CN101432024A - 有机化合物的用途 - Google Patents

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Abstract

ERRγ激动剂或其药学上可接受的盐用于预防、治疗下列疾病、延迟其进展或改善运动耐力的用途，所述疾病是糖尿病、胰岛素抵抗、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、肥胖症、超重、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。

Description

有机化合物的用途
本发明涉及雌激素相关受体γ(ERRγ)激动剂或其药学上可接受的盐在治疗下述疾病或病症或者改善运动耐力中的用途，所述疾病或病症选自糖尿病(优选2型糖尿病)、胰岛素抵抗、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、肥胖症、超重、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病，所述用途通过将有效剂量的至少一种雌激素相关受体γ激动剂或其药学上可接受的盐给药至需要此类治疗的动物来实现。
雌激素相关受体(ERR)包括3个成员ERRα、ERRβ和ERRγ，它们形成孤儿核受体的一个亚族，它们的天然配体仍待确定。ERR与雌激素受体(ER)在它们的DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)中具有显著的氨基酸同源性，但是ERR对雌二醇没有响应。反之ER是配体激活的受体，ERR可以以组成性方式激活基因转录，并且ERR的激活能力可能是由存在的转录辅激活因子决定的。结构研究证实了上述发现，这是通过证明ERRγLBD能采取转录活性构象，并在没有任何配体时与类固醇受体共激活因子1(SRC-1)相互作用实现的。
在它的DBD内，ERRγ与ERRα和ERRβ分别具有93％和99％的氨基酸同一性。ERR在其LBD内更不保守(ERRγ与ERRα和ERRβ相比，分别具有61％和77％的氨基酸同一性)。据报道共激活因子(过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α，PGC-1α)是ERRα和ERRγ的内源性蛋白配体[Hentschke M等人(2002)-PGC-1和PERC，雌激素受体相关受体γ的共激活因子(PGC-1 and PERC，coactivators of the estrogenreceptor-related receptor γ.)生物化学和生物物理学研究通讯(BiochemBiophys Res Commun)；299：872-9)。
证据表明ERRα和PGC-1α一起具有调节与线粒体的生物合成和氧化磷酸化相关的基因表达的功能。ERRα、ERRγ和PGC-1α在利用线粒体脂肪酸氧化作为它们的主要能量来源的组织例如骨骼肌、心脏和肾脏中共表达(Yang L，Stallcup MR(1999)，由新孤儿核受体ERR3引起的非激素依赖性转录激活和共激活因子结合(Hormone-independent transcriptionalactivation and coactivator binding by novel orphan nuclear receptorERR3)，生物学和化学杂志(J Biol Chem)，274：22618-26)，并且最近研究表明ERRγ是ERRα基因表达的有效激活子，其能被PGC-1α增强[Liu D，Zhang Z，Teng CT(2005)，雌激素相关受体-γ和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α通过保守的多激素反应元件调节雌激素相关受体-α的基因表达(Estrogen-related receptor-γ and peroxisomeproliferator-activated receptor-γ coactivator-1α regulate estrogen-relatedreceptor-α gene expression via a conserved multi-hormone responseelement)，分子内分泌学杂志(J Mol Endocrinol)，34：473-87)。
已表明在没有激动剂时ERRγ LBD蛋白是活化的，但活性可通过加入已知的激动剂化合物GSK4716(葛兰素史克公司(Glaxo-Smith-Kline)，NVP-AJQ710)和GSK9089(葛兰素史克公司，NVP-LCN446)而增强[Zuercher WJ等人(2005)，作为雌激素相关的孤儿核受体ERRβ和ERRγ的选择性激动剂的酚酰基腙类的鉴定和构效关系(Identification andstructure-activity relationship of phenolic acyl hydrazones as selectiveagonists for the estrogen-related orphan nuclear receptors ERRβ andERRγ)，药物化学杂志(J Med Chem)，48：3107-9)。
美国专利申请US 2005/0096384推测了靶向于ERR受体的配体的潜在用途。该申请特别推测了ERR拮抗剂在治疗数种适应征中的用途。
在该领域继续研究，申请人已惊奇地发现与US 2005/0096384所述相反，仅使用ERRγ激动剂刺激ERRγ活化导致提高的线粒体发生。
申请人还发现用ERRγ激动剂刺激ERRγ活化对治疗下述疾病或改善运动耐力产生意想不到的有益作用，所述疾病选自糖尿病、2型糖尿病、胰岛素抵抗、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、肥胖症/超重、神经变性疾病。
为了便于描述ERRγ激动剂的性质，申请人开发了荧光共振能量转移(FRET)实验(如下文所述)，该实验测量对配体结合响应的LBD和共激活因子肽之间相互作用的变化。使用两种已知的ERRγ小分子激动剂即GSK4716(葛兰素史克公司，AJQ710)和GSK9089(葛兰素史克公司，LCN446)已经验证了该实验[Zuercher等人，2005，作为雌激素相关的孤儿核受体ERRβ和ERRγ的选择性激动剂的酚酰基腙类的鉴定和构效关系，药物化学杂志(J Med Chem)，2005年5月5日，48(9)：3107-9)。
已表明在没有激动剂时ERRγ LBD蛋白是活化的，但活性可通过加入已知的激动剂化合物GSK4716(葛兰素史克公司)和GSK9089(葛兰素史克公司)而提高(Zuercher等人，2005)。
术语“ERRγ激动剂”意指具有激活ERRγ活性(例如1-100％活化)的作用的分子，并尤其是保持底物分子的作用的上述分子。优选地，在ERRγ
FRET实验(ERRγ激动剂的诱导FRET反应增强的能力)中，ERRγ激动剂具有0.001至10μM(或者0.001至1μM)的EC50。优选地，在下述实验中ERRγ激动剂具有0.001至10μM发(或者0.001至1μM)的EC50。“ERRγ激动剂”优选指当键合至ERRγ的LBD序列时，能增加ERRγ的量或延长ERRγ的持续时间或提高ERRγ的活性的分子。激动剂可以包括多肽、核酸、碳水化合物、脂质或其任何衍生物或任何其它分子。
可以通过如Zuercher等人-2005或Coward，P等人-2001(4-羟基他莫昔芬结合至雌激素相关受体并灭活雌激素相关受体γ(“4-Hydroxytamoxifen binds to and deactivates the estrogen-relatedreceptor gamma.”)，美国国立科学院学报(Proc Natl Acad Sci USA.)，2001年7月17日；98(15)，8880-4，电子版2001年7月10日)和Zhou G.等人-1998(通过荧光共振能量转移鉴定(“Characterization by FluorescenceResonance Energy Transfer”)，分子内分泌学(Mol.Endocrin.)，1998，12，1594-1604)所述筛选化合物分离得到ERRγ激动剂，将所述实验引入本申请中作为参考。优选地，ERRγ激动剂可以如由申请人开发的下述实验(参见实验部分)中所述筛选化合物而分离得到。
在本文中，“ERRγ激动剂”还预期包括上述化合物的活性代谢物和前药，例如ERRγ激动剂的活性代谢物和前药。“代谢物”是当ERRγ激动剂被代谢时产生的ERRγ激动剂的活性衍生物。“前药”是能被代谢成ERRγ激动剂或能被代谢成与ERRγ激动剂相同的代谢物的化合物。
ERRγ激动剂是本领域中公知的。例如在每种情况中，ERRγ激动剂通常和特别公开在例如Zuercher等人-2005中。
优选的ERRγ激动剂是GSK4716或GSK9089。
GSK4716是4-羟基-N’-(4-异丙基苯基亚甲基)-苯甲酰肼，是由Zuercher等人-2005描述的，其结构式为
Figure A200780015597D00071
GSK9089(或DY131)是N’-(4-(二乙氨基)苯基亚甲基)-4-羟基苯甲酰肼，结构式为
Figure A200780015597D00072
并且其CAS登记号是095167-41-2。化合物GSK9089和它对ERRγ的活性还由D.D.Yu和col(雌激素相关受体ERRβ/γ的激动剂配体的鉴定(Identification of an agonist ligand for estrogen-related receptors ERRβ/γ)，生物有机和药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)，15(2005)，1311-1313)和Zuercher等人(2005)描述。
尤其优选的是口服活性的ERRγ激动剂抑制剂。
认为上述专利文件(在此引入作为参考)中公开的任何物质能够用作实施本发明的ERRγ激动剂。
根据本发明单独使用的ERRγ激动剂可以与载体联合使用。
在本文中，载体是工具(天然的、合成的、肽的、非肽的)，例如转运特定的物质穿越细胞膜的蛋白质，该蛋白质嵌入细胞中。转运不同的物质需要不同的载体(天然的、合成的、肽的、非肽的)，因为每一种载体设计为仅识别一种物质或一类相似物质。
可以使用本领域技术人员公知的任何检测手段来检测ERRγ激动剂与载体的联合，例如通过标记载体。
最优选的是口服活性的ERRγ激动剂和其药用盐。
本发明的活性成分或其药学上可接受的盐还可以以溶剂合物(例如水合物或包含其它用于结晶的溶剂的)形式使用。
现在令人惊奇地发现ERRγ激动剂可用于预防、治疗下列疾病或病症、延迟其进展或用于改善运动耐力，所述疾病或病症选自糖尿病(优选2型糖尿病)、胰岛素抵抗、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、肥胖症、超重、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
因此，本发明涉及ERRγ激动剂(例如GSK4716或GSK9089)或其药学上可接受的盐在制备预防、治疗下列疾病或病症、延迟其进展或改善运动耐力的药物中的用途，所述疾病或病症选自糖尿病(优选2型糖尿病)、胰岛素抵抗、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、肥胖症、超重、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
本发明还涉及预防、治疗下列疾病或病症、延迟其进展或改善运动耐力的方法，所述疾病或病症选自糖尿病(优选2型糖尿病)、胰岛素抵抗、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、肥胖症、超重、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病，该方法包括将治疗有效量的ERRγ激动剂(优选GSK4716或GSK9089)给药至有其需要的温血动物包括人。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含治疗有效量的ERRγ激动剂和一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物用于治疗下述疾病或病症，或者用于改善运动耐力，所述疾病或病症选自糖尿病(优选2型糖尿病)、胰岛素抵抗、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、肥胖症、超重、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
根据本发明最优选，所治疗的疾病或损害选自2型糖尿病、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿病，或者ERRγ激动剂用于改善运动耐力。
在本说明书中，术语“治疗”包括预防性治疗以及治愈性或疾病抑制性治疗，包括治疗有感染疾病风险的患者或怀疑感染疾病的患者以及疾病患者。该术语还包括用于延迟疾病进展的治疗。
正如文中所用，术语“治愈性”意指在治疗正进行的疾病中的效用。
术语“预防”指将所述组合产品预防性给药至健康患者，以预防本文所述的疾病的发生。并且，术语“预防”指将所述组合产品预防性给药至处于被治疗的病症前期的患者。
术语“预防性”指预防疾病或损害的发作或复发。
正如文中所用，术语“延迟进展”意指将活性化合物给药至处于被治疗的疾病的前期或早期的患者，其中患者被诊断为例如相应疾病的早期或患者处于病症中(例如医疗期间或意外导致的病症)，在所述情形下很可能相应疾病会恶化。
代谢综合征是一组显著提高心血管事件发生风险的风险因素：糖尿病或前驱糖尿病、腹部肥胖症、胆固醇变化和高血压。然而世界范围内近2亿患有糖尿病的成年人中的高达80％将死于心血管疾病，患有代谢综合征的患者还具有更高的风险，他们死于心脏病或中风的可能性是未患综合征的人的两倍，并且他们患心脏病或中风的可能性是未患综合征的人的三倍。患有代谢综合征的患者具有高五倍的患2型糖尿病风险(如果现在还没有患病)。上述风险因素组的确切性质是似乎导致额外风险，其高于和超过每一因素预期产生的风险(例如当测量胆固醇时的高甘油三酯类)。对于界定为患有代谢综合征的患者来说，需要他们具有中枢性肥胖症和下面四个其它因素中的两个：升高的甘油三酯、低的HDL胆固醇、升高的血压或升高的空腹血糖水平。性别和种族也是在界定代谢综合征时应考虑的因素。
如本文所用的术语“糖尿病”指2型糖尿病、1型糖尿病和成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)，糖尿病优选是2型糖尿病。
2型糖尿病通常发生在大于40岁的人群或超重(肥胖的)人群中。一般来讲，2型糖尿病患者的治疗不涉及胰岛素疗法，而是在一些生活方式方面(例如运动、减肥、控制饮食)进行改变，并且有时口服抗糖尿病药足以控制血糖水平。当身体产生胰岛素抵抗(遗传因素和肥胖症的结果)时，通常出现2型糖尿病(成人发作的糖尿病)，并且其一般在成人期被诊断出。胰岛素抵抗引起高血糖症和胰脏的β细胞退化(因为持续需求胰岛素产生)。胰岛素抵抗和降低的β细胞功能的组合最终引起2型糖尿病。
1型糖尿病通常在儿童期被诊断出，并且因为这个原因，1型糖尿病时常称作青少年糖尿病。早期诊断对于预防一些更严重的糖尿病并发征而言是重要的，所述糖尿病并发征包括心脏疾病、失明、高血压、神经损伤和肾衰竭。然而，尽管1型糖尿病趋向于最频繁地在年轻的瘦的一般30岁之前的个体中发生，但是年长的患者确实也存在这种类型的糖尿病。这种类型的1型糖尿病通常称作成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)。与更常见的青少年1型糖尿病一样，LADA是由免疫-介导的产生胰岛素的胰脏β细胞破坏引起的。LADA还称作缓慢-起病1型糖尿病、成人晚-起病自身免疫糖尿病和1型糖尿病。青少年1型糖尿病和LADA的主要区别是诊断的年龄-通常三十岁或更大些。诊断LADA的方法例如描述在专利申请WO2005054512 A2中。因此，1型糖尿病可以存在于任何年龄，并且决定临床表现的年龄的因素是未知的。
糖代谢异常(IGM)是根据如下血糖水平定义的：其高于正常范围但是未高到符合2型糖尿病的诊断标准。IGM的发病率随着国家不同而变化，但是与显性糖尿病相比，IGM一般以比其高2-3倍的频率发生。直到最近，已察觉患有IGM的个体是前驱糖尿病，但是就他们的糖尿病风险和他们的心血管发病率和死亡率风险而言，来自几个流行病学研究的数据证明患有IGM的个体表现不同。数据表明患有IGM(尤其IGT)的个体不总是发展成糖尿病，但是无论他们是糖尿病或不是，对于心血管发病率和死亡率而言他们处于高风险下。
患有IGM的个体中，大约58％的个体具有糖耐量减低(IGT)，另外29％的个体具有空腹血糖受损(IFG)，并且13％的个体具有上述两种异常(IFG/IGT)。IGT是以升高的饭后(餐后)高血糖症为特征的，而IFG已经由ADA根据空腹升胰岛素(glycemic)值进行确定(见下表)。
超重：体重减轻(即治疗/预防/延迟超重)是糖尿病、肥胖症和超重个体病例中所期望的。体重减轻(即治疗/预防/延迟超重)能有助于预防许多所述的有害后果，特别是与糖尿病和心血管疾病(CVD)有关的后果。体重减轻还可以降低超重的高血压个体和非高血压个体的血压、血清甘油三酯水平和增加有益的高密度脂蛋白(HDL)形式的胆固醇。体重减轻一般还稍微降低总血清胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇水平。体重减轻还可以降低超重和肥胖患者的血糖水平。
体重减轻和低热量饮食还是治疗2型糖尿病时用于控制血糖水平的主要目标。因此控制饮食和体重减轻是治疗2型糖尿病所需要的。术语“治疗超重”涉及例如体脂减少或体重减轻。
术语“体重减轻”指减少总体重的一部分。
术语“体脂减少”指减少一部分体脂。
体重指数(BMI)的公式是[体重(磅)÷身高(英寸)÷身高(英寸)]×703。不管年龄和性别，成人的BMI分切点是一个固定的数值，采用下述指标：超重型成年人个体具有25.0-29.9的BMI。肥胖型成年人具有30.0或更高的BMI。体重过轻型成年人具有小于18.5的BMI。将成年人的正常体重范围定义为BMI 18.5-25。16岁以下儿童的BMI分切点是根据百分位数定义的：将超重定义为就年龄而言大于第85百分位数的BMI，将肥胖症定义为就年龄而言大于第95百分位数的BMI。将体重过轻定义为就年龄而言小于第5百分位数的BMI。将儿童的正常体重范围定义为大于第5百分位数并且低于第85百分位数的BMI。
神经变性疾病优选选自下述病症和疾病：例如痴呆(例如老年性痴呆、早老性痴呆(也称作轻度认知损害)、阿尔茨海默氏相关的痴呆(阿尔茨海默氏型痴呆))、亨廷顿病、亨廷顿舞蹈病、急性精神错乱疾病以及尤其是其中凋亡的细胞坏死起作用的那些例如肌萎缩性侧索硬化病、青光眼、多发性硬化病、偏头痛、中风、脑缺血病和帕金森氏病，并尤其是阿尔茨海默氏病。
神经变性疾病更优选选自阿尔茨海默氏病和痴呆，优选老年性痴呆、轻度认知损害或阿尔茨海默氏型痴呆。
神经变性疾病更优选是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或亨廷顿病。
本发明还涉及包含游离形式或其药学上可接受的盐形式的作为活性成分的ERRγ激动剂的药物组合物。
本发明的另一方面是包含游离形式或其药学上可接受的盐形式的作为活性成分的ERRγ激动剂(优选GSK4716或GSK9089)的药物组合物在制备预防、治疗下述疾病或延迟其进展或改善运动耐力的药物组合物中的用途，所述疾病是糖尿病(优选2型糖尿病)、胰岛素抵抗、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、肥胖症、超重、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
本发明还涉及预防、治疗下述疾病或延迟其进展或改善运动耐力的方法，该方法包括将治疗有效量的包含游离形式或其药学上可接受的盐形式的作为活性成分的ERRγ激动剂(优选GSK4716或GSK9089)的药物组合物共同给药至有其需要的温血动物包括人，所述疾病是糖尿病(优选2型糖尿病)、胰岛素抵抗、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、肥胖症、超重、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
根据本发明的药物组合物可以以本身公知的方式进行制备，并且该药物组合物是适合用于肠道(例如口服或直肠)和胃肠外给药至哺乳动物(温血动物)包括人的那些，所述药物组合物仅包含治疗有效量的药理活性化合物或者还包含一种或多种药学上可接受的载体，尤其适合肠道或胃肠外施用。
这些药物制剂用于肠道(例如口服或直肠)或胃肠外给药于恒温动物，并且所述制剂仅包含药理活性化合物或者还包含常用的药物辅助物质。例如，药物制剂包含约0.1％至90％、优选约1％至约80％的活性化合物。用于肠道或胃肠外给药以及用于眼睛给药的药物制剂是例如单位剂量形式，例如包衣片剂、片剂、胶囊剂或栓剂，以及安瓿剂。它们是以本身公知的方式制备的，例如采用常规混合、成粒、包衣、溶解或冻干方法。因此，用于口服使用的药物制剂可以如下获得：将活性化合物与固体赋形剂混合，如果需要的话将得到的混合物制粒，并且如果需要或必要的话，在加入适当的辅助物质后，将所述混合物或颗粒加工成片剂或包衣片剂的核心。
活性化合物的剂量可能取决于多种因素，例如给药方式、恒温动物种类、年龄和/或个体情况。
本发明的用途和方法的优选的患者是患有糖尿病(优选2型糖尿病)、IGM(优选IGT)、肥胖症或超重、代谢疾病、血脂异常、神经变性疾病或低的运动耐力的患者或动物。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的、用于在患有IGM(优选IGT)患者中预防糖尿病(优选2型糖尿病)或延迟其进展的组合物、用途或方法。
因此本发明还涉及：
-预防2型糖尿病或延迟其进展的方法，所述方法包括将治疗有效量的ERRγ激动剂的给药至患有IGM(优选IGT)的温血动物包括人。
-包含治疗有效量的ERRγ激动剂以及一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物，所述药物组合物用于在患有IGM(优选IGT)患者中预防2型糖尿病或延迟其进展。
-ERRγ激动剂或其药学上可接受的盐在制备在患有IGM(优选IGT)患者中预防2型糖尿病或延迟其进展的药物中的用途。
本发明还涉及任何本文所述的药物组合物、方法或用途中，其中ERRγ激动剂例如在ERRγFRET实验(ERRγ激动剂诱导FRET响应增加的能力)中或本文所述的任何实验中具有0.001至10μM的EC50。优选地，ERRγ激动剂在本文所述的实验(例如下面实施例1的FRET实验)中具有0.001至1μM的EC50。
对于本发明药物组合产品的活性成分(商业可得的)而言，优选的剂量尤其是治疗有效的商业可得的剂量。
活性化合物的剂量取决于多种因素，例如给药方式、温血动物种类、年龄和/或个体情况。
相应活性成分或其药学上可接受的盐还可以以水合物或包括其它用于结晶的溶剂的形式使用。
对于所述适应征而言，准确剂量当然会根据所用的化合物、给药的方式和预期的治疗而变化。可以通过任何常规途径(非口服或优选口服)给药化合物。
当以约0.01至100mg/kg、更优选0.1至50mg/kg的日剂量给药时，可以得到期望的治疗效果。
对于较大的哺乳动物，推荐的总日剂量是约0.01至100mg/kg的化合物，方便地以单位剂量形式每天2至4次分剂量给药，所述单位剂量形式包含例如缓释形式的约10至约100mg化合物。
另一个优选的人类口服日剂量是1mg至1g，优选10mg至500mg例如10mg，或者10mg至200mg。
用于口服给药的适当单位剂量包含例如约10至约500mg活性成分即ERRγ激动剂。用于肠胃外给药的适当剂量包含例如约10至约500mg或者10至约200mg的化合物。可以用与本领域使用的公知标准方法相似的方式给药化合物。对于具体的化合物而言，适当的日剂量应取决于多种因素例如其活性的相对效价。相关领域的技术人员完全能够确定治疗有效剂量。
本发明化合物可以以游离碱或者作为药学上可接受的酸加成盐或季铵盐给药。可以以常规方式制备所述盐，并且这些盐具有与游离形式同样级别的活性。
如果所述化合物具有例如至少一个碱性中心，它们可以形成酸加成盐。如果需要的话，在存在另外的碱性中心情况下还可以形成相应的酸加成盐。具有酸基团(例如COOH)的化合物还可以与碱形成盐。例如用于组合的化合物可以作为钠盐、马来酸盐或二盐酸盐存在。活性成分或其药学上可接受的盐还可以以水合物形式或包含其它用于结晶的溶剂的形式使用。
根据本发明的药物组合物可以以本身公知的方式进行制备，并且该药物组合物是适于肠道(例如口服或直肠)和肠胃外给药至哺乳动物(温血动物)包括人的那些，上述药物组合物仅包含治疗有效量的药理活性化合物或还包含一种或多种药学上可接受的载体(尤其适合于肠道或肠胃外施用)。
由编号、普通名或商品名确定的活性物质的结构可以得自标准概要“默克索引(The Merck Index)”的现行版或数据库例如专利国际(例如IMSWorld Publications)。将其相应内容在此引入作为参考。本领域任何技术人员完全能够鉴定活性物质，并且，根据上述参考文献，同样能够制备它们并在体外和体内的标准实验模型中测试药物适应征和性能。
可以例如在临床研究或基本如下文所述的实验方法中用技术人员公知的方式证实药理学活性。
用于本发明用途和方法的优选ERRγ激动剂是GSK4716或GSK9089，并且在任何情况下任选其药学上的盐。
实验部分
用ERRγ激动剂进行下面的实施例，以显示ERRγ激动剂的所声称的活性。
实施例
下面的实施例是非限制性的，并且只代表本发明的各个方面和特性。
实施例1-用于分离ERRγ激动剂的筛选实验
用于检测结合和实施本发明的化合物的FRET实验(见图1.1)
将FRET实验进行设计，以便检测在共激活因子肽PGC-1α存在时激动剂-诱导的ERRγ活化。将下面的组分加到50μL的终体积中：(His)6-hERRγ LBD或GST-hERRγ LBD、铕-标记的抗-(His)6抗体或铕-标记的抗-GST抗体和Cy5-标记的PGC-1α肽(带有C-末端酸的Cy5-RPCSELLKYLTT(SEQ ID NO.4)，在AnaSpec定做和标记的)。混合物1包含在19μL缓冲液中的抗体、hERRγ LBD，将其加入到30μL混合物2中，混合物2含有在缓冲液中的Cy5-肽(1.6xHis-ERRγ-LBD，3.6mg/ml，MW 27KDa；2.得自AnaSpec的Cy5-PGC-1肽；3.得自西格玛(Sigma)的其它缓冲物质；4.得自珀金-埃尔默(Perkin Elmer)的EU-抗His6-Ab；和5.受试化合物)。在黑色384-孔板上进行实验，并且在用WallacVictor 2(珀金-埃尔默)读板仪测量FRET信号之前于室温培养3小时。将发射信号(665nm/615nm)的比率用于测定FRET实验的响应。在某些情况下，使用FRET信号对空白的比率，并且将其简单地定义为在蛋白存在下的FRET比率或无蛋白存在的FRET比率。将受试化合物以10mM的浓度溶解于DMSO中，并根据说明使用。
(a)表1 试剂列表
Figure A200780015597D00161
使用文献所述的作为ERRγ激动剂的两种化合物GSK4716(葛兰素史克公司；AJQ710)和GSK9089(葛兰素史克公司；LCN446。参见ZuercherWJ，Gaillard S，Miller-Orband LA等人(2005)，“作为雌激素相关的孤儿核受体ERRβ和ERRγ选择性激动剂的酚酰基腙类的鉴别和构效关系(Identification and structure-activity relationship of phenolic acylhydrazones as selective agonists for the estrogen-related orphan nuclearreceptors ERRβ and ERRγ)”，药物化学杂志(J Med Chem)，48：3107-9)来评估激动剂化合物的能力，所述能力是诱导铕-标记的抗-(His)6抗体/(His)6-hERRγ LBD复合物和Cy5-RPCSELLKYLTT(SEQ ID NO.4)之间的提高的FRET响应的能力。将化合物溶解于10mM DMSO中，并且剂量调整的浓度范围是从100μM降低至2nM。最终的DMSO浓度是2％。还准备了2％浓度的DMSO对照(没有化合物)。将所有的样品一式两份制备。如图1.2所示，AJQ710在最高测试浓度能够诱导FRET信号高达60％的增加。FRET响应是剂量-依赖的，并且由数据得到EC50为2.1μM。类似地，LCN446也诱导了剂量-依赖的FRET响应，在化合物的饱和浓度具有最高的70％的响应，其具有0.54μM的EC50。上述两个EC50值分别与AJQ710和LCN446等价物的报道值1.3μM和0.13μM相类似。
实施例2
AJQ710对小鼠原代肌管线粒体功能的作用鉴定
从FVB小鼠分离小鼠原代成肌细胞，并如Bare等所述保存。就实验方法而言，将小鼠成肌细胞于包含20％胎牛血清、1％青霉素/链霉素和2.5ng/mL bFGF(人重组体)的F-10/Ham’s培养基中培养至80％汇合。接着将细胞接种到6-孔板里(700,000细胞/孔)，并且在含有5％马血清和青霉素/链霉素的DMEM中培养36至48h以使其分化成肌管。将细胞用ERRγ/β激动剂AJQ710处理24h。完成的测定包括通过实时定量PCR(RT-PCR)分析基因表达、细胞色素c ELISA、柠檬酸合酶测定、脂肪酸氧化测定和呼吸测定。就RT-PCR、细胞色素c ELISA和柠檬酸合酶测定而言，将肌管用下述浓度的AJQ710处理：1μM、3μM、10μM和30μM。对于脂肪酸氧化测定而言，将肌管用下述浓度的AJQ710处理：10μM和30μM。对于呼吸测定而言，将肌管用30μM浓度的AJQ710处理。每个剂量一式三分进行测试，并且为了对照目的，将一系列用所使用的等体积DMSO处理的孔包括在每个实验的读数中。
为了用RT-PCR评价基因表达的目的，将RNA从细胞裂解液中分离，并且接着由该RNA合成cDNA。就RNA分离而言，将细胞在TRIzol(英杰(Invitrogen)，目录号15596-026，Carlsbad，CA)中匀化，并按厂商说明分离总RNA。用分光光度计定量RNA。
使用来自BD生物科学(BD Biosciences，目录号639562)的BD SprintTMPowerScriptTM试剂盒进行逆转录。采用得自应用生物系统(AppliedBiosystems)的根据实验需要的(Assay-on-Demand)引物探针(见后文表8-1的目录号)进行下述基因的实时定量PCR：B2M、ERRγ、ERRβ、ERRα、PGC-1α、PGC-1β、PPARα、PPARγ、PPARδ、COX-4、细胞色素c、UQCRB、CPT-1b、LCAD、MCAD、IDH3a、ATP-5b、UCP-2和UCP-3。
遵照生产商(应用生物系统)的说明完成Taqman实时定量PCR并进行分析。具体来讲，在10μl反应混合物中一式三份进行扩增。所述反应混合物包括：1X 
Figure A200780015597D00181
 Universal PCR Master Mix(应用生物系统公司，目录号4304437)、1X根据实验需要的引物探针和2μl cDNA样品。通过用由B2M内源性对照(应用生物系统，目录号Mm00437762_m1)测量的总cDNA标准化来计算基因表达。首先将样品在50℃培养2min以最适宜尿嘧啶(uracyl)-N-糖基化酶活性。PCR程序以在95℃变性10min开始，接着在384-孔热循环仪(珀金-埃尔默应用生物系统(Perkin-Elmer AppliedBiosystems))中进行40次95℃/15秒和60℃/1min的循环。每个扩增过程包含“无模板”对照(只有缓冲液和引物)。将扩增数据用7700序列检测器(Sequence Detector)收集并用珀金-埃尔默(应用生物系统)开发的序列检测系统(Sequence Detection System)软件分析。将反应阳性PCR结果的部分循环数称作循环域值(Ct)。
将缓冲液处理的细胞(0μM)表达标准化为值1，用2-ΔΔCt(如应用生物系统，Foster City，CA所述)计算每一组相对于B2M的平均基因表达值。将数据表示为平均值±SEM(n＝3个重复孔)。统计学显著性用Student’s t检验测定。
遵照生产商的说明书，使用来自R&D系统(R&D Systems)(目录号MCTC0，R&D系统，Minneapolis，MN)的大鼠/小鼠细胞色素c免疫测定试剂盒完成细胞色素c酶联免疫吸附测定(ELISA)。
按照本申请上面所述的方法完成柠檬酸合酶测定。
根据修改的公开方法(St-Pierre等人，JBC，278(29)，26597-603(2003))，在用AJQ710培养24小时的肌管中测量呼吸。将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次，并于37℃用2ml胰蛋白酶(美地泰克(Mediatech)，目录号25-052-CI)处理5min。不除掉胰蛋白酶，将加入10％ FBS的10ml DMEM加入到每孔中。将细胞转移到15ml试管中并于1000rpm离心5min。将细胞用培养液冲洗一次，并且沉淀细胞，然后再悬浮于实验缓冲液中，所述实验缓冲液包含在D-PBS(英杰，目录号14040-133)中的25mM葡萄糖(西格玛(Sigma)，目录号G-5400)、1mM丙酮酸盐(英杰(Invitrogen)，目录号11360-070)和2％牛血清蛋白(BSA)(MP生物医药(MP Biomedicals)，目录号103703)。将细胞悬浮液在实验缓冲液中稀释至每ml 1×106个细胞，并保持于37℃直到使用。根据Hansatech(Norfolk，UK)提供的说明，用Clark电极测量氧气消耗。每一测试使用一半的细胞悬浮液。寡霉素(MP生物医药，目录号151786)和FCCP(4-(三氟甲氧基)羰基氰化物苯腙)(西格玛，目录号C2920)的浓度分别是2μg/ml和2-5μM。实验一式三份进行。使用生产商提供的软件通过计算氧气消耗流量的斜率来测量呼吸速率。
使用Microsoft Excel和GraphPad Prism 4软件完成数据处理和图形生成。数据以平均值±SEM表示。在所有实验中，将每个剂量一式三份进行测试。对此的唯一例外是呼吸测量，其中实验被重复三次。使用双侧(two-tailed)Student’s t检验进行统计分析。
结果
发明人在用下述浓度AJQ710处理的分化型小鼠肌管中测定了线粒体基因表达的各种标记表达，所述浓度为：30μM、10μM、3μM和1μM。制备储备液以便将恒定体积的药物溶液加到每个板孔的细胞中。将所有效力与仅有溶媒(DMSO)的效力比较。被测试的线粒体通路/基因包括氧化磷酸化、脂肪酸氧化、三羧酸循环、ATP合酶和解偶联蛋白。此外，测定了与ERRγ功能相关的转录调节子的表达。对于几乎所有被测定的基因而言，发明人发现伴随AJQ710处理基因表达呈剂量-依赖性增加。所有的基因表达结果来自24-小时AJQ710处理。
随着AJQ710浓度的增加，氧化磷酸化的基因显示了增加的表达。当用30μM浓度的AJQ710处理时，COX-4表达增加了2倍，细胞色素c增加3.7倍(即从没有用AJQ710处理的1.0基因/B2M至用30μM浓度的AJQ710处理时的3.7基因/B2M)，并且UQCRB增加了2倍。
类似地，用AJQ710处理24-h后，所测试的与脂肪酸氧化相关的基因显示了剂量-依赖式的向上调节。用30μM的AJQ710处理后，CPT-1b表达增加超过3倍(即从没有用AJQ710处理的1.0基因/B2M至用30μM浓度的AJQ710处理时的3.0基因/B2M)，LCAD增加2.8倍，并且MCAD增加了1.6倍。
随着AJQ710剂量的增加，所测试的两种其它线粒体基因IDH3α(三羧酸循环的组件)和ATP-5b(ATP-合成酶)在表达中显示了剂量-依赖的诱导。用30μM的AJQ710处理24h后，IDH3α表达增加超过2倍(即从没有用AJQ710处理的1.0基因/B2M至用30μM浓度的AJQ710处理时的2.0基因/B2M)，并且ATP-5b增加了1.6倍。
发明人测量了解偶联蛋白UCP-2和UCP-3的mRNA表达。对所有AJQ710的剂量，UCP-2显示了边缘的(marginal)表达向上调节，用10μM处理后，其具有最高表达，即1.5倍。UCP-3显示了剂量-依赖的表达增加，超过3倍，即从没有用AJQ710处理的1.0基因/B2M至用30μM AJQ710处理后的3.0基因/B2M。
发明人测量了ERR家族响应激动剂对肌管的处理的表达。据称AJQ710激活ERRγ和ERRβ，但不激活ERRα和ERs(Zuercher等人，药物化学杂志(J.Med.Chem.)，48(9)，3107-9(2005))。用AJQ710处理后，与ERRβ或ERRγ相比，ERRα的表达被增加至更高的程度。用30μM的AJQ710处理后，ERRγ增加至1.4倍表达，ERRβ显示了表达1.5倍增加，并且ERRα显示了表达3.7倍增加。
还测量了共激活因子PGC-1α和PGC-1β的基因表达。这些转录物的表达显示了相似的剂量-依赖的表达增加，PGC-1α升高至1.9倍表达(即从没有用AJQ710处理的1.0基因/B2M至用30μM浓度的AJQ710处理时的1.9基因/B2M)，并且PGC-1β升高至1.8倍。
发明人进一步测量了在脂质代谢中起重要作用的核受体家族PPARs的基因表达。用AJQ710处理后，PPARα和PPARδ在表达中显示没有变化。PPARγ在表达中显示了剂量-依赖的增加，具有最大2.2倍表达(即从没有用AJQ710处理的1.0基因/B2M至用30μM的AJQ710处理后的2.2基因/B2M)。
为了在蛋白质水平上评价线粒体活性，进行了细胞色素c ELISA。细胞色素c是电子传递链的主要组件，并且大量蛋白质作为线粒体数目和氧化磷酸化活性的生物标记。发明人观察到随着用化合物处理细胞色素c剂量-依赖性增加，当将肌管用30μM AJQ710处理24h时具有88％的增加(图2.1)。
为了测量线粒体活性，测定了柠檬酸合酶活性。该酶通常被用作人肌肉中线粒体含量或活性的指示剂(Kelley等人，糖尿病(Diabetes)，51(10)，2944-50，2002)。柠檬酸合酶催化三羧酸循环的起始步骤，该步骤为氧化磷酸化提供底物。用30μM AJQ710处理24h的肌管显示柠檬酸合酶活性增加28％，而10μM和3μM处理分别显示增加8％和9％(图2.2)。
发明人还研究了线粒体基因表达的诱导对氧化磷酸化是否具有影响。在用AJQ710处理24h的小鼠原代肌管中测量了细胞呼吸。与呼吸链组分的表达的诱导一致，与用溶媒处理的对照相比，在用AJQ710处理的肌肉细胞中基础呼吸增加了37％(图2.3)。寡霉素-不敏感呼吸(质子漏)增加了36％，尽管该增加不是统计学显著的。在FCCP存在下，与用溶媒处理的对照细胞相比，AJQ710将呼吸速率提高了32％(图2.3)。这些结果说明ERRγ激动剂通过偶联的呼吸能提高线粒体氧化能力。
可从上述测试中观察到的线粒体功能的改善将表明在本文所要求保护的适应征中的治疗效果。
附图简述
图1.1显示FRET实验的示意图。
图1.2显示激动剂-诱导的FRET响应。
图2.1显示在用NVP-AJQ710-NX-2处理的小鼠肌管中细胞色素c的蛋白表达水平。
图2.2显示在用NVP-AJQ710-NX-2处理的小鼠肌管中的柠檬酸合酶活性。
图2.3显示在用NVP-AJQ710-NX-2处理的小鼠原代肌管中的细胞呼吸的测量。
实施例3-体重/肥胖症
使用21-23周龄的饮食-诱导的肥胖小鼠进行研究。研究的第一天，动物在上午7:30被禁食。在上午10:30进行体重测量和基础血样收集。将动物分成两组(n＝10/组)，两组之间的血糖值和体重匹配。使动物以5ml/kg的剂量体积口服溶媒(水)或化合物(30mg/kg)。每天在相同时间将日剂量的溶媒或化合物给药，总计28天。在研究期间测量每天的体重和食物摄取。化合物降低被治疗动物的体重，但不影响食物摄取。在28天期间每周使用EchoMRI全部身体组成分析仪(Whole Body Composition Analyzer)进行脂肪和瘦体重(Iean mass)分析。使用厂商提供的适当大小的持器(holders)完成扫描。给予药物的动物显示脂肪重量减少并伴随瘦体重增加。在研究的第24天，将动物放在CLAMS系统(哥伦布仪器公司(ColumbusInstruments)，Columbus，OH)中，该系统通过密封室里的空气样本取样测量消耗的氧气体积(VO2)和产生的二氧化碳体积(VCO2)。VO2是动物全部氧化能力的量度。用消耗的氧气体积除以产生的二氧化碳体积的比率来计算呼吸商(RQ)，呼吸商是底物利用的量度。如果动物使用脂肪作为主要的燃料来源，比率较接近于0.7；然而如果燃料来源是碳水化合物，RQ较接近于0.7。与对照动物相比，用药物治疗的动物表现更高的氧化能力。由于更高的燃烧脂肪的能力，被治疗的动物表现出更低的RQ水平。在研究的最后一天(第28天)，于上午10:30给予动物溶媒或化合物。在午后12:30取尾巴血样。然后将动物用二氧化碳安乐死。通过心脏穿刺收集最后的血样用于血液化学分析。
实施例4-2型糖尿病/代谢疾病
使用21-23周龄、饮食-诱导的肥胖小鼠进行研究。研究的第一天，动物在上午7:30被禁食。在上午10:30进行体重测量和基础血样收集操作。接着测量血糖值。把动物分成两组(n＝10/组)，两组之间的血糖值和体重匹配。在中午12点，使动物以5ml/kg的剂量体积口服溶媒(水)或化合物(30mg/kg)。在下午1:00点，取血样(在0min时)，接着以1g/kg(20％的葡萄糖水溶液)进行口服葡萄糖耐量实验(OGTT)，剂量体积为5ml/kg。在给予葡萄糖后30、60和120min收集血样。OGTT后重新喂食动物。每天中午12点，给予动物日剂量的溶媒或化合物，总计15天。研究期间每日测量体重和食物摄取。遵照上面所述的第1天的进行OGTT的方法，在研究期间的第7天和第14天进行另外两次OGTT。与对照动物相比，用药物治疗的动物表现出糖耐受提高，糖耐受是通过OGTT期间曲线下面积测量的。从第7天至第14天OGTT提高的大小呈时间-依赖的方式增加。在研究的最后一天(第15天)，小鼠在上午7:30被禁食，于上午10:30给予溶媒或化合物。在中午12:30取尾巴血样。接着将动物用二氧化碳安乐死。通过心脏穿刺收集最后的血样，用于血液化学分析。
血液收集和分析
研究期间通过尾巴流血采取血样。使用血糖仪(Ascensia Elite，BayerCorp.，Mishawaka，IN)测定血糖浓度。将血样收集在含有预防血液凝固的肝素锂的试管(Microvette CB300，Aktiengesellschaft & Co.，Numbrecht，德国)里。每一血样收集之前，将1μl 1∶10稀释的蛋白酶抑制剂混合物(西格玛(Sigma)，St.Louis，MO)加入到样品管里。血样收集后，离心之前将试管置于冰上。通过在4℃于10,000×g离心10min获得血样的血浆部分，然后在-80℃保存。使用Mouse Endocrine Lincoplex试剂盒(LincoResearch，Inc.，St.Charles，MO)通过Luminex分析来测量血浆胰岛素和胰高血糖素水平。与对照动物相比，用药物即ERRγ激动剂治疗的动物表现降低的血浆胰岛素水平。使用基于Amplex Red试剂盒(分子探针公司(Molecular Probes)，Eugene，OR)的荧光分析来测量血浆甘油三酯、脂肪酸和总胆固醇水平。用自动干式化学系统(SPOTCHEMEZ Analyzer，Heska，Fort Collins，CO)完成血液化学分析。用ERRγ激动剂治疗的动物表现出体重减少和脂质改善。
实施例5-血脂异常
使用21-23周龄的饮食-诱导的肥胖小鼠进行研究。研究的第一天，动物在上午7:30被禁食。在上午10:30进行体重测量和基础血样收集操作。把动物分成两组(n＝10/组)，两组之间的血糖值和体重匹配。使动物以5ml/kg的剂量体积口服溶媒(水)或化合物(30mg/kg)。每天在相同时间将日剂量的溶媒或化合物给药，总计15天。研究期间测量每天的体重和食物摄取。在15天期间使用EchoMRI全部身体组成分析仪进行两次脂肪和瘦体重分析。使用厂商提供的适当大小的持器进行扫描。在研究的最后一天(第15天)，动物在上午7:30被禁食，并于上午10:30给予动物溶媒或化合物。在中午12:30取尾巴血样。接着将动物用二氧化碳安乐死。通过心脏穿刺收集最后的血样用于血液化学分析。
血液收集和分析
研究期间通过尾巴流血采取血样。使用血糖仪(Ascensia Elite，BayerCorp.，Mishawaka，IN)测定血糖浓度。将血样收集在含有预防血液凝固的肝素锂的试管(Microvette CB300，Aktiengesellschaft & Co.，Numbrecht，德国)里。每一血样收集之前，将1μl 1:10稀释的蛋白酶抑制剂混合物(西格玛(Sigma)，St.Louis，MO)加入到样品管里。血样收集后，离心前将试管置于冰上。通过在4℃于10,000×g离心10min收集血样的血浆部分，接着在-80℃保存。使用Mouse Endocrine Lincoplex试剂盒(Linco Research，Inc.，St.Charles，MO)通过Luminex分析来测量血浆胰岛素水平。使用基于Amplex Red试剂盒(分子探针公司(Molecular Probes)，Eugene，OR)的荧光分析来测量血浆甘油三酯、脂肪酸和总胆固醇水平。与对照动物相比，用药物即ERRγ激动剂治疗的动物表现出减少的血浆甘油三酯、游离脂肪酸和总胆固醇水平。用自动干式化学系统(SPOTCHEM EZ Analyzer，Heska，Fort Collins，CO)完成血液化学分析。
实施例6-运动耐力
为了测量运动能力，使年龄-和体重-匹配的C57B16小鼠在带有电击板刺激的电动跑步机(Exer-6，哥伦布仪器公司(Columbus Instruments)，Columbus，OH)上跑步。实验开始的前一天使小鼠适应跑步机。在第一天，使小鼠从上午9点开始运动2小时。第一个小时跑步机速度是恒定的，并在第二个小时内每15分钟增加2米/min。实验期间跑步机的斜度是保持恒定的。直到每只小鼠精疲力竭并且不能待在跑步机上为止，通过测量时间和跑步机的速度来评估小鼠的运动能力。计算跑的总距离和完成的功作为运动能力的量度。还测量运动期间的氧气消耗(称为最大氧化能力)用于测定动物的运动耐力。接着将动物分成两组(每组n＝10)，两组之间的运动能力匹配。在中午12点，使动物以5ml/kg的剂量体积口服溶媒(水)或化合物即ERRγ激动剂(30mg/kg)。在中午12点给予日剂量的溶媒或化合物，总计28天。在研究期间每天测量体重和食物摄取。在研究的第14和27天，如上所述评估动物的运动能力。与对照动物相比，用药物治疗的动物能够跑更长的时间和距离。与对照个体相比，这些动物还表现出最大氧化能力增加。从研究的第14天至第27天治疗动物和对照动物之间的这些运动耐力参数的差异幅度增加。在第28天，在中午12点给予动物溶媒或化合物，并在中午12:30取尾巴血样。接着将动物用二氧化碳安乐死，并收集组织用于代谢和基因表达分析。通过心脏穿刺收集最后的血样用于血液化学分析。将血样收集在含有预防血液凝固的肝素锂的试管(MicrovetteCB300，Aktiengesellschaft & Co.，Numbrecht，德国)里。每一血样收集之前，将1μl 1∶10稀释的蛋白酶抑制剂混合物(西格玛(Sigma)，St.Louis，MO)加入到样品管里。血样收集后，离心前将试管置于冰上。通过在4℃于10,000×g离心10min收集血样的血浆部分，接着在-80℃保存。使用基于Amplex Red试剂盒(分子探针公司(Molecular Probes)，Eugene，OR)的荧光分析来测量血浆甘油三酯、脂肪酸和总胆固醇水平。用自动干式化学系统(SPOTCHEM EZ Analyzer，Heska，Fort Collins，CO)完成血液化学分析。与对照动物相比，用药物即ERRγ激动剂治疗的动物表现出减少的血浆甘油三酯、游离酸和总胆固醇水平。
实施例7-神经变性疾病
通过下述实验来评估对神经变性疾病的积极作用
动物
将来自雌性B6CBATg(HDexon1)62Gpb/1J小鼠(R6/2，Mangiarini等人，1996)的卵巢移植到雌性B6CBAF1/J小鼠，该雌性B6CBAF1/J小鼠是从杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(Bar Harbor，Maine)得到的，将其与B6CBAF1/J(杰克逊实验室，Maine)雄性小鼠一起喂养。在来自我们的群落的45只小鼠样品(雄性和雌性)中，重复长度测量为119-130cm。将来自7窝的小鼠(R6/2转基因的(TG)，n＝27，雄性＝14，雌性＝13)从21天龄一至实验到70天龄，并在84天龄时进行安乐死(见图1，实验时间点详述)。使小鼠住在温度(21-23℃)和湿度(30-70％)受控的房间里，并可随意获得食物和水，该房间采用可逆的光照-黑暗循环(上午10点熄灯，下午10点开灯)。测定在3周龄得到的断尾的DNA的基因型。使用购自Qiagen(Valencia，CA)的试剂盒分离DNA。采用在AM缓冲液(67mM Tris-HCl[pH8.8]，16.6mM NH4SO4，2.0mM MgCl2，0.17mg/ml BSA，10mM 2-巯基乙醇)中的FAM-标记的引物(5’-ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’)和(5’-GGCGGCTGAGGAAGCTGAGGA-3’)、10％ DMSO、200mM dNTPs、8ng/μl引物使用0.5U/ml Taq聚合酶，通过PCR测定CAG重复的大小。循环条件是：在94℃下90秒，25X(在94℃下30秒，在65℃下30秒、在72℃下90秒)，在72℃下10分钟。使用ABI序列分析仪及Genescan和Genotyper软件包测定PCR产物大小。CAG重复的大小是85bp，小于PCR产物的大小。所有实遵照NIBRI的机构动物关照和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)规定进行，并由其认可。
化合物给药(例如本文所述的ERRγ激动剂GSK4716或GSK9089)
从21至84天龄每周测量小鼠体重。在21天龄，将动物分成两组，并使动物以5ml/kg的剂量体积口服溶媒(水)或化合物即ERRγ激动剂(30mg/kg)。在每天相同时刻给药日剂量的溶媒或化合物，总计63天。在治疗末期进行行为表型测试。记录每只小鼠的死亡年龄。与未治疗的动物相比，用药物即ERRγ激动剂治疗的动物显示延长的存活时间。
行为测试
转轮(Running wheel)
将小鼠单独地放在装备有转轮(23cm直径，Mini Mitter CompanyInc.，Bend OR)的笼子里。在3min的时间段(bin)中用磁体检测轮子的每次旋转并用VitalView数据采集软件V4.0(Mini Mitter Company Inc.，同上)记录。将转轮笼子放在橱柜(8只笼子/橱柜)里以使光照和声音干扰(上午10点熄灯，下午10点开灯)降到最小。连续6-8天记录跑动(running)活动(大多数笼养7-8天WT，n＝12，R6/2n＝21)。使用ActiView V 1.2(MiniMitter Company Inc.，同上)计算光照期间和黑暗期间的轮转动活动。由每天的跑动活动或每次接触转轮的中间部分(在4.5-5.5或8.5-9.5周在转轮中的第3、4和5天全天)计算测量值。测量值包括：(1)第3、4和5天期间每一时间段(3min)的最大旋转数，(2)光照期间和黑暗期间每一时间段的平均活动，其得自在转轮中每个连续日，(3)每一时间段的平均光照活动和平均黑暗活动，其得自在转轮中第3、4和5天期间的平均活动，(4)在第3、4和5天晚上的夜间时期发生的中断数，(5)在转轮中第3、4和5天全天期间的总旋转数。当给药ERRγ激动剂化合物时，活动(例如旋转数和/或平均活动)得到提高。
转棒(Rotarod)
使用转棒装置(Ugo Basile，Varese，意大利)来测量运动协调和平衡。将轴用光滑的橡胶覆盖以防止小鼠爬到轴上。在大约黑暗期间的中间进行测试，使用红光(25W)照明。对测试房间适应15-20分钟后，采用与其它公开方法相似的加速方法(10min内4-40rpm)，让小鼠进行3次实验(实验之间间隔至少10min)。测量掉落的等待时间。如果小鼠不到20秒从转棒掉下来，立刻将该小鼠放回去(最多3次)。在基线(4周龄)对小鼠测试4天时间，并在8周龄测试3天。计算每只小鼠在基线和8周龄掉落的平均等待时间，并用于得出组平均值。ERRγ激动剂增加小鼠在转棒上的时间。
抓握力量
将一个带有吊架的弹簧重量计(飞世尔科技(Fisher Scientific)，Tustin，CA)悬挂在墙架上。让小鼠用前爪抓住吊架，然后观察者轻轻向下拉小鼠尾巴。将下拉力减去体重用于分析。让小鼠进行5次实验，其中3个最好的得分用于分析。ERRγ激动剂化合物提高抓握力量。
通过参照优选的实施方案对本发明进行了以上描述，但是，本领域技术人员将理解，在下面权利要求范围内，许多增加、删减和修改都是可能的。
在说明书中所引的全部专利和参考文献在此以全部内容引入作为参考。如有不一致，包括定义和解释，以本说明书为准。
其它实施方案对本领域技术人员是显而易见的。应当理解提供前面的详细描述仅用于阐明并且仅是示例性的。本发明的精神和范围不限于上述实施例，但是包括在下面权利要求书中。

Claims (12)

1.预防、治疗下列疾病或病症、延迟其进展或改善运动耐力的方法，所述疾病或病症选自糖尿病、胰岛素抵抗、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、肥胖症、超重、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病，该方法包括将治疗有效量的ERRγ激动剂给药至有其需要的温血动物包括人。
2.包含治疗有效量的ERRγ激动剂以及一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物用于预防、治疗下列疾病或病症、延迟其进展或改善运动耐力，所述疾病或病症选自糖尿病、胰岛素抵抗、血脂异常、运动耐力、肥胖症、超重、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
3.ERRγ激动剂或其药学上可接受的盐在制备预防、治疗下列疾病或病症、延迟其进展或改善运动耐力的药物中的用途，所述疾病或病症选自糖尿病、胰岛素抵抗、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、肥胖症、超重、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
4.根据权利要求3的用途、根据权利要求1的方法或根据权利要求2的药物组合物，其中所治疗的疾病选自2型糖尿病、代谢疾病/代谢综合征、血脂异常、神经变性疾病例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
5.根据权利要求3的用途、根据权利要求1的方法或根据权利要求2的药物组合物，其用于改善运动耐力。
6.预防2型糖尿病或延迟其进展的方法，所述方法包括将治疗有效剂量的ERRγ激动剂给药至患有IGM的温血动物包括人。
7.包含治疗有效量的ERRγ激动剂以及一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物用于在患有IGM的患者中预防2型糖尿病或延迟其进展。
8.ERRγ激动剂或其药学上可接受的盐在制备用于在患有IGM的患者中预防2型糖尿病或延迟其进展的药物中的用途。
9.根据任何一项前述权利要求的用途、治疗方法或药物组合物，其中ERRγ激动剂选自GSK4716或GSK9089，或在每种情况中它们药学上可接受的盐。
10.根据任何一项前述权利要求的用途、治疗方法或药物组合物，其中ERRγ激动剂的口服日剂量是10至500mg或者10至200mg。
11.根据任何一项前述权利要求的用途、治疗方法或药物组合物，其中ERRγ激动剂具有0.001至10μM或者0.001至1μM的EC50。
12.根据任何一项前述权利要求的用途、治疗方法或药物组合物，其中ERRγ激动剂在ERRγFRET实验例如实施例1的实验或本文所述的任何其它实验中具有0.001至10μM或者0.001至1μM的EC50。
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C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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