CN101434592A - 朝鲜槐中提取的新的黄酮类化合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及从朝鲜槐中提取的新的黄酮类化合物。本发明运用各种分离手段包括硅胶柱色谱、大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶LH－20柱色谱和半制备型高效液相色谱法等，从朝鲜槐中共分离得到54个化合物，14个黄酮类化合物，其中7个为新的化学成分，分别为怀槐黄酮A(Maackiaflavanone A)、怀槐黄酮B(Maackiaflavanone B)、怀槐酮素(Maackiapentone)、怀槐紫檀素A(Maackiapterocarpan A)、怀槐紫檀素B(Maackiapterocarpan B)、怀槐异黄酮苷(Maackiaisoflavonoside)和怀槐黄烷(8－3，3－dimethylallyl－5－hydroxy－7－methoxy chromone)。初步活性研究表明，这类化合物具有一定的抗肿瘤细胞增殖作用，为今后的开发研究奠定了基础。

Description

朝鲜槐中提取的新的黄酮类化合物

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及从朝鲜槐中提取的新的黄酮类化合物，还涉及从朝鲜槐中提取的新的黄酮类化合物的提取分离方法和用途。

背景技术

朝鲜槐(Maackia amurensis Rupr.et Maxim.)又名山槐、高丽槐、怀槐，为豆科马鞍树属植物。朝鲜槐为一民间药物，其茎、枝有祛风湿的功效，可用于风湿性关节炎的治疗；朝鲜族用朝鲜槐的叶及枝皮治疗肿瘤；俄罗斯阿穆尔州民间使用朝鲜槐的叶及枝皮治疗肝脏疾病和胆囊炎；俄罗斯远东地区及那族人用朝鲜槐内皮粉末来促进深度伤口和溃疡的愈合；朝鲜槐新鲜细根可用于治疗小疣和鸡眼；其花可用于止血。

从上世纪70年代开始，俄罗斯、日本、中国等国学者相继对朝鲜槐的心材、茎及叶进行了化学成分及药理作用方面的研究。其中，黄酮类化合物为朝鲜槐的主要成分，也是主要的活性成分。目前从该植物中共分离得到17个黄酮类化合物，包括14个异黄酮类化合物，1个异黄烷类化合物，1个紫檀素类化合物和1个二氢异黄酮类化合物。多篇文献报道了黄酮类化合物具有多方面的生物学活性，具有一定的开发前景。本发明所述的7个化合物，目前尚未见有报道。

发明内容

本发明目的是系统研究朝鲜槐的化学成分，寻找活性单体化合物，从而提供一组朝鲜槐中提取的新的黄酮类化合物。

本发明是这样实现的：

利用多枝分离手段，包括硅胶柱色谱、大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶LH-20柱色谱和半制备高效液相色谱法等，系统研究朝鲜槐的化学成分。从朝鲜槐中分离得到54个化合物，其中7个为新的黄酮类化合物，分别为怀槐黄酮A(Maackiaflavanone A)、怀槐黄酮B(Maackiaflavanone B)、怀槐酮素(Maackiapentone)、怀槐紫檀素A(Maackiapterocarpan A)、怀槐紫檀素B(Maackiapterocarpan B)、怀槐异黄酮苷(Maackiaisoflavonoside)和怀槐黄烷(8-3，3-dimethylallyl-5-hydroxy-7-methoxy chromone)。

本发明的效果在于首次从朝鲜槐中分离制备出7个新黄酮类化合物，经过初步活性测定表明，这些化合物具有一定的抗肿瘤细胞增殖作用，从而为今后深入研究与开发这些活性单体化合物并用于临床奠定了物质基础。

具体实施方式

实施例1：化合物1-7的制备

1.提取分离

取干燥的朝鲜槐树皮9kg，用70％乙醇加热回流提取4次，每次3h，减压干燥，浓缩，得浸膏1800g。浸膏用水混悬，按1:1比例，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取3次，萃取部分分别经减压浓缩，得石油醚萃取部分120g，首先进行硅胶柱色谱(800g，200-300目)，用石油醚-二氯甲烷(10:1→1:1)，二氯甲烷-乙酸乙酯梯度洗脱(50:1→1:1)，共收集109个流份，每个流份体积约500mL，根据薄层色谱合并得9个子流份(Fr.1-Fr.9)。Fr.3经Sephadex LH-20凝胶色谱，CH₂Cl₂-MeOH(1:1)反复洗脱以除去大量油脂，所有含黄酮类子流份(依据薄色谱显色)重新合并，再经Sephadex LH-20凝胶色谱，MeOH洗脱得5个子流份：Fr.3-1～3-5。Fr.3-3(0.2g)经制备薄层色谱(己烷-丙酮，10:3)纯化得到化合物3(5mg)(结构式3)。Fr.3-4(0.4g)经制备薄层色谱(CH₂Cl₂-EtOAc，50:1)，再经半制备液相(MeOH-H₂O，75:25)纯化，得化合物4(4.5mg)(结构式4)和化合物5(1.5mg)(结构式5)。Fr.4经Sephadex LH-20凝胶色谱，CH₂Cl₂-MeOH(1:1)反复洗脱以除去大量油脂，所有含黄酮类子流份(依据薄层色谱显色)重新合并，再经Sephadex LH-20凝胶色谱，MeOH洗脱得6个子流份：Fr.4-1～4-6。Fr.4-2(1.3g)经开放ODS柱色谱，MeOH-H₂O(80:20→90:10)纯化得化合物2(20mg)(结构式2)。Fr.4-3(1.5g)和Fr.4-4(2.2g)合并，经Sephadex LH-20凝胶色谱，MeOH洗脱，开放ODS柱色谱，MeOH-H₂O(80:20→85:15)洗脱得化合物1(15mg)(结构式1)。正丁醇萃取部分(400g)用大孔树脂柱色谱进行分离，以乙醇-水进行梯度洗脱，收集75％乙醇洗脱部分(Fr.1)和50％乙醇洗脱部分(Fr.2)。Fr.2进行硅胶柱色谱，使用CH₂Cl₂-MeOH(10:1→1:1)为流动相进行梯度洗脱，得到1个流份(Fr.2.1—Fr.2.10)。Fr.2.7经ODS柱色谱纯化(MeOH-H₂O，40:60)得到化合物6(50mg)(结构式6)。乙酸乙酯萃取部分(250g)经硅胶柱色谱，用石油醚-二氯甲烷(10:1→1:1)，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(100:1→1:1)，得到8个流份(Fr.1-Fr.8)。Fr 7进行硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮进行梯度洗脱(10:1-1:1)，合并所得第29-31号流份，再经Sephadex LH-20凝胶色谱，MeOH洗脱得到化合物7(25mg)(结构式7)。

主要利用光谱，包括紫外、红外、质谱、核磁共振谱(¹HNMR、¹³CNMR、2D-NMR)和ESI-MS、HRSI-MS分析(表)，鉴定其结构。

运用2D-NMR技术，尤其是COSY、NOESY、HMQC和HMBC谱，解决了取代基的位置和糖的连接位置，结合高分辨质谱，对它们的全部氢信号进行了确切的归属。

新黄酮类化合物1-7的结构

化合物1(Maackiaflavanone A)

化合物2(Maackiaflavanone B)

化合物3(Maackiapentone)

化合物4(Maackiapterocarpan A)

化合物5(Maackiapterocarpan B)

化合物6(Maackiaisoflavonoside)

化合物7(8-3，3-dimethylallyl-5-hydroxy-7-methoxy chromone)

实施例2：化合物1-7的结构确证

表1.化合物1-7的理化常数及主要光谱数据

化合物1

分子式C₂₆H₂₈O₆，为白色无定形粉末。[α]²⁰ _D＝-67.3°(c，0.1，MeOH)，CD(c0.05，MeOH；nm)：[θ]₃₅₀+0.92，[θ]₂₉₀-6.20。UV(MeOH)在289nm处有最大吸收。IR(KBr)υ_max，cm^-13443(broad)，2925，1634，1502，1445，1383，1206，1167，1106，1073。ESI-MSm/z：437.3[M+1]⁺，435.3[M-1]^-，873.8[2M+1]⁺，871.6[2M-1]^-，HR-ESI-MS m/z 437.1968[M+H]⁺。¹HNMR(600MHz，acetone-d₆)见表2。¹³CNMR(150MHz，acetone-d₆)见表2。

化合物2

分子式：C₃₀H₃₄O₅，淡黄色胶状物。[α]²⁰ _D＝-34.7°(c，0.2，MeOH)。UV(MeOH)在293nm处有最大吸收。IR(KBr)υ_maxcm^-13420，2973，2923，1637，1505，1435，1383，1170，1148，1077。ESI-MSm/z：475.4[M+1]⁺，473.4[M-1]^-，HR-ESI-MS m/z 475.2480[M+H]⁺。¹HNMR(600MHz，acetone-d₆)见表2。¹³CNMR(150MHz，acetone-d₆)见表2。

化合物3

分子式：C₃₀H₃₂O₅，淡黄色无定形粉末。UV(MeOH)在273nm处有最大吸收。IR(KBr)υ_maxcm^-13444，2922，1650，1560，1507，1434，1384，1254，1117。HR-ESI-MS m/z：473.2326[M+H]⁺。¹HNMR(600MHz，CDCl₃)见表2。¹³CNMR(150MHz，CDCl₃)见表2。

化合物4

分子式：C₂₁H₂₀O₆，白色无定形粉末。[α]²⁰ _D＝-240°(c，1.5，MeOH)。UV(MeOH)在304nm处有最大吸收。IR(KBr)υ_maxcm^-13454，2925，1612，1473，1384，1135，1035，925,847。ESI-MS m/z：369.3[M+1]⁺，368.3[M-1]^-，HR-ESI-MS m/z 369.1327[M+H]⁺。¹HNMR(600MHz，CDCl₃)见表3。¹³CNMR(150MHz，CDCl₃)见表3。

化合物5

分子式：C₂₁H₁₈O₆，白色无定形粉末。[α]²⁰ _D＝-233°(c，1.1，MeOH)。UV(MeOH)在311nm处有最大吸收。ESI-MS m/z：367.3[M+1]⁺，365.3[M-1]^-，HR-ESI-MS m/z 367.1182[M+H]⁺。¹HNMR(600MHz，CDCl₃)见表3。¹³CNMR(150MHz，CDCl₃)见表3。

化合物6

分子式：C₂₉H₃₄O₁₅，无色粘稠胶状物。[α]²⁰ _D＝-7.9°。ESI-MS m/z：[M+1]⁺623.2，[M+Na]⁺645.2，[M-1]^-621.1，[2M+1]1243.5，[2M-1]1242.6，HR-ESI-MS m/z 645.1790[M+Na]⁺。¹HNMR(600MHz，DMSO-d₆)见表4。¹³CNMR(150MHz，DMSO-d₆)见表4。

化合物7

分子式：C₁₅H₁₆O₄，无色油状物。HR-ESI-MS m/z 261.2931[M+H]⁺。¹HNMR(600MHz，CDCl₃)见表5。¹³CNMR(150MHz，CDCl₃)见表5。

表2.化合物1、2、3的¹HNMR和¹³CNMR化学位移值

表3.化合物4、5的¹HNMR和¹³CNMR化学位移值

表4.化合物6的¹HNMR和¹³CNMR化学位移值

表5 化合物7的¹HNMR和¹³CNMR化学位移值

实施例3：化合物1-7的抗肿瘤活性

采用MTT法考察了上述化合物的体外抗肿瘤活性。具体实施方法如下：

人宫颈癌HeLa细胞、人黑色素瘤A375S2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人肝癌HepG2细胞以以1×105/孔的密度接种在96孔板中，培养12h后加入不同浓度样品，继续培养48h后弃去培养液，每孔加入100μl培养液及10μl 5mg/ml MTT，再培养4h，以酶联免疫分析仪测定吸光值。同时设定空白对照和阴性对照，以5-氟尿嘧啶为阳性对照，并按下列公式计算死亡率：

采用LOGIT法计算各化合物的IC₅₀值。结果见表6。

结果显示，上述各化合物对4种人癌细胞均显示一定的增殖抑制作用，其中化合物1、2、3对MCF-7的作用强于5-氟尿嘧啶，化合物1、2对HepG2的作用强于5-氟尿嘧啶，化合物1、5对A375-S2的作用强于5-氟尿嘧啶，而对于HeLa细胞，上述所有化合物均显示很强的增殖抑制作用，IC₅₀值均小于5-氟尿嘧啶。由以上结果可知，本发明中所述化合物不仅对肿瘤细胞具有一定的增殖抑制作用，同时对不同的细胞株还显示出较强的选择性。

表6 化合物1、2、3、4、5、6、7对四种人癌细胞的增殖抑制作用

Claims (3)

1、朝鲜槐中提取的新的黄酮类化合物，其特征在于：包括二氢黄酮类化合物怀槐黄酮A(1)、二氢黄酮类化合物怀槐黄酮B(2)、异黄酮类化合物怀槐酮素(3)、异黄酮类化合物怀槐紫檀素A(4)、异黄酮类化合物怀槐紫檀素B(5)、异黄酮类化合物怀槐异黄酮苷(6)、黄烷类化合物怀槐黄烷(7)，其结构式如下所示：

2、权利要求1所述的朝鲜槐中提取的新的黄酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

3、根据权利要求1所述的朝鲜槐中提取的新的黄酮类化合物，其特征在于：所述的黄酮类化合物中的一种或多种可以和药学上可接受的载体制备成临床可接受的剂型。