CN101437799B - p38MAP激酶抑制剂 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及一系列氨基酸和氨基酸酯化合物，含有其的组合物，其制备方法及其药物用途，即作为p38MAP抑制剂来治疗自身免疫和炎症性疾病，包括类风湿性关节炎、牛皮癣、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、多发性硬化、糖尿病、特应性皮炎、移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮等。
背景技术
白细胞(包括单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞)的异常活动可导致细胞因子如TNF-α、IL1-β和IL-8的产生量增加，这是包括类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘和牛皮癣在内的炎症性疾病的病理特征。炎症细胞产生细胞因子是由于响应多种外部刺激引起的，从而导致多种胞内信号转导机制的活化。其中显著的是有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)超家族，它由高度保守的信号转导激酶组成，这些激酶调控细胞生长、分化和应激反应。哺乳动物细胞含有至少三个MAPK家族：p42/44胞外信号调控的激酶(ERK)MAPK、c-JunNH2-端激酶(JNKs)和p38MAPK(也称作p38a/Mpk2/RK/SAPK2a/CSBP1/2)。p38MAPK在被鉴定为一种用脂多糖(LPS)刺激单核细胞后会酪氨酸磷酸化的激酶，其随后首次被克隆[Han等，Science1994，265，808]。还描述了其它哺乳动物p38的同源物，包括p38β[Jiang等，J.Biol.Chem，1996，271，17920]、p38γ[Li等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1996，228，334]和p38δ[Jiang等，J.Biol.Chem.1997，272，30122]。虽然p38α和p38β是普遍表达的，p38γ则主要限于骨骼肌，而p38δ在肺和肾中优势表达。
宿主防御细胞释放细胞因子以及白细胞对细胞因子和其它促炎性刺激的应答，均在不同程度上受到p38MAPK的调控[Cuenda等，FEBS Lett，1995，364，229-233]。在其它细胞类型中，p38MAPK控制应激反应，例如支气管上皮细胞经TNF-α刺激产生IL-8，LPS-刺激的内皮细胞中细胞粘附分子ICAM-1上调。p38MAPK 活化后，可通过双重特异性激酶MKK3和MKK6使TGY位点双重磷酸化，从而使转录因子和其它激酶磷酸化而发挥作用。已鉴定MAP激酶活化的蛋白激酶-2(MAPKAPK-2)是p38的磷酸化位点。已证明缺乏MAPKAP-K2的小鼠[Kotlyarov等，Nat.Cell Biol.1999，1，94-97]在响应LPS/半乳糖胺介导的内毒素休克时TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IFN-γ的释放水平下降。这些细胞因子以及COX-2的调控水平是mRNA水平。TNF-α水平是通过TNF-αmRNA中富含AU元件的3’-UTR对其翻译控制而调控的，而MAPKAP-K2信号转导可促进TNF-αmRNA的翻译。MAPKAP-K2信号转导导致COX-2、IL-6和巨噬细胞炎性蛋白的mRNA稳定性提高。MAPKAP K2具有位于其C末端的核定位信号和核输出信号作为其自身抑制域的一部分，从而决定了p38MAPK的细胞定位及其信号转导途径[Engel等，EMBO J.1998，17，3363-3371]。在应激细胞中，MAPKAP-K2和p38MAPK从核迁移到胞质中，该迁移仅在p38MAPK具有催化活性时才发生。研究者认为这种迁移是由p38MAPK磷酸化引起的MAPKAP-K2核输出信号的暴露所驱动的[Meng等，J.Biol.Chem.2002，277，37401-37405]。此外，p38MAPK直接或间接导致多种介导炎症反应的转录因子的磷酸化，包括ATF1/2(活化转录因子1/2)、CHOP-10/GADD-153(生长停滞和DNA损伤可诱导基因153)、SAP-1(血清反应因子辅助蛋白-1)和MEF2C(肌细胞增强因子-2)[Foster等，Drug News Perspect.2000，13，488-497]。
已证明在几种情况下，通过小分子抑制p38MAPK活性有利于治疗多种细胞因子分泌异常所介导的疾病，包括类风湿性关节炎、COPD、哮喘和脑缺血。该特征是几篇综述的主题[Salituro等，Current Medicinal Chemistry，1999，6，807-823；Kumar等，Nature Revi ews Drug Di scovery 2003，2，717-726]。
已有实验表明p38的抑制剂在类风湿性关节炎动物模型中有效，例如胶原诱导的关节炎大鼠模型[Revesz等，Biorg.Med.Chem.Lett.，2000，10，1261-1364]和佐剂诱导的关节炎大鼠模型[Wadsworth等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1999，291，1685-1691]。在胰腺炎诱导的肺损伤小鼠模型中，用p38MAPK抑制剂预处理减少了呼吸道和肺水肿中TNF-α的释放[Denham等，Crit.Care Med.，2000，29，628and Yang et al，Surgery，1999，126，216]。在卵清蛋白(OVA)致敏的过敏性消化道炎症模型小鼠中，于卵清蛋白激发前抑制p38MAPK可减少消化道内细胞因子和炎症细胞的聚集[Underwood等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，2000，293，281]。 在炎性肠病的患者中可见p38MAP激酶活性提高[Waetzig等，J.Immunol，2002，168，5432-5351]。已有实验表明p38MAPK抑制剂在心脏肥大大鼠模型[Behr et al，Circulat ion，2001，104，1292-1298]和局灶性脑缺血大鼠模型中[Barone et al，J.Pharmacol.Exp.Ther.，2001，296，312-321]有效。
我们现在发现了一组化合物，它们是p38MAPK(p38α、β、γ和δ)及其同功酶和剪接变体，特别是p38α、p38β和p38β2有效的和选择性的抑制剂。因此，该化合物可用作药物，例如用于治疗和预防本文所述的免疫和炎性疾病。该化合物的特征在于分子内存在可通过胞内羧酸酯酶水解的氨基酸酯基基序或氨基酸基序(motif)。本发明的化合物具有亲脂性的氨基酸酯基序，可穿过细胞膜，并由胞内羧酸酯酶水解成酸。极性的水解产物不能轻易穿过细胞膜，从而在细胞内聚集。因此，细胞内化合物的p38MAP激酶活性被延长并增强。本发明的化合物与国际专利申请WO03076405中所述的p38MAP激酶抑制剂相关，但由于本发明的化合物具有上述氨基酸酯基序，因此与其不同。
具体实施方式
根据本发明，提供了式(I)的化合物：
其中：
G是-N＝或-CH＝；
D是任选取代的二价单-或双环芳基或杂芳基，具有5-13个环成员；
R6是氢或任选取代的C1-C3烷基；
P代表氢，U代表式(IA)基团；或U代表氢，P代表式(IA)基团；
-A-(CH2)z-X1-LI-Y-NH-CHR1R2 (IA)
其中
A代表任选取代的二价单-或双环碳环或杂环基，具有5-13个环成员；
z是0或1；
Y是键、-C(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)NR3-、-C(＝S)-NR3、-C(＝NH)NR3或-S(＝O)2NR3-，其中R3是氢或任选取代的C1-C6烷基；
L1是式(Alk1)m(Q)n(Alk2)p-的二价基团，其中：
m，n和p分别是0或1，
Q是(i)任选取代的二价单-或双环碳环或杂环基，具有5-13个环成员，或(ii)，条件是当m和p均为0时，为式-X2-Q1-或-Q1-X2-，其中X2是-O-，S-或NRA-，其中RA是氢或任选取代的C1-C3烷基，Q1是任选取代的二价单-或双环碳环或杂环基，具有5-13个环成员，
Alk1和Alk2分别代表任选取代的二价C3-C7环烷基，或任选取代的直链或支链C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基、或C2-C6亚炔基(alkynylene)，其任选的含有或以醚(-O-)、硫醚(-S-)或氨基(-NRA-)连接终止，其中RA是氢或任选取代的C1-C3烷基，和
X1代表键；-C(＝O)；或-S(＝O)2-；-NR4C(＝O)-；-C(＝O)NR4-；-NR4C(＝O)NR5-；-NR4S(＝O)2-或-S(＝O)2NR4-；其中R4和R5分别是氢或任选取代的C1-C6烷基。
R1是羧基(-COOH)，或可以被一种或多种胞内酯酶水解成羧酸基团的酯基；和
R2是天然或非天然α-氨基酸的侧链。
式(I)化合物可以制备成盐的形式，特别是其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、及其溶剂化物。任何本文所要求、或所称的“本发明的化合物”、“本发明有关的化合物”、“式(I)化合物”等包括这些化合物的盐、N-氧化物、水合物和溶剂化物。
虽然上述定义可能包括高分子量的分子，优选根据药物化学实践的一般原理，本发明的化合物的分子量应不大于600。
在本发明的另一个大方面，提供了如上所述的式(I)化合物，或其N-氧化物、盐、水合物或溶剂化物在制备可抑制p38MAP激酶活性的组合物时的用途。
本发明的化合物可用于在体外或体内抑制p38MAP激酶活性。
在本发明的一个方面，本发明的化合物可用于制备一种治疗自身免疫或炎症性疾病的组合物，特别是那些上文所述的p38MAP激酶活性起作用的疾病。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗上述疾病类型的方法，包括对患有这些疾病的患者施用有效量的如上定义的式(I)的化合物。
术语
术语“酯”或“酯化羧基”表示基团RXO(C＝O)-，其中Rx是酯的特征性基团， 理论上衍生自醇RxOH。
如本文所用的术语“(Ca-Cb)烷基”，其中a和b是整数，指具有a到b个碳原子的直链或支链烷基。因此例如当a是1、b是6时，术语包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。
本文所用的术语“二价(Ca-Cb)亚烷基”，其中a和b是整数，指具有a到b个碳原子和两个不饱和价键的饱和烃链，。
本文所用的术语“(Ca-Cb)链烯基”，其中a和b是整数，指具有a到b个碳原子和至少一个可适用E或Z立体化学的双键的直链或支链烯基。术语包括例如乙烯基、丙烯基(allyl)、1-和2-丁烯基和2-甲基-2-丙烯基。
本文所用的术语“二价(Ca-Cb)亚链烯基”指具有a到b个碳原子、至少一个双键和两个未饱和价键的烃链。
本文所用的术语“(Ca-Cb)炔基”，其中a和b为整数，指具有a到b个碳原子和另一个三键的直链或支链烃基。术语应包括例如乙炔基、1-丙炔基、1-和2-丁炔基、2-甲基-2-丙炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基和5-己炔基。
本文所用的术语“二价(Ca-Cb)亚炔基”，其中a和b是整数，指具有a到b个碳原子和至少一个三键的二价烃链。
本文所用的术语“碳环”指单-、双-或三环基团，其最多具有16个环原子，且均为碳原子；术语还包括芳基和环烷基。
本文所用的术语“环烷基”指具有3-8个碳原子的单环饱和碳环基团，并包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
本文所用的术语“芳基”指单-、双-或三环碳环芳基，包括具有两个直接通过共价键连接的单环碳环芳环的基团。这些基团的例子是苯基、联苯基和萘基。
本文所用的无限制术语“杂芳基”指含有一个或多个选自S、N和O的杂原子的单-、双-或三环芳基，还包括含有两个这样的单环的基团、或一个这样的单环和一个单环芳环的基团，两基团间通过共价键直接连接。这样的基团的例子是噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吡咯基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噻唑基、苯并异噻唑基、吡唑基、噁唑基、苯并噁唑基、异噁唑基、苯并异噁唑基、异噻唑基、三唑基、苯并三唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吲哚基、吲唑基。
本文所用的无限制术语“杂环基”或“杂环”包括如上定义的“杂芳基”，其非芳族意义中涉及单-、双-、或三环非芳族基团，其含有一个或多个选自S、N 和O的杂原子，以及由一个含有一个或多个这样的杂原子的单环非芳族基团与另一个这样的基团或单环碳环基共价连接所组成的基团。这些基团的例子是吡咯基、呋喃基、噻吩基、哌啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、嘧啶基、哌嗪基、吲哚基、吗啉基、苯并呋喃基、吡喃基、异噁唑基、苯并咪唑基、亚甲基二氧苯基、亚乙基二氧苯基、马来酰亚氨基和琥珀酰亚氨基。
“二价亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基、或亚吡嗪基”是具有两个不饱和价键的苯、吡啶、嘧啶或吡嗪环，包括1，3-亚苯基、1，4-亚苯基和如下：
除非在文中出现时另外说明，如用于本文中任何基团，术语“取代的”意味着被多达4个相容的取代基取代，每个单独可以是例如(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、羟基、羟基(C1-C6)烷基、巯基、巯基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷硫基、苯基、卤代(包括氟、溴和氯)、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、腈基(-CN)、氧代、-COOH、-COORA、-CORA、-SO2RA、-CONH2、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、-SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、-NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2OH、-NRBSO2ORA、-NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARB、或-NRACONRARB，其中RA和RB分别是(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、苯基或具有5或6个环原子的单环杂芳基、“任选取代的”可以是上述取代基之一。
术语“天然或非天然α-氨基酸侧链”指式具有NH2-CH(RY)-COOH结构式的天然或非天然氨基酸中的基团RY。
天然α-氨基酸的侧链的例子包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、5-羟基赖氨酸、4-羟基脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、α-氨基己二酸、α-氨基-正丁酸、3，4-二羟基苯丙氨酸、高丝氨酸、α-甲基丝氨酸、鸟氨酸、哌可酸和甲状腺素。
在其特征性侧链中含有功能性取代基，例如氨基、羧基、羟基、巯基、胍基、咪唑基、或吲哚基的天然α-氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。当本发明化合物的R2是这些侧链之一时，功能性取代基可被任意保护。
当用于天然α-氨基酸侧链中的功能性取代基时，术语“被保护”意味着该取代基的一个衍生物，它基本是非功能性的。例如，羧基可以被酯化(例如作为C1-C6烷基酯)、氨基可以转化成酰胺(例如作为NHCOC1-C6烷基酰胺)或羧酰胺(例如作为NHC(＝O)OC1-C6烷基或NHC(＝O)OCH2Ph羧酰胺)，羟基可以转化成醚(例如OC1-C6烷基或O(C1-C6烷基)苯基醚)或酯(例如OC(＝O)C1-C6烷基酯)，和硫醇基团可以转化成硫醚(例如叔丁基或苄基硫醚)或硫酯(例如SC(＝O)C1-C6烷基硫酯)。非天然α-氨基酸侧链的例子包括下文讨论的适用于本发明化合物的R2基团中所述的那些。
本文所用的术语“盐”包括碱加成、酸加成和季铵盐。酸性的本发明的化合物可以与碱，例如碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠和钾)；碱土金属氢氧化物(例如氢氧化钙、钡和镁)；有机碱(例如N-甲基-D-葡糖胺、三(羟甲基)氨基甲烷胆碱、L-精氨酸、L-赖氨酸、N-乙基哌啶、二苄胺等)形成盐，包括药学上可接受的盐。碱性的式(I)化合物可以与无机酸，例如氢卤酸(例如盐酸或氢溴酸)、硫酸、硝酸或磷酸等；有机酸，例如乙酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苹果酸、水杨酸、柠檬酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、苯甲酸、苯磺酸、谷氨酸、乳酸和扁桃酸等形成盐，包括药学上可接受的盐。对合适的盐的综述可见Stahl和Wermuth的“Handbookof Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use”《药用盐手册：性质、选择及使用》(威利-VCH，德国威汉姆(Wiley-VCH，Weinheim，Germany)，2002)。
本文所用的术语“溶剂化物”描述一种分子复合物，它含有本发明的化合物和化学计量的一种或多种药学上可接受的溶剂分子，例如乙醇。当所述溶剂为水时，使用术语“水合物”。
由于不对称碳原子的存在，含有一个或多个实际或可能手性中心的本发明的化合物可能以对映体或多种非对映异构体的形式存在，在每个手性中心具有R或S立体化学。本发明包括所有这些对映体、非对映异构体及其混合物。
如上所述，本发明的酯可被胞内酯酶转化成羧酸。这些酯和羧酸本身都可能具有p38MAP抑制活性。本发明的化合物因此不仅包括酯，还包括对应的羧酸水解产物。
本发明关注的化合物中：
基团D
D是任选取代的二价单-或双环芳基或杂芳基，具有5-13个环成员。现在优选B是任选的苯基或任选取代的吡啶基。优选的B上的取代基包括氯、氟、甲基、甲氧基、和三氟甲基，例如当B是2，4-二氯苯基时。
取代基R6
R6是氢或任选取代的C1-C3烷基。目前优选R6是氢或甲基。
P/U区域异构体
目前优选P是氢，而U是如上定义的式(IA)的基团。
基团A
在式(IA)的基团中，目前优选A是任选取代的1，4-亚苯基。在这种情况下，优选的任选取代基包括氟和氯。A还可以是任何下列基团，其可被任选取代：
其中Z1是NH，S或O。
本发明化合物的特别优选的亚基由式(IIA)，(IIB)和(IIC)中的那些组成：
其中R11＝F，R12＝H，R13＝H，R14＝H；或
R11＝F，R12＝F，R13＝H，R14＝H；或
R11＝F，R12＝H，R13＝F，R14＝F；或
R11＝F，R12＝F，R13＝F，R14＝F；或
R11＝F，R12＝F，R13＝F，R14＝H
和其中z，X1，L1，Y，R1和R2的定义如上式(I)所述，并如下进一步阐述。
基团-Y-L1-X1-[CH2]z-
该基团(或键)是从特定的化学策略产生的，其被选择用于连接氨基酸酯基序R1CH(R2)NH-和环系统A。毫无疑问，用于该连接的化学策略可大相径庭，因此可能存在变量Y，L1，X1和z的许多种组合。变量的精确组合组成了氨基酸酯基序和环系统A之间的连接化学，这种组合常常与整个化合物的主要结合模式无关。在另一方面，这种连接化学有时会与酶发生额外的结合作用。还应注意到当氨基酸酯基序和环系统A之间的连接不是细胞内肽酶活性的底物(肽酶可能会将氨基酸从分子上切下)时，能最大程度发挥氨基酸酯基序的益处(易于进入细胞、在细胞内被酯酶水解，并在细胞内积聚活性羧酸水解产物)。当然，通过将化合物与破碎细胞的内含物一起培育，并分析任何这样的氨基酸切割，可容易地测得胞内肽酶的稳定性。
考虑前面的一些观察结果，依次分析组成-Y-L1-X1-[CH2]z-基团的变量：
z可以是0或1，因此连接到环系统A上的亚甲基是可任选的；
当不需要巨噬细胞选择性时，Y的特别优选的例子包括-(C＝O)-，-(C＝O)NH-，和-(C＝O)O-；当需要巨噬细胞选择性时，任何其它的Y的选项，包括当Y是键时，都是 合适的。
在基团L1中，Alk1和Alk2基团的例子(如存在)包括：
-CH2-，-CH2CH2-，-CH2CH2CH2-，-CH2CH2CH2CH2-，-CH＝CH-，-CH＝CHCH2-，-CH2CH＝CH-，CH2CH＝CHCH2-C≡C-，-C≡CCH2-，CH2C≡C-，和CH2C≡CCH2。Alk1和Alk2的其它例子包括-CH2W-，-CH2CH2W-，-CH2CH2WCH2-，-CH2CH2WCH(CH3)-，-CH2WCH2CH2-，-CH2WCH2CH2WCH2-和-WCH2CH2-，其中W是-O-，-S-，-NH-，-N(CH3)-，或-CH2CH2N(CH2CH2OH)CH2-。Alk1和Alk2的其它例子包括二价环丙基、环戊基和环己基。
在L1中，当n是0时，该基团是烃链(可任选的被取代，并可能具有醚、硫醚或氨基连接)。目前优选在L1中没有任选取代基。当m和p都是0时，L1是二价单-或双环碳环或杂环基团，具有5-13个环原子(可任选被取代)。当n是1且m和p中至少有一个是1时，L1是二价基团，包括一条或多条烃链，和具有5-13个环原子(可被任意取代)单-或双环碳环或杂环基团。如果Q存在，则可以是例如二价苯基、萘基、环丙基、环戊基、或环己基，或具有5-13个环成员的单-或双环杂环基团，例如哌啶基、哌嗪基、吲哚基、吡啶基、噻吩基、或吡咯基，但目前优选的是1，4-亚苯基。
特别是，在本发明的一些实施方式中，L1、m和p可以是0，而n是1。在其它实施方式中，n和p可以是0而m是1。在其它实施方式中，m、n和p可以都是0。在还有其它实施方式中，m可以是0，n可以是1，而Q可以是单环杂环基团，而p可以是0或1。若Alk1和Alk2存在，则其可以选自-CH2-，-CH2CH2-和-CH2CH2CH2-，而Q可以是1，4-亚苯基。
基团-Y-L1-X1-[CH2]z-的特别例子包括-C(＝O)-和-C(＝O)NH-以及-(CH2)v-，-(CH2)vO-，-C(＝O)-(CH2)v-，-C(＝O)-(CH2)vO-，-C(＝O)-NH-(CH2)w-，-C(＝O)-NH-(CH2)wO-
其中v是1，2，3或4，而w是1，2或3，例如-Y-L1-X1-[CH2]z-，是-CH2-，-CH2CH2-，-CH2CH2CH2-，-CH2CH2CH2CH2-，-CH2O-，-CH2CH2O-，-CH2CH2CH2O-，-CH2CH2CH2CH2O-，-C(＝O)-CH2-，-C(＝O)-CH2O-，-C(＝O)-NH-CH2-，或-C(＝O)-NH-CH2O-。
基团R1
在本发明的一类化合物中，R1是羧酸基团。虽然该类化合物可以羧酸或其盐的形式施用，优选的是相应的化合物(其中R1是酯基)在细胞中经胞内酯酶的作用产 生其羧酸或盐形式。
本发明的化合物中的酯基R1应当可被一种或多种胞内羧酸酯酶水解成羧酸基团。能将本发明化合物的酯基水解成对应酸的胞内羧酸酯酶包括三种已知的人同工型酶hCE-1，hCE-2和hCE-3。虽然它们被视为主要的酶，其它酶(例如二苯基水解酶BPH)也可能在酯基的水解中发挥作用。通常认为，如果羧酸酯酶能将游离氨基酸酯水解成原来的酸，它也能水解与抑制剂共价偶联的酯基序。因此，本文所述的破碎细胞和/或分离羧酸酯酶的实验可以直接、迅速和简便地对需要水解的酯基进行初级筛选。然后，用该方法选择的酯基序与抑制剂通过所选的偶联化学方法偶联后，可以用相同的羧酸酯酶实验重新测试，以确保其在该背景下仍然是羧酸酯酶的底物。
根据其应可被胞内羧酸酯酶水解的要求，具体酯基R1的例子包括式-(C＝O)OR14，其中R14是R8R9R10C-，其中
(i)R8是氢或任选取代的(C1-C3)烷基-(Z1)a-[(C1-C3)烷基]b-或(C2-C3)链烯基-(Z1)a-[(C1-C3)烷基]b-，其中a和b分别是0或1，而Z1是-O-，-S-，或-NR11-，其中R11是氢或(C1-C3)烷基；而R9和R10分别是氢或(C1-C3)烷基-；
(ii)R8是氢或任选取代的R12R13N-(C1-C3)烷基-，其中R12是氢或(C1-C3)烷基，而R13是氢或(C1-C3)烷基；或R12和R13与和它们结合的氮一起形成任选取代的具有5或6个环原子的单环杂环，或具有8-10个环原子的双环杂环系统，而R9和R10分别是氢或(C1-C3)烷基-；或
(iii)R8和R9与和它们结合的碳原子一起形成具有3-7个环原子的单环碳环，或具有8-10个环原子的双环碳环，而R10是氢。
在该分类中，R10往往是氢。R14的特定例子包括甲基、乙基、正或异丙基、正、仲或叔丁基、环己基、烯丙基、苯基、苄基、2-，3-或4-吡啶基甲基，N-甲基哌啶-4-基，四氢呋喃-3-基或甲氧基乙基。目前优选的是R14是环戊基。
已知巨噬细胞可通过释放细胞因子，尤其是TNFα和IL-1，在炎症疾病中发挥关键作用(van Roon etal，Arthritis and Rheumatism，2003，1229-1238)。在类风湿性关节炎中，它们是维持关节炎症和关节破坏的主要原因。巨噬细胞也参与肿瘤生长和发育(Naldini and Carraro，Curr Drug Targets Inflamm Allergy，2005，3-8)。因此选择性针对巨噬细胞增殖的药物可能在癌症和自身免疫疾病的治疗中有价值。通过靶向特定的细胞类型可减少副作用。本发明人发明了一种将p38激酶抑制剂靶向至巨噬细胞的方法，该方法的依据是：酯酶基序与p38激酶抑制剂的连接方式将决定它是否被水解，从而决定它是否在不同细胞类型中聚集。特别是， 发现了巨噬细胞含有人羧酸酯酶hCE-1，而其它细胞不含。在通式(I)中，当酯酶基序R1CH(R2)NH-上的氮原子不直接与羰基(-C(＝O)-)连接时，即当Y不是-C(＝O)，-C(＝O)O-或-C(＝O)NR3-基团时，该酯仅能被hCE-1水解，因此抑制剂仅在巨噬细胞中聚集。在本文中，除非特别限定为“单核细胞”，术语巨噬细胞应被用于指巨噬细胞(包括肿瘤相关巨噬细胞)和/或单核细胞。
氨基酸侧链R2
根据酯基R1应当可被胞内羧酸酯酶水解的要求，侧链基团R2不是关键的。
氨基酸侧链的例子包括：
C1-C6烷基，苯基，2，-3-，或4-羟苯基，2，-3-，或4-甲氧基苯基，2，-3-，or4-吡啶基甲基、苄基、苯基乙基、2-，3-，或4-羟基苄基，2，-3-，或4-苄氧基苄基，2，-3-，或4-C1-C6烷氧基苄基，和苄氧基(C1-C6烷基)-基团；
天然α-氨基酸的特征性基团，其中任何官能团都可以被保护；
基团-[Alk]nR6，其中Alk是(C1-C6)烷基或(C2-C6)链烯基，其中可任选的插入一个或多个-O-，或-S-原子或-N(R7)-基团[其中R7是氢原子或(C1-C6)烷基]，n是0或1，而R6是可任选取代的环烷基或环烯基；
在苯环内被式-OCH2COR15取代的苄基，其中R15是羟基、氨基、(C1-C6)烷氧基、苯基(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基氨基、二((C1-C6)烷基)氨基、苯基(C1-C6)烷基氨基，氨基酸或卤代酸的残基、其酯或酰胺衍生物，所述残基通过酰胺键连接，所述氨基酸选自甘氨酸、α-或β-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸；
杂环(C1-C6)烷基，杂环中不被取代或被下列基团单-或二取代：卤素、硝基、羧基、(C1-C6)烷氧基、氰基、(C1-C6)烷酰基、三氟甲基(C1-C6)烷基、羟基、甲酰基、氨基、(C1-C6)烷基氨基、二-(C1-C6)烷基氨基、巯基、(C1-C6)烷硫基、羟基(C1-C6)烷基、巯基(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基苯基甲基；和
基团-CRaRbRc，其中：
Ra，Rb和Rc各自分别是氢、(C1-C6)烷基、(C2-C6)链烯基、(C2-C6)炔基、苯基(C1-C6)烷基、(C3-C8)环烷基；或
Rc是氢，Ra和Rb各自分别是苯基或杂芳基，例如吡啶基；或
Rc是氢，(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基，(C2-C6)炔基，苯基(C1-C6)烷基，或(C3-C8) 环烷基，以及Ra、Rb与和它们连接的碳原子一起形成3-8元碳环或5-6元杂环；或
Ra、Rb和Rc与和它们结合的碳原子形成三环(例如金刚烷基)；或
Ra和Rb各自分别是(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基，(C2-C6)炔基，苯基(C1-C6)烷基，或如下定义为Rc的基团(除了氢)，或Ra、Rb与和它们结合的碳原子一起形成碳环或杂环，Rc是氢，-OH，-SH，卤素，-CN，-CO2H，(C1-C4)全氟烷基，-CH2OH，-CO2(C1-C6)烷基，-O(C1-C6)烷基，-O(C2-C6)链烯基，-S(C1-C6)烷基，-SO(C1-C6)烷基，-SO2(C1-C6)烷基，-S(C2-C6)链烯基，-SO(C2-C6)链烯基，-SO2(C2-C6)链烯基或基团-Q2-W，其中Q2代表键或-O-，-S-，-SO-或-SO2-，W代表苯基，苯基烷基，(C3-C8)环烷基，(C3-C8)环烷基烷基，(C4-C8)环烯基，(C4-C8)环烯基烷基，杂芳基或杂芳基烷基，其中基团W可任选的被一个或多个选自下列的取代基取代，包括羟基、卤素、-CN，-CO2H，-CO2(C1-C6)烷基，-CONH2，-CONH(C1-C6)烷基，-CONH(C1-C6烷基)2，-CHO，-CH2OH，(C1-C4)全氟烷基，-O(C1-C6)烷基，-S(C1-C6)烷基，-SO(C1-C6)烷基，-SO2(C1-C6)烷基，-NO2，-NH2，-NH(C1-C6)烷基，-N((C1-C6)烷基)2，-NHCO(C1-C6)烷基，(C1-C6)烷基，(C2-C6)链烯基，(C2-C6)炔基，(C3-C8)环烷基，(C4-C8)环烯基，苯基或苄基。
特定R2基团的例子包括氢(甘氨酸“侧链”)、苄基、苯基、环己基甲基、环己基、吡啶-3-基甲基、叔丁氧基甲基、异丁基、仲丁基、叔丁基、1-苄硫基-1-甲基乙基、1-甲硫基-1-甲基乙基、1-巯基-1-甲基乙基和苯基乙基。目前优选的R2基团包括苯基、苄基、异丁基、环己基和叔丁氧基甲基。
对于本发明的可全身给药的化合物，优选具有缓慢羧酸酯酶切割速率的酯，因为它们较不容易被系统前代谢。其完整地达到靶组织的能力因此得到提高，而酯可在靶组织的细胞内被转化成酸产物。然而，对于局部给药，酯被直接施用到靶组织，或通过例如吸入靶向到该处时，常常要求酯具有迅速的酯酶切割速率，从而尽可能减少系统性药物暴露和随后的不良副作用。在本发明的化合物中，如果α-氨基酸酯上邻近α碳原子的碳被单取代，即R2是CH2Rz(Rz是单取代基)，那么酯相比碳被二取代或三取代时更易于被迅速切开，例如R2是苯基或环己基的情况。
如上所述，本发明涉及的化合物是p38MAK激酶活性的抑制剂，因此能用于治疗p38MAP激酶活性相关的疾病，例如牛皮癣、炎症性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、多发性硬化、糖尿病、特应性皮炎、移植物抗宿主病、或系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎。
应理解任何具体病人的具体剂量水平应视各种因素而定，包括使用的特定化合物的活性、患者年龄、一般健康状况、性别、饮食、给药次数、给药途径、排泄速率、药物组合以及需治疗的具体病症的严重程度。最佳剂量水平和给药频率应通 过临床试验决定。
本发明涉及的化合物可被制成具有任何给药途径的剂型，且与其药代动力学特性一致。可口服的组合物的形式可以是片剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，锭剂，液体或凝胶制品，例如口服、局部或无菌注射溶液或悬浮液。供口服给药的片剂或胶囊可采用单位剂型，并可含有传统辅料，如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填料，例如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；压具润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；崩解剂，例如马铃薯淀粉，或可接受的润湿剂如月桂基硫酸钠。可按照常规制药实践中熟知的方法对片剂进行包衣。口服液体制剂的形式可以是，例如，水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者是干燥产品，在使用前用水或其它合适的介质复溶。这种液体制剂可含有常规的添加剂，如悬浮剂，例如山梨糖醇、糖浆、甲基纤维素、葡萄糖浆、明胶、氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、山梨糖醇酐单油酸酯或阿拉伯胶；非水性介质(可包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、油性酯如甘油、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，需要的话还可含有常规的调味剂或着色剂。
为用于皮肤局部给药，可将药物制成霜剂、洗剂或软膏剂。可能用于药物的霜剂或软膏剂处方是本领域熟知的常规处方，例如标准药物教科书如《英国药典》(British Pharmacopoeia)中描述的配方。
为通过吸入局部施用，可将药物制成通过气雾剂递送，例如通过压力驱动的喷雾器或超声喷雾器，或者优选通过推进剂驱动的计量式气雾剂或者不采用推进剂给予微粉化粉末，例如吸入型胶囊或其它“干粉”递送系统。这种吸入配方中可含有辅料，例如推进剂(例如，在计量式气雾剂中为Frigen)、表面活性物质、乳化剂、稳定剂、防腐剂、调味剂和填料(例如，在干粉吸入器中为乳糖)。为了达到吸入的目的，大量装置都是适用的，这些装置能产生最佳粒度的气溶胶并采用适合患者的吸入技术进行给药。为给予经过计量的气溶胶，尤其是采用干粉吸入器时，除了采用适配器(间隔物(spacer)、扩展器)、梨形容器(例如
)以及发射吹入喷雾的自动装置
以外，许多技术方案都是适用的(例如， 或者例如欧洲专利申请EP0505321中描述的吸入器)。
为用于眼部局部给药，可用合适的水性或非水性无菌介质配制药物溶液或悬浮液。也可含有添加剂，例如，缓冲剂，如偏亚硫酸氢钠或依地酸二钠；防腐剂，包括杀菌剂和杀真菌剂如醋酸苯汞或硝酸苯汞、苯扎氯铵或氯己定；以及增稠剂， 如羟丙甲纤维素。
也可采用无菌介质肠胃外给予活性成分。根据所用介质和浓度，药物可悬浮或溶解在介质中。有利地，佐剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可溶于该介质。
合成
有多种合成策略可用来合成本发明所涉及的化合物(I)，但它们都依赖于已知的化学方法并为合成有机化学家所知晓。因此可按照标准文献中描述的并为精通本领域的技术人员所熟知的方法合成式(I)中的化合物。典型的文献来源有“高级有机化学(Advanced organic chemistry)”，第四版(Wiley)，J March，“综合有机转化(Comprehensive Organic Transformation)”，第二版(Wiley)，R.C.Larock，“杂环化学手册(Handbook of Heterocyclic Chemistry)”，第二版(Pergamon)，A.R.Katritzky)，例如在“Synthesis”、“Acc.Chem.Res.”、“Chem.Rev”中的综述文章，或者通过标准在线文献检索找到的第一文献来源或来自诸如“Chemical Abstracts”或“Beilstein”等第二文献来源中找到的论文。
本发明的化合物可通过许多下文概述的方法制备而得，并在随后的实施例中进行更具体的阐述。在下文所述的反应中，有必要对活性官能团进行保护，例如羟基、氨基和羧基(它们应在终产物中得到)，以避免它们参与不必要的反应[见例如Greene，T.W.，“化学合成中的基团保护(Protect ing Groups in OrganicSynthesis)”，John Wiley and Sons，1999]。可将常规的保护基团和标准方法联合使用。在一些情况下，去保护可以是合成通式(I)化合物的最后步骤，下文所述的本发明的方法应理解能延伸到这种去除保护基团上。
列出了可用于合成通式(I)的化合物的这些方法的例子，但不限于下面流程1所示的反应。
流程1
如此，以三氟乙酸的二氯甲烷溶液处理通式(2a)的羧酸叔丁酯可以制备通式(A)的氨基酯。以WO03/076405和本文参考文献所述的方法可以制备通式(2)的中间物。在式(2a)的化合物的合成过程中，通式(2b)的氨基酯可以作为副产物形成，其经三氟乙酸处理后可得到通式(B)的化合物。
可根据流程2所示的方法制备通式(5)的中间物酯。
流程2
硝基苄基中间物(6)在THF中和钯碳催化剂上被氢化，得到通式(5)的胺。对应的胺与羧酸二叔丁氧酯在惰性溶剂，例如THF中，于室温下反应可制得式(6)的中间物。式(8)的氨基酯在4-硝基苄基溴的作用下烷基化，可制得通式(7)的中间物。上述反应可在二烷基酰胺溶剂，例如DMF中进行，同时有无机碱，例如碳酸钾或碳酸铯的参与。这种反应列于马氏高级有机化学(March’s Advanced OrganicChemistry)[约翰威利父子(John Wiley and Sons)，1992]。
流程3列出了合成通式(9)的N-苄基氨基酸酯的另一种通用方法，其中需要进一步对苄基取代基上的芳基环进行官能化。
流程3
在本发明的另一个方面，可通过但不限于流程3列出的反应制备通式(9)的氨基酸酯。因此，通式(11)的苄腈(可以是市售的，或可通过本领域技术人员熟知的方法轻易制备)经合适的金属氢化物，例如DIBAL-H还原，并对中间物亚胺进行酸水解，可以转化成通式(10)的对应的苯甲醛[见例如LeBel J.Am.Chem.Soc.，1964，86，3759]。可通过在还原型烷基化条件下，使用硼氢化(borohydride)试剂，例如NaBH3CN或NaBH(OAc)3在酸性条件下，在质子溶剂，例如甲醇中与所述苯甲醛反应，制备通式(9)的N-苄基氨基酸酯[见例如Borsch等，J.Am.Chem.Soc.，1971，93， 2897]。
流程4
在本发明的另一个方面，根据流程4中列出的方法，使通式(12)的甲磺酸酯与通式(8)的中间物反应进行烷基化，可以制得通式(C)的化合物。烷基化反应可以在惰性醚溶剂，例如THF中，在碘化钠和无机碱，例如碳酸钾的存在下进行。本领域技术人员理解对应的烷基化溴或烷基化氯可以用于该反应。使伯醇(13)和甲磺酰氯在惰性溶剂，如二氯甲烷中，在有机碱，例如三乙胺的存在下反应，制备甲磺酸酯(12)。通式(14)的化合物可以根据WO03/076405和本文的参考文献所述的方法制备。
在本发明的另一个方面，可通过但不限于流程5所述的反应制备通式(D)的化合物。
流程5
因此，可用合适的经保护的环烷醇衍生物，例如1，4-二氧杂螺[4，5]癸-8-醇(1，4-dioxaspiro[4，5]decan-8-ol)，在三苯膦和氮杂二羧酸二烷酯(例如DEAD)的惰性醚溶液中对通式(14)的醇进行烷基化[见例如Mitsunobu等，Bull.Chem.Soc.Jpn.，1967，40，2380]。可在酸性水溶液条件下除去通式(16)缩酮的保护基，生成对应的酮。在硼氢化试剂，例如氰基硼氢化钠和三乙氧基硼氢化钠存在时，在酸条件下，用通式(8)的氨基酸酯处理可得到式(16)化合物的还原型胺化物(reductive amination)，即通式(D)的化合物。
在本发明的另一个方面，可通过但不限于流程6的反应制备通式(E)的化合物。
流程6
可在硼氢化试剂，例如氰基硼氢化钠和三乙氧基硼氢化钠的存在下，在酸性条件下用二苄胺处理，可以得到式(22)化合物的还原型胺化物，即通式(21)的化合物。氢化(21)，并随后与硫光气反应可得到通式(20)的异氰酸酯。使(20)与对应的苯乙酮在叔丁醇钠的作用下反应，可制得通式(19)的化合物。化合物(19)和碘乙烷可在无机碱，例如碳酸钾的作用下，在溶剂，例如丙酮中反应，进行烷基化。通式(18)的化合物可经过环化、氧化，然后用氨取代得到通式(17)的缩酮。随后，可在酸性水溶液中使通式(17)的缩酮去保护，得到对应的环己酮中间物。环己酮随后可以与通式(8)的氨基酸酯在硼氢化试剂，例如氰基硼氢化钠和三乙氧基硼氢化钠的作用下，在还原型胺化条件下反应。
在本发明的另一个方面，可通过但不限于流程7中列出的方法制备通式(F)的氨基酸。
流程7
因此，例如通式(C)的氨基酸酯可以经氢氧化钠或氢氧化钾水溶液、或任何合适的碱处理，于室温下，在共溶剂，例如甲醇或乙醇中，被水解成对应的氨基酸(F)。
在本发明的另一方面，可通过但不限于流程8的方法制备通式(G)的氨基酸。
流程8
因此，以通式(23)的甲磺酸酯对通式(8)的中间物进行烷基化，可制得通式G的氨基酯。可在惰性醚溶剂，例如THF中，在碘化钠和无机碱，例如碳酸钾的存在下进行烷基化。使伯醇(24)和甲磺酰氯在惰性溶剂，例如二氯甲烷中，和在有机碱，例如三乙胺的存在下反应，可制得甲磺酸酯(23)。可通过在酸性条件(例如HCl)下脱去中间物(25)的乙酰保护基，制备醇(24)。可用WO 03/076405和本文的参考文献所述的类似方法制备通式(4)、(25)和(26)的中间物。
下列实施例阐明了本发明。所有温度为℃。使用了下列缩写：
MeOH＝甲醇
EtOH＝乙醇
EtOAc＝乙酸乙酯
Boc＝叔丁氧羰基
CDI＝1，1’-羰基二咪唑
DCM＝二氯甲烷
DMF＝二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲亚砜
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
Na2CO3＝碳酸钠
HCl＝盐酸
DIPEA＝二异丙基乙胺
NaH＝氢化钠
NaOH＝氢氧化钠
NaHCO3＝碳酸氢钠
Pd/C＝钯碳
TME＝叔丁基甲基醚
N2＝氮气
Na2SO4＝硫酸钠
Et3N＝三乙胺
NH3＝氨
TMSCl＝三甲基氯硅烷
TBME＝叔丁基甲基醚
NH4Cl＝氯化铵
LiAlH4＝氢化锂铝
MgSO4＝硫酸镁
nBuLi＝正丁基锂
CO2＝二氧化碳
EDCI＝N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐
Et2O＝乙醚
LiOH＝氢氧化锂
HOBt＝1-羟基苯并三唑
ELS＝蒸发光散射
TLC＝薄层层析
ml＝毫升
g＝克
mg＝毫克
mol＝摩尔
mmol＝毫摩尔
LCMS＝高效液相色谱/质谱
NMR＝核磁共振
RT＝室温
用CEM Discover聚焦微波反应器进行微波辐射。用GenVac SeriesI不经加热除去溶剂；或配用VacRamp的Genevac SeriesII在30℃下除去溶剂；或Buchi旋转蒸发器除去溶剂。以快速层析柱法纯化化合物，选用Silicycle的硅胶，粒径40-63
μm(230-400目)。以制备级HPLC纯化化合物，在Gilson系统上进行。色谱柱为反向ThermoHypersil-Keystone Hyperprep HS C18柱(12微米，100x21.2毫米)；色谱条件为：梯度为20-100％B(A为水/0.1％TFA，B为乙腈/0.1％TFA)，经9.5分钟，流速为30ml/分钟，进样溶剂2:1DMSO:乙腈(1.6ml)，UV检测波长为215nm。
以Bruker400MHz AV或Bruker300MHz AV核磁共振仪记录1H NMR谱，溶剂为氘代溶剂。化学位移(δ)为百万分之一。在Ki eselgel 60F254(Merck)板上进行薄层层析(TLC)分析，并在UV光下观察。
分析级HPLCMS在Agi lent HP1100，Waters600或Waters1525LC系统上进行，使用反向Hypersil BDS C18柱(5微米，2.1x50毫米)，梯度为0-95％B(A为水/0.1％TFA，B为乙腈/0.1％TFA)，经2.10分钟，流速为1.0ml/min。以Gilson G1315A二极管阵列检测器，G1214A单波长UV检测器，Waters2487双波长UV检测器，Waters2488双波长UV检测器，或Waters2996二极管阵列UV检测器在215nm下记录UV图谱。在m/z150-850范围内，采样速率为每1秒两次扫描，或每1.2秒一次扫描时，使用具有Z-喷雾界面的Micromass LCT或具有Z-喷雾或MUX界面的Micromass LCT记录质谱。用OpenLynx和OpenLynx Browser软件拟合并记录数据。
中间物
中间物1A(S)-2-[(4-氨基苄基)-叔丁氧基羰基氨基]-4-甲基戊酸环戊酯
将(S)-2-[叔丁氧基羰基-(4-硝基苄基)氨基]-4-甲基戊酸环戊酯(3.8g， 8.74mmol)溶于EtOH(100ml)中，然后加入Pd/C(10％湿重)催化剂(100mg)，并在球囊压力和室温下氢化反应18小时。反应混合物以硅藻土垫过滤，蒸干，得到粉色固体(3.15g，产率89％)。LCMS纯度100％，m/z 405[M+H]+。
作为该反应起始物质的氨基甲酸硝基苄酯是如下制备的：
将(S)-(4-硝基苄基)氨基]-4-甲基戊酸环戊酯(15.8g，47.4mmol)溶于THF(250ml)中，然后加入碳酸钾(7.58g，56.9mmol)和水(150ml)。加入二碳酸二叔丁酯(15.5g，71.1mmol)，反应混合物于50℃加热18小时。减压浓缩反应混合物，以除去挥发物，得到的水相剩余物，用EtOAc(200ml)提取。用0.1M HCl(150ml)，饱和NaHCO3水溶液和水(150ml)连续洗涤EtOAc层。以Na2SO4干燥有机层，过滤并浓缩至干。经快速柱层析法(10％EtOAc/己烷)纯化后，分离产物(9.36g，产率46％)。LC purity 94％，m/z 435[M+H]+。
该过程中所用的硝基苄基氨基起始物质是如下制备的：：
将4-硝基苄基溴(11g，50mmol)溶于DMF(180ml)中，加入碳酸钾(13.6g，99mmol)，然后加入L-亮氨酸环戊酯(中间物8)(16g，43mmol)。反应物室温搅拌18小时。用EtOAc(500ml)稀释剩余物，并用水洗涤3次(每次100ml)，以Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到粗产物(15.8g)，它无需进一步纯化即可用于下一步反应。LCMS纯度60％，m/z 335[M+H]+。
下列化合物以相似方式制备：
中间物1B(S)-2-[(4-氨基苄基)-叔丁氧基羰基氨基]-3-苯基丙酸环戊酯
LCMS纯度75％，m/z 439[M+H]+。
中间物1C(S)-[(4-氨基苄基)-叔丁氧基羰基氨基]-苯基乙酸环戊酯
LCMS纯度100％，m/z 425[M+H]+。
中间物1D(S)-2-[(4-氨基-3，5-二氟苄基)-叔丁氧基羰基氨基]-4-甲基戊酸环戊酯
将2(S)-[(4-氨基-3，5-二氟苄基)氨基]-4-甲基戊酸环戊酯(2.54g粗产物，约5.73mmol)溶于THF(25ml)和水(25ml)的混合溶液中。加入K2CO3(5.15g， 37.3mmol)和Boc2O(8.14g，37.2mmol)，并在室温下持续搅拌18小时。减压除去挥发物，剩余水层用EtOAc(50ml)提取。以Na2SO4干燥有机层，过滤并减压浓缩。以快速柱层析法(5％EtOAc/庚烷)纯化，得到N-叔丁基-氧羰基保护的产物(1.0g，40％).LCMS纯度89％m/z 441[M+H]+。
作为该反应起始物质的苄基氨基羧酸甲酯如下制备：
向4-氨基-3，5-二氟苯甲醛(0.90g，5.73mmol)的1/1MeOH/DMF(16ml)溶液中加入L-亮氨酸环戊酯(中间物8)(3.19g，8.59mmol)和K2CO3(1.19g，8.59mmol)。滴加冰醋酸调节反应混合物pH至5-6，搅拌1小时，加入NaCNBH3(0.72g，11.46mmol)。室温继续搅拌18小时。浓缩反应混合物除去MeOH，用EtOAc(20ml)稀释，用NaHCO3(5ml)和水(10ml)依次洗涤。以Na2SO4干燥有机层，过滤并真空浓缩，得到粗产物(2.54g)，其无需纯化即可用于下一步反应。LC纯度＝68％.
作为该反应起始物质的苯甲醛如下制备：
0℃时，于搅拌状态向4-氨基-3，5-二氟苄腈(2.0g，12.98mmol)的甲苯(16ml)的溶液中滴加DIBAL(1.5M的甲苯溶液)。反应混合物加热至室温，继续搅拌2小时。滴加10％柠檬酸水溶液(10ml)终止反应。加入EtOAc(50ml)和饱和酒石酸钾钠水溶液(罗谢尔(氏)盐)(30ml)，混合物剧烈搅拌20分钟。分离有机层，以水(10ml)洗涤，Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干，得到淡黄色固体(1.9g，93％)。LCMS纯度92％，m/z 158[M+H]+。
以类似方式制备下列化合物：
中间物1E(S)-2-[(4-氨基-3，5-二氟苄基)-叔丁氧基羰基氨基]-3-苯基丙酸环戊酯
LCMS纯度86％，m/z 475[M+H]+。
中间物1F(S)-2-[(4-氨基-3，5-二氟苄基)-叔丁氧基羰基氨基]-苯基乙酸环戊酯
LCMS纯度86％，m/z 461[M+H]+。
中间物2A(S)-[叔丁氧基羰基-(-4{[3-(4-氟苯基)-3-氧代丙酰亚氨基]氨基苄基)氨基苯基乙酸环戊酯
将3-(4-氟苯基)-3-氧代硫代丙酰亚氨酸4-氯苯酯[WO03/076405](300mg，0.874mmol)、中间物1C(0.41g，0.961mmol)和冰醋酸(3ml)的混合物于80℃搅拌2小时。减压蒸发反应混合物至干，得到粘稠剩余物，加入乙醚(3ml)研磨。通过吸滤收集得到的固体。通过在EtOAc(20ml)和饱和NaHCO3水溶液(10ml)之间分配产物，以中和产物。以Na2SO4干燥有机层，过滤并真空浓缩。产率＝305mg(59％).LCMS纯度＝75％，m/z 588[M+H]+。产物无需进一步纯化即可用于下一步反应。
用类似方式制备了下列起始物质：
中间物2B(S)-2-[叔丁氧基羰基-(4-{[3-(4-氟苯基)-3-氧代丙酰亚氨基]氨基}苄基)氨基]-3-苯丙酸环戊酯
来自中间物1B，LCMS纯度76％，m/z 602[M+H]+.
中间物2C(S)-2-[叔丁氧基羰基-(4-{[3-(4-氟苯基)-3-氧代丙酰亚氨基]氨基}苄基)氨基]-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物1A，LCMS纯度55％，m/z 568[M+H]+。
中间物2D(S)-[叔丁氧基羰基-(-4-[3-(2，4-氟苯基)-3-氧代丙酰亚氨基]氨基苄基)氨基苯基乙酸环戊酯
来自中间物1C，LCMS纯度76％，m/z 606[M+H]+。
中间物2E(S)-2-[叔丁氧基羰基-(4-{[3-(2，4-二氟苯基)-3-氧代丙酰亚氨基]氨基}苄基)氨基]-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物1B，LCMS纯度78％，m/z 620[M+H]+。
中间物2F(S)-2-[叔丁氧基羰基-(4-{[3-(2，4-二氟苯基)-3-氧代丙酰亚氨基]氨基}苄基)氨基]-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物1A，LCMS纯度76％，m/z 586[M+H]+。
中间物2G(S)-[叔丁氧基羰基-(-4-[3-(3-甲基-4-氟苯基)-3-氧代丙酰亚氨基]氨基苄基)氨基苯基乙酸环戊酯
来自中间物1C，LCMS纯度77％，m/z 602[M+H]+。
中间物2H(S)-2-[叔丁氧基羰基-(4-{[3-(3-甲基-4-氟苯基)-3-氧代丙酰亚氨基]氨基}苄基)氨基]-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物1B，LCMS纯度77％，m/z 616[M+H]+。
中间物2I(S)-2-[叔丁氧基羰基-(4-{[3-(3-甲基-4-氟苯基)-3-氧代丙酰亚氨基]氨基}苄基)氨基]-4-甲基丙酸环戊酯
来自中间物1A，LCMS纯度77％，m/z 582[M+H]+。
中间物2J(S)-[叔丁氧基羰基-(3，5-二氟-4-{[3-(4-氟苯基)-3-氧代丙酰亚氨基]氨基}苄基)氨基]苯基乙酸环戊酯
来自中间物1F，LCMS纯度％，m/z 624[M+H]+。
中间物2K(S)-2-[叔丁氧基羰基-(3，5-二氟-4-{[3-(4-氟苯基)-3-氧代丙酰亚氨基]氨基}苄基)氨基]-4-甲基丙酸环戊酯
来自中间物1D，LCMS纯度％，m/z 604[M+H]+。
中间物2L(S)-2-[叔丁氧基羰基-(3，5-二氟-4-{[3-(4-氟苯基)-3-氧代-丙酰亚氨基]氨基}苄基)-氨基]-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物1E，LCMS纯度100％，m/z 638[M+H]+。
中间物2M(S)-2-[叔丁氧基羰基-(3，5-二氟-4-{[3-(2，4-二氟苯基)-3-氧代丙酰亚氨基]氨基}苄基)氨基]-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物1D，LCMS纯度86％，m/z 622[M+H]+。
中间物3A(S)-({4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基}-叔丁氧基羰基氨基)苯基乙酸环戊酯
向中间物2A(305mg，0.52mmol)的MeOH(5ml)溶液中加入丙酸甲酯(70微升，0.78mmol)。混合物于80℃加热3小时。真空浓缩反应混合物，柱层析(30％EtOAc/庚烷)纯化剩余物。产率＝200mg(60％)。LCMS纯度80％，m/z 640[M+H]+。
用相似方式制备了下列化合物：
中间物3B(S)-({4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基}-叔丁氧基羰基氨基)苯基乙酸环戊酯
来自中间物2D，LCMS纯度71％，m/z 658[M+H]+。
中间物3C(S)-({4-[6-氨基-5-(3-甲基-4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基}-叔丁氧基羰基氨基)苯基乙酸环戊酯
来自中间物2G，LCMS纯度73％，m/z 654[M+H]+。
中间物3D(S)-2-({4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基}-叔丁氧基羰基氨基)-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物2B，LCMS纯度64％，m/z 654[M+H]+。
中间物3E(S)-2-({4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-苄基}-叔丁氧基羰基氨基)-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物2E，LCMS纯度59％，m/z 672[M+H]+。
中间物3F(S)-2-({4-[6-氨基-5-(3-甲基-4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-苄基}-叔丁氧基羰基氨基)-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物2H，LCMS纯度87％，m/z 668[M+H]+。
中间物3G(S)-2-({4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基}-叔丁氧基羰基氨基)-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物2C，LCMS纯度82％，m/z 620[M+H]+。
中间物3I(S)-2-({4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基}-叔丁氧基羰基氨基)-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物2F，LCMS纯度84％，m/z 638[M+H]+。
中间物3J(S)-2-({4-[6-氨基-5-(3-甲基-4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基}-叔丁氧基羰基氨基)-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物2I，LCMS纯度90％，m/z 634[M+H]+。
中间物3K(S)-2-({4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苄基}-叔丁氧基羰基氨基)-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物2L，LCMS纯度92％，m/z 690[M+H]+。
中间物3L(S)-2-({4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苄基}-叔丁氧基羰基氨基)-4-甲基丙酸环戊酯
来自中间物2M，LCMS纯度92％，m/z 674[M+H]+。
中间物4A3-{4-[6-氨基-5-(4-氟-3-甲基-苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}甲磺酸丙酯
0℃时，向6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-1-[4-(3-羟基丙氧基)-苯基]-1H-吡啶-2-酮(100mg，0.25mmol)的无水DCM(1ml)悬液中加入甲磺酰氯(21.5微升，0.28mmol)，然后加入Et3N(70微升，0.50mmol)。反应混合物加热至室温，搅拌10-20分钟完成反应，用TLC(5％MeOH/DCM)监控。用DCM(10ml)稀释反应混合物，并以10％柠檬酸(5ml)，饱和NaHCO3水溶液(5ml)和水(5ml)依次洗涤。以Na2SO4干燥DCM层，过滤并真空浓缩。产率＝105mg(88％).LCMS纯度＝79％m/z＝475[M+H]+。该物质无需进一步纯化即可用于下一步反应。
如下制备用作起始物质的醇：
如下所示制备了6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-1-[4-(3-羟基丙氧基)-苯基]-1H-吡啶-2-酮。
6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-1-[4-羟基苯基]-1H-吡啶-2-酮[WO03/076405](0.80g，2.37mmol)，3-溴-1-丙醇(0.23ml，2.60mmol)，K2CO3(1.37g，9.46mmol)和NaI(0.73g，4.86mmol)的混合物的丙酮溶液在氮气保护下，于70℃加热18小时。减压浓缩反应混合物，以水(20ml)重悬，所得固体过滤，并用乙醚(0.5ml)洗涤。产率＝0.8g(85％).LCMS纯度＝96％，m/z 397[M+H]+。
用WO03/076405所述的用于合成对应的4-羟基苯基中间物的方法，以及与制备中间物4A相似的方式制备了下列甲磺酸酯中间物。
中间物4B3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}甲磺酸丙酯
LCMS纯度66％，m/z 461[M+H]+。
中间物4C3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}甲磺酸丙酯
LCMS纯度88％，m/z 479[M+H]+。
中间物4D3-{4-[6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}甲磺酸丙酯
LCMS纯度51％，m/z 511[M+H]+。
中间物4E3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}-甲磺酸丙酯
LCMS纯度72％，m/z 497[M+H]+。
中间物4F3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}甲磺酸丙酯
LCMS纯度81％，m/z 515[M+H]+。
通过4-羟基苯基中间物(如WO03/076405所述)与1-溴-5-氯戊烷反应烷基化，可直接制得下列中间物。
中间物4G6-氨基-1-{4-[(5-氯戊基)氧]-2，6-二氟苯基}-5-(2，4-二氟苯甲酰基)吡啶-2(1H)-酮
氮气保护下，向6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-1-(2，6-二氟-4-羟基苯基)-吡啶-2(1H)-酮(300mg，0.79mmol)的丙酮溶液(6ml)中加入1-溴-5-氯戊烷(0.115ml，0.87mmol，1.1当量)，碘化钠(238mg，1.59mmol，2当量)和碳酸钾(438mg，3.17mmol，4当量)。混合物于70℃加热16小时，然后冷却至室温，在EtOAc(50ml)和水(50ml)之间分配。用MgSO4干燥有机层，过滤并减压浓缩。以柱层析法(30％EtOAc的庚烷溶液)进行纯化，得到标题所述化合物和6-氨基-1-{4-[(5-碘戊基)氧]-2，6-二氟苯基}-5-(2，4-二氟苯甲酰基)吡啶-2(1H)-酮3:2的混合物(142mg)，其不经纯化即可使用。
LC/MS：m/z483，575[M+H]+。
中间物4H6-氨基-1-{4-[(5-氯戊基)氧]-2，6-二氟苯基}-5-(4-氟苯甲酰基)吡啶-2(1H)-酮
氮气保护下，向6-氨基-5-(2，4-氟苯甲酰基)-1-(2，6-二氟-4-羟基苯基)-吡啶-2(1H)-酮(200mg，0.56mmol)的无水DMF溶液(6ml)中加入1-溴-5-戊烷(0.088ml，0.67mmol，1.2当量)和碳酸钾(115mg，0.83mmol，1.5当量)。混合物于40℃加热19小时，然后冷却至室温，用EtOAc(20ml)稀释。用水(3x20ml)和盐水(20ml)洗涤溶液。用MgSO4干燥有机层，过滤并减压浓缩。用柱层析法(20-40％EtOAc的庚烷溶液)纯化，得到黄色固态的标题所述化合物(104mg)，它不经进一步纯化即可使用。
LC/MS：m/z 465[M+H]+.1H NMR(300MHz，CD3OD)δ：7.60(2H，m)，7.53 (1H，d，J＝9.4Hz)，7.33(2H，m)，7.05(2H，m)，5.72(1H，d，J＝9.8Hz)，4.11(2H，t，J＝6.3Hz)，3.68(2H，t，J＝6.5Hz)，1.84-1.77(4H，m)，1.56(2H，m)。
中间物4J2-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-苯基}-甲磺酸乙酯
0℃时向6-氨基-5-(4-氟-3-甲基-苯甲酰基)-1-[4-(2-羟基乙基)-苯基]-1H-吡啶-2-酮(150mg，0.43mmol)的无水DCM悬液(3ml)中加入甲磺酰氯(34微升，0.47mmol)，然后加入Et3N(120微升，0.85mmol)。反应混合物加热至室温，搅拌24小时至反应完成。以DCM(10ml)稀释反应混合物，以10％柠檬酸(5ml、饱和NaHCO3水溶液(5ml)和水(5ml)依次洗涤。以MgSO4干燥DCM层，过滤并真空浓缩。产率＝183mg(粗产物).LCMS纯度＝85％m/z＝431[M+H]+。该物质不经进一步纯化直接用于下一步反应。用作起始物质的醇按下法制备：
将2-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-苯基}-乙酸乙酯(300mg)溶于水(5ml)和浓盐酸(5ml)，100℃加热1小时。然后冷却反应体系，用10ml水稀释并过滤。所得固体减压干燥，得到264mg产物，m/z＝353[M+H]+。
用作起始物质的2-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-苯基}-乙酸乙酯按下法制备：
将丙炔酸(270μl，4.39mmol)和CDI(712mg，4.34mmol)的THF溶液(13ml)从0℃加热至室温，搅拌1.5小时。向该溶液中加入2-(4-{[3-(4-氟苯基)-3-氧代-丙酰亚氨基]-氨基}-苯基)-乙酸乙酯(1g，2.92mmol)的THF溶液(6ml)，然后将反应物在80℃加热最多2小时。冷却和减压蒸发，粗产物置于甲醇(7ml)中超声，过滤，用少量甲醇洗涤。收集白色固体(350mg粗产物)。
用作起始物质的2-(4-{[3-(4-氟苯基)-3-氧代-丙酰亚氨基]-氨基}-苯基)-乙酸乙酯按下法制备：
将3-(4-氟苯基)-3-氧代-硫代丙亚氨酸4-氯苯酯(1g，2.9mmol)和4-氨基苯乙醇(418mg，3.08mmol)溶于乙酸(5ml)，80℃加热24小时。冷却反应物至室温， 减压蒸发。在DCM和Na2CO3之间分配粗剩余物。再用盐水洗涤DCM层，MgSO4干燥，然后减压蒸发。分离产物(1g粗产物)，得乙酰化产物：醇为3:1的混合物。其不经纯化直接用于上述环化反应。产物m/z＝343[M+H]+，醇m/z＝301[M+H]+。
中间物56-氨基-1-[2，6-二氟-4-(4-氧代-环己基氧基)苯基]-5-(4-氟苯甲酰基)-1H-吡啶-2-酮
室温下向6-氨基-1-[4-(1，4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基氧基)-2，6-二氟苯基]-5-(4-氟苯甲酰基)-1H-吡啶-2-酮(0.55g，1.10mmol)的1，4-二噁烷溶液(10ml)中加入2M盐酸(5ml)。继续搅拌18小时。反应完成后，用水(10ml)稀释反应混合物，减压蒸发二噁烷。剩余的水溶液用EtOAc(2x10ml)提取。合并有机相，以Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩至干，得到所需的白色固态酮(0.43g，86％)。LCMS纯度98％，m/z457[M+H]+，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：2.05-2.15(2H，m)，2.25-2.45(4H，m)，2.55-2.70(2H，m)，4.65-4.75(1H，m)，5.85(1H，d)，6.70-6.75(2H，m)，7.05-7.15(2H，m)，7.50-7.65(3H，m)，
用作起始物质的缩酮按下法制备：
室温搅拌下向1，4-二氧杂螺[4.5]癸-8-醇(0.5g，1.45mmol)的THF溶液(1.5ml)中加入6-氨基-1-(2，6-二氟-4-羟基苯基)-5-(4-氟苯甲酰基)-1H-吡啶-2-酮(用WO 03/076405所述方法制备)(0.5g，1.39mmol)和三苯膦(0.38g，1.45mmol)。滴加氮杂二羧酸二异丙酯(0.29ml，1.45mmol)，继续搅拌18小时。蒸干反应混合物，柱层析法纯化，得到白色固态的所需物质(0.55g，79％).LCMS纯度99％，m/z501[M+H]+，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：1.55-1.65(2H，m)，1.75-2.00(6H，m)，3.85-3.90(4H，m，)，4.35-4.40(1H，m)，5.85(1H，d)，6.10-6.20(2H，m)，7.05-7.15(2H，m)，7.45-7.60(3H，m)。
中间物66-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-1-(4-氧代-环己基)-1H-吡啶-2-酮
室温下向6-氨基-1-(1，4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基)-5-(4-氟苯甲酰基)-1H-吡啶-2-酮(664mg，1.78mmol)的1，4-二噁烷(60ml)黄色溶液中加入2M HCl(14ml)。所得黄色溶液室温搅拌24小时，然后用H2O(30ml)稀释并真空浓缩，以除去1，4-二噁烷，得到黄色晶状固体。过滤分离固体，用水洗涤，吹干，得到黄色晶状固体。产率＝479mg，82％.LCMS纯度92％，m/z329[M+H]+，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ：1.90-2.30(8H，m)，5.35(1H，m)，5.65(1H，d)，7.05-7.15(2H，m)，7.30(1H，d)，7.35-7.45(2H，m)，11.45(1H，s)。
在上述过程中用作起始物质的吡啶酮缩醛按下法制备：
室温和氮气下，向1-(1，4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-基)-6-乙基亚磺酰基-5-(4-氟苯甲酰基)-1H-吡啶-2-酮(1.046g，2.42mmol)的0.5M NH3的1，4-二噁烷(30ml)溶液中加入三乙胺(0.74ml，5.31mmol)。所得黄色溶液室温搅拌过夜，然后真空浓缩，得到黄色固体；用TBME研磨，过滤分离并用TBME洗涤，得到淡黄色固体。产率＝802mg，89％.LCMS纯度100％，m/z373[M+H]+，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ:1.90-2.00(6H，m)，2.60(2H，m)，4.15(4H，m)，5.90(1H，d)，7.25(2H，m)，7.55(1H，d)，7.65(2H，m)。
上述过程中所用的亚砜按下法制备：
室温和氮气保护下，向1-(1，4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基)-6-乙基亚磺酰基-5-(4-氟苯甲酰基)-1H-吡啶-2-酮(986mg，2.36mmol)的CH2Cl2黄色溶液(30ml)中加入一份间氯过氧苯甲酸(583mg，2.60mmol)。所得黄色溶液室温搅拌过夜，然后用CH2Cl2(25ml)稀释，用饱和Na2SO3(2x30ml)，饱和NaHCO3(2x30ml)和H2O(30ml)依次洗涤，Na2SO4，过滤并真空浓缩，得到亮黄色油。产率＝1.046g，102％.LCMS纯度96％，m/z 434[M+H]+。
上述过程中所用的硫醚按下法制备：
0℃和氮气保护下，向丙炔酸(0.94ml，15.34mmol)的无水THF(50ml)无色溶液中加入1-氯-N，N-2-三甲基丙烯胺(2.03ml，15.34mmol)。所得无色溶液0℃搅拌2小时，0℃下于5分钟内加入N-(1，4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基)-3-(4-氟苯基)-3-氧代-硫代丙亚氨酸(4.667g，12.79mmol)的无水THF(50ml)溶液。将所得黄色溶液加热至室温，搅拌24小时。真空浓缩反应混合物，得到暗棕色油，用EtOAc(20ml)稀释，室温过夜，得到晶状固体，过滤分离，用庚烷和TBME洗涤。产率＝216mg。滤液真空浓缩，得到棕色固体，将其溶于CH2Cl2(100ml)，用饱和Na2CO3(3x100ml)和H2O(2x100ml)洗涤，Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到棕色油。快速柱层析法(二氧化硅，100％CH2Cl2到30％EtOAc/CH2Cl2)纯化，然后用TBME研磨，得到环化产物。总产率＝986mg，19％.LCMS纯度100％，m/z 418[M+H]+。
上述过程中所用的硫代丙亚氨酸按下法制备：
室温和氮气保护下，向N-(1，4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基)-3-(4-氟苯基)-3-氧代-硫代丙酰胺(18.8g，55.7mmol)的丙酮溶液(200ml)中依次加入K2CO3(16.1g，117mmol)和碘乙烷(6.68ml，83.6mmol)。反应混合物于室温和氮气下搅拌2小时，然后真空浓缩，得到棕色糊，用EtOAc(300ml)溶解，并用H2O(250ml)洗涤。分离有机相，用EtOAc(2x150ml)提取水相。合并有机相，Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩成棕色油。用快速柱层析法(二氧化硅，15％EtOAc/庚烷)纯化，得到黄色油。产率＝9.94g，49％.LCMS纯度94％，m/z 366[M+H]+。
上述方法中使用的硫代丙酰胺按下法制备：
0℃搅拌下，于5分钟内将4-氟乙酰苯酮(6.76ml，55.7mmol)的THF溶液(50ml)缓慢加至KOtBu(6.56g，58.5mmol)的THF悬液(40ml)中。0℃下于5分钟内加入8-异硫氰基-1，4-二氧杂螺[4.5]癸烷(11.1g，55.7mmol)的THF溶液(30ml)，所得混合物0℃搅拌90分钟。反应混合物蒸干，得到暗棕色固体，其在下一步反应中作为粗产物使用。产率＝18.8g，100％.LCMS纯度55％，m/z 338[M+H]+。
上述过程中使用的异硫氰酸酯按下法制备：
室温剧烈搅拌下，向1，4-二氧杂螺[4.5]癸—8-基胺(13.5g，85.9mmol)的CH2Cl2(675ml)和H2O(330ml)溶液中加入碳酸钙(13.75g，137.4mmol)。于5分钟内滴加硫光气(8.5ml，111.6mmol)，加完后，反应混合物室温搅拌2小时。以H2O(600ml)稀释反应混合物，然后以CH2Cl2(300ml)提取。以Na2SO4干燥有机相，过滤并真空浓缩，得到产物。产率＝8.5g，50％.LCMS纯度47％，m/z 200[M+H]+。
上述过程中使用的环己胺按下法制备：
室温下向N，N-二苄基-N-1，4-二氧杂螺[4.5]癸—8-基胺(21.13g，62.7mmol)的EtOH(400ml)的微悬浮液中加入10％Pd(OH)2/C(1g)。所得混合物以H2抽空并吹洗三次，然后置于氢气中(球囊压力)过夜。随后以氮气抽空并吹洗三次，过滤除去催化剂。滤液真空浓缩，得到无色油状胺。产率＝14.34g，99％.LC-MS(ELS检测)纯度100％，m/z 158[M+H]+。
上述过程中使用的二苄胺按下法制备：
室温和氮气保护下，向1，4-二氧杂螺[4.5]癸-8-酮(21.5g，138mmol)的DCE溶液(350ml)中加入二苄胺(27.8ml，145mmol)，并搅拌1小时。10分钟内分步加入三乙酰氧基硼氢化钠(46.7g，220mmol)，加完后，反应物于室温和氮气下搅拌过夜。 依次加入饱和NaHCO3(300ml)和DCM(300ml)，反应混合物搅拌30分钟。分离有机相，以NaHCO3(300ml)，盐水(300ml)洗涤，Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到油。随后加入庚烷研磨，过滤分离，得到白色固体。产率＝30.95g，67％.LCMS纯度100％，m/z 338[M+H]+。
中间物7(S)-2-(叔丁氧基羰基-{3，5-二氟-4-[3-(4-氟苯甲酰基)-6-氧代-1，6-二氢吡啶-2-基氨基]苄基}氨基)-3-苯基丙酸环戊酯
在所述的中间物3K的合成过程中，产生副产物--吡啶酮。LCMS纯度80％，m/z690[M+H]+。
氨基酸酯(中间物8-16)的制备
途径I。用于制备中间物8、9、13、14和15
途径II.用于制备中间物10、11、12和16
制得的中间物：
中间物8 中间物9
中间物 10中间物11
中间物 12中间物13
中间物14 中间物15 中间物16
图1
图1所示化合物的合成
途径I(以中间物9为例)
阶段1-形成酯
0℃下向(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-环己基丙炔酸(5g，19.4mmol)的DMF溶液(50ml)中依次加入环戊醇(8.8ml，97.15mmol)，EDCI(4.09g，21.37mmol)和DMAP(237mg，1.94mmol)。将反应混合物加热至室温，搅拌18小时。真空除去DMF，得到澄清的油，在水和EtOAc之间分离。以MgSO4干燥有机相并真空浓缩。粗产物经柱层析法(25％EtOAc的庚烷溶液)纯化，得到澄清油状产物(14.87g，55％)。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ；7.09(1H，d)，5.08(1H，t)，3.76(1H，t)，1.50-1.85(10H，brm)，1.39(9H，s)，1.00-1.25(9H，br m)。
阶段2-叔丁基去保护，得到(2S)-氨基(环己基)乙酸环戊酯盐酸盐(中间物9)
将阶段1的产物(14.87g，45.69mmol)溶于DCM(100ml)，用4M HCl/二噁烷(22.8ml，91.38mmol)处理，反应混合物室温搅拌24小时。粗混合物经减压浓缩，得到橙色油。加入Et2O后研磨，得到白色沉淀。然后用Et2O洗涤，得到所需的白色粉末状产物(7.78g，65％)。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ；8.45(3H，br s)，5.22(1H，t)，3.28(1H，d)，1.95-1.50(10H，br m)，1.30-0.90(9H，br m)。
途径II(以中间物10为例)
阶段1-形成酯，得到4-甲基苯磺酸(1S)-2-(环戊氧基)-2-氧代-1-苯乙铵(中间物10)
向(S)-苯基甘氨酸(5g，33.1mmol)的环己烷(150ml)浆液中加入环戊醇 (29.84ml，331mmol)和对甲苯磺酸(6.92g，36.4mmol)。反应在Deab-Stark接收器中进行；反应物加热到135℃使其完全溶解。12小时后，将反应物冷却至室温，得到白色固体沉淀。过滤固体，以EtOAc洗涤，减压干燥，得到白色粉末状产物(11.01g，85％)。1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ；8.82(2H，br s)，8.73(1H，br s)，7.47(7H，m)，7.11(2H，d)，5.25(1H，br s)，5.18(1H，m)，2.29(3H，s)，1.87-1.36(8H，m)。
分别用2-茚满醇和α-降冰片代替环戊醇(经途径II)制备了中间物11和12。以相似方式，分别用二甲基氨基乙醇和4-(2-羟基乙基)-吗啉(经途径I)制备了中间物13和14。用市售的Z-Dab(Boc)-OH(N-α-Z-N-γ-Boc-L-2，4-二氨基丁酸)经途径I制备了中间物15。
以上述相似的方式，从相应的市售(R)-氨基酸开始制备上述中间物对应的(R)-氨基酸酯。另外，对应的亮氨酸和苯基甘氨酸叔丁酯是市售的，可在需要时直接使用。
实施例
实施例1(S)-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}苯基乙酸环戊酯
将中间物3A(80mg，0.125mmol)的20％TFA/DCM溶液(5ml)的混合物在室温下搅拌1小时。蒸干反应混合物，经制备级HPLC纯化得到所需产物。产率＝33mg(40％)，LCMS纯度＝100％m/z 540[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：1.21-1.82(8H，m)，4.01-4.14(2H，m)，5.11-5.21(2H，m)，5.64(1H，d)，7.21-7.54(13H，m)，7.62(1H，d)，10.16(2H，br s)。
下列实施例是用与实施例1相似的方式制备的。
实施例2(S)-2-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物3D。LCMS纯度100％，m/z 554[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：1.22-1.83(8H，m)，3.10(1H，m)，4.45(3H，m)，5.19(1H，m)，5.85(1H，d)，7.35-7.74(14H，m)，7.82(1H，br s)，9.96(1H，br s)。
实施例3(S)-2-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物3G。LCMS纯度100％，m/z 520[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：1.10(6H，m)，1.70-2.11(11H，m)，4.14-4.53(3H，m)，5.42(1H，m，CH)，5.90(1H，d)，7.49-7.91(9H，m)，9.83(2H，br s)。
实施例4(S)-{4-[6-氨基-5-(3-甲基-4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}苯基乙酸环戊酯
来自中间物3C，LCMS纯度97％，m/z 554[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.30-1.81(8H，m)，2.25(3H，s)，3.72(2H，s)，4.34(1H，s)，5.08(1H，m)，5.70(1H，d)，7.03-7.38(10H，m)，7.46-7.61(3H，m)。
实施例5(S)-2-{4-[6-氨基-5-(3-甲基-4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物3F。LCMS纯度100％，m/z 568[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：1.09-1.77(8H，m)，2.30(3H，s)，2.95(1H，m)，3.14(2H，s)，4.19-4.42(3H，m)，5.02(1H，m)，5.69(1H，d)，7.19-7.51(11H，m)，7.68(2H，m)，9.79(2H，br s)。
实施例6(S)-2-{4-[6-氨基-5-(3-甲基-4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物3J。LCMS纯度100％，m/z 534[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：0.71(6H，m)，1.32-1.70(11H，m)，2.09(3H，s)，3.72-4.14(3H，m)，5.03(1H，m)，5.50(1H，d)，7.00-7.29(6H，m)，7.46(2H，m)，9.40(2H，br s)。
实施例7(S)-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}苯基乙酸环戊酯
来自中间物3B。LCMS纯度100％，m/z 558[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：1.33-1.89(8H，m)，3.71(2H，m)，4.28(1H，s)，5.04(1H，m)，5.61(1H，d)，6.91(1H，br s)，7.18-7.60(13H，m)，10.05(1H，br s)。
实施例8(S)-2-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物3E.LCMS纯度100％，m/z 572[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：1.08-1.76(8H，m)，2.95(1H，t)，4.11-4.40(3H，m)，4.98(1H，m)，5.68(1H，d)，6.89(1H，br s)，7.13-7.50(12H，m)，7.65(1H，m)，9.64-10.12(2H，br s)。
实施例9(S)-2-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物3I。LCMS纯度100％，m/z 538[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：0.79(6H，m)，1.39-1.78(11H，m)，3.84-4.22(3H，m)，5.10(1H，m)，5.59(1H，d)，6.79(1H，br s)，7.03-7.18(2H，m)，7.21-7.42(4H，m)，7.56(2H，m)，9.54(1H，br s)，9.92(1H，br s)。
实施例10(S)-2-{4-[6-氨基-5-(2，4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苄基氨基}-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物3K。LCMS纯度94％，m/z 591[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：1.20-1.90(10H，m)，3.10(1H，m)，3.50-3.60(2H，m)，4.40-4.50(4H，m)，5.20(1H，m)，5.90(1H，d)，7.35-7.50(7H，m)，7.65-7.70(5H，m)，9.50(1H，br)。
实施例11(S)-2-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苄基氨基}-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物3L。LCMS纯度96％，m/z 574[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)， δ：0.95-1.15(6H，m)，1.65-2.05(11H，m)，4.15-4.25(1H，m)，4.35-4.45(2H，m)，5.35-5.45(1H，m)，5.85(1H，d)，7.10-7.20(2H，m)，7.45-7.55(4H，m)。
实施例12(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(3-甲基-4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-3-苯基丙酸环戊酯
向L-苯丙氨酸环戊酯甲苯磺酸盐(中间物16)(218mg，0.54mmol)，K2CO3(192mg，1.39mmol)，NaI(108mg，0.72mmol)的混合物中加入甲磺酸酯中间物4A(170mg，0.35mmol)的THF溶液(2ml)。用DMF(2ml)稀释反应混合物，70℃搅拌加热18小时。反应混合物冷却至室温，通过减压浓缩除去THF。剩余物以EtOAc(20ml)稀释，并以水(10ml)洗涤，Na2SO4干燥，过滤并蒸干。经制备级HPLC纯化得到所需产物，产率＝57mg，15％。LCMS纯度97％，m/z 612[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.30-2.00(8H，m)，2.30(2H，m)，3.10(1H，m)，3.40(1H，m)，4.25(2H，m)，4.40(1H，m)，5.20(1H，m)，5.85(1H，d)，6.90(2H，m)，7.10(2H，d)，7.20-7.45(7H，m)，7.65(2H，m)，7.75(1H，m)。
下列化合物以相似方式制备。
实施例13(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸环戊酯
来自中间物4E和L-苯基甘氨酸环戊酯甲苯磺酸盐(中间物10)，LCMS纯度96％，m/z 620[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.40-1.65(5H，m)，1.80(2H，m)，1.95(1H，m)，2.30(2H，m)，3.15(1H，m)，3.30(1H，m)，4.25(2H，m)， 5.25(1H，s)，5.40(1H，m)，5.90(1H，d)，6.90(2H，d)，7.30(2H，t)，7.55-7.60(5H，m)，7.65(2H，m)7.75(1H，d)。
实施例14(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸环戊酯
来自中间物4E和L-苯丙氨酸环戊酯甲苯磺酸盐(中间物16)，LCMS纯度97％，m/z 634[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.30-2.00(8H，m)，2.30(2H，m)，3.10(1H，m)，3.40(1H，m)，4.25(2H，m)，4.40(1H，m)，5.20(1H，m)，5.85(1H，d)，6.90(2H，m)，7.10(2H，d)，7.20-7.45(7H，m)，7.65(2H，m)，7.75(1H，m)。
实施例15(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物4E和L-亮氨酸环戊酯(中间物8)，LCMS纯度96％，m/z 600[M+H]+， 1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.10(6H，m)，1.70-2.0(12H，m)，2.30(2H，m)，4.10(1H，m)，4.25(2H，m)，4.40(1H，m)，5.40(1H，m)，5.85(1H，d)，6.90(2H，m).7.10(2H，d)，7.60.(2H，m)，7.65(2H，m)，7.75(1H，m)。
实施例16N-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)-L-亮氨酸乙酯
来自中间物4E和L-亮氨酸乙酯，LCMS纯度98％，m/z 560[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.10-1.20(6H，m)，1.45-1.55(3H，t)，1.65-1.85(2H，m)，1.90-2.00(1H，m)，2.15-2.30(2H，m)，2.85-3.05(2H，m)，3.55(1H，m)，4.35-4.50(4H，m)，6.00(1H，d)，7.10(1H，d)，7.45-7.55(1H，m)，7.80-7.85(1H，m)，7.95(1H，d)。
实施例17(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸环戊酯
来自中间物4D和L-苯基甘氨酸环戊酯甲苯磺酸盐(中间物10)，LCMS纯度100％，m/z 634[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：1.20-1.80(8H，m)，2.0(2H，m)，2.20(3H，m)，2.80-3.00(2H，m)，4.10(2H，m)，5.10(1H，m)，5.30(1H，s)，5.60(1H，d)，6.95(1H，d)，7.20(1H，m)，7.30(1H，m)，7.40-7.50(8H，m)，9.65(1H，m)。
实施例18(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物4D和L-苯丙氨酸环戊酯甲苯磺酸盐(中间物16)，LCMS纯度97％，m/z 648[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.20-1.90(9H，m)，2.25(2H，m)，2.35(3H，s)，3.15(1H，m)，3.45(1H，m)，4.25(2H，m)，4.40(1H，d)，5.20(2H，m)，5.82(1H，d)，6.95(2H，m)，7.20(1H，m)，7.30-7.50(7H，m)，7.75(1H，d)。
实施例19(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物4D和L-亮氨酸环戊酯(中间物8)，LCMS纯度100％，m/z 614[M+H]+， 1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：0.90(6H，m)，1.60-1.70(10H，m)，1.90(2H，m)，2.15(2H，m)，2.30(3H，s)，3.00-3.20(2H，m)，4.10(1H，s)，4.20(2H，m)，5.25(1H，m)，5.70(1H，d)，7.05(1H，d)，7.25(1H，m)，7.40(1H，m)，7.50(1H，m)，7.60(1H，d)。
实施例20(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸环戊酯
来自中间物4F和L-苯基甘氨酸环戊酯甲苯磺酸盐(中间物10)，LCMS纯度91％，m/z 638[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：1.50-2.10(8H，m)，2.30(2H，m)，3.10-3.25(2H，m)，4.33(2H，m)，5.40(1H，m)，5.56(1H，m)，5.90(1H，d)，7.20(1H，d)7.40-7.75(9H，m)，9.85(2H，m).
实施例21(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}-丙基氨基)-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物4F和L-苯丙氨酸环戊酯甲苯磺酸盐(中间物16)。LCMS纯度100％，m/z 652[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：1.10-1.80(9H，m)，2.15(2H，m)，2.95-3.20(2H，m)，4.20(2H，m)，4.40(1H，m)，5.10(1H，m)，5.75(1H，d)，7.06(2H，d)，7.25-7.58(9H，m)，9.34(2H，m)。
实施例22(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物4F和L-亮氨酸环戊酯(中间物8)，LCMS纯度87％，m/z618[M+H]+， 1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：1.0(6H，m)，1.75(9H，m)，1.95(2H，m)，2.20(2H，m)，3.10-3.30(2H，m)，4.16(1H，m)，4.26(2H，m)，5.33(1H，m)，5.80(1H，d)，7.15(2H，d)，7.40-7.65(4H，m)，9.13-9.25(2H，m)。
实施例23(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸环戊酯
来自中间物4B和L-苯基甘氨酸环戊酯甲苯磺酸盐(中间物10)，LCMS纯度95％，m/z584[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.25-1.55(5H，m)，1.60-1.85(3H，m)，2.15(2H，m)，3.00(1H，m)，3.15(1H，m)，4.05(2H，m)，5.10(1H，s)， 5.25(1H，m)，5.70(1H，d)，7.00(2H，m)，7.15(4H，m)，7.40-7.50(7H，m)，7.55(1H，d)。
实施例24(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物4B和L-苯丙氨酸环戊酯(中间物16)，LCMS纯度93％，m/z598[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.50-2.10(8H，m)，2.50(2H，m)，3.35-3.40(1H，m)，3.55-3.70(2H，m)，4.40-4.50(2H，m)，4.60(1H，m)，5.40-5.45(1H，m)，6.05-6.10(1H，d)，7.40-7.65(11H，m)，7.85(2H，m).7.90(1H，m)。
实施例25(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物4B和L-亮氨酸环戊酯(中间物8)，LCMS纯度97％，m/z 564[M+H]+， 1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：0.90(6H，m)，1.60-1.75(10H，m)，1.90(2H，m)，2.15(2H，m)，3.10-3.30(2H，m)，4.10(1H，m)，4.15(2H，m)，5.30(1H，m)，5.70(1H，d).7.15(2H，d)，7.30(2H，d)，7.35(2H，t)，7.50(1H，d)，7.55(1H，m)9.05-30(2H，m)。
实施例26(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基-苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸环戊酯
来自中间物4A和L-苯基甘氨酸环戊酯甲苯磺酸盐(中间物10)，LCMS纯度95％，m/z 598[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：1.302.20(10H，m)，2.30(3H，m)，2.90-3.10(2H，m)，4.15(2H，m)，5.20(1H，m)，5.30(1H，m)，5.70(1H，d)，7.10(2H，d)，7.25-7.40(5H，m)，7.40-7.50(3H，m)，7.55(5H，m)，9.70(2H，m)。
实施例27(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物4A和L-亮氨酸环戊酯(中间物8)，LCMS纯度89％，m/z 578[M+H]+， 1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：0.95(6H，m)，1.55-2.25(12H，m)，2.30(3H，m)，2.75-3.30(2H，m)，4.15(3H，m)，5.25(1H，m)，5.70(1H，d).7.15(2H，d)，7.30-7.40(4H，m)，7.40-7.50(2H，m)。
实施例28(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸环戊酯
来自中间物4C和L-苯基甘氨酸环戊酯甲苯磺酸盐(中间物10)，LCMS纯度99％， m/z 602[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：1.35-2.15(10H，m)，2.90-3.10(2H，m)，4.10(2H，m)，5.25(1H，m)，5.40(1H，m)，5.70(1H，d)，7.10(2H，d)，7.25-7.30(4H，m)，7.40-7.50(2H，m)，7.55(5H，m)，9.70(2H，m)。
实施例29(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-3-苯基丙酸环戊酯
来自中间物4C和L-苯丙氨酸环戊酯甲苯磺酸盐(中间物16)，LCMS纯度99％，m/z 616[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：1.10-1.80(8H，m)，2.20(2H，m)，2.95(1H，m)，3.10-3.30(2H，m)，3.40(2H，m)，4.20(2H，m)，4.40(1H，m)，5.05(1H，m)，5.70(1H，d)，7.15(2H，d)，7.20-7.55(11H，m)，9.70(2H，m)。
实施例30(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物4C和L-亮氨酸环戊酯(中间物8)，LCMS纯度99％，m/z 582[M+H]+， 1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：0.95(6H，m)，1.65-2.15(13H，m)，3.10-3.20(2H，m)，4.15(3H，m)，5.30(1H，m)，5.70(1H，d)，7.15(2H，d)，7.25-7.55(6H，m)，9.24(2H，m)。
实施例31(S)-2-(4-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}环己基氨基)-4-甲基戊酸三氟乙酸环戊酯
将中间物5(120mg，0.263mmol)和L-苯丙氨酸环戊酯甲苯磺酸盐(中间物16)(98mg，0.263mmol)的MeOH(1.2ml)悬液室温搅拌1小时，然后加入NaCNBH3(66mg，1.05mmol)。继续室温搅拌18小时。反应完成后，浓缩反应混合物至干，并在EtOAc(10ml)和水(10ml)之间分配。以Na2SO4干燥有机层，过滤并减压浓缩至干，经制备级HPLC纯化后所需产物--TFA盐。产率＝37mg(18％)。
LCMS纯度97％，m/z 674[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.10-2.20(16H，m)，2.35-2.45(1H，m)，2.70-3.00(2H，m)，3.50-3.55(1H，m)，4.25-4.35(1H，m)，4.95-5.05(1H，m)，5.70(1H，d)，6.75(2H，dd)，7.05-7.25(7H，m)，7.45-7.55(2H，m)，7.65(1H，d)。
下列实施例以相似方式制备：
实施例32(2S)-[(4-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}环己基)氨基](苯基)乙酸环戊酯
来自中间物5(120mg，0.263mmol)和L-苯基甘氨酸环戊酯(中间物10).LCMS纯度97％，m/z 660[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.30-1.80(14H，m)，1.90-2.05(2H，m)，2.35-2.50(1H，m)，4.35-4.45(1H，m)，4.50-4.60(1H，m)，5.05-5.10(1H，m)，5.70(1H，d)，6.75-6.85(2H，m)，7.10-7.15(2H，m)，7.20-7.35(5H，m)，7.45-7.55(2H，m)，7.55-7.60(1H，m)。
实施例33(S)-2-(4-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}环己基氨基)-4-甲基戊酸环戊酯
来自中间物5(120mg，0.263mmol)和L-亮氨酸环戊酯(中间物8)。LCMS纯度100％，m/z 640[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：0.95-1.05(6H，m)，1.50-2.00(16H，m)，2.10-2.35(3H，m)，3.15-3.20(1H，m)，4.00-4.15(1H，m)，4.40and4.75(每个0.5H，m)，5.25-5.35(1H，m)，5.75(1H，d)，6.85-6.95(2H，m)，7.15-7.25(2H，m)，7.55-7.65(2H，m)，7.65-7.70(1H，m)。
实施例34和35(S)-2-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]环己基氨基}-3-苯基丙酸环戊酯
在室温和氮气下，向L-苯丙氨酸环戊酯(89mg，0.38mmol)的无色MeOH溶液(10ml)中加入中间物6(50mg，0.15mmol)，室温搅拌1小时。滴加冰醋酸，以调节pH至6，然后加入NaCNBH3(38mg，0.61mmol)。得到的无色溶液室温搅拌过夜，然后小心地以饱和NaHCO3(20ml)溶液终止反应，并以CH2Cl2(3x15ml)提取。合并有机相，用2M HCl(2x20ml)和盐水(20ml)洗涤，Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩，得到有色膏状固体。快速柱层析法(二氧化硅，40-100％EtOAc/庚烷梯度洗脱)纯化，得到所需物质，其可分离成两种异构体，异构体1(实施例34)是白色固体(产率＝39mg，47％)，LCMS纯度100％，m/z 546[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.40-2.05(16H，m)，2.85-3.10(3H，m)，3.60-3.70(1H，m)，4.55-4.65(1H，m)，5.10-5.20(1H，m)，5.70(1H，d)，7.15-7.40(7H，m)，7.45-7.50(1H，m)，7.50-7.60(2H，m)；异构体2(实施例35)为无色薄膜(产率＝15mg，18％)，LCMS纯 度97％，m/z 546[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.25-1.85(12H，m)，1.95-2.20(2H，m)，2.45-2.95(4H，m)，3.00-3.10(1H，m)，3.65-3.75(1H，m)，4.55-4.65(1H，m)，5.05-5.15(1H，m)，5.65(1H，d)，7.20-7.35(7H，m)，7.40-7.50(1H，m)，7.50-7.60(2H，m)。
实施例36(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸叔丁酯
来自中间物4F和L-苯基甘氨酸叔丁酯，LCMS纯度93％，m/z 626[M+H]+，1HNMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.30(9H，s)，2.15(2H，m)，3.00-3.15(2H，m)，4.06(2H，m)，5.02(1H，s)，5.70(1H，d)，6.75(2H，d)，7.02(2H，m)，7.30-7.50(7H，m)。
实施例37(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}-丙基氨基)-3-苯基丙酸叔丁酯
来自中间物4F和L-苯丙氨酸叔丁酯。LCMS纯度97％，m/z 640[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.25(9H，s)，2.16(2H，m)，3.00(1H，dd)，3.15-3.25(2H，m)，3.35(1H，dd)，4.10(2H，m)，4.20(1H，m)，5.71(1H，d)，6.79(2H，d)，7.02(2H，t)，7.20-7.30(5H，m)，2H(2H，m)。
实施例38(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)-4-甲基丙酸叔丁酯
来自中间物4F和L-亮氨酸叔丁酯，LCMS纯度97％，m/z 606[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：0.95(6H，m)，1.41(9H，s)，1.61(1H，m)，1.75(2H，m)，2.15(2H，m)，3.22-3.25(2H，m)，3.88(1H，m)，4.13(2H，m)，4.20(1H，m)，5.40(1H，s)，5.75(1H，d)，6.85(2H，d)，7.00(2H，t)，7.40(2H，m)。
实施例39(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-4-甲基丙酸叔丁酯
来自中间物4C和L-亮氨酸叔丁酯，LCMS纯度91％，m/z 570[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：0.95(6H，m)，1.45(9H，s)，1.65(1H，m)，2.15(2H，m)，3.15-3.30(2H，m)，3.85(1H，m)，4.15(2H，m)，5.75(1H，d)，7.00-7.20(6H，m)，7.35(2H，m)。
实施例40(2S)-[(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)氨基](苯基)乙酸2，3-二氢-1H-茚-2-酯
来自中间物4F和L-苯基甘氨酸茚满酯(中间物11)，LCMS纯度96％，m/z 686[M+H]+，1H NMR(300MHz，CD3OD)，δ：7.55-7.47(2H，m)，7.46-7.31(5H，m)，7.22-7.10(6H，m)，6.85(2H，d，J＝9.6Hz)，5.82(1H，d，J＝9.6Hz)，5.57-5.51 (1H，m)，4.37(1H，s)，4.13(1H，t，J＝6.0Hz)，3.32-3.21(2H，m)，3.05-2.98(1H，m)，2.80-2.63(3H，m)，2.05-1.97(2H，m)。
实施例41(2R)-[(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)氨基](苯基)乙酸2，3-二氢-1H-茚-2-酯
来自中间物4F和D-苯基甘氨酸茚满酯，LCMS纯度94％，m/z 686[M+H]+，1HNMR(300MHz，CD3OD)，δ：7.56-7.47(2H，m)，7.38-7.31(5H，m)，7.28-7.14(6H，m)，6.85(2H，d，J＝9.6Hz)，5.82(1H，d，J＝9.6Hz)，5.57-5.52(1H，m)，4.37(1H，s)，4.13(1H，t，J＝6.0Hz)，3.31-3.21(2H，m)，3.09-2.99(1H，m)，2.78-2.64(3H，m)，2.06-1.99(2H，m)。
实施例42(2R)-[(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)氨基](苯基)乙酸环戊酯
来自中间物4F和D-苯基甘氨酸环戊酯，LCMS纯度95％，m/z 638[M+H]+。
实施例43(2S)-[(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)氨基](苯基)乙酸二环[2.2.1]庚-2-酯
来自中间物4F和L-苯基甘氨酸降冰片酯(中间物12)，LCMS纯度97％，m/z 664[M+H]+，1H NMR(300MHz，CD3OD)，δ：7.50-7.21(7H，m)，7.02(2H，t，J＝8.6Hz)，6.75(2H，d，J＝9.6Hz)，5.70(1H，d，J＝9.6Hz)，4.50(1H，d，J＝6.6Hz)，4.32-4.26(1H，m)，4.05(2H，t，J＝5.9Hz)，2.71-2.56(2H，m)，2.24-1.90(4H，m)，1.64-1.06(8H，m)。
实施例44(2R)-[(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)氨基](苯基)乙酸二环[2.2.1]庚-2-酯
来自中间物4F和D-苯基甘氨酸降冰片酯，LCMS纯度98％，m/z 664[M+H]+，1HNMR(300MHz，CD3OD)，δ：7.42-7.17(7H，m)，7.00(2H，t，J＝8.6Hz)，6.74(2H，d，J＝9.1Hz)，5.69(1H，d，J＝9.8Hz)，4.49(1H，d，J＝6.8Hz)，4.32-4.26(1H，m)，4.03(2H，t，J＝6.0Hz)，2.70-2.52(2H，m)，2.18-1.86(4H，m)，1.63-0.92(8H，m)。
实施例45(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸叔丁酯
来自中间物4E和L-苯基甘氨酸叔丁酯，LCMS纯度100％，m/z 608[M+H]+，1HNMR(300MHz，CD3OD)，δ：7.55-7.47(3H，m)，7.30-7.21(6H，m)，7.09(1H，t，J＝8.7Hz)，6.61(2H，d，J＝9.3Hz)，5.81(1H，d，J＝9.6Hz)，4.18(1H，s)，4.03(2H，t，J＝6.0Hz)，2.75-2.69(1H，m)，2.65-2.58(1H，m)，1.96-1.88(1H，m)，1.96-1.88(2H，m)，1.32(9H，s)。
实施例46N-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)-L-亮氨酸2-(二甲基氨基)乙酯
来自中间物4F和中间物13，LCMS纯度90％，m/z 621[M+H]+，1H NMR(300MHz，DMSO)，δ：10.18(1H，br s)，9.50(1H，br s)，7.57(1H，q，J＝7.8Hz)，7.39(2H，m)，7.37-7.15(3H，m)，7.04(2H，m)，5.73(1H，d，J＝9.6Hz)，4.59-4.46(2H，m)，4.21(2H，t，J＝9.0Hz)，4.11(1H，m)，3.14(2H，m)，2.86(6H，s)，2.14(2H，m)，1.74(2H，m)，0.92(8H，m)。
实施例47N-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)-L-亮氨酸2-吗啉-4-基乙酯
来自中间物4F和中间物14，LCMS纯度90％，m/z 621[M+H]+，1H NMR(300MHz，DMSO)，δ：7.57(1H，q，J＝7.5Hz)，7.40(2H，m)，7.26-7.17(3H，m)，7.06(2H，d，J＝10.8Hz)，5.74(1H，d，J＝9.9Hz)，4.53(2H，m)，4.21(4H，m)，3.80(4H，m)，3.37(2H，m)，3.17(4H，m)，2.15(2H，m)，1.75(3H，m)，0.94(6H，br s)。
实施例48(2S)-[(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)氨基](环己基)乙酸环戊酯
来自中间物4F和L-环己基甘氨酸环戊酯(中间物9)，LCMS纯度95％，m/z 664[M+H]+，1H NMR(300MHz，DMSO)，δ：9.15(1H，br s)，8.95(1H，br s)，7.62-7.52(1H，m)，7.46-7.31(2H，m)，7.27-7.20(1H，m)，7.05(2H，d，J＝10.2Hz)，5.74(1H，d，J＝9.6Hz)，5.30-5.25(1H，m)，4.20(2H，t，J＝5.7Hz)，4.10-3.95(1H，m)，3.25-2.95(2H，m)，2.20-2.07(2H，m)，2.00-1.50(15H，m)，1.30-1.00(4H，m)，0.95-0.75(1H，m)。
实施例49(2S)-[(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)氨基](环己基)乙酸叔丁酯
来自中间物4F和L-环己基甘氨酸叔丁酯，LCMS纯度95％，m/z 632[M+H]+， 1H NMR(300MHz，DMSO)，δ：9.10(1H，br s)，8.85(1H，brs)，7.62-7.52(1H，m)，7.45-7.31(2H，m)，7.28-7.20(1H，m)，7.06(2H，d，J＝10.2Hz)，5.74(1H，d，J＝9.6Hz)，4.20(2H，t，J＝5.9Hz)，3.95-3.85(1H，m)，3.25-2.95(2H，m)，2.20-2.07(2H，m)，2.00-1.60(6H，m)，1.51(9H，s)，1.35-1.07(4H，m)，1.00-0.85(1H，m)。
实施例50N-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)-D-亮氨酸环戊酯
来自中间物4F和D-亮氨酸环戊酯，LCMS纯度95％，m/z 618[M+H]+，1H NMR(300MHz，DMSO)，δ：10.10(1H，br s)，9.40-9.10(2H，m)，8.15(1H，br s)，7.62-7.52(1H，m)，7.47-7.31(2H，m)，7.28-7.12(1H，m)，7.07(2H，d，J＝10.5Hz)，5.73(1H，d，J＝9.6Hz)，5.30-5.20(1H，m)，4.25-4.00(3H，m)，3.30-3.00(2H，m)，2.20-2.00(2H，m)，1.95-1.80(2H，m)，1.75-1.55(10H， m)，1.00-0.90(6H，m)。
实施例51N-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)-D-亮氨酸叔丁酯
来自中间物4F和D-亮氨酸叔丁酯，LCMS纯度95％，m/z 606[M+H]+，1H NMR(300MHz，DMSO)，δ：9.30-9.00(2H，m)，7.62-7.52(1H，m)，7.47-7.32(2H，m)，7.28-7.12(1H，m)，7.06(2H，d，J＝10.2Hz)，5.73(1H，d，J＝9.6Hz)，4.20(2H，t，J＝5.7Hz)，3.99(1H，br s)，3.25-2.95(2H，m)，2.20-2.05(2H，m)，1.80-1.60(3H，m)，1.49(9H，s)，0.95(6H，d，J＝4.8Hz)。
实施例52(2S)-4-氨基-2-[(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)氨基]丁酸环戊酯
来自中间物4F和中间物15，LCMS纯度90％，m/z 605[M+H]+，1H NMR(300MHz，CD3OD)，δ：7.46-7.55(2H，m)，7.12(2H，t，J＝8.7Hz)，6.93(2H，d，J＝9.6Hz)，5.81(1H，d，J＝9.6Hz)，5.37-5.44(1H，m)，4.20-4.31(4H，m)，3.33-3.42(1H，m)，2.25-2.49(4H，m)，1.91-2.08(2H，m)，1.65-1.89(7H，m)。
实施例53N-(5-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}戊基)-L-亮氨酸环戊酯
来自中间物4G。氮气保护下向6-氨基-1-{4-[(5-氯戊基)氧]-2，6-二氟苯基}-5-(2，4-二氟苯甲酰基)吡啶-2(1H)-酮(138mg，0.29mmol)的无水DMF溶液(3ml)中加入L-亮氨酸环戊酯(中间物8)(284mg，1.43mmol，5当量)，碘化钠(86mg，0.57mmol，2当量)和N，N-二异丙基乙胺(0.052ml，0.29mmol，1当量)。混合物于90℃加热16小时，然后冷却至室温，以EtOAc(25ml)稀释。溶液用水(2x25ml)和盐水(25ml)洗涤。以MgSO4干燥有机层，过滤并减压浓缩。依次经柱层析(3-4％MeOH的DCM溶液)和制备级HPLC纯化，得到有色膏状固体状的标题化合物(96mg，产率52％)。
LC/MS：m/z 646[M+H]+.1H NMR(300MHz，CD3OD)δ：7.56-7.47(2H，m)，7.13(2H，m)，6.88(2H，m)，5.82(1H，d，J＝9.8Hz)，5.23(1H，t，J＝4.1Hz)，4.11(2H，t，J＝6.3Hz)，3.28(1H，m)，2.61-2.51(2H，m)，1.95-1.41，(17H，br m)，0.98-0.93(6H，m)。
实施例54N-(5-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}戊基)-L-亮氨酸叔丁酯
来自中间物4G。氮气保护下，向6-氨基-1-{4-[(5-氯戊基)氧]-2，6-二氟苯基}-5-(2，4-二氟苯甲酰基)吡啶-2(1H)-酮(96mg，0.20mmol)的无水DMF溶液(3ml)中加入L-亮氨酸叔丁酯盐酸盐(198mg，0.99mmol，5当量)，碘化钠(60mg，0.40mmol，2当量)和N，N-二异丙基乙胺(0.072ml，0.40mmol，2当量)。混合物于90℃加热20小时，然后冷却至室温，以EtOAc(20ml)稀释。溶液用水(2x20ml)和盐水(20ml)洗涤。以MgSO4干燥有机层，过滤并减压浓缩。依次经柱层析(1-3％MeOH的DCM溶液)和制备级HPLC纯化，得到白色固态标题化合物(23mg，产率18％)。
LC/MS：m/z 634[M+H]+.1H NMR(300MHz，CD3OD)δ：7.56-7.47(2H，m)，7.14 (2H，m)，6.89(2H，m)，5.81(1H，d，J＝9.6Hz)，4.11(2H，t，J＝6.2Hz)，3.19(1H，m)，2.60-2.53(2H，m)，1.89-1.84(2H，m)，1.72-1.41(16H，m)，0.96(6H，m)。
实施例55N-(5-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}戊基)-L-亮氨酸环戊酯
来自中间物4H。在氮气保护下，向6-氨基-1-{4-[(5-氯戊基)氧]-2，6-二氟苯基}-5-(4-氟苯甲酰基)吡啶-2(1H)-酮(99mg，0.21mmol)的无水DMF溶液(3ml)中加入L-亮氨酸环戊酯(中间物8)(212mg，1.06mmol，5当量)，碘化钠(64mg，0.43mmol，2当量)和N，N-二异丙基乙胺(0.039ml，0.21mmol，1当量)。混合物于90℃加热20小时，然后冷却至室温，以EtOAc(25ml)稀释。用水(2x25ml)和盐水(25ml)洗涤溶液。以MgSO4干燥有机层，过滤并减压浓缩。依次经柱层析(2％MeOH的DCM溶液)和制备级HPLC纯化，得到黄色固态标题化合物(64mg，48％产率)。
LC/MS：m/z 628[M+H]+.1H NMR(300MHz，CD3OD)δ：7.71(1H，d，J＝9.6Hz)，7.62(2H，m)，7.26(2H，m)，6.89(2H，m)，5.81(1H，d，J＝9.6Hz)，5.23(1H，t，J＝5.3Hz)，4.11(2H，t，J＝6.4Hz)，3.28(1H，m)，2.55(2H，m)，1.91-1.48(17H，m)，0.98-0.93(6H，m)。
实施例56N-({4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]苯氧基}乙酰基)-L-亮氨酸环戊酯
LC/MS：m/z 564[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：8.47(1H，d，J＝7.7Hz)，7.56(2H，m)，7.45(1H，d，J＝9.6Hz)，7.38-7.24(4H，m)，7.15(2H，m)， 5.69(1H，d，J＝9.8Hz)，5.09(1H，t，J＝5.3Hz)，4.63(2H，m)，4.31(1H，m)，1.84-1.79(2H，m)，1.66-1.53(9H，m)，0.92-0.86(6H，m)。
氮气保护下，向6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-1-(4-羟基苯基)吡啶-2(1H)-酮[WO03/076405](100mg，0.31mmol)的无水DMF溶液(3ml)中加入N-(溴乙酰基)-L-亮氨酸环戊酯(109ml，0.34mmol，1.1当量)和碳酸钾(51mg，0.37mmol，1.2当量)。混合物于40℃加热16小时，然后冷却至室温，加入水(20ml)。用EtOAc(3x15ml)提取混合物，合并提取物，以水(2x40ml)和盐水(40ml)洗涤。以MgSO4干燥有机层，过滤并减压浓缩。经柱层析(2-3％MeOH的DCM溶液)纯化，然后用最少量的MeOH研磨，得到白色固态标题化合物(91mg，产率52％)。
L-亮氨酸环戊酯经一步法合成N-(溴乙酰基)-L-亮氨酸环戊酯，如下详述。
向L-亮氨酸环戊酯(中间物8)(568mg，2.84mmol)的DCM溶液(6ml)中滴加三乙胺(0.24ml，2.84mmol，1当量)和溴代乙酰氯(1.44ml，3.13mmol，1.1当量)。混合物室温搅拌20小时，以DCM(50ml)稀释，水(50ml)和盐水(50ml)洗涤。以MgSO4干燥有机层，过滤并减压浓缩，得到含有标题化合物的粗混合物(902mg)，其不经进一步纯化即可使用。LC/MS：m/z 320/322[M+H]+。
实施例57N-[2-(4-{6-氨基-5-[(4-氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸环戊酯
来自中间物4J和L-亮氨酸环戊酯(中间物8)。LC/MS：m/z 534[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：8.47(1H，d，J＝7.7Hz)，7.56(2H，m)，7.45(1H，d，J＝9.6Hz)，7.38-7.24(4H，m)，7.15(2H，m)，5.69(1H，d，J＝9.8Hz)，5.09(1H，t，J＝5.3Hz)，4.63(2H，m)，4.31(1H，m)，1.84-1.79(2H，m)，1.66-1.53 (9H，m)，0.92-0.86(6H，m)。
下列实施例以相似的方式合成的：
实施例58N-[2-(4-{6-氨基-5-[(4-氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸叔丁酯
来自中间物4J和L-亮氨酸叔丁酯。LC/MS：m/z 522[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：9.40-9.10(2H，m)，7.59-7.44(5H，m)，7.38-7.30(4H，m)，5.71(1H，d，J＝9.6Hz)，4.00(1H，br s)，3.40-3.28(1H，m)，3.25-3.15(1H，m)，3.10-3.00(2H，m)，1.80-1.70(3H，m)，0.96(6H，d，J＝5.1Hz)。
实施例59N-[2-(4-{6-氨基-5-[(2，4-二氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸环戊酯
实施例59采用与实施例57相似的途径，由3-(2，4-二氟苯基)-3-氧代-硫丙亚氨酸4-氯苯酯合成而得。LC/MS：m/z 552[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：10.07(1H，br s)，9.35(2H，br s)，7.55-6.95(8H，m)，5.72(1H，d，J＝9.9Hz)，5.27(1H，t，J＝5.7Hz)，4.15-4.00(1H，m)，3.41-3.15(2H，m)，3.10-3.00(2H，m)，1.96-1.80(2H，m)，1.78-1.55(9H，m)，0.95(6H，d，J＝5.1Hz)。
实施例60N-[2-(4-{6-氨基-5-[(2，4-二氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸叔丁酯
实施例60采用与实施例57相似的途径，由3-(2，4-二氟苯基)-3-氧代-硫代丙亚氨酸4-氯苯酯合成而得。LC/MS：m/z 540[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：10.07(1H，br s)，9.30(2H，br s)，7.55-6.94(8H，m)，5.72(1H，d，J＝9.6Hz)，4.05-3.93(1H，m)，3.40-3.10(2H，m)，3.08-3.00(2H，m)，1.80-1.65(3H，m)，1.50(9H，s)，0.96(6H，d，J＝5.1Hz)。
实施例61(2S)-{[2-(4-{6-氨基-5-[(4-氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]氨基}(苯基)乙酸环戊酯
来自中间物4J和L-苯基甘氨酸环戊酯(中间物10).LC/MS：m/z 554[M+H]+. 1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：10.35(1H，br s)，7.60-7.13(14H，m)，5.91(1H，d，J＝10.2Hz)，5.22-5.14(1H，m)，4.36(1H，s)，3.00-2.85(4H，m)，2.16(1H，br s)，1.99-1.43(8H，m)。
实施例62(2S)-{[2-(4-{6-氨基-5-[(4-氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]氨基}(苯基)乙酸叔丁酯
来自中间物4J和L-苯基甘氨酸叔丁酯。LC/MS：m/z 542[M+H]+.1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：10.30(1H，br s)，7.51-7.45(3H，m)，7.38(2H，d，J＝6.9Hz)，7.27-7.04(9H，m)，5.82(1H，d，J＝9.6Hz)，4.20(1H，s)，2.86-2.75(4H，m)，2.04(1H，br s)，1.31(9H，s)。
实施例63N-[2-(4-{6-氨基-5-[(4-甲基苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸环戊酯
实施例63是采用与实施例59相似的方法，由3-(4-甲基苯基)-3-氧代-硫代丙亚氨酸4-氯苯酯制备而得，后者采用与中间物4J相似的方法制备而得。LC/MS：m/z530[M+H]+.1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.65(1H，d，J＝9.9Hz)，7.47(4H，m)，7.26(4H，m)；5.89(1H，d，J＝9.9Hz)，5.20(1H，m)，3.25(1H，t，J＝7.2Hz)，2.87(4H，m)，2.44(3H，s)，1.99-1.53(9H，m)，1.42(2H，t，J＝6.3Hz)，0.91(6H，m)。
实施例64N-[2-(4-{6-氨基-5-[(4-甲氧基苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸环戊酯
实施例64是采用与实施例59相似的方法，由3-(4-甲氧基苯基)-3-氧代-硫代丙亚氨酸4-氯苯酯制备而得，后者采用与中间物4J相似的方法制备而得。LC/MS：m/z 546[M+H]+.1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.67(1H，d，J＝9.9Hz)，7.55(2H，d)，7.46(2H，d)，7.24(2H，d，J＝8.4Hz)，6.98(2H，d，J＝6.9Hz)，5.90(1H，d，J＝9.6Hz)，5.18(1H，m)，3.88(3H，s)，3.24(1H，t，J＝7.2Hz)，2.87(4H，m)，1.97-1.53(9H，m)，1.43(2H，t)，0.90(6H，m)。
实施例65N-[2-(4-{6-氨基-5-[(4-氯苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸环戊酯
实施例65采用与实施例59相似的方法，由3-(4-氯苯基)-3-氧代-硫代丙亚氨酸4-氯苯酯制备而得，后者采用与中间物4J相似的方法制备而得。。LC/MS：m/z551[M+H]+.1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.40(7H，m)，7.16(2H，d，J＝8.4Hz)，5.82(1H，d，J＝9.9Hz)，5.11(1H，m)，3.17(1H，t，J＝7.5Hz)，2.78(4H，m)，1.92-1.43(9H，m)，1.35(2H，t)，0.82(6H，dd)。
实施例66N-[3-(4-{6-氨基-5-[(4-氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}-3-氟苯氧基)丙基]-L-亮氨酸环戊酯
实施例66采用与实施例25相似的方法，由6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰其)-1-[2-氟-4-羟基苯基]-1H-吡啶-2-酮[WO03/076405]制备而得。LCMS纯度97％，m/z 582[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：7.57(2H，m)，7.48(1H，d，J＝9.6Hz)，7.34(3H，m)，7.10(1H，dd，J＝11.9，2.3Hz)，7.00(1H，dd，J＝9.7，2.3Hz)，5.70(1H，d，J＝9.6Hz)，5.12(1H，m)，4.11(2H，t，J＝6.2Hz)，3.14(1H，m)，2.68(1H，m)，1.98(1H，m)，1.88-1.82(4H，m)，1.67-1.57(7H，m)，0.88(6H，t，J＝7.2Hz)。
实施例67N-[3-(4-{6-氨基-5-[(4-氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)丙基]-L-亮氨酸环戊酯
实施例61采用与实施例57相似的途径，由3-(4-氨基苯基)-丙-1-醇合成而得。 LC/MS：m/z 548[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：9.13(2H，br s)，7.59-7.52(2H，m)，7.50-7.42(3H，m)，7.39-7.25(4H，m)，5.70(1H，d，J＝9.6Hz)，5.28-5.24(1H，m)，4.04(1H，br s)，3.35-2.85(2H，m)，2.80-2.70(2H，m)，2.10-1.80(4H，m)，1.75-1.55(10H，m)，0.93(6H，d，J＝3.4Hz)。
3-(4-氨基-苯基)-丙-1-醇是由4-硝基肉桂醇经一步法合成得到，如下所示：
氮气保护下，向4-硝基肉桂醇(2g，11.1mmol)的甲醇溶液(30ml)中加入拉内镍(2ml浆液，水为溶剂)。然后向反应物中通氢气，氢气保护下搅拌12小时，以完成反应。反应混合物经硅藻土过滤，甲醇和乙酸乙酯洗涤。过滤，减压浓缩，经柱层析(8:2 EtOAc：己烷)纯化，得到所需的黄色固态产物(1.68g，95％)。
实施例68N
2
-[3-(4-{6-氨基-5-[(2，4-二氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}-3，5-二氟苯氧基)丙基]-L-赖氨酸环戊酯
实施例68采用与实施例52相似的途径，由L-赖氨酸(Z)-环戊酯合成而得。LC/MS：m/z 633[M+H]+.1H NMR(300MHz，CD3OD)δ：7.45-7.54(2H，m)，7.12(2H，t，J＝8.6Hz)，6.93(2H，d，J＝9.8Hz)，5.81(1H，d，J＝9.8Hz)，5.33-5.40(1H，m)，4.25(2H，t，J＝5.1Hz)，4.10-4.16(1H，m)，2.96(2H，t)，2.27-2.35(2H，m)，1.63-2.12(16H，m)。
实施例69N
2
-[3-(4-{6-氨基-5-[(2，4-二氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}-3，5-二氟苯氧基)丙基]-L-赖氨酸叔丁酯
实施例69采用与实施例52相似的途径，由L-赖氨酸(Z)-叔丁酯合成而得。LC/MS：m/z 621[M+H]+.1H NMR(300MHz，CD3OD)δ：7.48(2H，dd，J＝9.7，2.7 Hz)，7.12(2H，t，J＝8.6Hz)，6.88(2H，d，J＝9.2Hz)，5.81(1H，d，J＝9.6Hz)，4.18(2H，t，J＝6.2Hz)，3.15(H，t，J＝6.6Hz)，2.76-2.87(3H，m)，2.68(1H，dt，J＝11.5，6.9Hz)，1.97-2.05(4H，m)，1.64(4H，dt，J＝6.1Hz)，1.01(9H，s)。
实施例70N-[2-(3-{6-氨基-5-[(4-氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸环戊酯
实施例70采用与中间物4J(但使用3-氨基苯乙醇)和L-亮氨酸环戊酯(中间物8)类似的方法合成的。LC/MS：m/z 534[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：9.40-9.00(2H，m)，7.65-7.44(5H，m)，7.38-7.11(4H，m)，5.72(1H，d，J＝9.9Hz)，5.30-5.20(1H，m)，4.10-4.00(1H，m)，3.45-3.15(2H，m)，3.10-3.00(2H，m)，1.95-1.80(2H，m)，1.75-1.55(9H，m)，9.93(6H，d，J＝4.8Hz)。
实施例71(S)-2-{3，5二氟-4-[3-(4-氟苯甲酰基)-6-氧代-1，6-二氢吡啶-2-基氨基]苄基氨基}-3-苯基丙酸环戊酯
将中间物7(20mg)的20％TFA/DCM溶液(0.5ml)室温放置1小时。反应完成后，通温和氮气流，以蒸干反应混合物。加入DCM(0.5ml)，氮气吹气。继续在氮气下干燥过夜。产率＝20mg，98％。
LCMS纯度96％，m/z 590[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：0.75-1.33(8H，m)，2.90(1H，m)，3.50(2H，m)，4.25(3H，m)，4.93(1H，m)，5.70，(1H， m)，5.98(1H，m)，7.15-7.62(11H，m)，9.7(1H，br s)，10.42(0.5H br s)。
实施例72(S)-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}苯基乙酸
向实施例7(100mg，0.179mmol)的THF(1ml)和MeOH(0.5ml)溶液中加入2MNaOH(溶液，1ml)。混合物室温搅拌3小时，蒸发至近干，滴加1M HCl使酸化，以EtOAc(5ml)提取。真空浓缩EtOAc层，得到粗酸。LCMS显示80％产物m/z＝490[M+H]+和20％杂质m/z 470[M+H]+。经制备级HPLC纯化，得到所需产物。产率＝34mg，(31％).LCMS纯度100％，m/z 490[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：3.64(2H，m，CH2)，4.06(1H，s，CH)，5.50(1H，d，Ar)，6.75(1H，br s，NH)，6.96(13H，m，Ar)，9.84(1H，br s，NH)。
下列化合物以相似方式制备：
实施例73(S)-2-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-3-苯基丙酸
来自实施例8。LCMS纯度99％，m/z 504[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：2.96-3.09(3H，m)，3.81(1H，d)，3.98(1H，d)，5.76(1H，d)，7.00(1H，brs)，7.22-7.40(9H，m)，7.41-7.61(4H，m)，10.11(1H，br s)。
实施例74(S)-2-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-4-甲基戊酸
来自实施例9.LCMS纯度91％，m/z 470[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：0.71(6H，m)，1.40(2H，m)，1.60(1H，m)，3.44(1H，m)，3.89(2H，s)，5.49(1H，d)，6.70(1H，br s)，6.94-7.08(2H，m)，7.14-7.33(4H，m)，7.46(2H，m)，9.86(1H，br s)。
实施例75(S)-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}苯基乙酸
来自实施例1。LCMS纯度100％，m/z 472[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：4.13(1H，d)，4.22(1H，d)，5.18(1H，s)，5.73(1H，d)，7.30-7.61(13H，m)，7.73(1H，d)，10.09(2H，br s)。
实施例76(S)-{4-[6-氨基-5-(3-甲基-4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}苯基乙酸
来自实施例4.LCMS纯度86％，m/z 486[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：2.20(3H，s)，3.98(1H，d)，4.06(1H，d)，5.07(1H，s)，5.62(1H，d)，7.12-7.50(12H，m)，7.61(1H，d)，9.90(2H，br s)。
实施例77(S)-2-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-4-甲基戊酸
来自实施例9。LCMS纯度91％，m/z 470[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：0.71(6H，m)，1.40(2H，m)，1.60(1H，m)，3.44(1H，m)，3.89(2H，s)，5.49(1H，d)，6.70(1H，br s)，6.94-7.08(2H，m)，7.14-7.33(4H，m)，7.46(2H，m)，9.86(1H，br s)。
实施例78(S)-2-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-3-苯基丙酸
来自实施例2.LCMS纯度100％，m/z 486[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：3.00(2H，m)，3.98(3H，m)，5.65(1H，d)，7.15-7.34(11H，m)，7.40(1H，d)，7.51(2H，m)。
实施例79(S)-2-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-4-甲基戊酸
来自实施例3.LCMS纯度100％，m/z 452[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：0.81(6H，m)，1.51(2H，m)，1.72(1H，m)，3.95(2H，m)，5.61(1H，d)，7.21-7.30(4H，m)，7.39(1H，d)，7.48(2H，m)，7.52(2H，m)。
实施例80(S)-2-{4-[6-氨基-5-(3-甲基-4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-3-苯基丙酸
来自实施例5.LCMS纯度100％，m/z 500[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：2.33(3H，s)，2.90-3.07(3H，m)，3.76(1H，d)，3.92(1H，d)，5.72(1H，d)，7.20-7.42(9H，m)，7.49(4H，m)。
实施例81(S)-2-{4-[6-氨基-5-(3-甲基-4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苄基氨基}-4-甲基戊酸
来自实施例6.LCMS纯度98％，m/z 500[M+H]+。
实施例82(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-3-苯基丙酸环戊酯
来自实施例24.LCMS纯度93％，m/z 530[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：1.90(2H，m)，2.80-2.90(2H，m)，3.00(2H，m)，3.40(1H，m)，4.05(2H，m)，5.70(1H，d)，7.10(1H，d)，7.20(2H，d).7.30(5H，m)，7.35(1H，d)，7.45(1H，d)，7.60(1H，d)。
实施例83(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(3-甲基-4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-3-苯基丙酸
来自实施例12.LCMS纯度96％，m/z 544[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：2.30(2H，m)，2.40(3H，s)，3.30(1H，m)，4.30(2H，m)，4.45(1H，m)，5.85(1H，d)，5.40(1H，m)，5.85(1H，d)，7.25(2H，d)，7.40-7.55(9H，m)，7.60-7.70(2H，m)。
实施例84(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸
来自实施例28.LCMS纯度82％，m/z 534[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：2.25(2H，m)，3.10(1H，m)，3.25(1H，m)，4.20(1H，m)，5.83(1H，d)，7.15 -7.60(13H，d)。
实施例85(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸
来自实施例25.LCMS纯度100％，m/z 496[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：1.00(6H，m)，1.75-1.90(3H，m)，2.30(2H，m)，3.10-3.30(2H，m)，4.00(1H，m)，4.25(2H，m)，5.85(1H，d)，5.40(1H，m)，5.85(1H，d)，7.20(2H，d)，7.30(2H，d)，7.40(2H，t)，7.55(1H，m)，7.65(2H，m)。
实施例86(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-3-苯基丙酸
来自实施例29。LCMS纯度100％，m/z 548[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：2.15(2H，m)，3.15-3.30(3H，m)，3.35(1H，m)，4.10(2H，m)，4.20(1H，m)，5.65(1H，d)，7.15(2H，d)，7.20-7.35(11H，m)。
实施例87(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基-苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸
来自实施例26。LCMS纯度95％，m/z 530[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)， δ：2.15(3H，s)-2.35(2H，m)，2.85(2H，m)，3.05(2H，m)，4.10(2H，m)，5.25(1H，m)，5.70(1H，d)，4.25(2H，m)，5.85(1H，d)，5.40(1H，m)，5.85(1H，d)，7.10(2H，d)，7.25(2H，d)，7.3(1H，d)，7.35(1H，m)，7.40-7.55(5H，m)，7.60(2H，m)。
实施例88(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸
来自实施例27.LCMS纯度94％，m/z 510[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：0.90(6H，br s)，1.65-1.80(3H，m)，2.1-2.30(3H，s+2H，m)，3.0-3.20(2H，m)，3.90(1H，m)，4.15(2H，m)，5.65(1H，d)，7.15(2H，d)，7.20-7.30(3H，m)，7.30(1H，m)，7.40(1H，d)，7.45(2H，s)。
实施例89S)-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸
来自实施例13。LCMS纯度91％，m/z 552[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：2.10-2.25(2H，br m)，2.80(1H，m)，3.00(1H，m)，4.15(2H，d)，5.20(1H，s)，5.70(1H，d)，5.65(1H，d)，6.95(2H，d)，7.30(2H，t)，7.30(1H，m)，7.40-7.60(8H，m)。
实施例90(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸
来自实施例14.LCMS纯度98％，m/z 566[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：2.35(2H，m)，3.1-3.3(3H，m)，3.50(1H，m)，4.25-4.40(3H，m)，5.80(1H，d)，5.70(1H，d)，7.10(2H，d)，7.30-7.45(7H，m)，7.60-7.70(3H，m)。
实施例91(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸
来自实施例15.LCMS纯度92％，m/z 532[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ：0.95(6H，m)，1.8(3H，m)，2.30(2H，m)，3.10-3.25(2H，m)，3.95(1H，m)，4.25(2H，m)，5.80(1H，d)，7.10(2H，m)，7.40(2H，m)，7.60(1H，m)，7.65(2H，m)。
实施例92(S)-2-{4-[6-氨基-5-(2，4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苄基氨基}-3-苯基丙酸
来自实施例10。LCMS纯度95％，m/z 522[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：3.30(2H，m)，4.15(1H，m)，4.25(2H，m)，5.75(1H，d)，7.15-7.35(9H，m)，5.20(1H，m)，5.90(1H，d)，7.35-7.50(9H，m)，7.55(2H，m)，7.65(1H，d)。
实施例93(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)-3-苯基丙酸
来自实施例18。LCMS纯度92％，m/z 580[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：2.30(2H，m)，2.40(3H，s)，3.15-3.35(4H，m)，3.50(1H，m)，4.30(2H，m)，4.35(1H，m)，5.80(1H，d)，7.10(2H，m)，7.35-7.50(7H，m)，7.55(1H，m)，7.65(1H，m)。
实施例94(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸
来自实施例23。LCMS纯度87％，m/z 516[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：2.25(2H，m)，2.80(1H，m)，3.10(1H，m)，4.15(2H，m)，5.30(1H，s)，5.75(2H，d)，7.15(2H，d)，7.25(2H，d)，7.40(2H，t)，7.50-7.70(7H，m)。
实施例95(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸
来自实施例20。LCMS纯度84％，m/z 570[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：2.30(2H，m)，2.90(1H，m)，3.15(1H，m)，4.23(2H，m)，5.32(1H，s)， 5.85(1H，d)，7.10(2H，d)，7.50(3H，m)，7.60-7.65(6H，m)。
实施例96(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸
来自实施例30。LCMS纯度93％，m/z 514[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：0.95(6H，m)，1.85(3H，m)，2.30(2H，m)，3.15-3.22(2H，m)，3.99(1H，m)，4.21(2H，m)，5.77(1H，d)，7.20(2H，d)，7.30(4H，m)，7.45(1H，m)，7.55(1H，m)。
实施例97(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸
来自实施例22。LCMS纯度88％，m/z 550[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：0.80-0.95(6H，m)，1.50-1.85(3H，m)，1.95-2.10(2H，m)，2.95-3.05(2H，m)，3.75-3.85(1H，m)，4.05-4.15(2H，m)，5.65(1H，d)，7.00(1H，d)，7.10-7.20(1H，m)，7.25-7.30(1H，m)，7.30-7.40(1H，m)，7.45-7.55(1H，m)，7.80-8.25(1H，br s)，9.90-10.20(1H，br s)。
实施例98(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸
来自实施例19。LCMS纯度93％，m/z 546[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：0.95-1.05(6H，m)，1.55-1.75(2H，m)，1.80-1.90(1H，m)，2.10-2.25(2H，m)，2.35(3H，s)，3.00-3.15(2H，m)，3.70(1H，m)，4.15-4.30(2H，m)，5.80(1H，d)，7.10(1H，d)，7.25-7.35(1H，m)，7.40-7.45(1H，m)，7.50-7.55(1H，m)，7.55-7.65(1H，m)，8.90-10.70(2H，br s)。
实施例99(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(4-氟-3-甲基苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸
来自实施例17。LCMS纯度100％，m/z 566[M+H]+，1H NMR(400MHz，d6-DMSO)，δ：2.05-2.20(2H，m)，2.30(3H，s)，2.75-3.05(2H，m)，4.05-4.20(2H，m)，4.65-4.85(1H，m)，5.70(1H，d)，7.00(1H，d)，7.25-7.35(1H，m)，7.35-7.60(8H，m)。
实施例100(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}-丙基氨基)-3-苯基丙酸
来自实施例21。LCMS纯度100％，m/z 584[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：2.05-2.15(2H，m)，3.00-3.10(3H，m)，4.00-4.25(4H，m)，5.75(1H，d)， 7.05(1H，d)，7.25-7.50(8H，m)，7.55-7.65(1H，m)。
实施例101(S)-2-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苄基氨基}-4-甲基戊酸
来自实施例11.LCMS纯度92％，m/z 506[M+H]+，1H NMR(400MHz，MeOD)，δ：0.85-1.05(6H，m)，1.65-1.85(3H，m)，3.95-4.05(1H，m)，4.25-4.35(2H，m)，5.75(1H，d)，6.90(1H，d)，7.00-7.10(2H，m)，7.35-7.45(4H，m)。
实施例102(S)-2-(4-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}环己基氨基)-4-甲基戊酸
来自实施例31。LCMS纯度91％，m/z 606[M++H]，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.55-2.55(8H，m)，3.20-3.40(2H，m)，4.25-4.35(1H，m)，4.45-4.55(1H，m)，4.85-4.95(1H，m)，5.95(1H，d)，6.95-7.10(2H，m)，7.35-7.55(6H，m)，7.70-7.80(2H，m)，7.80-7.85(1H，d)。
实施例103(2S)-[(4-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}环己基)氨基](戊基)乙酸
来自实施例32.LCMS纯度89％，m/z 592[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.60-1.75(2H，m)，1.80-1.95(2H，m)，2.00-2.15(2H，m)，2.15-2.30(2H，m)，3.05-3.20(1H，m)，4.65-4.75(1H，m)，4.75-4.80(1H，m)，5.80(1H，d)，6.85-6.95(2H，m)，7.20-7.30(2H，m)，7.40-7.50(3H，m)，7.55-7.65(4H，m)，7.65-7.70(1H，m)。
实施例104N-(4-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}环己基)-L-亮氨酸
来自实施例33.LCMS纯度93％，m/z 572[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：0.85-1.00(6H，m)，1.45-2.00(9H，m)，2.05-2.25(3H，m)，3.05-3.15(1H，m)，3.60-3.75(1H，m)，4.30和4.65(每个0.5H，m)，5.70(1H，d)，6.75-6.85(2H，m)，7.10-7.15(2H，m)，7.45-7.55(2H，m)，7.55-7.65(1H，m)。
实施例105(S)-2-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]环己基氨基}-3-苯基丙酸
来自实施例34.LCMS纯度98％，m/z 478[M+H]+，1H NMR(400MHz，CD3OD)，δ：1.55-1.85(4H，m)，1.95-2.20(2H，m)，2.30-2.75(2H，m)，3.15-3.20(1H，m)，3.25-3.35(2H，m)，4.05-4.15(1H，m)，5.60(1H，d)，7.05-7.15(2H，m)，7.15-7.35(5H，m)，7.35-7.45(3H，m)。
实施例106(R)-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸
来自实施例42.LCMS纯度88％，m/z 570[M+H]+，1H NMR(400MHz，DMSO)，δ：2.05-2.20(2H，m)，2.75-2.95(2H，m)，4.10-4.20(2H，m)，4.30-4.50(1H，m)，5.75(1H，d)，7.00-7.10(2H，m)，7.20-7.30(1H，m)，7.35-7.50(7H，m)，7.55-7.65(1H，m)。
实施例107(2S)-[(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)氨基](环己基)乙酸
来自实施例48，LCMS纯度95％，m/z 576[M+H]+，1H NMR(300MHz，DMSO)，δ：10.16(1H，br s)，8.78(1H，br s)，8.12(1H，br s)，7.62-7.53(1H，m)，7.47-7.32(2H，m)，7.27-7.21(1H，m)，7.07(2H，d，J＝10.2Hz)，5.74(1H，d，J＝9.6Hz)，4.19(2H，t，J＝5.7Hz)，3.85-3.75(1H，m)，3.15-3.00(2H，m)，2.20-2.05(2H，m)，1.95-1.60(6H，m)，1.40-0.90(5H，m)。
实施例108N-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)-D-亮氨酸
来自实施例50.LCMS纯度90％，m/z 550[M+H]+，1H NMR(300MHz，DMSO)， δ：7.63-7.52(1H，m)，7.46-7.32(2H，m)，7.28-7.10(1H，m)，7.06(2H，d，J＝10.2Hz)，5.73(1H，d，J＝9.9Hz)，4.25-4.15(2H，m)，3.90-3.80(1H，m)，3.20-3.00(2H，m)，2.20-2.05(2H，m)，1.80-1.55(3H，m)，0.98-0.90(6H，m)。
实施例109N-(5-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}戊基)-L-亮氨酸
来自实施例55。向N-(5-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}戊基)-L-亮氨酸环戊酯(33mg，0.05mmol)的THF(1ml)和水(1ml)溶液中加入LiOH(25mg，1.05mmol，20当量)。混合物室温搅拌16小时，然后在80℃加热10小时。混合物减压浓缩，加入5ml水。用1M HCl调节pH至7，以1-丁醇(3x5ml)提取水层。合并有机提取物，减压浓缩。所得固体剩余物用Et2O研磨，过滤收集并经制备级HPLC纯化，得到白色固态的标题化合物的单-TFA盐(7mg，产率24％)。
LC/MS：m/z 560[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：7.62-7.51(3H，m)，7.34(2H，m)，7.05(2H，m)，5.72(1H，d，J＝9.8Hz)，4.09(2H，t，J＝5.7Hz)，3.23(1H，m)，2.80(2H，m)，1.79-1.43(9H，m)，0.89(6H，t，J＝6.7Hz).
实施例110N-({4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基苯氧基}-乙酰基)-L-亮氨酸
来自实施例56.向N-({4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]苯氧基}乙酰基)-L-亮氨酸环戊酯(35mg，0.06mmol)的THF(1ml)和水(1ml)溶液中加入LiOH(30mg，1.24mmol，20当量)。混合物室温搅拌16小时，减压浓缩，加入 水(5ml)。用1M HCl调节pH至7，以1-丁醇(3x5ml)提取水层。合并有机抽提物，减压浓缩。以Et2O研磨固体剩余物，过滤并减压干燥，得到膏状固态标题化合物(11mg，产率36％)。
LC/MS：m/z 496[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：7.58-7.53(3H，m)，7.43(1H，d，J＝9.6Hz)，7.36-6.98(6H，m)，5.68(1H，d，J＝9.6Hz)，4.58(2H，s)，3.90(1H，m)，1.67-1.31(3H，m)，0.86(6H，m)。
实施例111N-[2-(4-{6-氨基-5-[(4-氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸
来自实施例58.LC/MS：m/z 466[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：8.21(1H，br s)，7.60-7.44(4H，m)，7.39-7.30(4H，m)，5.76-5.69(1H，m)，4.00-3.85(1H，m)，3.10-2.95(2H，m)，1.85-1.60(3H，m)，1.30-1.10(2H，m)，0.95(6H，d，J＝6Hz)。
实施例112N-[2-(4-{6-氨基-5-[(4-甲基苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸
来自实施例63.LC/MS：m/z 462[M+H]+.1H NMR(300MHz，CD3OD)δ：7.69(1H，d，J＝9.6Hz)，7.53(2H，d，J＝7.2Hz)，7.45(2H，d，J＝8.1Hz)，7.34(2H，d，J＝7.8Hz)，7.25(2H，d，J＝8.4Hz)，5.80(1H，d，J＝9.6Hz)，3.15(1H，m)，3.02-2.75(4H，m)，2.45(3H，s)，1.73(1H，m)，1.56-1.22(2H，m)，0.96(6H，dd)。
实施例113N-[2-(4-{6-氨基-5-[(4-甲氧基苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸
来自实施例64.LC/MS：m/z 478[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：7.28(2H，d，J＝8.7Hz)，7.15(2H，d，J＝8.1Hz)，7.04(1H，d，J＝9.3Hz)，6.89(4H，m)，4.87(1H，d，J＝9.3Hz)，3.78(1H，m)，3.41(3H，s)，2.75(2H，m)，1.78(1H，m)，1.24(2H，m)，0.86(6H，t)。
实施例114N-[2-(4-{6-氨基-5-[(4-氯苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸
来自实施例65.LC/MS：m/z 482[M+H]+.1H NMR(300MHz，CD3OD)δ：7.16(1H，d)，7.52(6H，m)，7.23(2H，d)，6.82(1H，d)，3.15(1H，t)，1.74(1H，m)，1.44(2H，m)，0.93(6H，dd)。
实施例115(2S)-4-氨基-2-[(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)氨基]丁酸
来自实施例52.LC/MS：m/z 537[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：7.52-7.75(2H，m)，7.30-7.48(2H，m)，7.20-7.29(1H，m)，7.09(2H，d，J＝9.7Hz)，4.23(1H，t，J＝6.1Hz)，4.07-4.17(2H，m)，2.14-2.32(2H，m)，1.22-1.41(6H，m)，0.88(4H，t，J＝7.3Hz)。
实施例116N-(5-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}戊基)-L-亮氨酸
来自实施例54.向N-(5-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}戊基)-L-亮氨酸叔丁酯(21mg，0.04mmol)的DCM(2.5ml)溶液中加入TFA(2.5ml)。混合物室温搅拌20小时，然后减压浓缩。以少量MeOH溶解剩余物，以1:1甲苯/DCM共沸三次。得到有色膏状固态的标题化合物的单—TFA盐(21mg，92％产率)。
LC/MS：m/z 634[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：10.14(1H，br s)，8.21(1H，br s)，7.57(1H，m)，7.46(1H，m)，7.34(1H，dd，J＝9.6，2.4Hz)，7.21(1H，m)，7.06(2H，d，J＝10.2Hz)，5.73(1H，d，J＝9.9Hz)，4.10(2H，t，J＝5.7Hz)，3.40(1H，m)，2.84(2H，t，J＝6.6Hz)，1.79-1.48(9H，m)，0.90(6H，t，J＝6.3Hz)。
下列实施例以相似方式制备：
实施例117N-[2-(4-{6-氨基-5-[(2，4-二氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸
来自实施例60.LC/MS：m/z 484[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：10.06(1H，br s)，9.17(2H，br s)，7.55-6.94(8H，m)，5.72(1H，d，J＝9.6Hz)，4.05-3.93(1H，m)，3.40-3.10(3H，m)，1.85-1.65(4H，m)，0.95(6H，d，J＝5.7Hz)。
实施例118(2S)-{[2-(4-{6-氨基-5-[(4-氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]氨基)(苯基)乙酸
来自实施例62.LC/MS：m/z 486[M+H]+.1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：9.80(2H，br s)，7.70-7.20(14H，m)，5.70(1H，d，J＝9.6Hz)，5.24(1H，s)，3.20-2.90(4H，m)。
生物活性的测定
p38MAP激酶活性
以Upstate(Dundee UK)试验测定化合物对p38MAP a激酶活性的抑制能力。在最终反应体积25微升中，将p38MAP激酶a(5-10mU)与25mM Tris pH7.5，0.002mM EGTA，0.33mg/mL髓磷脂碱性蛋白，10mM醋酸镁和[g-33p-ATP](比活力约500cpm/pmol，浓度根据需要确定)共孵育。加入MgATP混合物引发反应。室温孵育40分钟后，加入5微升3％磷酸溶液终止反应。然后取10微升反应物点样到P30滤膜(filtermat)上，以75mM磷酸洗涤三次，每次5分钟，再以甲醇洗涤一次，然后干燥并闪烁计数。
以DMSO对储备液进行1/3对数稀释，获得一式两份的数据点。从最高浓度的10μM进行9次稀释，并加入一个“无化合物”的空白。在ATP浓度等于或接近Km时进行标准放射性滤膜结合试验。收集闪烁计数的数据，并用Prism软件进行自由配合(free-fit)分析。从得到的曲线求出半数抑制浓度并记录。
LPS刺激THP-1细胞
向V-形底96孔组织培养板(处理过)中种入100微升密度为4x104个细胞/孔的THP-1细胞，37℃5％CO2中培育16小时。向100微升组织培养液中加入抑制剂，2小时后以终浓度为1μg/ml的LPS(大肠杆菌菌株005:B5，Sigma)刺激细胞，并在37℃5％CO2中继续培育6小时。用夹层ELISA试剂盒(R&D Systems #QTA00B)测定不含细胞的上清液中的TNF-α水平。
LPS-刺激人全血
用肝素化的真空采血管(
Becton Dickinson)通过静脉穿刺采集 全血，以等体积的RPMI1640组织培养基(Sigma)稀释。将100微升铺在经处理的V形底96孔组织培养板中。向100微升RPMI1640培养基中加入抑制剂，2小时后以终浓度为100ng/ml的LPS(大肠杆菌菌株005:B5，Sigma)刺激血液，并于37℃，5％CO2中继续培育6小时。用夹层ELISA(R&D Systems#QTA00B)试剂盒测定不含细胞的上清液中的TNF-α水平。
IC50值如下分配成三个范围：
范围A：IC50<100nM
范围B：100nM<IC50<1000nM
范围C：IC50>1000nM
结果表：
| 实施例 | 对p38MAPKα的抑制活性 | 对THP-1TNFα释放的抑制活性 | 对人全血TNFα释放的抑制活性 |
| 1 | B | C | NT |
| 2 | B | C | NT |
| 3 | B | C | C |
| 4 | B | C | NT |
| 5 | B | C | NT |
| 6 | B | C | NT |
| 7 | A | C | NT |
| 8 | A | B | NT |
| 9 | A | B | C |
| 10 | A | B | NT |
| 11 | A | B | C |
| 12 | A | B | NT |
| 13 | A | A | NT |
| 14 | A | A | NT |
| 15 | A | A | C |
| 16 | A | A | NT |
| 17 | A | A | NT |
| 18 | A | A | NT |
| 19 | A | A | C |
| 20 | A | A | B |
| 21 | A | A | C |
| 22 | A | A | B |
| 23 | A | B | NT |
| 24 | A | B | NT |
| 25 | A | BB | C |
| 26 | A | B | NT |
| 27 | B | B | C |
| 28 | A | A | NT |
| 29 | A | B | NT |
| 30 | A | A | NT |
[0798]
| 31 | A | A | NT |
| 32 | A | A | NT |
| 33 | A | A | NT |
| 34 | B | C | NT |
| 35 | B | C | NT |
| 36 | A | A | C |
| 37 | A | B | NT |
| 38 | A | A | C |
| 39 | A | B | NT |
| 40 | A | A | NT |
| 41 | B | A | C |
| 42 | A | A | B |
| 43 | A | A | NT |
| 44 | B | A | NT |
| 45 | A | A | NT |
| 46 | B | A | B |
| 47 | A | A | B |
| 48 | A | A | C |
| 49 | A | B | C |
| 50 | A | A | NT |
| 51 | A | A | NT |
| 52 | A | A | B |
| 53 | A | A | B |
| 54 | A | A | NT |
| 55 | B | A | NT |
| 56 | B | C | NT |
| 57 | B | A | B |
| 58 | B | A | B |
| 59 | B | A | B |
| 60 | B | A | NT |
| 61 | B | A | NT |
| 62 | B | B | NT |
| 63 | C | A | NT |
| 64 | C | B | NT |
| 65 | B | A | NT |
| 66 | B | B | NT |
| 67 | B | B | C |
| 68 | NT | NT | NT |
| 69 | NT | NT | NT |
| 70 | NT | NT | NT |
| 71 | A | C | NT |
| 72 | A | NT | NT |
| 73 | A | NT | NT |
| 74 | A | NT | NT |
| 75 | B | NT | NT |
| 76 | B | NT | NT |
| 77 | A | NT | NT |
| 78 | B | NT | NT |
| 79 | B | NT | NT |
| 80 | A | NT | NT |
| 81 | B | NT | NT |
| 82 | A | NT | NT |
| 83 | A | NT | NT |
[0799]
| 84 | A | NT | NT |
| 85 | A | NT | NT |
| 86 | C | NT | NT |
| 87 | B | NT | NT |
| 88 | A | NT | NT |
| 89 | A | NT | NT |
| 90 | A | NT | NT |
| 91 | A | NT | NT |
| 92 | A | NT | NT |
| 93 | A | NT | NT |
| 94 | A | NT | NT |
| 95 | A | NT | NT |
| 96 | A | NT | NT |
| 97 | A | NT | NT |
| 98 | A | NT | NT |
| 99 | A | NT | NT |
| 100 | A | NT | NT |
| 101 | A | NT | NT |
| 102 | A | NT | NT |
| 103 | A | NT | NT |
| 104 | A | NT | NT |
| 105 | B | NT | NT |
| 106 | A | NT | NT |
| 107 | A | NT | NT |
| 108 | A | NT | NT |
| 109 | A | NT | NT |
| 110 | B | NT | NT |
| 111 | B | NT | NT |
| 112 | NT | NT | NT |
| 113 | NT | NT | NT |
| 114 | NT | NT | NT |
| 115 | NT | NT | NT |
| 116 | A | NT | NT |
| 117 | A | NT | NT |
| 118 | A | NT | NT |
破碎细胞羧酸酯酶试验
通过下列实验可测试任何本发明提供的R1为酯基的化合物是否满足能被胞内酯酶水解的要求。
细胞提取物的制备
用4体积的Dulbeccos PBS(约1升)洗涤U937或Hut78肿瘤细胞(约109个)，并以525g的转速4℃沉淀10分钟。重复两次，最终的细胞沉淀以35ml冷匀浆缓冲液(Trizma 10mM，NaCl 130mM，CaCl20.5mM，25℃时pH为7.0)重悬。经氮气气蚀(700psi，50min，4℃)制备匀浆。将匀浆置于冰上，以混合抑制剂重悬，其中抑制剂终浓度为：
亮肽酶素 1μM
抑肽酶 0.1μM
E64 8μM
胃酶抑素 1.5μM
抑氨肽酶素b(贝他定) 162μM
糜蛋白酶抑制素 33μM
将细胞匀浆525g离心10分钟使澄清，得到的上清液用作酯酶活性的来源，-80℃储藏备用。
酯酶切割的测定
可用如上制备的细胞提取物测定酯水解成对应羧酸的过程。为此，将细胞提取物(约30微克/0.5ml(总测定体积))置于Tris-HCl 25mM，125mM NaCl缓冲液(25℃时pH为7.5)中37℃培育。零点加入终浓度为2.5μM的酯(底物)，样品于37℃培育合适的时间(通常为0或80分钟)。加入3体积乙腈终止反应。对于零点的样品，乙腈在酯化合物前加入。样品120000g离心5分钟，室温下以LCMS(Sciex API 3000，HP1100双极泵，CTC PAL)分析其中的酯及其对应的羧酸。色谱条件：AceCN(75x2.1mm)柱，流动相为5-95％乙腈于水/0.1％甲酸。
水解速率的单位以pg/mL/min表示。
表1中的数据表明，经多种化学连接基团偶联到胞内酶抑制剂上的各种氨基酸酯基元都被胞内羧酸酯酶水解成对应的酸。
表1
Claims (17)
1.式(I)的化合物：
其中：
G是-CH＝；
D是任选被1-4个独立选自卤素、(C1-C6)烷基和(C1-C6)烷氧基的取代基取代的苯环；
R6是氢；
P代表氢，U代表式(IA)所示的基团；或U代表氢，P代表式(IA)所示的基团；
-A-(CH2)z-X1-L1-Y-NH-CHR1R2 (IA)
其中
A代表各自任选地被卤素取代的苯环或环己基环；
z是0；
Y是键或-C(＝O)-；
L1是键或式-(Alk1)m(Q)n(Alk2)p-的二价基团；其中：m和n是0；p是1；Alk2是二价直链或支链C1-C6亚烷基，以-O-终止的二价直链或支链C1-C6亚烷基，或以-O-终止的二价环己基；和
X1代表键；和
R1是式-(C＝O)OR14的酯基，其中R14是R8R9R10C-，其中，
(i)R8是(C1-C3)烷基-(Z1)a-[(C1-C3)烷基]b-，其中a是0，b是0或1；而R9和R10分别是氢或(C1-C3)烷基-；
(ii)R8是R12R13N-(C1-C3)烷基-，其中R12是(C1-C3)烷基，R13是(C1-C3)烷基；或R12和R13与和它们结合的氮一起形成吗啉基环，而R9和R10分别是氢；或
(iii)R8和R9与和它们结合的碳原子一起形成环戊基或环己基，而R10是氢；和
R2选自苯基、苄基、叔丁基、异丁基和环己基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中P是氢而U是如权利要求1所定义的式(IA)所示的基团。
3.如权利要求1所述的化合物，其中A是任选地被卤素取代的1，4-亚苯基。
4.如权利要求2所述的化合物，其中A是任选地被卤素取代的1，4-亚苯基。
5.如权利要求1所述的化合物，其具有式(IIA)，(IIB)和(IIC)：
其中，R11＝F，R12＝H，R13＝H和R14＝H；或
R11＝F，R12＝F，R13＝H和R14＝H；或
R11＝F，R12＝H，R13＝F和R14＝F；或
R11＝F，R12＝F，R13＝F和R14＝F；或
R11＝F，R12＝F，R13＝F和R14＝H；
和其中z，X1，L1，Y，R1和R2如权利要求1所定义。
6.如权利要求1所述的化合物，其中-Y-L1-X1-[CH2]z-基团是-CH2-，-CH2CH2-，-CH2CH2CH2-，-CH2CH2CH2CH2-，-CH2O-，-CH2CH2O-，-CH2CH2CH2O-，-CH2CH2CH2CH2O-，-C(＝O)-CH2-，或-C(＝O)-CH2O-。
7.如权利要求2所述的化合物，其中-Y-L1-X1-[CH2]z-基团是-CH2-，-CH2CH2-，-CH2CH2CH2-，-CH2CH2CH2CH2-，-CH2O-，-CH2CH2O-，-CH2CH2CH2O-，-CH2CH2CH2CH2O-，-C(＝O)-CH2-，或-C(＝O)-CH2O-。
8.如权利要求3所述的化合物，其中-Y-L1-X1-[CH2]z-基团是-CH2-，-CH2CH2-，-CH2CH2CH2-，-CH2CH2CH2CH2-，-CH2O-，-CH2CH2O-，-CH2CH2CH2O-，-CH2CH2CH2CH2O-，-C(＝O)-CH2-，或-C(＝O)-CH2O-。
9.如权利要求4所述的化合物，其中-Y-L1-X1-[CH2]z-基团是-CH2-，-CH2CH2-，-CH2CH2CH2-，-CH2CH2CH2CH2-，-CH2O-，-CH2CH2O-，-CH2CH2CH2O-，-CH2CH2CH2CH2O-，-C(＝O)-CH2-，或-C(＝O)-CH2O-。
10.如权利要求5所述的化合物，其中-Y-L1-X1-[CH2]z-基团是-CH2-，-CH2CH2-，-CH2CH2CH2-，-CH2CH2CH2CH2-，-CH2O-，-CH2CH2O-，-CH2CH2CH2O-，-CH2CH2CH2CH2O-，-C(＝O)-CH2-，或-C(＝O)-CH2O-。
11.如权利要求1所述的化合物，其中R14是乙基、环戊基或叔丁基。
12.如权利要求1所述的化合物，其中R2是苯基、苄基、异丁基或环己基。
13.如权利要求1所述的化合物，其中R1是式-(C＝O)OR14的酯基，其中R14是环戊基，R2是苯基、苄基、异丁基、或环己基。
14.如权利要求1所述的化合物，其选自：
(S)-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)苯基乙酸环戊酯
(S)-2-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代-2H-吡啶-1-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基氨基)-4-甲基戊酸环戊酯
(2R)-[(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)氨基](苯基)乙酸环戊酯
N-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)-L-亮氨酸2-吗啉-4-基乙酯
N-(3-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}丙基)-L-亮氨酸2-(二甲基氨基)乙酯
N-[2-(4-{6-氨基-5-[(4-氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸环戊酯
N-(5-{4-[6-氨基-5-(2，4-二氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}戊基)-L-亮氨酸环戊酯
N-[3-(4-{6-氨基-5-[(4-氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)丙基]-L-亮氨酸环戊酯
N-(5-{4-[6-氨基-5-(4-氟苯甲酰基)-2-氧代吡啶-1(2H)-基]-3，5-二氟苯氧基}戊基)-L-亮氨酸环戊酯
N-[2-(4-{6-氨基-5-[(2，4-二氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸环戊酯
N-[2-(4-{6-氨基-5-[(2，4-二氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸叔丁酯
(2S)-{[2-(4-{6-氨基-5-[(4-氟苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]氨基}(苯基)乙酸环戊酯
N-[2-(4-{6-氨基-5-[(4-甲基苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸环戊酯
N-[2-(4-{6-氨基-5-[(4-氯苯基)羰基]-2-氧代吡啶-1(2H)-基}苯基)乙基]-L-亮氨酸环戊酯。
15.如权利要求1-14中任一项所述的化合物，它是药学上可接受的盐的形式。
16.一种药物组合物，其含有如权利要求1-15中任一项所述的化合物，和药学上可接受的载体。
17.权利要求1-15中任一项所述的化合物在制备治疗自身免疫疾病或炎症性疾病的组合物中的用途。
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