而用对照病毒和Ad-PPE-GFP共转导的细胞看起来正常。
利用结晶紫染色来定量Fas-c的细胞毒性作用。如图7所示，用Ad-PPE-Fas-c感染BAEC和HUVEC分别导致57％和65％的死亡率，而对照病毒不影响细胞生存力。
通过用此载体感染NSF(正常皮肤成纤维细胞)证实促凋亡载体Ad-PPE-Fas-的内皮细胞特异性。这些表达低水平PPE-1的细胞[Varda-Bloom，N.等，Gene Ther 8，819-27.(2001)]不受Ad-PPE-Fas-c感染影响。相反，重组载体Ad-CMV-Fas-c在这些细胞中诱导凋亡。
实施例4
共同施用Ad-PPE-1(3x)-Fas-c受体和TNFα配体以选择性方式增大促凋亡作用
研究了TNFα增大表达Fas-c的细胞中的凋亡作用的能力。将人TNFα添加到用Ad-PPE-Fas-c(MOI 100)病毒感染后48小时的内皮细胞培养物中。24小时后测定细胞生存力。如图8所示，TNFα(10ng/ml)诱导Ad-PPE-1(3x)-Fas-c感染的细胞生存力下降73％，而单独的TNFα或对照病毒(Ad-Luc)感染的细胞中没有实现显著死亡率。
为证实TNFα的作用，处理细胞特异性。用Ad-PPE-Fas-c或对照病毒感染NSF(正常皮肤成纤维细胞)、DA3(小鼠乳腺癌)、D122(Lewis肺癌)和B16黑素瘤细胞。48小时后，向培养物中补加TNFα，且用结晶紫染色后评定细胞形态学。如图9a-e所示，用Ad-PPE-Fas-c感染的非内皮细胞表现出正常外观，且不受TNF影响。另一方面，腺病毒介导的Fas-c感染BAEC在添加TNF时导致细胞生存力明显下降。图10a显示了由CMV启动子驱动的Fas-c的非选择性凋亡活性，说明Ad-CMV-Fas-c对内皮细胞的TNF依赖性凋亡作用。与TNF温育后测定用指示MOI的Ad-CMV-Fas-嵌合体感染的BAEC细胞的生存力。
值得注意的是，非内皮特异性载体Ad-CMV-Fas-c引起内皮细胞和非内皮细胞两者的TNFα依赖性凋亡(图10b-d)。
实施例5
Ad-PPE1(3x)-Fas-c诱导小鼠中的B16黑素瘤体内生长阻滞
用B16黑素瘤小鼠模型来检验由PPE1-3x启动子表达的Fas-c的抗肿瘤作用。将B16黑素瘤细胞(8×105)皮下注射到40只C57bl/6小鼠胁腹区。当肿瘤可触知(约5×5毫米)时，将小鼠随机分成如下4组：(i)对照—盐水注射；(ii)对照病毒(包含受PPE启动子控制的萤光素酶的腺病毒)；(iii)包含受前内皮素原(PPE)启动子控制的Fas-TNF受体嵌合基因的Ad-PPE1-3x-Fas-c-病毒；和(iv)包含受非内皮特异性CMV启动子控制的Fas-TNF受体嵌合基因的Ad-CMV-Fas-c-病毒。
用手持测径器测量肿瘤大小(长和宽)。如图11a所示，与对照小鼠相比，用Ad-PPE1-3x-Fas-c或Ad-CMV-Fas-c处理的小鼠肿瘤尺寸较小。在治疗期结束时，Ad-PPE1-3x-Fas-c处理小鼠中的肿瘤重量也较低(图11b)。用Ad-PPE1-3x-Fas-c注射的小鼠显示其肿瘤明显坏死(图11c)。
转移疾病的抑制：Lewis肺癌模型：在转移性Lewis肺癌模型中进一步检验PPE-1(3x)-Fas-c嵌合体的表达特异性和抑制肿瘤生长的功效。如下文详述在雄性C57BL/6J中诱发肺LLC转移，且以9天的间隔给小鼠注射两次病毒载体AdPPe-1(3x)LUC、AdPPE-1(3x)-Fas-c和AdCMV-Fas-c(Greenberger等，J Clin Invest 2004；113：1017-1024)。
在病毒施用后6天由小鼠收获器官，且通过PCR测定Fas-c表达。PPE-1(3x)启动子对Fas-c的转录控制导致表达受限于具有肿瘤的肺(结果未显示)，与CMV-Fas-c-处理小鼠中的Fas-c表达的广泛分布完全相反(未显示数据，参见Greenberger等，J Clin Invest 2004；113：1017-1024)。
此外，处理组和对照组的肺的总体病理学检查揭示，向具有转移的小鼠施用AdPPE-1(3x)-Fas-c抑制肿瘤生长，且降低肺表面上生长肿瘤的大小，而对照动物肺几乎被肿瘤组织完全取代(未显示数据，参见Greenberger等，J Clin Invest 2004；113：1017-1024)。
另外，处理小鼠和对照小鼠肺切片的组织病理学以及TUNEL和内皮特异性CD31染色揭示，向具有转移的小鼠施用AdPPE-1(3x)-Fas-c在肿瘤组织中引起与对肿瘤血管内皮的广泛损伤相关的大范围凋亡和坏死。相反，对照处理小鼠的血管未受影响(未显示数据，参见Greenberger等，J Clin Invest 2004；113：1017-1024)。
实施例6
3X-PPE-1质粒体外活性的分析
为了分析PPE-1-3X的活性，对PPE-1-3X启动子质粒和未经修饰的PPE-1启动子质粒的报告基因表达进行比较。将含有PPE-1-3X片段或未经修饰的PPE-1片段以及报告基因萤光素酶的报告基因质粒转染到内皮细胞系和非内皮细胞系以及表达PPE-1启动子的支气管上皮细胞系(B2B)中(参见上文的材料和方法)。选择B2B细胞系是为了提供相对于PPE-1启动子而言所述3X元件降低非内皮细胞系中表达的能力的指示。采用脂质转染胺(Promega Corp.，Madison，WI)完成转染。每种情况下，按照公认的分子生物学实践，用β-gal-neo质粒作为转染效率的指示剂。
转染后48小时，用裂解缓冲液(Promega Corp.，Madison，WI)收获细胞，且用发光计(TD-20e—Turner Designs，Sunnyvale，California)分析萤光素酶活性。在平行实验中，分析？gal活性，以将不同的转化效率标准化。结果总结于图12和表2中。处于PPE-3X控制之下的萤光素酶活性为处于未经修饰的PPE-1控制之下的萤光素酶活性的15-20倍。在非内皮细胞系中，用PPE-1和PPE-1-3X两者检测最低表达。这证明PPE-3X是用于在体内将基因特异性地递送到内皮细胞中的有前景候选物。
表2—用PPE-1和PPE-1-3X萤光素酶构建体转染的细胞中的萤光素酶活性
Figure A200780014285D00881
实施例7
Ad5PPE-1/萤光素酶的体外活性和特异性
也将PPE-1/萤光素酶、PPE-1-3X/萤光素酶、PPE-1/GFP和PPE-1-3X/GFP连接到Ad5质粒中，以产生Ad5PPE-1/Luc和Ad5PPE-1-3X/luc、Ad5PPE-1/GFP和Ad5PPE-1-3X/GFP(Varda-Bloom等，(2001)Gene therapy 8：819-827)。如下文详述，分别测定这些构建体。
为了测试Ad5PPE-1/luc的活性，对B2B(人支气管上皮)、BAEC(牛主动脉内皮细胞)和HUVEC(人脐静脉内皮细胞)进行转染。这三个细胞系都表达内皮素基因，且选择这些细胞系以指示被测构建体在内皮细胞中的表达水平。用不表达内皮素的RIN(大鼠胰岛素瘤)细胞系作为阴性对照，且用相同构建体进行转染。用Ad5CMVLuc(处于CMV启动子控制之下的萤光素酶)作为所有细胞系中的非内皮特异性对照。
图13清楚说明，用PPE-1启动子比用CMV启动子在内皮BAEC和HUVEC细胞系中达到的萤光素酶表达要高。在非内皮来源的RIN细胞中，CMV启动子比PPE-1启动子产生的萤光素酶活性要高。这些结果证实了未经修饰的PPE-1启动子的内皮特异性。
实施例8
Ad5PPE-3XLuc和Ad5PPE-3XGFP的活性和特异性
用Ad5PPE-3X/萤光素酶和Ad5PPE-3X/GFP构建体转染上文实施例7中所述的细胞系，以确定3X元件对特异性和表达水平的影响。如同在实施例7中一样，用Ad5CMVLuc作为非内皮特异性对照。与CMV启动子相比，在BAEC细胞系和HUVEC细胞系中检测出处于PPE-3X启动子控制之下的较高萤光素酶表达。
图14A是显微照片，说明在BAEC细胞系中处于Ad5PPE-1-3X控制之下的GFP表达。图14B是显微照片，说明BAEC系中Ad5CMV的GFP表达。如这些图所清楚显示的，PPE-1-3X启动子在内皮细胞中更有活性。这些结果清楚表明，所述3X元件不降低PPE-1启动子的内皮特异性。下文实施例11中给出了PPE-1启动子和PPE-1-3X启动子在细胞培养物中的相对活性。
实施例9
p55基因促凋亡活性的体外测定
将P55(TNFR1，GenBank登记号M75866)亚克隆到PACPPE3X(含有PPE-1-3X启动子)和PACCMV中后，如上文所述将这些质粒和GFP(pEGFP-C1载体；CLONTECH，Palo Alto，CA)进行共转染。简而言之，通过T4DNA连接酶将所述基因亚克隆到PPE-1启动子(而不是萤光素酶基因)下游的NotI限制位点中，然后将其转化到DH5α感受态细胞中。转染后24小时，目测可辨别小而圆的凋亡细胞和正常细胞。用促凋亡质粒转染的细胞的电子显微镜术显示出典型凋亡外观，从而证实所述目测评价。
在PPE-1-3X启动子控制之下，p55仅在内皮细胞中诱导凋亡(图15)，而CMV启动子没有显示任何细胞特异性活性。处于PPE-1-3X控制之下的萤光素酶在任何被测细胞系中都没有诱导调亡。这些结果表明，通过应用PPE-1-3X启动子，在内皮细胞中特异性地诱导凋亡是可行的。
实施例10
低氧反应元件(HRE)可增强低氧敏感性内皮细胞中的靶基因表达
低氧是血管紧张性和结构的重要调节剂。还已表明，它是血管生成的有效刺激物(在缺血性心脏病和癌症中(Semenza，G.L.等，(2000)AdvExp Med Biol.；475：123-30；Williams，K.J.(2001)Breast Cancer Res.2001：3；328-31和Shimo，T.(2001)Cancer Lett.174；57-64))。此外，据报道低氧调节许多基因包括促红细胞生成素、VEGF、糖酵解酶和ET-1的表达。这些基因受共同的氧传感途径(oxygen-sensing pathway)，称为低氧诱导型因子-1(HIF-1)的诱导型转录复合体控制。所述HIF-1复合体通过结合靶基因的顺式作用低氧反应元件(HRE)来介导对低氧的转录反应。HRE是位于对低氧应答的少数基因启动子中的保守序列，所述基因包括：VEGF、氧化氮合酶-2、促红细胞生成素和包括内皮素-1-ET-1在内的其它基因。ET-1启动子在转录起始位点上游-118bp位含有反向低氧反应元件，该元件含有7个碱基对，且位于GATA-2和-50碱基对的AP1位点5′GCACGTT 3′之间。(SEQ ID NO：5)。
前内皮素原-1(PPE-1)启动子含有具有增加其在肿瘤或局部缺血组织的低氧微环境中表达之潜力的低氧反应元件(HRE)，从而使其具有“肿瘤组织特异性”和/或“局部缺血组织特异性”。为了评价该HRE的实际功能，结合萤光素酶或GFP报告基因以及用腺病毒载体递送对PPE-1启动子和PPE-1-3X启动子进行测定。
比较在BAEC细胞中在常氧和低氧条件(0.5％ O2达16小时)下处于PPE-1启动子或PPE-1-3X启动子控制之下的萤光素酶活性。处于PPE-1启动子控制之下的萤光素酶活性当暴露于低氧时提高至5倍(图16和图17)。此外，处于PPE-1-3X启动子控制之下的萤光素酶活性在低氧条件下提高至2.5倍。概括地讲，将3X元件导入PPE1启动子中仍能够增加下游基因对低氧应答的表达水平，即使在用PPE-1-3X基因时常氧的表达水平比用未经修饰的PPE-1启动子所观察的表达水平高。
实施例11
对内皮细胞系中PPE-1-3X和PPE-1启动子活性的进一步评估
图18总结了得自用pPPE-1/萤光素酶和pPPE-1-3X/萤光素酶的B2B、HUVEC和BAEC转染实验的结果。分别在B2B、HUVEC和BAEC中观察到处于PPE-1-3X启动子控制之下的萤光素酶表达高于处于PPE-1启动子控制之下的萤光素酶表达(是后者的30倍、8.5倍和1.5倍)。这些结果证实了上文给出的结果，并可用于确立PPE-1-3X非常适合将高水平表达特异性地导向内皮细胞。在将来的体内递送背景中，用PPE-1-3X构建体实现的较高表达水平转化为施用更少量的DNA。这进而会用来甚至进一步增加特异性。
实施例12
Ad5PPE-1Luc在体内的效率、特异性和稳定性
为了证实在实施例7-10中所观察的表达的内皮特异性不是细胞培养物的人为产物，如上文在“正常小鼠中的组织基因表达”中所述，将Ad5PPE-1/萤光素酶构建体注射到C57BL/6小鼠中。如同在所述体外研究中一样，用Ad5CMV/萤光素酶作为阴性对照。
注射腺病毒载体后，测定血管形成组织和非血管形成组织中的萤光素酶的特异性活性和稳定性。结果总结于图19(相对于肝中表达的萤光素酶表达)和表3(萤光素酶表达以身体总表达的百分比表示)。正如所料，在Ad5CMV/萤光素酶治疗的小鼠中，在肝中发现大部分萤光素酶活性(>总身体表达的80％)。由PPE-1启动子控制的萤光素酶活性在肝中较低(总身体表达的37-54％)。与Ad5CMV/萤光素酶治疗的小鼠相比(最高达总身体表达的1.8％；表2)，PPE-1驱动的表达在主动脉中高得多(在注射后5天和14天分别为总身体表达的23-33％)。这些结果证实了在细胞培养物中观察到的内皮特异性。应记得的是，肝是高度血管形成器官。因此，如下文详述对器官内的细胞表达进行检查。
表3—注射基于PPE-1和CMV的构建体后5天和14天器官中的萤光素酶表达
Figure A200780014285D00921
图41A和图41B图示了110只注射小鼠的主动脉(A)和肝(B)中的绝对萤光素酶活性(光单位/μg蛋白)。注射后1天(n＝13)、5天(n＝34)、14天(n＝32)、30天(n＝20)和90天(n＝11)测量萤光素酶活性。主动脉中的结果代表主要在内皮细胞中的启动子(PPE-1或CMV)活性，而肝中的结果代表其主要在肝细胞中的活性。
实施例13
BALB/C小鼠中Ad5PPE-1的体内效率、特异性和稳定性的测定
在12周龄BALB/C小鼠(每组n＝10)中重复实施例12的实验，以证明所观察的结果不是特定动物品系的人为产物。
因为用腺病毒载体得到的绝对结果在BALB/C小鼠中比在C57BL/6小鼠中低，所以萤光素酶表达以所有组织中总萤光素酶活性的百分比表示。
在注射Ad5PPE-1的小鼠脾(90.9％)和注射Ad5CMV的小鼠肝(86.2％)中观察到注射后5天的最高相对萤光素酶表达。还观察到注射后14天注射Ad5PPE-1的小鼠主动脉中的相对萤光素酶活性(32.9％)与注射后5天的其活性(1.75％)相比显著增加(图42A和图42B；Ad5PPE-1Luc—空心条：Ad5CMVLuc—黑色条)。
这些结果证实，无论用何种小鼠品系，PPE-1启动子的组织特异性都足以强烈地有效消除肝细胞表达，尽管肝细胞优先摄入注射的DNA。
实施例14
Ad5PPE-1所递送基因的体内细胞定位
为了确定PPE-1表达的基因在体内的细胞表达部位，使用通过腺病毒载体Ad5PPE-1-GFP递送的绿色荧光蛋白(GFP)。用Ad5CMVGFP(Quantum，加拿大)作为非内皮细胞特异性阴性对照。静脉内注射后5天处死小鼠，并通过荧光显微镜术分析其组织。
在注射Ad5CMVGFP载体的小鼠中，在肝细胞中检测到大部分表达，而在肝内皮细胞中没有检测到表达(图20A)。与之形成鲜明对比的是，注射Ad5PPE-1-GFP的小鼠(图20B)显示在肝细胞中没有表达，但在肝血管内皮细胞中有显著表达。在其它组织中也获得相似的结果，在那里于内皮中检测到几乎所有PPE-1驱动的表达，而CMV驱动的表达是非内皮性的。这些结果表明，内皮特异性甚至在含有内皮细胞和非内皮细胞的器官中也可保持。这一发现对预防生长中肿瘤的血管生成具有重大意义。
实施例15
Ad5PPE-1-3XLuc和Ad5PPE-1-3X GFP的体外效率和内皮特异性的测定
为了测定Ad5PPE-1和Ad5PPE-1-3X在细胞中驱动报告基因萤光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)表达的相对功效，用上文所述细胞系体外测试内皮细胞中的特异性活性。用Ad5CMVLuc和Ad5CMVGFP作为非组织特异性对照。Ad5PPE-1Luc和Ad5PPE-1GFP用来确定因加入3X序列所引起的表达水平的相对变化。
在图21和图22中总结的结果表明，在EC系(牛主动脉内皮细胞-BAEC)中处于PPE-1-3X启动子控制之下的萤光素酶活性是在非内皮细胞—大鼠胰岛素瘤-RIN、HeLA、HePG2和正常皮肤成纤维细胞(NSF)中的活性的5-10倍(图21和图22)。
图21显示在Ad5PPE-1Luc、Ad5PPE-1-3XLuc和Ad5CMVLuc转导的B2B细胞、BAEC细胞和RIN细胞中以光单位/μg蛋白表示的萤光素酶活性。在Ad5CMVLuc转导的RIN细胞中观察到最高的萤光素酶表达，然而，该构建体在BAEC细胞和B2B细胞中表达差。在Ad5PPE-1-3Xluc转导的BAEC细胞中观察到次最高水平的萤光素酶表达。Ad5PPE-1Luc在BAEC细胞中以较低水平表达。在B2B细胞系中，Ad5PPE-1Luc和Ad5PPE-1-3Xluc以几乎相同的水平表达。
总的来讲，在相同感染条件下(moi＝10)，在内皮细胞系中处于PPE-1-3X启动子控制之下的萤光素酶活性是处于PPE-1启动子控制之下的萤光素酶活性的23倍，且是处于CMV启动子控制之下的萤光素酶活性的23-47倍，而处于CMV启动子控制之下的非内皮RIN细胞中的萤光素酶表达高达3000倍(图21)。
为了确立PPE-1和PPE-1-3X在其它非内皮细胞谱系中是无活性的，转导了HeLA、HepG2、NSF细胞系。用BAEC作为内皮对照。图22显示了在用Ad5PPE-1Luc、Ad5PPE-1-3XLuc和Ad5CMVLuc转导的HeLA细胞、HepG2细胞、NSF细胞和BAEC细胞中以光单位/μg蛋白表示的萤光素酶活性。用Ad5CMVLuc转导在HeLA细胞、HepG2细胞和NSF细胞中引起高水平的萤光素酶表达。这些细胞系不能表达处于PPE-1控制之下的萤光素酶，在PPE-1-3X启动子控制之下以低水平表达萤光素酶。正如所料，用Ad5PPE-1Luc或Ad5PPE-1-3XLuc转导的BAEC细胞表现出高萤光素酶表达。
综合考虑，这些结果表明，将所述3X序列导入PPE-1启动子中引起内皮细胞系中较高水平的表达，同时防止非内皮细胞中不想要的表达。
加入3X序列至PPE-1启动子中还增加EC系(牛主动脉内皮细胞-BAEC)中绿色荧光蛋白表达的水平，如描绘了以moi＝1转导的BAEC中的GFP表达的图23A-C所示。在该实验中，用CMV启动子没有观察到GFP的表达。
在图23中，图A表示Ad5PPE-1-3XGFP转导的细胞，图B表示Ad5PPE-1GFP转导的细胞，而图C表示Ad5CMVGFP。再次，将3X序列导入PPE-1启动子中显著增加报告基因的表达。这一结果表明，所述3X序列作为内皮特异性增强子起作用的能力并不随待转录的下游基因而变。
此外，相比于在CMV启动子下的高表达，Ad5PPE-1-3X-GFP和Ad5PPE-1GFP转导导致在非内皮细胞SMC、HeLa、HePG2和正常皮肤成纤维细胞(NSF)中无GFP表达，如图24-27中总结的。
图24显示了以moi＝1的Ad5PPE-1-3XGFP(图A)或Ad5CMVGFP(图B)转导的SMC中的GFP表达。尽管Ad5CMVGFP转导导致高水平GFP表达，但用Ad5PPE-1-3XGFP转导不引起GFP表达。
图25显示了在HeLa细胞中进行的相似实验的结果。如同在前面的图中一样，图A表示用Ad5PPE-1-3XGFP转导的细胞，而图B表示用Ad5CMVGFP转导的细胞。再次，尽管Ad5CMVGFP转导导致高水平GFP表达，但用Ad5PPE-1-3XGFP转导不引起GFP表达。
图26显示在HepG2细胞中进行的相似实验的结果。如同在前面的图中一样，图A表示用Ad5PPE-1(3X)GFP转导的细胞，而图B表示用Ad5CMVGFP转导的细胞。再次，尽管Ad5CMVGFP转导导致高水平GFP表达，但用Ad5PPE-1-3XGFP转导不引起GFP表达。
图27显示了在NSF细胞中进行的相似实验的结果。如同在前面的图中一样，图A表示用Ad5PPE-1-3XGFP转导的细胞，而图B表示用Ad5CMVGFP转导的细胞。再次，尽管Ad5CMVGFP转导导致高水平GFP表达，但用Ad5PPE-1-3XGFP转导引起极低的GFP表达。
这些结果综合起来表明，高水平的内皮特异性和高水平的内皮表达通过使用含SEQ ID NO：7的3X序列的修饰型PPE-1启动子而获得。
实施例16
Ad5PPE-1-3X递送的报告基因的体内细胞定位
为了测定处于PPE-1-3X启动子控制之下表达的报告基因的体内细胞定位模式，如上文所述将Ad5PPE-1-3XGFP和Ad5PPE-1GFP注射到小鼠内。静脉内注射后5天，处死小鼠并通过荧光显微镜术分析其组织。
注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠与注射Ad5PPE-1GFP的小鼠相比，在肝血管、肾血管和脾血管的内皮细胞中观察到显著更高的GFP活性。图28A-B显示了代表性结果。
图28A显示了注射Ad5PPE-1GFP的小鼠血管内衬内皮细胞中的低水平GFP表达。图28B显示了由于加入3X序列至构建体中产生的水平高得多的GFP表达。
尽管在血管内衬中高表达，但是在肝细胞、肾小球、上皮细胞和脾细胞中没有检测到表达(图18和图19)。
图29显示了得自注射小鼠肾组织的代表性结果。注射Ad5CMVGFP的小鼠(图29A)、注射Ad5PPE-1GFP的小鼠(图29b)和注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠(图29C)在肾细胞中都表现出低GFP活性。在图29B中，在血管壁中可见略高的GFP表达(箭标所指)。
图30显示了注射小鼠脾组织的代表性结果。注射Ad5CMVGFP的小鼠(图30A)、注射Ad5PPE-1GFP的小鼠(图30B)和注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠(图30C)在脾细胞中都表现出低水平的GFP活性。在注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠血管可见较高的GFP活性(箭标所指)。
这些结果证实，PPE-1启动子和PPE-1-3X启动子在体内均为内皮细胞特异性的。它们进一步提示，这两种启动子的活性限于非增殖性内皮组织(即健康器官的血管。因此，在肿瘤血管生成模型中进行测定。
实施例17
肿瘤新血管形成中Ad5PPE-1构建体的体内测定
为了确定AD5PPE将报告基因的表达特异性地导向肿瘤中血管生成性血管的能力，使用鼠LLC模型(上文在材料和方法中描述的)。在一个实验中，全身注射Ad5PPE-1Luc或Ad5CMVLuc(各1010pfu/ml)后5天测试肿瘤新血管形成中的萤光素酶表达。
在该实验中，给原发性肿瘤模型和转移肿瘤模型全身注射Ad5CMVLuc导致在原发性肿瘤或转移肺中均产生最低表达。该表达水平与在首次用于实验的正常肺中由CMV指导的萤光素酶的最低表达相似(图35；黑色条；n＝12)。与之鲜明对比的是，在PPE-1启动子控制下(图35；空心条；n＝9)，高血管生成性肺转移与萤光素酶活性相关，所述萤光素酶活性为在血管形成程度低的原发性肿瘤和首次用于实验的肺中的萤光素酶活性的约200倍。
在诸如肝、肾、心脏和胰的非转移瘤组织中的萤光素酶表达最低。主动脉中的表达水平大约是转移肺中所述水平的30％。
在LLC模型的另一个实验中，用Ad5PPE-1GFP构建体和Ad5CMVGFP构建体将报告基因表达定位于原发性肿瘤和转移肺中。
注射Ad5PPE-1GFP的小鼠在原发性肿瘤血管中显示高水平的GFP特异性表达(图47C)，尽管在肿瘤细胞自身中没有检测到表达。此观察结果与实施例20中提供的LLC细胞培养物模型的结果相一致。在肺转移中，在转移病灶的大动脉和小血管生成性血管两者中均检测到高水平的GFP表达(图47A)。在正常肺组织中没有检测到表达。内皮细胞定位为GFP表达(图47A)和CD31抗体免疫染色(图47B)的共定位所证实。与之形成鲜明对比的是，在注射Ad5CMVGFP的小鼠中，在原发性肿瘤和肺转移两者中均没有检测到GFP活性。
图47C说明瘤内注射Ad5PPE-1GFP后在原发性肿瘤血管中的GFP表达。图47D是与说明肿瘤及其血管的图C一样归档的相差图像。
这些结果表明，尽管PPE-1不驱动肿瘤细胞自身中的高水平表达，但所述启动子的确驱动肿瘤内血管内皮中、尤其是在快速增殖的血管生成性血管中的高水平表达。
给原发性皮下肿瘤模型瘤内注射Ad5CMV，导致在肿瘤组织中的高萤光素酶表达，及在肝中导致中等水平表达(肿瘤表达量的10％；图53)。在转移肺中没有检测到表达。另一方面，当瘤内注射时，处于PPE-1启动子控制之下的萤光素酶表达在原发性肿瘤和转移肺中产生相似的萤光素酶表达水平，而在肝中没有检测到表达。
实施例18
癌细胞培养物系统中的Ad5PPE-1构建体的测定
为了测定Ad5PPE-1和Ad5CMV在癌性细胞中驱动萤光素酶表达的效率，使用D122-96Lewis肺癌细胞系。
以不同的感染复数(moi)进行体外转导。结果表明，两种腺病毒载体均能够将萤光素酶基因转导给这些细胞(表4)。然而，由PPE-1启动子指导的萤光素酶活性在LLC细胞中比在内皮细胞中检测到的所述活性低得多，分别为50光单位/？g蛋白对1000-2500光单位/？g蛋白。
表4—用Ad5PPE-1Luc和Ad5CMVLuc体外转导Lewis肺癌细胞系(D122-96)
 
MOI＝1 MOI＝5 MOI＝10
AdPPE-1 8.1±0.06 33.95±7.0 50.7±5.0
Ad5CMV 9.3±1.1 47.3±4.0 88.13±10.1
实施例19
3X序列在肿瘤血管生成性血管中体内作用的测定
为了确定3X序列对血管生成性血管中PPE-1启动子的作用，使用Lewis肺癌(LLC)转移模型(上文材料和方法中所描述的)。如材料和方法所述的，静脉内注射1010感染单位的Ad5PPE-1GFP、Ad5PPE-1-3XGFP或Ad5CMVGFP后5天，处死小鼠并分析其组织。
图31A-D总结了注射盐水的对照小鼠(图31A)、注射Ad5CMVGFP的小鼠(图31B)、注射Ad5PPE-1GFP的小鼠(图31C)和注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠(图31D)的转移肺中的GFP表达。抗CD31免疫染色(图31C′-20D′)证实每种转移组织中GFP表达的位置。结果表明，尽管在对照—注射盐水的小鼠中没有检测到GFP表达(图31A)，在注射CMV的小鼠上皮支气管周围有微弱表达，但在这些小鼠转移肺血管生成性血管中没有表达(图31B)。在注射Ad5PPE-1GFP的小鼠转移肺中观察到低GFP表达(图31C和31C′)，而在注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠新血管中观察到高且特异性的表达(图31D和31D′)。
这些结果解释了实施例15的体内结果和实施例7、8和11的体外结果之间明显不一致之处。PPE-1启动子和PPE-1-3X启动子两者都是内皮特异性的。然而，所述3X序列大大增加了快速增殖的内皮组织(诸如生长肿瘤中的新形成血管)中的表达水平。
实施例20
3X元件对肿瘤血管生成性血管中PPE-1启动子的作用
为了研究本发明的3X元件对肿瘤血管生成性血管中PPE-1启动子功效和特异性活性的作用，使用LLC转移模型。如上文所述，静脉内注射1010pfu/ml的Ad5PPE-1Luc、Ad5PPE-1-3XLuc、Ad5CMVLuc、Ad5PPE-1GFP、Ad5PPE-1-3X-GFP或Ad5CMVGFP后5天，处死小鼠并分析其组织的萤光素酶表达或GFP表达。
图48是直方图，比较全身注射Ad5PPE-1-3Xluc、Ad5PPE-1Luc或Ad5CMVLuc后在正常肺和转移肺中的萤光素酶表达。各实验组为Ad5CMVLuc(n＝7；黑色条)、Ad5PPE-1Luc(n＝6；灰色条)和Ad5PPE-1-3XLuc(n＝13；褐色条)。活性以光单位/μg蛋白表示。
处于PPE-1-3X启动子控制之下的萤光素酶表达在转移肺中是其在正常肺中的活性的35倍，且是由无所述3X元件的PPE-1启动子驱动的表达的3.5倍(p<0.001)。在注射Ad5PPE-1-3XLuc的小鼠的其它组织中检测到非常低的萤光素酶活性。计算每只经注射的动物肺中萤光素酶表达占肝中表达的百分比揭示出，与正常肺中的所述活性相比，转移肺中的所述活性增加至10倍(图49)。
为了将报告基因表达定位至特定细胞类型，使用GFP构建体。图50A-B显示了注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠转移肺中的GFP表达(图50A)。通过CD31抗体免疫染色(图50B)证实GFP表达定位于新血管中。在对照—注射盐水的小鼠中没有检测到GFP表达。注射CMV的小鼠上皮支气管周围有低水平表达，但在转移肺的血管生成性血管中没有表达。概括地讲，这些结果表明，表达水平大大增加是由于将3X元件导入Ad5PPE-1构建体中所致，并且这种增加的表达对肿瘤血管生成性血管是特异性的。可能是，所观察的作用可能与上文所述的低氧应答结合，以进一步增强目标序列的表达水平。
实施例21
PPE-1低氧应答的进一步表征
为了进一步表征低氧对鼠PPE-1启动子活性的作用，用DNA质粒(pEL8；图37A)转染牛主动脉内皮细胞(BAEC)。pEL8质粒含有鼠PPE-1启动子(1.4kb)(红色)、萤光素酶基因(1842bp)、SV40聚腺苷酸化(poly A)位点和内皮素-1基因的第一内含子，它们合称为PPE-1启动子盒，如材料和方法中所述，用BamHI限制酶对其进行消化和提取。转染后，让细胞经历低氧条件。
经历18小时低氧(0.5％ O2)的转染的BAEC中的萤光素酶表达高达常氧环境下生长的细胞中的萤光素酶表达的8倍(图32)。图32显示，用含有鼠PPE-1启动子的质粒转染的BAEC中的萤光素酶活性(光单位/μg蛋白)当转染的细胞在低氧环境下温育时明显更高。同样的转染效率通过与β-半乳糖苷酶报告载体共转染和LacZ活性测定得以证实。
为了确定由腺病毒载体递送的鼠PPE-1启动子是否也受到低氧的上调，用Ad5PPE-1Luc转导BAEC。在该实验中用Ad5CMVLuc作为非特异性对照。结果总结于图33中。用Ad5PPE-1Luc转导的BAEC中的低氧萤光素酶活性。与之明显相反，在Ad5CMV转导的细胞中没有检测到常氧和低氧之间的显著性差异(图33)。
为了了解PPE-1启动子活性的增强是否是内皮细胞特异性的，用Ad5PPE-1(moi＝10)转导不同的细胞系(BAEC、B2B、CHO、RIN和心肌细胞)，且让其经历低氧(0.5％ O2)或常氧环境。结果总结于图34中。萤光素酶表达在低氧环境下培养的B2B细胞中略微增加，而在低氧环境中培养的BAEC细胞中显著增加。与常氧相比，低氧环境降低其它细胞系中的萤光素酶表达。这些结果证实，PPE-1启动子的低氧诱导主要在内皮细胞谱系中发生。
实施例22
3X序列对PPE-1低氧应答的作用
为了确定3X序列对PPE-1低氧应答的作用，用Ad5PPE-1Luc和Ad5PPE-1(3X)Luc转导BAEC。转导后，如上文详述，将BAEC细胞或者在低氧环境中或者在常氧环境中温育。结果总结于图35中。使用Ad5PPE-1Luc构建体的萤光素酶表达在对低氧应答时显著增加(7倍)(低氧条件下为2578，而常氧条件下为322.1)。相比之下，Ad5PPE-1(3X)Luc构建体在对低氧应答时仅表现出增加至1.5倍(从常氧条件下的2874.5增加至低氧条件下的4315)。这些结果表明，当在PPE-1启动子中加入3X序列时所观察的高常氧表达水平在一定程度上起掩蔽低氧应答的作用。
实施例23
在转基因小鼠模型中PPE-1对低氧应答的测定
为了检查经历区域低氧/局部缺血的组织中的鼠PPE-1启动子活性，使用如上文在材料和方法中描述的mPPE-1-Luc转基因小鼠。如先前(Couffinhal T.等，(1998)Am.J.Pathol.152；1667-1679)所述，诱发小鼠发生区域性后肢局部缺血。简而言之，用戊巴比妥钠(40mg/kg，IP)麻醉动物。通过对邻近隐动脉和腘动脉分叉处约2mm的右股动脉结扎，诱发后肢单侧局部缺血。为了证实灌注功能变化的诱导，通过配备7.5MHz转换器和血管造影软件的Synergy超声波系统(GE)，在第4天和第14天进行超声波成像。将动物在常规条件下圈养最高达18天。
结扎后2天、5天、10天和18天，测定局部缺血肌肉、正常未结扎肌肉、肝、肺和主动脉中的萤光素酶表达。
在图36中总结的结果显示，尽管在结扎后数天期间，在肝、肺和主动脉中没有检测到显著性差异，但是在股动脉结扎后萤光素酶基因表达在正常未结扎肌肉和局部缺血肌肉两者中均增加。尽管在结扎后5天在局部缺血肌肉中检测到峰值萤光素酶表达，但在股动脉结扎后10天在未结扎肌肉中也检测到峰值萤光素酶表达。这表明PPE-1启动子的低氧应答在体内系统中是有功能的。非局部缺血肌肉中的萤光素酶表达在所测试的天数期间与其在对照未经手术组织中的表达(天数＝0)相比并没有变化。相比之下，第5天在局部缺血肌肉中的萤光素酶表达明显高于其它时间点。
第5天，PPE-1驱动的萤光素酶表达在对照未经手术小鼠中，及与第10天和第18天局部缺血肌肉相比为2.5倍高(图51)。
在经历区域局部缺血的转基因小鼠的其它非局部缺血组织包括肝、肺和主动脉中的萤光素酶表达揭示出，在诱发局部缺血后18天内，在这些组织中的萤光素酶表达没有显著变化(图52)。
此外，这些结果证实，萤光素酶表达在含有高百分比内皮组织的组织(肺和主动脉)中比在含有低百分比内皮组织的组织(肝和非局部缺血肌肉)中高。
实施例24
细胞增殖水平对内皮细胞中Ad5PPE-1Luc活性的作用
为了确定细胞增殖水平对Ad5PPE-1Luc的效率和特异性活性的作用，体外测试内皮细胞血管生成性模型(BAEC)。通过血清除尽诱导经转导的BAEC静息，或者让其在10％ FCS中生长而正常增殖。简而言之，将细胞转导48小时，作为静息细胞—血清除尽后72小时，或者作为增殖细胞—在正常培养基(10％ FCS)中。萤光素酶活性以光单位/？g蛋白表示，以对细胞量差异标准化。所给出的结果是得自4个代表性独立实验的一式三份试验的平均值。
处于PPE-1启动子控制之下的萤光素酶表达(空心条；图28)在正常增殖的BAEC中是在静息细胞中的4倍，且在正常增殖的BAEC中是处于CMV启动子控制之下的萤光素酶表达的25倍(黑色条；图28)。此外，在增殖细胞中，处于PPE-1启动子控制之下的活性是处于CMV启动子控制之下的活性的10倍。
为了体外模拟血管生成性状况，测试通过加入40ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)诱导快速增殖的BAEC中的Ad5PPE-1Luc活性。如上文所述，比较在这些条件下正常增殖细胞和静息细胞中的活性。用VEGF诱导细胞增殖的BAEC中的萤光素酶表达是在正常增殖细胞中的44倍，且是在静息细胞中的83倍(图40)。
总的来讲，这些实验表明，处于PPE-1启动子转录控制之下的目标序列的活性水平随细胞增殖水平而变动，快速增殖引起较高水平的表达。
实施例25
对诱发动脉粥样硬化的小鼠中的PPE-1启动子的测定
为了测试动脉粥样硬化血管中Ad5PPE-1载体的效率和特异性，给6月龄ApoE缺陷型小鼠(Plump，A.S.等Cell；1991；71：343-353)全身注射1010pfu/ml病毒载体。
随着ApoE缺陷型小鼠衰老，在没有脂质获取膳食(lipid reach diet)诱导的情况下，它们发展高胆固醇值和广泛的致动脉粥样化斑。图43是从ApoE缺陷型小鼠解剖的Sudan-IV着色的主动脉照片。注意到胸主动脉含有的红色染色的动脉粥样硬化病变较少，而腹区高度动脉粥样硬化(图43，摘自Imaging of Aortic atherosclerotic lesions by 125I-HDL and125I-BSA.A.Shaish等，Pathobiology-Pathobiol 2001；69：225-9)。
图44总结了给ApoE缺陷型小鼠全身注射Ad5PPE-1Luc(空心条；n＝12)和Ad5CMVLuc(黑色条；n＝12)后5天所观察到的萤光素酶表达。结果以含有较少动脉粥样硬化病变的胸主动脉和富含动脉粥样硬化病变的腹主动脉中的绝对萤光素酶表达来表示。
与处于对照CMV启动子之下的表达相比，受PPE-1启动子控制的萤光素酶表达在高度动脉粥样硬化的腹部中为其6倍，而在轻微动脉粥样硬化的胸主动脉中为其1.6倍。
在注射Ad5PPE-1Luc的小鼠的两个主动脉区之间没有观察到显著性差异，而与含有病变的腹主动脉中的低表达相比，在Ad5CMVLuc注射组的胸主动脉中观察到较高的萤光素酶表达。
这些结果表明，尽管组成型启动子(CMV)在动脉粥样硬化最严重的区域往往不起作用，但PPE-1启动子相对而言不受疾病进程影响。
实施例26
伤口愈合模型中PPE-1启动子的测定
为了测试Ad5PPE-1构建体在将萤光素酶表达导向愈合伤口血管方面的效率和特异性活性，使用如上文在材料和方法中描述的鼠伤口愈合。
如同在其它实验中一样，用Ad5CMVLuc作为非组织特异性对照。处于PPE-1启动子(图45；空心条)控制之下的萤光素酶活性在正常区域(6.8±3.2)和愈合伤口区域(5±1.6)中均比处于CMV控制(图45；黑色条)之下所观察到的活性高。
因为CMV启动子和PPE-1启动子在愈合伤口中均表现出降低的表达水平，所以这些结果难以解释。尽管这是意想不到的观察结果，但显然PPE-1启动子在正常组织和愈合组织中都比CMV启动子驱动的表达水平高。坏死性瘢痕组织的存在可能是在愈合伤口中用两种启动子所观察到的表达水平降低的原因。
实施例27
VEGF和PDGF-B对局部缺血肌肉血管的靶向表达
体内诱导血管生成时常导致产生由内皮细胞组成的原始血管网络。这些新生血管容易破裂、有退化和渗漏倾向并且灌注差。为了克服这些局限，需要定位、定时和剂量可控地递送各种能够募集内皮细胞以及内皮周细胞(即小血管中的周细胞或较大血管中的平滑肌细胞)的血管生成因子。
修饰型前内皮素原-1启动子PPE-1-3X用于在局部缺血肢体肌肉的内皮中表达VEGF或PDGF-B，即将平滑肌细胞募集到分泌起源的内皮分泌的因子，从而阻止新形成的血管的高渗透性。
为了测定VEGF和PDGF-B在局部缺血组织中的表达，进行原位杂交。如图54A-C所示，尽管在来自Ad5PPE-1-3XVEGF治疗小鼠的局部缺血肌肉切片中可检测到VEGF mRNA的显著表达，但在Ad5CMVVEGF或盐水治疗小鼠的肌肉切片中基本上没有观测到信号。类似地，在用Ad5PPE-1-3XPDGF-B治疗的小鼠的局部缺血肢体肌肉中检测到PDGF-B mRNA的存在，但在Ad5CMVPDGF-B或盐水治疗小鼠中却没有检测到(图54E-G)。有趣的是，图12A和图12E中的信号模式类似血管结构。值得注意的是，各种治疗组的代表性肝切片证明VEGF或PDGF-B在Ad5CMV治疗的动物中大量表达(图54D和54H)，而在Ad5PPE-1-3X载体治疗小鼠的肝中没有检测到表达(数据未显示)。
总而言之，该测定表明，Ad5PPE-1-3X载体介导血管生成因子在靶器官中的可测量表达，而组成型Ad5CMV载体几乎只在肝组织中表达其转基因。
实施例28
PPE介导的VEGF表达增强的血管生成
将Ad5PPE-1-3XVEGF的治疗作用与先前报道的Ad5CMVVEGF的治疗作用进行比较。股动脉结扎后5天，将109PFU的任一治疗载体以及报告载体Ad5CMV萤光素酶和等体积的盐水(作为对照)全身施用于小鼠。以血管造影模式获得两个肢体的内侧面(medial aspect)的超声波(US)图像。如图38A-D所示，在结扎后21天，对照动物中的灌注信号减少并截短；然而，在Ad5PPE-1-3XVEGF治疗小鼠和Ad5CMVVEGF治疗小鼠的US图像中均观察到持续增强的信号。在两个VEGF治疗组中，第21天的平均灌注强度是对照组平均灌注强度的3倍以上(p<0.01)，并且与所述动物的正常对侧肢体记录的结果相似(图38E)。股动脉结扎并使用内皮特异性标记抗CD-31后21天进行的免疫组织化学分析显示，分别与Ad5CMVVEGF组和对照组中的585和485个CD31+细胞/mm2相比，在Ad5PPE-1-3XVEGF治疗小鼠的局部缺血肌肉切片中的平均值为546个CD31+细胞/mm2(图38F)。该数据表明，用Ad5PPE-1-3XVEGF短期治疗与Ad5CMVVEGF的有效CMV启动子治疗同样有效。此外，用H&E染色的小鼠肝切片显示，没有肝炎或其它慢性病理变化的指征(数据未显示)，从而排除了腺病毒对肝细胞的向性效应。
实施例29
PPE调节的表达延长的VEGF基因治疗的作用
考察针对血管生成诱导的促血管生成因子的组织特异性表达和组成型表达的对比。在长达70天的实验中，对PPE调节的和CMV调节的VEGF表达对灌注和血管生成的作用进行了测试。具有局部缺血肢体的小鼠如上进行治疗(参见实施例28)。US成像揭示出自病毒施用后1-2周开始在两个治疗组中灌注方面的显著改善，而在对照组中检测到微小变化(数据未显示)。股动脉结扎后50天和60天，检测到Ad5PPE-1-3XVEGF治疗的长期作用。与Ad5CMVVEGF或盐水治疗的小鼠相比，在Ad5PPE-1-3XVEGF治疗的小鼠中灌注显著增加。Ad5CMVVEGF治疗动物和对照治疗动物之间的灌注差异随时间间隔的增加而减少。第50天，Ad5PPE-1-3XVEGF治疗组的平均灌注强度比Ad5CMVVEGF或盐水治疗小鼠的平均灌注强度高约50％，而与对侧正常肢体的平均灌注强度相似(p<0.01，图55A)。第70天处死动物后，Ad5PPE-1-3XVEGF治疗小鼠的肌肉切片中的毛细血管密度为747个CD31+细胞/mm2，分别比Ad5CMVVEGF组(474个CD31+细胞/mm2)和对照组(342个CD31+细胞//mm2)高57％和117％(p<0.01，图55B)。
实施例30
PPE启动子内皮特异性PDGF-B表达增强的血管生成
PDGF-B是旁分泌内皮分泌的因子，已经表明它通过募集平滑肌细胞而参与血管成熟，且也可能参与血管生成[Edelberg，J.M.等，Circulation 105，608-13.(2002)；Hsu等，J Cell Physiol 165，239-45.(1995)；Koyama，N.等，J Cell Physiol 158，1-6.(1994)]。另外，已经表明PDGF-B参与内膜增厚[Sano，H.等，Circulation 103，2955-60.(2001)；Kaiser，M.等，Arthritis Rheum 41，623-33.(1998)]，并参与成纤维细胞增殖[Nesbit，M.等，Lab Invest 81，1263-74.(2001)；Kim，WJ.等，InvestOphthalmol Vis Sci 40，1364-72.(1999).]。在体外和体内测试PDGF-B处于内皮特异性调节下诱导血管生成的能力。
同Ad5PPE-1-3XVEGF一样，Ad5PPE-1-3XPDGF-B载体在体外诱导内皮细胞中的血管生成性变化(数据未显示)。用10MOI的Ad5PPE-1-3XPDGF-B转导在血纤蛋白包被的培养器具中培养的内皮细胞导致形成二维环状结构和血纤蛋白降解。
对于体内作用，在股动脉结扎后5天用109PFU的Ad5PPE-1-3XPDGF-B对小鼠进行全身治疗。结扎后30天，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治疗小鼠的平均灌注强度比对照组的平均灌注强度高约90％(图56A)。结扎后80天，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治疗组的灌注强度比对照组的灌注强度高60％(图56B)。
结扎后35天和90天测量毛细血管密度。在短时间间隔内，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治疗小鼠的局部缺血肌肉切片中的平均毛细血管密度为516个CD31+细胞/mm2，而在盐水治疗组中，平均毛细血管密度为439个CD31+细胞/mm2(图56C)。结扎后90天，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治疗小鼠的平均毛细血管密度略微增加到566个CD31+细胞/mm2，而在对照组中检测到中等减少(378个CD31+细胞/mm2，图56D)。
结果表明，Ad5PPE-1-3XPDGF-B载体本身是有效的血管生成治疗，它不仅在施用后短期内诱导血管生成，而且能够长时间段地维持治疗作用。在用Ad5PPE-1-3XPDGF-B治疗小鼠的肝中没有检测到慢性变化。
实施例31
内皮细胞中的PDGF-B表达使血管成熟
采用两种治疗模式检验以下假设：在联合疗法中使用VEGF和PDGF-B这两者可实现血管生成和血管系统成熟的进一步增强，这两种治疗模式是：(i)单次施用109PFU的Ad5PPE-1-3XVEGF和Ad5PPE-1-3XPDGF-B；(ii)在施用Ad5PPE-1-3XVEGF后5天施用相似剂量的Ad5PPE-1-3XPDGF-B。这两种模式均获得相同的结果，且因此将其认为是相同的。结扎后90天，与对照Ad5PPE-1-3XGFP治疗的小鼠相比，所述联合疗法和Ad5PPE-1-3XVEGF治疗小鼠均表现出显著更高的毛细血管密度，但在各种治疗组中不存在显著性差异(图57B)。然而，联合疗法组中US成像的平均灌注强度比Ad5PPE-1-3XVEGF治疗组最高42％(图57A)。这可用联合疗法组和Ad5PPE-1-3XPDGF-B治疗小鼠的局部缺血肌肉小血管的成熟来解释。在用联合疗法或Ad5PPE-1-3XPDGF-B治疗小鼠的对α-SMactin免疫染色的肌肉切片中，观察到血管平滑肌细胞的明显染色(图57C-D)。在对照和Ad5PPE-1-3XVEGF治疗小鼠中可以观察到稀疏染色(图57E-F)。在正常肢体肌肉中，较大的小动脉和小静脉周围存在明显染色(图57G)。在用Ad5PPE-1-3XPDGF-B治疗的小鼠中，相似的结果早在结扎后35天就可获得(数据未显示)。结扎后35天，治疗小鼠肝切片中的慢性变化不明显。
这些结果在独立的实验中得到进一步证实，该实验考察单独的和联合疗法中的PDGF-B对结扎后50天血液灌注的作用。如图58所示，结扎后50天，联合疗法组的血液灌注强度与正常肢体的十分相似。该作用是PPE-3X依赖性的，因为这两种生长因子的组成型表达(CMV启动子)仅导致产生一半的灌注能力。有趣的是，单独的PDGF-B的PPE-3X依赖性表达可以介导与联合疗法诱导几乎相同的灌注(即77％)。然而，使用组成型启动子时这样的结果并不明显。
这些结果证实，PPE-1-3X启动子尽管全身施用也能够足够强地激活治疗基因，而不损害在血管生成性内皮细胞中的优先表达。此外，这些结果还证实PDGF-B为可介导其血管生成作用的促血管生成因子，而无需再加入公认的血管生成生长因子如VEGF。
实施例32
构建和表征AdPPE-1(3x)-TK载体
HSV-TK/GCV是最广泛研究和实施的细胞减少性基因药物联合。使用含HSV-TK的质粒转染的细胞或用含HSV-TK的载体转导的细胞对包括阿昔洛韦、更昔洛韦(GCV)、伐昔洛韦和泛昔洛韦在内的药物超家族敏感。鸟苷类似物GCV在与TK组合时是活性最强的药物。HSV-TK阳性细胞产生病毒TK，其将GCV磷酸化成单磷酸GCV(GCV-MP)的有效性高达人TK的3个数量级。GCV-MP随后由天然胸苷激酶磷酸化成二磷酸GCV，且最终磷酸化成三磷酸GCV(GCV-TP)。
首先，制备两种质粒。一种质粒包含受控于修饰型鼠前内皮素原-1(PPE-13x)启动子的HSV-TK基因，且制备该质粒以检验由PPE-1(3x)启动子控制的基因的体外功效。制备含由PPE-1(3x)启动子控制的HSV-TK基因以及腺病毒序列的更大质粒，用于通过同源重组制备病毒载体。通过两种限制酶由4348bp的质粒pORF-HSV1TK消化出HSV-TK基因(1190bp)。SalI限制位点靠着(against)HSV-TK基因的5′末端定位，且EcoRI位点靠着3′末端定位。将HSV-TK基因连接至3400bp质粒pBluescript-SK的多克隆位点，质粒pBluescript-SK在插入的基因的上游含NotI限制位点(靠着HSV-TK基因的3′末端)。SalI位点经受克列诺(Klenow)程序，且NotI接头连接至HSV-TK基因的5′末端。HSV-TK基因(现在由两个NotI限制位点翼侧包围)连接至上文所述的两个质粒pEL8(3x)-Luc和pACPPE-1(3x)-GFP的NotI限制位点中：
1.8600bp质粒称为pEL8(3x)-Luc，代替1842bp的萤光素酶基因，侧接两个NotI限制位点。pEL8(3x)-TK质粒包含PPE-1(3x)启动子、HSV-TK基因、SV-40聚腺苷酸化位点和鼠内皮素-1基因的第一内含子(图60a)。
2.11946bp质粒pACPPE-1(3x)-GFP，代替1242bp的绿色荧光蛋白(GFP)基因，由两个NotI限制位点翼侧包围(图60b)。
构建具有受控于修饰型鼠前内皮素原-1启动子的HSV-TK基因的腺病毒-5载体。在第一代(E1基因缺失，E3不完整)腺病毒-5载体的基础上构建称为AdPPE-1(3x)-TK的复制缺陷型载体。使用众所周知的常规克隆技术，通过质粒pACPPE-1(3x)-TK和pJM-17(40.3kb)在人胚肾-293(HEK-293)中的共转染制备重组载体。pJM-17质粒包含除E1基因之外的完整腺病毒-5基因组。HEK-293细胞系替代了E1缺失，因为它们含反式E1基因。40种同源重组中有一种诱导载体AdPPE-1(3x)-TK。
AdPPE-1(3x)-TK载体特征。对病毒DNA进行PCR分析，以验证重组腺病毒中TK转基因和启动子的存在。使用两种引物：正向引物5′-ctcttgattcttgaactctg-3′(前内皮素原启动子序列中的455-474bp)(SEQ IDNo：9)和反向引物5′-taaggcatgcccattgttat-3′(HSV-TK基因序列中的1065-1084bp)(SEQ ID No：10)。使用在我们的实验室中产生的其它载体引物，以验证载体纯度。约1kb的条带证实在AdPPE-1(3x)-TK病毒中存在PPE-1(3x)启动子和HSV-TK基因(图61)。但是，构建的腺病毒载体的其它引物没有一个能提供任何产物。因此，所述载体是纯集落。
所述病毒在HEK-293细胞中进一步纯化，以分离单个病毒克隆。
在双脱氧核苷酸存在下通过循环测序反应对AdPPE-1(3x)-TK的病毒DNA测序，对其进行化学修饰，以在UV光下发荧光。4种引物用于验证完整转基因的存在：
1.正向引物5′-ctcttgattcttgaactctg-3′(在前内皮素原启动子中的455-474bp)(SEQ ID NO：9)，之后是“3x”元件。
2.反向引物5′-gcagggctaagaaaaagaaa-3′(在前内皮素原启动子中的551-570bp)(SEQ ID NO：11)。
3.正向引物5′-tttctttttcttagccctgc-3′(在前内皮素原启动子中的551-570bp)(SEQ ID NO：12)。
4.反向引物5′-taaggcatgcccattgttat-3′(在HSV-TK基因中的1065-1084bp)(SEQ ID NO：10)，其处于HSV-TK基因中。
使用称为2(SEQ ID NO：11)和3(SEQ ID NO：12)的引物，因为仅由引物1(SEQ ID NO：9)和3(SEQ ID NO：10)不能获得产物。结果显示出与小鼠(Mus musculus)Balb/c前内皮素原-1基因启动子区gi|560542|gb|U07982.1|MMU07982[560542](SEQ ID NO：1)具有99％同一性，以及显示出与单纯疱疹病毒胸苷激酶基因gi|59974|emb|V00470.1|HERPES[59974]具有99.4％同一性。AdPPE-1(3X)序列详述于图92。
3x序列(图93)包含内皮特异性正转录元件的额外一式三份重复。如上文所述，在此145bp序列中，有两个完整的内皮特异性正转录元件和一个被切成两个反向顺序的片段的序列。
对照载体。构建两个腺病毒载体，一个没有PPE-1(3x)启动子，且第二个没有Luc基因，以用作AdPPE-1(3X)载体的对照。载体AdCMV-TK(用作非组织特异性启动子对照)包含由早期巨细胞病毒(CMV)启动子控制的HSV-TK基因(图62c)。载体AdPPE-1(3x)-Luc包含由修饰型鼠前内皮素原-1启动子控制的萤光素酶(Luc)基因(图62b)。所述病毒以按比例放大批次培养，并以109-1012颗粒/ml的浓度储存于-20℃。
实施例33
更昔洛韦和处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK的细胞毒性：在PPE-1(3x)启动子控制之下的TK在体外的优良内皮细胞细胞毒性
通过与对照载体AdCMV-TK和AdPPE-1(3x)-Luc对比，在内皮细胞系中体外评价AdPPE-1(3x)-TK的特异性内皮细胞靶向的细胞毒性。
AdPPE-1(3x)-TK+GCV在低感染复数(moi)时有细胞毒性：用感染复数(m.o.i.)为0.1、1、10、100和1000的AdPPE-1(3x)-TK、AdCMV-TK和AdPPE-1(3x)-Luc转导牛主动脉内皮细胞(BAEC)。转导后4小时加入GCV(1μg/ml)。对照是用无GCV的载体或无载体的GCV转导的细胞。两个对照都未诱导细胞死亡(数据未显示)。于显著低于AdCMV-TK的m.o.i.在AdPPE-1(3x)+GCV处理细胞中注意到明显的细胞毒性的特征性形态学变化(细胞扩大、延伸和膨胀)和汇合丧失。AdPPE-1(3x)-Luc转导的细胞保持健康(小尺寸、圆形和汇合，图63)。通过用结晶紫染色测定评价细胞生存力(图64)，证实与GCV施用组合的AdPPE-1(3x)-TK载体在BAE细胞中于低于受强组成型CMV启动子控制的TK基因的m.o.i.表现出较高的细胞毒性。
AdPPE-1(3x)-TK+GCV在低浓度GCV时有细胞毒性：如上文所述，用AdPPE-1(3x)-TK、AdCMV-TK和AdPPE-1(3x)-Luc以感染复数(m.o.i.)10转导牛主动脉内皮细胞(BAEC)，并使该细胞接触转导后4小时加入的浓度渐增的GCV(0.001-10μg/ml，如所示)。用无GCV的载体转导的对照细胞或接受无载体的GCV的对照细胞在任何浓度都未显示出细胞死亡的指征(数据未显示)。在比接触AdCMV-TK(中间系列)的细胞显著低的GCV浓度，在AdPPE-1(3x)-TX+GCV处理细胞中注意到明显的细胞毒性的特征性形态学变化(细胞扩大、延伸和膨胀)和汇合丧失(图65)。通过用结晶紫染色测定评价细胞生存力(图66)，证实与GCV施用组合的AdPPE-1(3x)-TK载体在BAE细胞中且于比受强组成型CMV启动子控制的TK基因低的GCV浓度表现出较高的细胞毒性。
AdPPE-1(3x)-TK+GCV细胞毒性对内皮细胞是特异性的：为了评价载体AdPPE-1(3x)-TK对内皮细胞的特异性和功效，用AdPPE-1(3x)-TK、AdPPE-1(3x)-Luc或AdCMV-TK以m.o.i.10转导内皮细胞[牛主动脉内皮细胞(BAEC)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)]和非内皮细胞[人肝癌细胞(HepG-2)、人正常皮肤成纤维细胞(NSF)]，接着在转导后4小时施用1μg/ml GCV。转导后4天检测细胞毒性和细胞形态学变化。AdPPE-1(3x)-TK+GCV在BAEC和HUVEC中特异性地诱导细胞毒性，而AdCMV-TK+GCV仅在HepG-2中诱导细胞毒性。NSF对m.o.i.＝10的所有载体都有抗性。AdPPE-1(3x)-Luc+GCV对所有细胞类型都无毒(图67)。通过用结晶紫染色测定评价细胞生存力(图68)，证实与受强组成型CMV启动子控制的TK基因(AdCMV-TK+GCV)的非特异性细胞毒性相比，与GCV施用组合的AdPPE-1(3x)-TK载体表现出协同的内皮细胞特异性细胞毒性。
用AdPPE-1(3x)-TK、AdPPE-1(3x)-Luc或AdCMV-TK以较高的m.o.i.100转导非内皮性NSF细胞，接着在转导后4小时施用1μg/ml的GCV时，未观察到AdPPE-1(3x)-TK+GCV对细胞形态学的作用(图69)。相反，用处于强组成型CMV启动子控制之下的TK(AdCMV-TK+GCV)处理的细胞显示出强的非特异性细胞毒性，从而证实了即使在极端的感染复数下，处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK和更昔洛韦施用也有内皮选择性细胞毒性。
总之，这些结果首次表明，载体AdPPE-1(3x)-TK能够特异性诱导内皮细胞包括人内皮细胞的杀伤。而且，载体AdPPE-1(3x)-TK完全受控于前药GCV，且于相对低的GCV浓度具有相当的活性。最后，尽管腺病毒载体的内皮细胞转导功效相对低，但内皮细胞杀伤是高效的。
实施例34
施用更昔洛韦和处于PPE-1(3x)启动子控制下的TK的治疗作用：在PPE-1(3x)启动子控制之下的TK在体内的优良内皮细胞细胞毒性
在癌症肿瘤发生和转移生长的动物模型中，通过与全身施用GCV和对照载体AdCMV-TK和AdPPE-1(3x)-Luc相比，体内评价AdPPE-1(3x)-TK的特异性内皮细胞靶向的细胞毒性的治疗功效。
处于PPE-1(3x)启动子控制下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用对Lewis肺癌(LLC)中转移性生长的协同抑制作用：Lewis肺癌是充分表征的、具有高度转移潜力的严重侵袭性恶性癌症的动物模型。已尝试了使用细胞因子IL-2(Kwong等，Chest 119；112：1332-37)、采用内皮启动子Tie/Tek和GCV(dePalma等，Nat Med 2003；9：789-795)以及体外VEGF启动子和GCV(Koshikowa等，Cane Res 2000；60：2936-41)与HSV-TK进行联合治疗。为了测试全身施用AdPPE-1(3x)和GCV对转移性疾病的作用，通过用肿瘤细胞接种左足且一发展原发性肿瘤就截足来诱发LLC肺转移。去除原发性肿瘤后5天静脉内施用腺病毒载体[AdPPE-1(3x)-TK+GCV；AdCMV-TK+GCV；无GCV的AdPPE-1(3x)-TK]，接着每日腹膜内施用GCV达14天。
如下排除小鼠：22只小鼠由于无发展原发性肿瘤而被排除，1只小鼠由于载体注射失败而被排除，8只小鼠无任何肺转移踪迹而死亡。在排除的小鼠中，18只小鼠在入选前被排除，6只由组1(AdPPE-1(3x)-TK+GCV)排除，2只由组2(AdCMV-TK+GCV)排除，3只由组3(无GCV的AdPPE-1(3x)-TK)排除，且2只由组4(盐水+GCV)排除。在载体注射后第24天处死小鼠。在第24天，对照组(盐水+GCV和无GCV的AdPPE-1(3x)-TK)中25％的小鼠由于肺转移扩散而死亡。图70显示了治疗组和对照组的代表性肺组织，从而表明在AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠的肺中的转移扩散程度比AdCMV-TK+GCV、无GCV的AdPPE-1(3x)-TK和无腺病毒的GCV治疗的小鼠肺中的转移扩散程度显著降低。
在处死后，AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗的小鼠转移的平均重量(转移性疾病程度指标)低至用无GCV的AdPPE-1(3x)-TK治疗小鼠的该平均重量的1/3.3(平均值±SE：分别为0.3g±0.04对0.8g±0.2；p<0.05)。用AdCMV-TK+GCV或用盐水+GCV治疗的小鼠转移的平均重量与其它组别的该平均重量无统计学差异(图71)。
处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)对转移性肺组织的细胞毒性作用：为了确定AdPPE-1(3x)和GCV施用对LLC转移生长的作用机制，对转移性肺的肺组织进行苏木精和伊红染色(图72a-72c)。在取自无GCV的AdPPE-1(3x)-TK或盐水+GCV治疗小鼠的肺转移中检测到轻微的外周坏死(图72a)。取自AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠的肺组织表现出肺泡和支气管周围单核浸润，而在取自用无GCV的AdPPE-1(3x)-TK或盐水+GCV治疗小鼠的肺中未检测到浸润。与取自用无GCV的AdPPE-1(3x)-TK或盐水+GCV治疗小鼠的转移相比，取自AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠的肺转移表现出单核浸润簇(图72b、c)。还在取自AdCMV-TK+GCV治疗小鼠的标本中检测到最少的坏死和单核浸润。结果提示，AdPPE-1(3x)-TK+GCV在肺转移中诱导增加的中心坏死和单核浸润。
为确定负责AdPPE-1(3x)-TK+GCV对LLC肺转移的抑制作用的细胞死亡特征，对肺组织进行TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色，以评价凋亡。与无GCV的AdPPE-1(3x)-TK或盐水+GCV治疗小鼠相比，AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠的肺转移呈现出众多的凋亡肿瘤细胞(图73a和73b)。与AdCMV-TK+GCV治疗小鼠的标本相比，取自AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠肺之标本的组织病理学切片显示出显著更高程度的DNA损伤(TUNEL，图73a)和胱天蛋白酶-3(图73b)，从而表明肿瘤细胞凋亡。更有意义的是，转移肺的组织病理切片的TUNEL和胱天蛋白酶-3染色在静脉内AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠肺转移血管(内皮)区中表现出增强的凋亡(图74)，从而表明处于PPE-1(3x)启动子控制下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用对转移细胞凋亡的协同增强作用。结果提示，全身施用AdPPE-1(3x)-TK+GCV诱导大规模的肿瘤细胞凋亡。而且，血管生成性内皮细胞凋亡可能是大规模中心转移坏死和凋亡的机制。
处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK表达和更昔洛韦(GCV)施用在转移性疾病中具有体内抗血管生成作用：CD-31是血管生成的特征性内皮细胞标记。对转移肺组织进行抗CD-31染色，以确定内皮细胞涉及全身性AdPPE-1(3x)+GCV的抗转移作用的情况。图75a-75d揭示，AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠的肺转移中的血管生成性血管短，无连续性或分支，且边界模糊(图75a-75c)。在无GCV的AdPPE-1(3x)-TK或盐水+GCV治疗小鼠的肺转移中的血管生成性血管表现为具有丰富分支和明显边界的长血管(图75a)。在AdCMV-TK+GCV治疗小鼠的肺转移中也检测到最低程度的异常血管系统，尽管远小于AdPPE-1(3x)-TK治疗小鼠的状况(未显示)。对肝血管没有作用说明了对增殖的内皮组织的这种抗血管生成作用的特异性(图75c)。基于计算机的血管密度测量(Image Pro-Plus，Media Cybernetics Incorporated)表明，AdPPE-1(3x)-TK+GCV组的肺转移中的血管密度小至无GCV的AdPPE-1(3x)-TK治疗组的1/1.5(分别为40107.7μm2对61622.6μm2)(图75d)。
综上所述，这些结果表明，全身施用AdPPE-1(3x)-TK+GCV通过高度选择性诱导血管生成内皮细胞凋亡而诱发中心转移坏死和凋亡。
全身施用AdCMV-TK+GCV在具有LLC肺转移的小鼠中诱发肝脏毒性。因为全身施用腺病毒载体的其中一种主要副作用是肝毒性，所以在具有诱发的LLC肿瘤的C57Bl/6小鼠中测定肝形态学。治疗肝组织和对照肝组织的苏木精和伊红染色切片分析揭示，用处于组成型启动子AdCMV-TK控制之下的TK+GCV治疗的小鼠的肝表现出门(portal)和门管周单核浸润以及小汇合坏死区域，而AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗小鼠和对照组的肝仅表现出最小的单核浸润和肝细胞核增大(图76)。结果表明，尽管处于CMV启动子控制之下的TK组成型表达明显有肝毒性，但采用血管生成特异性AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗没有观察到对肝形态学的不利副作用。
处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达的严格器官特异性：为评价处于PPE-1(3x)启动子控制之下的HSV-TK表达的抗转移作用的器官和组织特异性程度，使用HSV-TK引物和β-肌动蛋白引物对用腺病毒载体治疗的具有LLC肺转移的小鼠不同器官的多种组织进行PCR分析。
9只15周龄的C57BL/6雄性小鼠入选。通过用肿瘤细胞接种左足以及一发展原发性肿瘤就截足来诱发LLC肺转移。在去除原发性肿瘤后14天静脉内递送腺病毒载体(AdPPE-1(3x)-TK和AdCMV-TK)或盐水。在注射载体后6天处死小鼠，且如所述由收获的器官提取RNA。对RNA实施逆转录酶PCR，接着使用HSV-TK引物和β肌动蛋白引物进行PCR。在AdPPE-1(3x)-TK治疗小鼠的肺中检测到阳性HSV-TK表达，而在肝中没有检测到HSV-TK表达。相比之下，在AdCMV-TK治疗的小鼠肝中检测到高度阳性的HSV-TK表达，且在肺中没有检测到表达(图77)。根据β肌动蛋白校正的基于计算机的光密度测定法(Optiquant，Packard-Instruments)表明，与AdCMV-TK治疗小鼠中的肝/肺表达比率5.8相比，AdPPE-1(3x)-TK治疗小鼠中的肝/肺表达比率为11.3。这些结果表明，AdPPE-1(3x)-TK治疗小鼠主要在富血管生成器官(即转移性肺)中表达HSV-TK基因，而处于CMV启动子控制之下的TK表达(AdCMV-TK治疗小鼠)主要在柯萨奇腺病毒受体富集器官如肝中进行(图77)。还在AdPPE-1(3x)-TK治疗小鼠的睾丸中检测到强阳性HSV-TK表达。尽管不希望受限于单一假设，但要认识到，在AdPPE-1(3x)-TK治疗小鼠中的阳性表达可能由性腺中内皮素启动子的高度表达来解释。在AdCMV-TK治疗小鼠中的阳性表达由相对高的RNA洗脱(RNAelution)来解释，如由高度阳性的β-肌动蛋白条带反映出来的。
总之，这些结果表明，全身施用AdPPE-1(3x)-TK+GCV通过诱导中心转移坏死和选择性诱导血管生成性内皮细胞凋亡，可以安全和组织特异性方式有效抑制甚至高度侵袭性的癌症转移扩散。
实施例35
施用更昔洛韦和处于PPE-1(3x)启动子控制下的TK与放疗联合：体内协同的内皮细胞细胞毒性
就导致不希望的副作用减少的所需剂量降低和治疗持续时间缩短而言，以及就由不同治疗机制的协同会聚产生的更大治疗功效而言，多形式抗癌治疗提供了超越个别治疗的显著优势(关于近期综述参见Fang等，Curr Opin Mol Ther 2003；5：475-82)。为了测试在多形式治疗中AdPPE-1(3x)-TK+GCV施用的功效，评价与单剂放疗联合的全身性AdPPE-1(3x)-TK+GCV施用对Balb/C小鼠中缓慢生长的原发性CT-26结肠癌和C57Bl/6小鼠中的转移性Lewis肺癌的作用。
局部单剂5Gy放疗对具有原发性CT-26结肠癌肿瘤的Balb/C小鼠是无毒的和亚治疗性的：用CT-26结肠癌接种入20只8周龄雄性BALB/C小鼠的左股，以发现亚治疗性且无毒的辐射剂量。肿瘤直径一达到4-6mm，就用局部单剂辐射治疗小鼠。检查4个辐射剂量：0Gy(黑色圆)、5Gy(空心圆)、10Gy(黑色三角形)或15Gy(空心三角形)。通过测量大轴和小轴每日评价肿瘤体积[按照式V＝π/6×α2×β(α是短轴，且β是长轴)计算]。每日通过观察和称重监控小鼠保持良好状态。与未治疗的小鼠相比，10和15Gy剂量抑制肿瘤进程的发展(分别为p＝0.039、p＝0.029)。但是，5Gy剂量仅诱导部分的、非统计学显著的肿瘤发展延迟(图78a)，且在5Gy治疗小鼠中，既没有检测到显著的重量减轻(图78b)，也没有检测到异常行为。根据这些结果，在联合治疗实验中使用单剂5Gy放疗。
处于PPE-1(3x)启动子控制之下的TK体内表达和更昔洛韦(GCV)施用联合局部5Gy放疗抑制了原发性结肠癌肿瘤进展：用CT-26结肠癌肿瘤细胞接种100只8周龄雄性Balb/C小鼠。肿瘤轴一达到4-6mm，就向尾静脉中静脉内注射1011PFU病毒载体[AdPPE-1(3x)-TK或AdCMV-TK]，接着每天按指示腹膜内注射GCV(100mg/kg体重)达14天。载体施用后3天，用局部5Gy剂量辐射小鼠。按照式V＝π/6×α2×β(α是短轴，且β是长轴)评价肿瘤体积。在处死时，给小鼠照相，且收获肿瘤和肝标本进行组织学分析。
与其它治疗方案相比，AdPPE-1(3x)-TK+GCV+放疗抑制肿瘤进展。平均肿瘤抑制持续时间约2周，与腺病毒活性持续时间相匹配。AdPPE-1(3x)-TK+GCV+放疗治疗组的平均肿瘤体积进展小于AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗组(p＝0.04)和AdCMV-TK+GCV治疗组(p＝0.008)。而且，该组(AdPPE-1(3x)-TK+GCV+放疗)中的平均肿瘤体积进展小于所有其它组中累积的平均肿瘤体积进展(p＝0.0025)、所有非辐射组(AdPPE-1(3x)-TK+GCV、Ad5CMV-TK+GCV、无GCV的AdPPE-1(3x)-TK和盐水+GCV；p＝0.0005)中的累积平均肿瘤体积进展以及其它辐射组(Ad5CMV-TK+GCV+放疗、无GCV的AdPPE-1(3x)-TK+放疗以及盐水+GCV+放疗；p＝0.041)中的累积平均肿瘤体积进展(图79a、b)。与非靶向载体AdCMV-TK相比，放疗仅显著加强血管生成内皮细胞转录靶向的载体AdPPE-1(3x)-TK(p＝0.04)(图79c-f)。在没有放疗时采用所有病毒载体的治疗方案都无效。
总之，这些结果表明了联合的AdPPE-1(3x)-TK+GCV和放疗在体内对CT-26结肠癌肿瘤发展的显著协同性肿瘤抑制作用。
AdPPE-1(3x)-TK+GCV联合放疗诱导大规模肿瘤坏死：为了确定联合的AdPPE-1(3x)-TK+GCV和放疗的抗肿瘤发生作用的机制，对肿瘤组织进行苏木精和伊红染色。肿瘤组织是细胞过多的(hypercellular)、凝缩的并具有高有丝分裂指数。检测所有组中的两种要素：坏死和坏死区域中的肉芽组织。与取自非辐射小鼠的肿瘤相比，取自用包含辐射的方案治疗的小鼠的肿瘤表现出更大的坏死区域和肉芽组织。在这些组中，坏死(图80a)和肉芽组织(图80b)主要位于中心。AdPPE-1(3x)-TK+GCV联合放疗治疗的小鼠表现出最广泛的坏死和肉芽组织(图80a和80b)，估计占标本面积的约55％-80％(图80)。与其它非辐射组相比，取自用无放疗的AdPPE-1(3x)-TK+GCV治疗的小鼠的肿瘤表现出相对更大的坏死区域(数据未显示)。结果提示，AdPPE-1(3x)-TK+GCV+放疗诱发大规模中心肿瘤坏死，其部分地被肉芽组织替代。
AdPPE-1(3x)-TK+GCV联合放疗诱导内皮细胞和大规模肿瘤凋亡：为确定负责AdPPE-1(3x)-TK+GCV和放疗对结肠癌肿瘤的抑制作用的细胞死亡特征，对肿瘤组织进行TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色，以显现凋亡细胞。TUNEL染色在辐射组中显现出中心坏死区域周围的凋亡肿瘤细胞。在由AdPPE-1(3x)-TK+GCV联合放疗治疗小鼠取出的肿瘤中检测到比任何其它组都更多的凋亡肿瘤细胞(图30a)。由肿瘤切片的抗胱天蛋白酶-3染色检测到相同的凋亡细胞模式。而且，被凋亡肿瘤细胞包围的坏死区域(白色箭标)为蛇形，且就含有增加的血管密度而言是独特的(图81b)。凋亡区域中的血管内皮细胞表现出阳性抗胱天蛋白酶-3染色(图82)。
总之，这些结果提示，AdPPE-1(3x)-TK+GCV联合放疗在结肠癌肿瘤的坏死区域周围诱导大规模的肿瘤细胞凋亡。而且，肿瘤凋亡区域中的血管生成性血管密度增加、坏死和凋亡区域的形状以及内皮细胞凋亡的存在表明血管周围坏死在血管生成组织损伤之后发生。
联合的AdPPE-1(3x)-TK+GCV联合放疗在体内抑制肿瘤发展方面具有抗血管生成作用：CD-31是血管生成的特征性内皮细胞标记。对肿瘤组织进行抗CD-31免疫染色，以证实联合治疗对内皮细胞的直接作用。由采用含单独辐射的方案治疗的小鼠取出的肿瘤切片的血管生成性血管短，没有连续性或分支，且边界模糊。施用无GCV的单独载体未引起异常(图83a)，而AdPPE-1(3x)-TK+GCV联合放疗显示出最广泛的血管异常(图32a)。肝血管未受影响(图83b)。结果表明，施用联合放疗的AdPP1(3x)-TK+GCV在血管生成性血管中诱发广泛的血管破坏。
全身性施用AdCMV-TK+GCV但无AdPPE-1(3x)施用在具有CT-26结肠癌肿瘤的小鼠中诱发肝脏毒性：因为全身施用腺病毒载体的其中一种主要副作用是肝毒性，所以对载体治疗小鼠、联合治疗小鼠和对照小鼠的肝组织进行苏木精和伊红染色。每个治疗组中的肝标本都显示出增大的肝细胞核和Kupfer细胞增生。最显著的变化在用有或无放疗的AdCMV-TK+GCV治疗小鼠中表现出来(图84)。在组间没有发现肝功能血浆标记(肝酶SGOT、SGPT)或肾功能血浆标记(尿素、肌酸酐)的差异。应当指出的是，肝内皮细胞不受载体AdPPE-1(3x)-TK+GCV联合放疗的影响(图84，右图)。结果表明，在CMV启动子控制下表达HSV-TK的腺病毒载体相对有肝毒性。
综上所述，这些结果提示，AdPPE-1(3x)-TK+GCV对于静脉内施用是安全的。而且，所述载体仅在与加入的无毒、局部递送的放疗联合时有效抑制缓慢生长的原发性肿瘤进展。尽管不希望受限于单一假设，然而看起来经由凋亡而特异性抑制肿瘤血管生成似乎是肿瘤抑制的机制。而且，AdPPE-1(3x)-TK载体的细胞毒性活性依赖于GCV和放疗的施用。
实施例36
施用更昔洛韦和处于PPE-1(3x)启动子控制下的TK联合放疗：体内协同增强转移性癌症中的存活
为了评价AdPPE-1(3x)-TK+GCV和单剂放疗的抗血管生成活性对癌症中的长期存活的联合作用，选择在快速转移的Lewis肺癌模型中全身施用载体和GCV和放疗。
局部单剂5Gy放疗对具有Lewis肺癌转移的C57Bl/6小鼠是无毒的和亚治疗性的：用LLC细胞接种入35只8周龄雄性C57BL/6小鼠的左爪垫。一发展原发性肿瘤就在全身麻醉下截足。截足后8天在全身麻醉下施用针对小鼠胸壁的单剂放疗。检查5个辐射剂量：0、2、50、10和15Gy。去除原发性肿瘤后3-4周，未辐射小鼠开始体重下降，这是转移疾病的病征。由此按照去除原发性肿瘤后第28天的计划处死小鼠。通过观察和称重每日监控小鼠保持良好状态。用15Gy治疗的6只小鼠中有5只在辐射后5天内死亡，没有任何肺转移的症征。如下排除小鼠：1只小鼠由于相比于其它组原发性肿瘤发展延迟2周而被排除。3只小鼠在随访期间死亡，且未进行尸体剖检。在被排除的小鼠中，1只小鼠在入选前被排除，1只来自未治疗组，1只来自2Gy组，且1只来自5Gy组。用10Gy治疗的小鼠的平均转移重量低于其它组的该重量，但仅与5Gy治疗组有统计学差异(p＝0.001)(图85a)。如前所述，15Gy辐射治疗的小鼠在5天内死亡，无任何转移踪迹。10Gy治疗小鼠在辐射后10天表现出非显著性的短暂重量下降(图85b)。因为单剂5Gy放疗既不是治疗性的(图85a)也不是有毒性的(图85b)，所以其用于联合治疗实验。
联合的亚治疗性放疗和处于PPE-1(3x)启动子控制下的TK表达连同更昔洛韦(GCV)施用协同抑制鼠肺癌中的转移性疾病：将LLC细胞接种入180只8周龄雄性Balb/C小鼠左爪垫中。一发展原发性肿瘤就在全身麻醉下截足。截足后5天，将1010PFU载体[AdPPE-1(3x)-TK或AdCMV-TK]注射入尾静脉中，接着每日腹膜内注射GCV(100mg/kg)达14天。载体注射后3天，在全身麻醉下施用针对小鼠胸壁的单剂5Gy放疗。
小鼠分为6组：1.Ad5PPE-1(3x)-TK+GCV；2.Ad5CMV-TK+GCV；3.盐水+GCV；4.Ad5PPE-1(3x)-TK+GCV+放疗；5.Ad5CMV-TK+GCV+放疗；和6.盐水+GCV+放疗。小鼠排除：4只小鼠在截腿后不久死亡，4只小鼠由于原发性肿瘤对于入选来说太大而被排除，7只小鼠由于原发性肿瘤发展晚而被排除，12只小鼠没有任何肺转移踪迹而死亡，1只小鼠由于两侧眼排出物而被排除。在排除的小鼠当中，14只在入选前内排除，2只由组1排除，2只由组2排除，2只由组3排除，4只由组4排除，3只由组5排除，且1只由组6排除。
用AdPPE-1(3x)-TK+GCV+放疗治疗的小鼠的存活显著长于任何其它治疗组中的小鼠(p＝0.05)(图86a)。而且，相比于非靶向载体AdCMV-TK，放疗仅显著增强血管生成性内皮细胞转录靶向的载体AdPPE-1(3x)-TK(p＝0.04)(图86b-d)。结果表明，全身施用AdPPE-1(3x)-TK载体+GCV+单剂放疗的联合治疗协同延长了转移性疾病中的存活。
实施例37
用处于PPE-1(3x)启动子控制之下的Fas和TNFR嵌合基因的双重治疗：
与阿霉素协同增强体外内皮细胞特异性
为了测试化疗和HSV/TK以外的“自杀基因”的血管生成性内皮特异性表达联合的功效，单独地和与蒽环类糖苷阿霉素(DOX)联合向BAE细胞施用AdPPE-1(3x)-Fas-c，其具有与Fas-嵌合体(Fas-c，参见上文的详述)组合的PPE-1(3x)启动子。
根据BAE细胞中细胞存活(％生存力，通过结晶紫染色评价)测量的凋亡在AdPPE-1(3x)-Fas-c+DOX治疗小鼠中显著高于在AdPPE-1(3x)-Fas-c或单独的DOX治疗小鼠中的凋亡(图91)。
这些结果表明，PPE-1(3x)启动子可用于指导其它治疗基因构建体的有效的、内皮特异性的表达，并且PPE-1(3x)依赖性的、凋亡诱导性的Fas-c表达和化疗的联合导致产生高度有效的协同内皮凋亡。
实施例38
条件复制型腺病毒载体材料和实验方法
细胞培养：牛主动脉内皮细胞(BAEC)和人正常皮肤成纤维细胞-NSF细胞系在含10％热灭活FCS、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的低葡萄糖DMEM中培养。HeLa(人子宫颈上皮腺癌)、Lewis肺癌细胞(D122-96)和293(人胚肾)细胞系在含10％热灭活FCS、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素的高葡萄糖DMEM中培养。人脐内皮细胞-HUVEC(Cambrex BioScience Walkersville，Inc.)在EGM-2 Bullet试剂盒(Clonetics，Bio-Whittaker，Inc.，MD，USA)中培养。人肺癌细胞系(A549)在含10％热灭活FCS、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的MEM中培养。所有细胞都在37℃、5％ CO2、湿润气氛中生长。
质粒和病毒载体构建：
质粒克隆：将萤火虫萤光素酶cDNA亚克隆入pcDNAIII表达质粒(含CMV启动子区，Invitrogen)的多克隆位点中，以及亚克隆入含PPE1-3x启动子和腺病毒-5DNA序列部分的pPACPPE-1.plpA中。通过从pPACPPE-1.plpA质粒中缺失PPE-1启动子的第一内含子克隆第三种质粒。先前已在我们的实验室中克隆了这3个质粒，并用于细胞培养物转染。
复制缺陷型载体克隆：将FAS-嵌合体的cDNA亚克隆入pPACPPE-1.plpA和pPACCMV.plpA质粒中。这些质粒与含大部分腺病毒-5基因组的pJM17共转染，且用磷酸钙法共转染入293人胚肾细胞系(ATCC)中。该细胞系设计成包含病毒复制必需但不包含在pPAC.plpA或pJM17质粒中的E1基因。所述质粒在所述细胞中经历同源重组，且约2周后形成重组病毒，并开始复制且最终引起细胞裂解。分离病毒集落并增殖，且其确切插入方向通过PCR验证。复制缺陷型载体先前通过现有技术的常规克隆技术制备。
条件复制型腺病毒(CRAD)构建：使用AdEasy法(Stratagene，LaJollaCA)构建CRAD。如下修饰含腺病毒-5DNA序列部分的质粒PShuttle-MK：由中期因子(Midkine)(mk)启动子和连续的腺病毒E1区替代pShuttle(Stratagene，La Jolla，CA)中的多克隆位点和右臂。之后，以无内含子的PPE1-3x替代MK启动子。通过在所述启动子和E1之间亚克隆IRES序列(得自pIRES-EYFP质粒，BD Biosciences)和FAS-嵌合体cDNA来构建第二种质粒。IRES允许由相同转录物翻译两种蛋白质。所获得的两种穿梭物(shuttle)用PmeI消化线性化，且随后转化入大肠杆菌BJ5183ADEASY-1(Stratagene)中。该种细菌已用pADEASY-1质粒转化，所述pADEASY-1质粒含除E1和E3基因区以外的大部分腺病毒-5序列。质粒在细菌中经历同源重组(在pShuttle和pADEASY-1之间)，由此生成完整载体基因组。重组体随后用PacI消化，并用磷酸钙法转染入293人胚肾细胞系(ATCC)中。余下的程序如对复制缺陷型载体的描述一样。
通过将普通启动子CMV(巨细胞病毒)亚克隆在E1基因之前构建阳性对照病毒CMV-E1。CMV-E1病毒是遍在性的，且对内皮细胞没有特异性。
按照上述方法构建以下的复制缺陷型载体和CRAD：
复制缺陷型载体：
PPE-1(3x)-FAS、CMV-FAS、CMV-LUC(LUC-萤火虫萤光素酶报告基因的缩写)、PPE-1(3x)-LUC。
CRAD：
PPE-1(3x)-CRAD、PPE-1(3x)-Fas-CRAD、CMV-E1。
转染实验：BAEC和HeLa细胞在24孔板中培养至60-70％汇合。使用0.4μg/孔表达构建体和作为转染效率对照的0.04μg/孔pEGFP-C1载体(CLONTECH，Palo Alto，CA)进行共转染。Lipofectamine和Lipofectamine plus(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于转染。于37℃温育3小时后，用生长培养基替换转染混合物。
转导实验：载体(PPE-FAS、CMV-FAS、CMV-LUC、PPE-LUC)用感染生长培养基(含2％ FCS，而不是正常生长培养基中的10％)稀释，以达到10、100、1000、10000的感染复数(moi)。感染复数根据每个靶细胞的病毒数计算。靶细胞(BAEC和293)已在转导前24小时接种。在转导当天，用含以所需moi混合在0.1或2ml感染培养基中的病毒的溶液分别替换96孔板或60mm板的细胞生长培养基。细胞温育4小时，接着向转导细胞中加入新鲜培养基。
分别由PFU滴定(参见下文)和ApoPercentage试剂盒(AccurateChemical，Westbury，NY)评价载体复制和凋亡诱导。结晶紫染色也用于评价附着于板表面的细胞量，作为细胞生存力的指示。
测试病毒滴度—噬斑形成单位测定(PFU)：滴定病毒原液并储存于-80℃。利用感染培养基稀释的连续稀度(10-2-10-13)的病毒载体感染293细胞的分汇合(80％)培养物2小时。2小时后，用PBS洗涤培养基，且替换为琼脂覆层。在约2周后有明显噬斑的最高稀度定为以PFU/ml为单位的浓度(PFU—噬斑形成单位)。
结果
细胞毒性基因表达增强腺病毒复制：为了检验凋亡诱导对病毒复制的影响，在293(人胚肾)细胞系中检验CMV-FAS复制。在该细胞系中，所述病毒可通过FAS-c或因其复制引起的细胞裂解诱导凋亡。早期(病毒感染后几小时)凋亡可能干扰病毒复制，而晚期凋亡(病毒感染后几天)可能增强病毒传播。
为了测试CMV-FAS诱导凋亡的能力，转导BAEC，且通过生存力的ELISA-结晶紫测定来评价细胞凋亡(图89)。较高浓度(10000moi)的CMV-FAS在没有活化配体(TNF-α)的情况下诱导凋亡，而在较低浓度时需要加入所述配体来诱导凋亡。
通过293细胞中的噬斑发展来测定细胞至细胞的CMV-FAS传播。如按照噬斑发展速率和噬斑大小所观察到的(图88和89)，和非凋亡诱导载体CMV-LUC相比，采用CMV-FAS载体时噬斑发展以较高速率发生。
通过萤光素酶报告基因评价有和没有内含子时PPE1-3x启动子诱导RNA转录的能力(未显示)。未观察到显著差异。
这些结果表明，通过宿主细胞的额外凋亡裂解，可增强腺病毒载体的复制，所述载体例如为上文所述的血管生成性、内皮特异性病毒构建体AdPPE-1(3x)，其携带诱导凋亡的“杀伤”基因如FAS。
实施例39
VEGF表达的PPE-1(3x)控制增强工程化组织的新血管形成和存活
为了研究处于内皮素启动子控制下的VEGF表达在体外和体内对工程化组织构建体的血管形成的作用，用Ad5PPEC-1-3x VEGF感染细胞，并分析构建体，以观察对血管形成的作用。
图91a表明，用Ad5PPEC-1-3x VEGF感染细胞对在工程化构建体中形成的血管样结构的数目和大小具有诱导作用。构建体在培养基有或没有补加VEGF(50ng/ml)的情况下培养。用Ad5PPEC-1-3x VEGF病毒或对照GFP腺病毒感染平行构建体(达4小时)。在培养2周后，对构建体进行固定、包埋、切片和染色。
在加入VEGF至培养基和用Ad5PPEC-1-3x VEGF感染细胞之间进行对比，发现用Ad5PPEC-1-3x VEGF病毒处理的样品中的血管数和血管面积百分比增加至4-5倍(图91a)。
在体内研究中，使用3种不同模型分析植入物的体内存活、分化、整合和血管形成。这些模型包括(i)在SCID小鼠背部皮下植入，(ii)植入裸大鼠四头肌中，和(iii)用构建体替代裸小鼠前腹肌节。
构建体被宿主血管渗透。Ad5PPEC-1-3x VEGF病毒感染的构建体与对照构建体相比显示出血管结构增加。
为评价组织工程化构建体的体内存活和整合，我们使用基于萤光素酶的成像系统。体内成像系统(IVIS)通过检测由全身施用的萤光素和局部产生的萤光素酶的相互作用产生的光来工作。构建体用编码萤光素酶的腺伴随病毒(AAV)载体感染48小时，然后移植。接着将构建体原位置于裸小鼠的前腹肌壁中。在外科手术时将AAV-萤光素酶注射入每只小鼠左下肢，以用作阳性对照。外科手术后3-4周，小鼠接受萤光素，以评价对组织工程化构建体的灌注。
用Ad5PPEC-1-3x VEGF感染(和之后用AAV-萤光素酶感染)的构建体具有比仅用AAV-萤光素酶感染的对照构建体高的信号(未显示结果)。总之，这些结果提示，用Ad5PPEC-1-3x VEGF体外感染可改善植入的工程化组织构建体的存活和血管形成。
实施例40
抗血管生成治疗体内活化PPE-1(3x)启动子
许多组织对血管生成阻抑的常见应答是响应于由控制血管稳态的自身调节的自分泌反馈回路产生的复杂信号传导上调内源性血管生成途径(参见Hahn等，Am J Med 1993，94：13S-19S，和Schramek等，SenimNephrol 1995；15：195-204)。为了确定此机制如何能影响处于PPE-1(3x)启动子控制下的核酸序列的表达，在有和没有施用有效抗血管生成药物波生坦的情况下，测量用本发明核酸构建体转化的转基因小鼠组织中的体内发光水平，其中所述核酸构建体含处于PPE-1(3x)控制下的萤光素酶(LUC)基因[PPE-1(3x)-LUC]。波生坦(TracleerTM)是双重内皮素受体(ETA和ETB)拮抗剂，目前临床上批准用于多种适应症，最重要的是肺动脉高血压和肺纤维化。
如上文详述的，通过本领域众所周知的克隆方法，产生携带本发明的PPE-1(3x)-LUC构建体或Harats等人(J Clin Invest 1995；95：1335-44)详述的PPE-1-LUC构建体的转基因小鼠。用食物饮食或含100mg/kg/天波生坦的食物饮食经口饲喂10周龄PPE-1(3x)-Luc或PPE-1-LUC转基因小鼠(每组n＝5)达30天。如在上文的方法部分中所述，在治疗最后一日处死小鼠，并取出器官，取出的小鼠器官用于测量发光强度。
图94显示了PPE-1(3x)启动子赋予转基因小鼠中的重组基因以组织特异性超表达。一般具有较高内皮素活性的器官如心脏和主动脉，以及具有程度低一些的内皮素活性的器官脑、气管和肺，与肝或肾相比显示出增加的发光强度。但是，在大部分器官中，波生坦施用使发光强度显著增强(在心脏组织中最高达40％)(图94)，由此表明内皮素受体拮抗剂，尤其是和一般的血管生成抑制剂一起，可活化本发明的内皮特异性启动子，并以组织特异性方式诱导处于PPE-1(3x)转录控制下的转基因表达进一步增强。细胞内前内皮素原-1mRNA和循环内皮素-1的水平的测量，表明给表达在PPE-1启动子控制下的萤光素酶的转基因小鼠施用内皮素受体拮抗剂(例如波生坦)事实上导致增强的组织内皮素-1转录(图97A)和在血浆中检测到的增加的免疫反应性的内皮素-1(图97B)。
为了进一步测定在PPE-1启动子控制下的基因产物的表达增强的特异性，将双重内皮素拮抗剂波生坦对内皮素受体活性的抑制作用与ET-1A(BQ123，Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)和ET-1B(BQ788，Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)的个别特异性拮抗剂的抑制作用相对比。图96显示了用在PPE-1启动子(上文所述的质粒pEL8-LUC)或对照SV40启动子控制下的萤光素酶表达质粒转染、随后用ET-1受体拮抗剂波生坦、BQ123或BQ788处理1小时的牛主动脉内皮细胞(BAEC)培养物中测量的萤光素酶活性，表达为未处理对照的百分比。
用波生坦和BQ788处理测量到在PPE-1启动子控制下的萤光素酶活性的显著增加，但是BQ123(ET-1A拮抗剂)不然。波生坦和BQ788处理(在1μM)导致萤光素酶活性与未处理对照相比分别有1.6和1.3倍增加(图96)。在SV40-萤光素酶转染的细胞中没有观察到显著增加(数据未显示)。
总之，这些结果表明，响应于ETB阻断的增加的前内皮素原-1mRNA水平由增加的PPE-1启动子活性介导，这暗示着响应于ET-1受体阻断在PPE-1控制下的基因增强的转录。此外，可以体外和体内检测增加的PPE-1启动子活性，分别用于短期和长期处理。
如本文所显示的，PPE-1mRNA水平与表达在PPE-1启动子控制下的萤光素酶报告基因的转基因小鼠的萤光素酶活性相关。因而，该模型也可以用于评价包括高血压、癌症和急性肾衰竭在内的不同病理生理学状态中的ET-1表达。
实施例41
在PPE-1(3x)启动子控制下体内表达的转基因不是免疫原性的
如上文所述，同其它长期治疗模式一样，基因治疗经常伴有针对持续接触所表达的转基因蛋白产生的内源性宿主免疫反应。转基因蛋白的免疫刺激可引起治疗功效降低、炎症并有时引起严重副作用。为了测试针对使用本发明的顺式反应调节元件表达的转基因的宿主免疫应答，在具有LLC微转移、并用携带Fas-TNF-R1嵌合体(Ad5PPE-1(3x)Fas-c和Ad5CMV Fas-c)或LUC报告基因(Ad5PPE-1(3x)Luc)的载体治疗的小鼠(每组6只小鼠)中测定抗腺病毒异己酮和TNF-R1的抗体效价。对照小鼠用盐水治疗。
载体以注射之间5天的间隔注射3次。在最后一次载体注射后10天处死小鼠，以使用ELISA测定来测定抗腺病毒和抗人TNF-R1(由所插入的转基因表达的蛋白)的抗体水平。
出乎意料的是，发现抗人TNF-R1的抗体水平低于Ad5-PPE(3x)-Fas-c治疗小鼠中的检测水平，而这些水平在非特异性Ad5-CMV-fas载体治疗小鼠中相对较高(图95b)。抗腺病毒异己酮抗原的抗体效价在注射不同病毒的组别间是相似的(图95a)。这些结果表明，使用本发明的PPE-1(3x)构建体表达的转基因被宿主免疫系统良好耐受，与系统发生接近度(phylogenetic proximity)无关。
实施例42
皮质类固醇处理增强内皮细胞中转基因的表达
最近已经表明，皮质类固醇(地塞米松)施用可以预防一些免疫-和凋亡-有关的重组腺病毒感染的内皮损伤(Murata，等人ArteriosclerThromb Vasc Biol 2005；25：1796-803)，从而抑制促炎症基因表达和最优化体外和体内重组基因表达效率。为了测试皮质类固醇是否可以增强内皮细胞中病毒介导的转基因表达，在转染之前，用地塞米松处理用包含萤光素酶报告分子编码序列或绿色荧光蛋白(GFP)报告分子编码序列的腺病毒构建体转染过的BAEC细胞。
图98表明，在用表达在CMV启动子控制下的萤光素酶的腺病毒(Ad-CMV-LUC)感染之前用3μM地塞米松处理过的BAEC细胞中按照每μg总蛋白的萤光素酶百分比测得的萤光素酶表达增加至超过3倍。最突出的作用是用1000感染复数。图99解释了在PPE-1启动子控制下的有活性的重组绿色荧光蛋白(GFP)在内皮BAEC中的表达，这由皮质类固醇-处理的细胞的增强的绿色指示。
因而，皮质类固醇可以增强内皮细胞中病毒介导的转基因表达，且可以与本发明的方法一起使用。
要认识到的是，为清楚起见而在独立实施方案背景下描述的本发明的某些特征也可组合在单一实施方案中提供。相反，为简短起见而在单一实施方案背景下描述的本发明的各种特征也可独立地或以任意合适的子组合方式提供。
尽管已结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是显然许多替代方案、修改和变化对于本领域技术人员是显而易见的。因此，本发明计划包括属于所附权利要求书的精神和宽泛范围内的所有这样的替代方案、修改和变化。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都全文引入到本说明书中作为参考，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体而单独地被指明引入本文中作为参考。另外，本申请中的任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认这样的参考文献对于本发明而言是现有技术。
<110>Harats，Dror
     Greenberger，Shoshana
     Breitbart，Eyal
     Bangio，Livnat
     Peled Michael
<120>表现出内皮细胞特异性的启动子和使用其调节血管生成的方法
<130>37180
<160>16
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1334
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>1
Figure A200780014285D01271
Figure A200780014285D01281
<210>2
<211>96
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>2
<210>3
<211>96
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>3
Figure A200780014285D01291
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Nhe-1限制位点
<400>4
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<210>5
<211>6
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>低氧反应元件-E-框
<400>5
Figure A200780014285D01293
<210>6
<211>44
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>misc_feature
<223>鼠内皮特异性增强子元件
<400>6
Figure A200780014285D01301
<210>7
<211>143
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>来源于PPE-1启动子的鼠增强子序列的一式三份拷贝
<400>7
Figure A200780014285D01302
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<211>47
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<220>
<223>EDC片段
<400>8
Figure A200780014285D01303
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<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>9
Figure A200780014285D01304
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<223>单链DNA寡核苷酸
<400>10
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<210>11
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<212>DNA
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<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>11
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<210>12
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<223>单链DNA寡核苷酸
<400>12
Figure A200780014285D01313
<210>13
<211>1334
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>13
Figure A200780014285D01314
Figure A200780014285D01321
<210>14
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<212>DNA
<213>人疱疹病毒1
<400>14
Figure A200780014285D01331
Figure A200780014285D01341
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<220>
<223>内皮转录元件的部分
<400>15
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>内皮转录元件的部分
<400>16
Figure A200780014285D01351

Claims (65)

1.一种产品，其包含包装材料和：
(a)核酸构建体，它包含：
(i)内皮细胞特异性启动子；
(ii)SEQ ID NO：5所述低氧反应元件的至少一个拷贝；和
(iii)编码血管生成调节物的核酸序列，所述核酸序列在所述启动子和所述低氧反应元件的调节控制下；和
(b)至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述内皮特异性启动子的活性；
其中所述包装材料包括标签或包装插页，它们指示所述核酸构建体和所述血管生成调节剂用于治疗受试者中血管生成有关的疾病或状况。
2.一种产品，其包含包装材料和：
(a)核酸构建体，它包含：
(i)内皮特异性启动子；
(ii)编码血管生成调节物的核酸序列，所述核酸序列在所述内皮特异性启动子和顺式调节元件的调节控制下，所述顺式调节元件包含共价连接至至少部分SEQ ID NO：16所示序列的至少部分SEQ ID NO：15所示序列；和
(b)至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述内皮特异性启动子的活性；
其中所述包装材料包括标签或包装插页，它们指示所述核酸构建体和所述血管生成调节剂用于治疗受试者中血管生成有关的疾病或状况。
3.一种产品，其包含包装材料和：
(a)设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生细胞毒性的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
(i)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和
(ii)第二多核苷酸区，其编码在所述血管生成细胞亚群中指导所述嵌合多肽表达的顺式调节元件；
其中选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给所述血管生成细胞亚群的配体结合，而所述配体与所述配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的所述效应物结构域；和
(b)至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性；
其中所述包装材料包括标签或包装插页，它们指示所述核酸构建体和所述血管生成调节剂用于治疗受试者中与过度血管生成有关的疾病或状况。
4.一种产品，其包含包装材料和：
(a)设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生细胞毒性的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
(i)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和
(ii)第二多核苷酸区，其编码在所述血管生成细胞亚群中指导所述嵌合多肽表达的顺式调节元件；
其中选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给所述血管生成细胞亚群的配体结合，而所述配体与所述配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的所述效应物结构域；和
(b)至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性；
其中所述包装材料包括标签或包装插页，它们指示所述核酸构建体和所述血管生成调节剂用于治疗受试者中与过度新血管形成有关的疾病或状况。
5.一种产品，其包含包装材料和：
(a)设计并构建用于在肿瘤细胞中产生细胞毒性的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
(i)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和
(ii)第二多核苷酸区，其编码在所述肿瘤细胞中指导所述嵌合多肽的表达的顺式调节元件；
其中选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给所述肿瘤细胞的配体结合，而所述配体与所述配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的所述效应物结构域；和
(b)至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性；
其中所述包装材料包括标签或包装插页，它们指示所述核酸构建体和所述血管生成调节剂用于治疗受试者中的肿瘤生长或发育。
6.一种产品，其包含包装材料和：
(a)设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生血管生成的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
(i)编码促血管生成因子的第一多核苷酸区；和
(ii)第二多核苷酸区，其编码在所述血管生成细胞亚群中指导所述促血管生成因子的表达的顺式调节元件；和
(b)至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性；
其中所述包装材料包括标签或包装插页，它们指示所述核酸构建体和所述血管生成调节剂用于治疗受试者中局部缺血相关的疾病或状况。
7.一种产品，其包含包装材料和：
(a)设计并构建用于在血管生成细胞中的细胞毒性的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
(i)编码自杀基因的第一多核苷酸区，和
(ii)第二多核苷酸区，其编码能够在所述血管生成细胞中指导所述自杀基因的表达的顺式调节元件；和
(b)至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性；
其中所述包装材料包括标签或包装插页，它们指示所述核酸构建体和所述血管生成调节剂用于治疗受试者中与过度血管生成有关的疾病或状况。
8.权利要求1-7中任一项的产品，其中所述核酸构建体另外包含条件复制型腺病毒。
9.权利要求8的产品，另外包含至少一种能增加所述腺病毒的拷贝数的化合物。
10.权利要求9的产品，其中所述化合物是皮质类固醇和/或N-乙酰半胱氨酸。
11.权利要求1-7中任一项的产品，其中所述血管生成调节剂是除了波生坦以外的内皮素受体拮抗剂。
12.权利要求11的产品，其中所述内皮素受体拮抗剂是双重A-形式和B-形式内皮素受体拮抗剂。
13.权利要求11的产品，其中所述内皮素受体拮抗剂是B-形式特异性内皮素受体拮抗剂。
14.权利要求13的产品，其中所述B-形式特异性内皮素受体拮抗剂选自：A192,621；BQ788；Res701-1和Ro46-8443。
15.权利要求2的产品，其中所述核酸序列编码促血管生成因子，且其中所述疾病或状况与减少的血管生成有关。
16.权利要求2的产品，其中所述核酸序列编码血管生成抑制剂，且其中所述疾病或状况与过度血管生成有关。
17.权利要求3-5中任一项的产品，另外包含所述配体结合结构域的配体。
18.权利要求3-7中任一项的产品，其中所述顺式作用调节元件是选自下述的内皮细胞特异性的或内皮周细胞特异性的启动子：PPE-1启动子、PPE-1-3x启动子、TIE-1启动子、TIE-2启动子、内皮糖蛋白启动子、von Willerband启动子、KDR/flk-1启动子、FLT-1启动子、Egr-1启动子、ICAM-1启动子、VCAM-1启动子、PECAM-1启动子和主动脉羧肽酶样蛋白(ACLP)启动子。
19.权利要求6的产品，其中所述局部缺血相关的疾病或状况选自：伤口愈合、缺血性中风、缺血性心脏病和胃肠损害。
20.权利要求7的产品，其中选择的所述自杀基因能将前药转化成毒性化合物，后者能造成所述血管生成细胞的细胞毒性或凋亡。
21.权利要求7和20中任一项的产品，另外包含前药，当所述前药被所述自杀基因转变为毒性化合物时，该前药能造成所述血管生成细胞的细胞毒性或凋亡。
22.核酸构建体用于生产药物的用途，所述核酸构建体包含：
(a)内皮细胞特异性启动子；
(b)SEQ ID NO：5所述低氧反应元件的至少一个拷贝；和
(c)编码血管生成调节物的核酸序列，所述核酸序列在所述启动子和所述低氧反应元件的调节控制下；
所述药物用于治疗受试者中血管生成有关的疾病或状况，所述受试者用至少一种选择的血管生成调节剂来治疗，该调节剂能以协同方式进一步增强所述内皮特异性启动子的活性。
23.核酸构建体用于生产药物的用途，所述核酸构建体包含：
(a)内皮特异性启动子；
(b)编码血管生成调节物的核酸序列，所述核酸序列在所述内皮特异性启动子和顺式调节元件的调节控制下，所述顺式调节元件包含共价连接至至少部分SEQ ID NO：16所示序列的至少部分SEQ ID NO：15所示序列；
所述药物用于治疗受试者中血管生成有关的疾病或状况，所述受试者用至少一种选择的血管生成调节剂来治疗，该调节剂能以协同方式进一步增强所述内皮特异性启动子的活性。
24.设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生细胞毒性的核酸构建体用于生产药物的用途，所述核酸构建体包含：
(a)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和
(b)第二多核苷酸区，其编码在所述血管生成细胞亚群中指导所述嵌合多肽表达的顺式调节元件；
其中选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给所述血管生成细胞亚群的配体结合，而所述配体与所述配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的所述效应物结构域；
所述药物用于治疗受试者中与过度血管生成有关的疾病或状况，所述受试者用至少一种选择的血管生成调节剂来治疗，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性。
25.设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生细胞毒性的核酸构建体用于生产药物的用途，所述核酸构建体包含：
(a)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和
(b)第二多核苷酸区，其编码在所述血管生成细胞亚群中指导所述嵌合多肽表达的顺式调节元件；
其中选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给所述血管生成细胞亚群的配体结合，而所述配体与所述配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的所述效应物结构域；
所述药物用于治疗受试者中与新血管形成有关的疾病或状况，所述受试者用至少一种选择的血管生成调节剂来治疗，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性。
26.设计并构建用于在肿瘤细胞中产生细胞毒性的核酸构建体用于生产药物的用途，所述核酸构建体包含：
(a)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和
(b)第二多核苷酸区，其编码在所述肿瘤细胞中指导所述嵌合多肽的表达的顺式调节元件；
其中选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给所述肿瘤细胞的配体结合，而所述配体与所述配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的所述效应物结构域；
所述药物用于治疗受试者中的肿瘤生长或发育，所述受试者用至少一种选择的血管生成调节剂来治疗，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性。
27.设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生血管生成的核酸构建体用于生产药物的用途，所述核酸构建体包含：
(a)编码促血管生成因子的第一多核苷酸区；和
(b)第二多核苷酸区，其编码在所述血管生成细胞亚群中指导所述促血管生成因子的表达的顺式调节元件；
所述药物用于治疗受试者中局部缺血相关的疾病或状况，所述受试者用至少一种选择的血管生成调节剂来治疗，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性。
28.设计并构建用于在血管生成细胞中的细胞毒性的核酸构建体用于生产药物的用途，所述核酸构建体包含：
(a)编码自杀基因的第一多核苷酸区，和
(b)第二多核苷酸区，其编码能够在所述血管生成细胞中指导所述自杀基因的表达的顺式调节元件；
所述药物用于治疗受试者中与过度血管生成有关的疾病或状况，所述受试者用至少一种选择的血管生成调节剂来治疗，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性。
29.至少一种血管生成调节剂用于生产药物的用途，所述药物用于治疗受试者中血管生成有关的疾病或状况，所述受试者用包含下述的核酸构建体治疗：
(a)内皮细胞特异性启动子；
(b)SEQ ID NO：5所述低氧反应元件的至少一个拷贝；和
(c)编码血管生成调节物的核酸序列，所述核酸序列在所述启动子和所述低氧反应元件的调节控制下，其中选择的所述血管生成调节剂能以协同方式增强所述内皮特异性启动子的活性。
30.至少一种血管生成调节剂用于生产药物的用途，所述药物用于治疗受试者中血管生成有关的疾病或状况，所述受试者用包含下述的核酸构建体治疗：
(a)内皮特异性启动子；
(b)编码血管生成调节物的核酸序列，所述核酸序列在所述内皮特异性启动子和顺式调节元件的调节控制下，所述顺式调节元件包含共价连接至至少部分SEQ ID NO：16所示序列的至少部分SEQ ID NO：15所示序列；
其中选择的所述至少一种血管生成调节剂能以协同方式进一步增强所述内皮特异性启动子的活性。
31.至少一种血管生成调节剂用于生产药物的用途，所述药物用于治疗受试者中与过度血管生成有关的疾病或状况，所述受试者用设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生细胞毒性的核酸构建体来治疗，所述核酸构建体包含：
(a)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和
(b)第二多核苷酸区，其编码在所述血管生成细胞亚群中指导所述嵌合多肽表达的顺式调节元件；
其中选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给所述血管生成细胞亚群的配体结合，而所述配体与所述配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的所述效应物结构域；
其中选择的所述至少一种血管生成调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性。
32.至少一种血管生成调节剂用于生产药物的用途，所述药物用于治疗受试者中与新血管形成有关的疾病或状况，所述受试者用设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生细胞毒性的核酸构建体来治疗，所述核酸构建体包含：
(a)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和
(b)第二多核苷酸区，其编码在所述血管生成细胞亚群中指导所述嵌合多肽表达的顺式调节元件；
其中选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给所述血管生成细胞亚群的配体结合，而所述配体与所述配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的所述效应物结构域；
其中选择的所述至少一种血管生成调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性。
33.设计并构建用于在肿瘤细胞中产生细胞毒性的核酸构建体用于生产药物的用途，所述核酸构建体包含：
(a)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和
(b)第二多核苷酸区，其编码在所述肿瘤细胞中指导所述嵌合多肽的表达的顺式调节元件；
其中选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给所述肿瘤细胞的配体结合，而所述配体与所述配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的所述效应物结构域；
所述药物用于治疗受试者中的肿瘤生长或发育，所述受试者用至少一种选择的血管生成调节剂来治疗，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性。
34.至少一种血管生成调节剂用于生产药物的用途，所述药物用于治疗受试者中局部缺血相关的疾病或状况，所述受试者用设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生血管生成的核酸构建体来治疗，所述核酸构建体包含：
(a)编码促血管生成因子的第一多核苷酸区；和
(b)第二多核苷酸区，其编码在所述血管生成细胞亚群中指导所述促血管生成因子的表达的顺式调节元件；
其中选择的所述至少一种血管生成调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性。
35.至少一种血管生成调节剂用于生产药物的用途，所述药物用于治疗受试者中与过度血管生成有关的疾病或状况，所述受试者用设计并构建用于在血管生成细胞中的细胞毒性的核酸构建体来治疗，所述核酸构建体包含：
(a)编码自杀基因的第一多核苷酸区，和
(b)第二多核苷酸区，其编码能够在所述血管生成细胞中指导所述自杀基因的表达的顺式调节元件；
其中选择的所述至少一种血管生成调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性。
36.权利要求22-35中任一项的用途，其中所述核酸构建体另外包含条件复制型腺病毒。
37.权利要求36的用途，另外包含至少一种能增加所述腺病毒的拷贝数的化合物。
38.权利要求37的用途，其中所述化合物是皮质类固醇和/或N-乙酰半胱氨酸。
39.权利要求22-35中任一项的用途，其中所述血管生成调节剂是除了波生坦以外的内皮素受体拮抗剂。
40.权利要求39的用途，其中所述内皮素受体拮抗剂是双重A-形式和B-形式内皮素受体拮抗剂。
41.权利要求39的用途，其中所述内皮素受体拮抗剂是B-形式特异性内皮素受体拮抗剂。
42.权利要求41的用途，其中所述B-形式特异性内皮素受体拮抗剂选自：A192,621；BQ788；Res701-1和Ro46-8443。
43.权利要求23和30中任一项的用途，其中所述核酸序列编码促血管生成因子，且其中所述疾病或状况与减少的血管生成有关。
44.权利要求23和30中任一项的用途，其中所述核酸序列编码血管生成抑制剂，且其中所述疾病或状况与过度血管生成有关。
45.权利要求24-26和31-33中任一项的用途，另外包含所述配体结合结构域的配体。
46.权利要求24-28和31-35中任一项的用途，其中所述顺式调节元件是选自下述的内皮细胞特异性的或内皮周细胞特异性的启动子：PPE-1启动子、PPE-1-3x启动子、TIE-1启动子、TIE-2启动子、内皮糖蛋白启动子、von Willebrand启动子、KDR/flk-1启动子、FLT-1启动子、Egr-1启动子、ICAM-1启动子、VCAM-1启动子、PECAM-1启动子和主动脉羧肽酶样蛋白(ACLP)启动子。
47.权利要求27和34中任一项的用途，其中所述局部缺血相关的疾病或状况选自：伤口愈合、缺血性中风、缺血性心脏病和胃肠损害。
48.权利要求28和35中任一项的用途，其中选择的所述自杀基因能将前药转化成毒性化合物，后者能造成所述血管生成细胞的细胞毒性或凋亡。
49.权利要求28、35和48中任一项的用途，另外包含前药，当所述前药被所述自杀基因转变为毒性化合物时，该前药能造成所述血管生成细胞的细胞毒性或凋亡。
50.调节受试者组织中血管生成的方法，该方法包含：
(a)在组织中表达核酸构建体，该核酸构建体包含：
(i)内皮细胞特异性启动子；
(ii)SEQ ID NO：5所述低氧反应元件的至少一个拷贝；和
(iii)编码血管生成调节物的核酸序列，所述核酸序列在所述启动子和所述低氧反应元件的调节控制下；和
(b)施用至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述内皮特异性启动子的活性；
从而调节所述受试者的所述组织中的血管生成。
51.调节组织中血管生成的方法，该方法包含：
(a)在组织中表达核酸构建体，该核酸构建体包含：
(i)内皮特异性启动子；
(ii)编码血管生成调节物的核酸序列，所述核酸序列在顺式调节元件的调节控制下，所述顺式调节元件包含共价连接至至少部分SEQ IDNO：16所示序列的至少部分SEQ ID NO：15所示序列；和
(b)给组织施用至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述内皮特异性启动子的活性；
从而调节所述组织中的血管生成。
52.下调受试者的组织中血管生成的方法，该方法包含：
(a)给受试者施用设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生细胞毒性的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
(i)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和
(ii)第二多核苷酸区，其编码在所述血管生成细胞亚群中指导所述嵌合多肽表达的顺式调节元件；
其中选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给所述血管生成细胞亚群的配体结合，而所述配体与所述配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的所述效应物结构域；和
(b)给受试者施用至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性；由此在所述组织中下调血管生成。
53.治疗与过度的新血管形成有关的疾病或状况的方法，该方法包含：
(a)施用治疗有效量的设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生细胞毒性的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
(i)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和
(ii)第二多核苷酸区，其编码在所述血管生成细胞亚群中指导所述嵌合多肽的表达的顺式调节元件；
其中选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给所述血管生成细胞亚群的配体结合，而所述配体与所述配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的所述效应物结构域；和
(b)施用至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性，由此在所述组织中下调血管生成，并治疗与过度的新血管形成有关的疾病或状况。
54.治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包含：
(a)给受试者施用治疗有效量的设计并构建用于在肿瘤细胞中产生细胞毒性的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
(i)编码嵌合多肽的第一多核苷酸区，所述嵌合多肽包含与细胞毒性分子的效应物结构域融合的配体结合结构域；和
(ii)第二多核苷酸区，其编码在所述肿瘤细胞中指导所述嵌合多肽的表达的顺式调节元件；
其中选择所述配体结合结构域，从而使其能与存在于或提供给所述肿瘤细胞的配体结合，而所述配体与所述配体结合结构域的结合活化所述细胞毒性分子的效应物结构域，以由此在所述肿瘤细胞中指导细胞毒性；和
(b)施用至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性；从而治疗所述受试者的肿瘤。
55.治疗与局部缺血相关的疾病或状况的方法，该方法包含：
(a)给受试者施用治疗有效量的设计并构建用于在血管生成细胞亚群中产生血管生成的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
(i)编码促血管生成因子的第一多核苷酸区；和
(ii)第二多核苷酸区，其编码在所述血管生成细胞亚群中指导所述促血管生成因子的表达的顺式调节元件；和
(b)施用至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性；
从而治疗所述受试者中所述局部缺血相关的疾病或状况，
由此上调所述组织中的血管生成，并治疗与局部缺血有关的疾病或状况。
56.下调受试者的组织中血管生成的方法，该方法包含：
(a)在所述组织中表达设计并构建用于在血管生成细胞中的细胞毒性的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
(i)编码自杀基因的第一多核苷酸区，和
(ii)第二多核苷酸区，其编码能够在所述血管生成细胞中指导所述自杀基因的表达的顺式调节元件；和
(b)给受试者施用至少一种选择的血管生成调节剂，该调节剂能以协同方式进一步增强所述顺式调节元件的活性；
由此下调所述组织中的血管生成。
57.权利要求50-56中任一项的方法，其中所述核酸构建体另外包含条件复制型腺病毒。
58.权利要求57的方法，另外包含至少一种能增加所述腺病毒的拷贝数的化合物。
59.权利要求58的方法，其中所述化合物是皮质类固醇和/或N-乙酰半胱氨酸。
60.权利要求50-56中任一项的方法，其中所述血管生成调节剂是除了波生坦以外的内皮素受体拮抗剂。
61.权利要求51的方法，其中所述核酸序列编码促血管生成因子，且其中所述疾病或状况与减少的血管生成有关。
62.权利要求51的方法，其中所述核酸序列编码血管生成抑制剂，且其中所述疾病或状况与过度血管生成有关。
63.权利要求52-54中任一项的方法，另外包含施用所述配体结合结构域的配体。
64.权利要求56的方法，其中选择的所述自杀基因能将前药转化成毒性化合物，后者能造成所述血管生成细胞的细胞毒性或凋亡。
65.权利要求56和64中任一项的方法，另外包含前药，当所述前药被所述自杀基因转变为毒性化合物时，该前药能造成所述血管生成细胞的细胞毒性或凋亡。
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