BRPI0711174A2 - uso de compostos orgánicos - Google Patents

Abstract

USO DE COMPOSTOS ORGáNICOS.A presente invenção refere-se ao uso de um agonista de (EERRy) ou seu sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, para a prevenção, retardo de progressão ou o tratamento de diabetes, resistência à insulina, doença metabólica /síndrome metabólica, dislipidemia, obesidade, sobrepeso, doenças neurodegenerativas como mal de Parkinson, mal de Alzheimer, mal de Huntington ou aperfeiçoamento da capacidade de resistência a exercício.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DECOMPOSTOS ORGÂNICOS".

A presente invenção refere-se ao uso*de um agonista de recep-tor gama relacionado a estrogênio (ERRy) ou um sal farmaceuticamente a-ceitável do mesmo para o tratamento de uma doença ou condição selecio-nada de diabetes preferivelmente diabetes tipo 2, resistência à insulina, do-ença métabólica / síndrome metabólica, dislipidemia, obesidade, super - pe-so, doenças neurodegenerativas como mal de Parkinson, mal de Alzheimer,mal de Huntington, ou aperfeiçoamento da capacidade de resistência a e-xercício, através de administração para o dito animal em necessidade de taltratamento de uma dose eficaz de pelo menos um agonista de receptor ga-ma relacionado a estrogênio ou um seu sal farmaceuticamente aceitável domesmo.

Os receptores relacionados a estrogênio (ERR) compreendem 3membros, ERRa, ERR|3, e ERRy1 que formam uma subfamília de receptoresnucleares órfãos para os quais Iigantes naturais ainda têm de ser identifica-dos. Os ERRs compartilham significante homologia de aminoácidos com oreceptor de estrogênio (ER) dentro de seus domínios de ligação de DNA(DBD) e domínios de ligação de Iigante (LBD), mas não respondem a estra-diol. Enquanto ERs são receptores ativados - ligantes, ERRs podem ativartranscrição dè gene em uma maneira constitutiva e sua habilidade de ativa-ção/pode ser determinada pela presença de co-ativadores transcricionais.Estudos estruturais confirmam esta verificação através de demonstração deque o LBD de ERRy podem adotar uma conformação transcricionalmenteativa e interagirem com um co-ativador de receptor de esteróide 1 (SRC-1)na ausência de qualquer ligante.

Dentro de seus DBD1 ERRycompartiIha 93% e 99% de identida-de de aminoácidos com ERRa e ERRp, respectivamente. Os ERRs são me-nos conservados dentro de seus LBDs (61% e 77% de identidade de amino-ácidos com ERRy vs. ERRa e ERRp1 respectivamente). O co-ativador, co-ativador-1a de receptor-y ativado por proliferador de peroxissoma (PGC-Ia)tem sido reportado para ser um ligante de proteína endógena para ERRa eERRy (Hentschke M1 et al. (2002) - PGC-1 and PERC, coactivators of theestrogen receptor-related receptor γ. Biochem Biophys Res Commun;299:872-9).

Evidências indicam que ERRa e PGC-1 a funcionam em concertopara regular a expressão de genes envolvidos em biogênese mitocondrial efosforilação oxidativa. ERRa, ERRy, e PGC-Ia são co-expressos em tecidosque utilizam oxidação de ácido graxo mitocondrial como sua fonte primária deenergia tais como músculo de esqueleto, coração, e rim (Hong H, Yang L, Stall-cup MR (1999) - Hormone-independent transcriptional activation and coactivatorbinding by novel orphan nuclear receptor ERR3. J Biol Chem; 274:22618-26), erecentemente foi mostrado que ERRy é um potente ativador para expressão degene ERRa, que é aperfeiçoada por PGC-1 α (Liu D, Zhang Z, Teng CT (2005)- Estrogen-related receptor-γ and peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1a regulate estrogen-related receptor-α gene expression via a con-served multi-hormone response element. J Mol Endocrinol; 34:473-87).

As proteínas LBD de ERRy foram mostradas serem ativas naausência de agonistas mas a atividade foi potencializada com. a adição deconhecidos compostos agonistas, GSK4716 (Glaxo-Smith-Kline; NVP-AJQ710) e GSK9089 (Glaxo-Smith-Kline; NVP-LCN446) (Zuercher WJ, et al.(2005) Identification and structureractivity relationship of phenolic acyl hydra-zones as selective agonists for the estrogen-related orphan nuclear recepíorsERFip and ERRy. J Med Chem; 48:3107-9).

O pedido de patente US 2005/0096384 especulou sobre o po-tencial uso de Iigantes tendo por alvo os receptores ERR. Este pedido espe-culou particularmente sobre o uso de antagonistas de ERR para o tratamen-to de várias indicações.

Dedicando-se a pesquisa neste campo, o requerente surpreen-dentemente verificou que ao contrário dos ensinamentos de US2005/0096384, somente estimulação de ativação de ERRy através do uso deagonistas de ERRy resulta em aperfeiçoada mitocondriogênese.

O requerente ainda verificou que estimulação de ativação deERRy com um agonista de ERRy, resulta em inesperados bons efeitos parao tratamento de uma doença selecionada de diabetes, diabetes tipo 2, resis-tência à insulina, doença metabólica / síndrome metabólica, dislipidemia,obesidade / superpeso, doenças neurodegenerativas, ou para o aperfeiçoa-mento da capacidade de resistência a exercício.

Para facilitar a formação de perfil de agonistas de ERRy, o re-querente desenvolveu um ensaio de transferência de energia de ressonânciade fluorescência (FRET) (descrito a seguir) que mede mudanças na intera-ção entre o LBD e um peptídeo co-ativador em resposta à ligação de ligante.

O ensaio (Zuercher, et al. 2005, "Identification and structure-activity relation-ship of phenolic acyl hydrazones as selective agonists for the estrogen-related orphan nuclear receptors ERRbeta and ERRgamma."; J Med Chem.2005 May 5;48(9):3107-9.) tem sido validado usando dois agonistas peque-nos conhecidos de ERRy, isto é, GSK4716 (Glaxo-Smith-Kline; AJQ710) eGSK9089 (Glaxo-Smith-Kline; LCN446).

As proteínas LBD de ERRy são mostradas serem ativas na au-sência de agonistas mas a atividade é potencializada com a adição de co-nhecidos compostos agonistas, GSK4716 (Glaxo-Smith-Kline) e GSK9089(Glaxo-Smith-Kline) (Zuercher, et al. 2005).

O termo "agonista de ERRy é pretendido indicar uma moléculaque exibe ativação da atividade de ERRy, tal como de 1-100% de ativação, eespecialmente preserva a ação de moléculas de substratos, Preferivelmenteo agonista de ERRy exibe uma EC50 compreendida entre 0,001 e 10 micro-molar (ou entre 0,001 e 1 micromolar) em um ensaio FRET ERRy (habilidadedo agonista de ERRy para induzir uma aumentada resposta FRET). Preferi-velmente o agonista de ERRy exibe uma EC5O compreendida entre 0,001 e10 micromolar (ou entre 0,001 e 1 micromolar) nos ensaios descritos abaixo.Preferivelmente o "agonista de ERRy" refere-se a uma molécula que quandoligada à seqüência LBD de ERRy, aumenta a quantidade de, ou prolonga aduração de, ou aperfeiçoa a atividade de ERRy. Agonistas podem incluir po-lipeptídeos, ácidos nucléicos, carboidratos, lipídeos, ou quaisquer derivadosdos mesmos, ou quaisquer outras moléculas.

Agonista de ERRy pode ser isolado através de seleção de compostoscomo descrito por Zuercher1 et al. 2005, or by Coward, P et al. - 2001, ("4-Hydroxytamoxifen binds to and deactivates the estrogen-related receptor gamma."Proc Natl Aead Sei USA. 2001 Jul 17;98(15):888Q-4. Epub 2001 Jul 10), andZhou G. et al. - 1998, (" Characterization by Fluorescence Resonance EnergyTransfer"; Mol. Endocrin. 1998,12,1594-1604), cujos ensaios são incorporados nopresente pedido de patente por referência. Preferivelmente os agonistas de ERRypodem ser isolados através da seleção de compostos como descrito no ensaiodescrito abaixo (ver parte experimental) desenvolvido pelo requerente.

No presente contexto "agonista de ERRy é também pretendidocompreender metabólitos ativos e suas pró-fármacos, tais como metabólitosativos e pró-fármacos de agonistas de ERRy. Um "metabólito" é um derivadoativo de um agonista de ERRy produzido quando o agonista de ERRy é me-tabolizado. Uma "pró-fármaco" é um composto que é tanto metabolizado aum agonista de ERRy como é metabolizado ao mesmo metabólito(s) comoum agonista de ERRy.

Agonistas de ERRy são conhecidos na técnica. Por exemplo,agonistas de ERRy são em cada caso genérica e especificamente mostra-dos, por exemplo, em Zuercher, et al., 2005.

Agonistas de ERRy preferidos são GSK4716 ou GSK9089.

GSK4716 é conhecido como 4-hidróxi-N'-(4-isopropil fenil metili-deno) benzoidrazida da fórmula

<formula>formula see original document page 5</formula>

e é descrito por Zuercher, et al. 2005.

GSK9089 (ou DY131) é conhecido como N'-(4-(dietilamino) fe-nilmetilideno)-4-hidróxibenzoidrazida da fórmula

<formula>formula see original document page 5</formula>e tem um número de registro CAS de 095167-41-2. O composto GSK9089 esua atividade sobre ERRy é também descrito por D. D. Yu and col. (Identifi-cation of an agonist Iigand for estrogen-related receptors ERRÕp Bioorg.Med. Chem. Lett. 15 (2005) 1311-1313) e por Zuercher, et al. 2005.

São especialmente preferidos inibidores de agonistas de ERRyoralmente ativos.

Qualquer uma das substâncias mostradas nos documentos depatente acima, aqui incluídos por referência, é considerada potencialmenteútil como agonistas de ERRy para serem usadas na concretização da pre-sente invenção.

Agonistas de ERRy para serem usados sozinhos de acordo coma invenção podem ser usados em associação com um veículo.

Um veículo no presente contexto é uma ferramenta (natural, sin-tética, peptídica, não-peptídica) por exemplo, uma proteína que transportasubstâncias específicas através da membrana de célula na ela é embutida edentro da célula. Diferentes veículos (naturais, sintéticos, peptídicos, não-peptídicos) são requeridos para transporte de diferentes substâncias, namedida em que cada uma é desenhada para reconhecer somente uma subs-tância, ou um grupo de substâncias similares.

Quaisquer meios de detecção conhecidos por aqueles versadosna técnica podem ser usados para detectar aassociaçãodos agonistas deERRycom um veículo, por exemplo, através de marcação de veículo.

Mais preferidos são agonistas de ERRy oralmente ativos e saisfarmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Os ingredientes ativos ou saisfarmaceuticamente aceitáveis dos mesmos de acordo com a presente inven-ção também podem ser usados na forma de um solvato, tal como um hidratoou incluindo outros solventes, usados para cristalização.

Foi agora surpreendentemente verificado que agonistas deERRy são úteis para a prevenção, retardo de progressão ou tratamento deuma doença ou condição selecionada de diabetes preferivelmente diabetestipo 2, resistência à insulina, doença metabólica / síndrome metabólica, disli-pidemia, obesidade, super - peso, doenças neurodegenerativas como mal deParkinson, mal de Alzheimer, mal de Huntington ou aperfeiçoamento da ca-pacidade de resistência a exercício.

A presente invenção assim refere-se eo uso de um agonista deERRy, por exemplo, GSK4716 ou GSK9089, ou seu sal farmaceuticamenteaceitável do mesmo, para a fabricação de um medicamento para a preven-ção, retardo de progressão, ou tratamento de uma doença ou condição sele-1 cionada de diabetes preferivelmente diabetes tipo 2, resistência a insulina,doença metabólica / síndrome metabólica, dislipidemia, obesidade, super -peso, doenças neurodegenerativas como mal de Parkinson, mal de Alzhei-mer, mal de Huntington, ou aperfeiçoamento da capacidade de resistência aexercício.

A presente invenção refere-se além disso a um processo para aprevenção, retardo de progressão ou tratamento de uma doença ou condi-ção selecionada de diabetes preferivelmente diabetes tipo 2, resistência àinsulina, doença metabólica / síndrome metabólica, dislipidemia, obesidade,super - peso, doenças neurodegenerativas como mal de Parkinson, mal deAlzheimer, mal de Huntington, ou aperfeiçoamento da capacidade de resis-tência a exercício, compreendendo administração a um animal de sanguequente, incluindo ser humano, em sua necessidade, de uma quantidade te-rapeuticamente eficaz de um agonista de ERRy preferivelmente GSK4716ou GSK9089.

) Ainda em uma concretização, a presente invenção refere-se auma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuti-camente eficaz de um agonista de ERRy em combinação com um ou maisveículos farmaceuticamente aceitáveis para o tratamento de uma doença oucondição selecionada de diabetes preferivelmente diabetes tipo 2, resistên-cia à insulina, doença metabólica / síndrome metabólica, dislipidemia, obesi-dade, super - peso, doenças neurodegenerativas como mal de Parkinson,mal de Alzheimer, mal de Huntington, ou aperfeiçoamento da capacidade daresistência a exercício.

Mais preferivelmente, de acordo com a presente invenção asdoenças ou danos tratados são selecionados de diabetes tipo 2, doença me-tabólica / síndrome metabólica, dislipidemia, doenças neurodegenerativascomo mal de Parkinson1 mal de Alzheimer, mal de Huntington, ou o agonistade HRRy é usado para aperfeiçoar capacidade de.resistência a exercício.

Na presente descrição, o termo "tratamento" inclui ambos, tra-tamento profilático ou preventivo assim como tratamento de cura ou de su-pressão de doença, incluindo tratamento de pacientes em risco de contraí-rem a doença ou suspeitos de terem contraído a doença assim como pacien-tes doentes. Este termo ainda inclui o tratamento para o retardo de progres-são da doença.

O termo "curativo" como aqui usado significa eficácia em trata-mento de doenças existentes.

O termo "prevenção" significa administração profilática da com-binação a pacientes saudáveis para prevenir a deflagração das condiçõesaqui mencionadas. Além disso, o termo "prevenção" significa administraçãoprofilática de tal combinação a pacientes estando em um pré-estágio dascondições a serem tratadas.

O termo "profilático" significa a prevenção do início ou recorrên-cia de doenças ou danos.

O termo "retardo de progressão" como aqui usado significa ad-ministração do composto ativo a pacientes estando em um pré-estágio ouem uma fase iniciaLda .doença a sér tratada, em que pacientes por exemploem uma pré-forma da correspondente doença são diagnosticados ou cujospacientes estão em uma condição, por exemplo, durante um tratamento mé-dico ou uma condição resultando de um acidente, sob a qual é provável queuma correspondente doença se desenvolva.

A síndrome metabólica é um agrupamento de fatores de riscoque aumenta grandemente o risco de ocorrência de um evento cardiovascu-lar: diabetes ou pré-diabetes, obesidade abdominal, mudanças em colesterole alta pressão sangüínea. Embora até 80 por cento dos quase 200 milhõesde adultos em todo o mundo com diabetes morrerão de doença cardiovascu-lar, pessoas com síndrome metabólica também estão em risco aumentado,sendo duas vezes prováveis de morrerem e três vezes prováveis de teremum ataque cardíaco ou acidente vascular cerebral comparadas a pessoassem a síndrome. Pessoas com síndrome metabólica têm um risco cinco ve-zes maior de desenvolverem diabetes tipo 2 (se já não presente). É a exatanatureza do agrupamento que parece trazer adicional risco sobre e acimadaquele que pode ser esperado de cada um dos componentes (triglicerídeosaltos quando medindo colesterol, por exemplo). Para uma pessoa ser defini-da comovendo a síndrome metabólica, a definição requer que ela tenha o-besidade central, plus dois dos seguintes quatro fatores adicionais: triglicerí-deos elevados, colesterol HDL reduzido, elevada pressão sangüínea, ou e-levado nível de glicose no plasma em jejum. Gênero e etnia também sãofatores levados em consideração na definição de síndrome metabólica.

O termo "diabetes" como aqui usado significa diabetes tipo 2,diabetes tipo 1 e diabetes auto-imune latente de adulto (LADA), preferivel-mente diabetes é diabetes tipo 2.

Diabetes tipo 2 usualmente se desenvcilve em pessoas comomais de 40 anos ou pessoas que estão com dobre peso (obesas). Em geral,o tratamento de pacientes de diabetes tipo 2 não envolve terapia de insulinamas modificação de certos aspectos de estilo de vida (por exemplo, exercí-cio, perda de peso, uma dieta restrita) e algumas vezes antidiabéticos oraissão suficientes para controle de níveis de glicose no sangue. Diabetes tipo 2(diabetes mellitus d© início - adulto) genericamente ocorre quando o corpodesenvolve resistência à insulina como um resultado de fatores genéticos eobesidade, e é tipicamente diagnosticada na idade adulta. Resistência à in-sulina causa hiperglicemia e, devido a prolongada demanda por produção deinsulina, deterioração das células beta pancreáticas. A combinação de resis-tência à insulina e diminuída função de célula beta por último causa diabetestipo 2.

Diabetes tipo 1 é freqüentemente diagnosticada na infância, e éalgumas vezes referida como diabetes juvenil por esta razão. O diagnósticoinicial é importante para prevenir algumas das complicações mais sérias dediabetes, que incluem doença cardíaco, cegueira, alta pressão sangüínea,dano ao nervo, e insuficiência renal. Entretanto, embora diabetes tipo 1 te-nha tendência de ocorrer mais freqüentemente em indivíduos magros, jo-vens, usualmente antes de 30 anos de idade, pacientes mais velhos tambémapresentam esta forma de diabetes. Este tipo de diabetes tipo 1 é usualmen-te referido como diabetes auto-imune latente de idade adulta (LADA). Comodiabetes tipo 1 juvenil mais comum, LADA é causada por destruição media-da - imune das células beta pancreáticas produzindo insulina. LADA é tam-bém corífiecida como diabetes tipo 1 de início lento, diabetes auto-imune deinício tardio de idade adulta, e diabetes tipo 1. A principal diferença entrediabetes tipo 1 juvenil e LADA é a idade de diagnóstico - genericamente trin-ta anos ou mais. Um processo para o diagnóstico de LADA é descrito, porexemplo, no pedido de patente W02005054512 A2. Assim, diabetes tipo 1pode estar presente em qualquer idade, e os fatores que determinam a ida-de de manifestação clínica não são conhecidos.

Metabolismo de glicose prejudicado (IGM) é definido por níveisde glicose no sangue que estão acima da faixa normal mas não são altos osuficiente para satisfazerem os critérios diagnósticos para diabetes mellitustipo 2. A incidência de IGM varia de país para país, mas usualmente ocorre2-3 vezes mais freqüentemente que diabetes aberta. Até recentemente, indi-víduos com IGM foram sentidos serem pré-diabéticos, mas dados de váriosestudos epidemiológicos argumentam que_sujeitos com IGM são heterogê-neos com respeito a seu risco de diabetes e seu risco de morbidez e morta- 'Iidade cardiovascular. Os dados sugerem que sujeitos com IGM, em particu-lar IGT, nem sempre desenvolvem diabetes, mas se eles são diabéticos ounão, eles são, não obstante, em alto risco para morbidez e mortalidade car-diovascular.

Entre sujeitos com IGM, cerca de 58% têm tolerância a glicoseprejudicada (IGT), outros 29% têm glicose de jejum prejudicada (IFG), e 13%têm ambas anormalidades (IFG/IGT). IGT é caracterizada por elevada hiper-glicemia pós-prandial (pós-refeição) enquanto IFG foi definida pela ADA (verTabela abaixo) nas bases de valores glicêmicos em jejum.

Sobrepeso: perda de peso, isto é, tratamento / prevenção / re-tardo de sobrepeso, é desejável no caso de diabetes, obesidade e superpe-so de indivíduos. Perda de peso, isto é, tratamento / prevenção / retardo desuper - peso, pode auxiliar na prevenção de muitas destas conseqüênciasdanosas, particularmente com relação a diabetes e doença cardiovascular(CVD). Perda de peso também pode reduzir pressão sangüínea em ambosindivíduos hipertensos com superpeso e não-hipertensos; níveis de triglicerí-deos em soro e aumenta a forma de lipoproteína de alta densidade (HDL)benéfica "de colesterol. Perda de peso também genericamente reduz umpouco os níveis de colesterol lipoproteína de baixa densidade (LDL) e lipo-proteína de alta densidade HDL) no soro. Perda de peso também pode re-duzir níveis de glicose no sangue em pessoas de superpeso e obesas.

Perda de peso, e dietas hipocalóricas, também são alvos primá-rios para o controle de níveis de glicose em plasma no tratamento de diabe-tes tipo 2. Assim o controle de apetite e a perda de peso são desejáveis parao tratamento de diabetes tipo 2. O termo "tratamento de super - peso" cobre,por exemplo, redução de gordura corporal ou perda de peso.

O termo "perda de peso" refere-se a perda de uma porção depeso corporal total.

O termo "redução de gordura corporal" significa perda de umaporção de gordura corporal.

A fórmula para índice de Massa de Corpo (BMI) é [peso em li-bras altura em polegadas altura em polegadas] χ 703. Pontos de corteBMI para humanos adultos são um número fixo, independente de idade ousexo, usando as seguintes diretrizes: indivíduos adultos humanos de super -peso têm um BMI de 25,0 a 29,9. Adultos humanos obesos têm um BMI de30,0 ou mais. Adultos de subpeso têm um BMI de menos que 18,5. Umafaixa de peso corporal normal para um adulto é definida como um BMI entre18,5 e 25. Pontos de corte de BMI para crianças abaixo de 16 são definidosde acordo com percentis: Superpeso é definido como um BMI para idademaior que >85° percentil e obesidade é definida como um BMI-para-idade>950opercentil. Subpeso é um BMI-paraHdade<5° percentil. Uma faixade peso corporal normal para uma criança é definida como um BMI acima de5o percentil e abaixo de 85° percentil.Preferivelmente o distúrbio neurodegenerativo é selecionado decondições e doenças como demência (por exemplo, demência senil, demên-cia pré-senil (também conhecida como prejuízo Gognitivo suave), demênciarelacionada a mal de Alzheimer (demência tipo Alzheimer)), mal de Hunting-ton, coréia de Huntington, distúrbios de confusão aguda e especialmenteaqueles onde necrocitose apoptótica desempenha uma parte, tal como es-clerose lateral amiotrófica, glaucoma, esclerose múltipla, enxaqueca, aciden-te vascular cerebral, isquemia cerebral, e mal de Parkinson e especialmentemal de Alzheimer.

Mais preferivelmente o distúrbio neurodegenerativo é seleciona-do de mal de Alzheimer e demência, preferivelmente demência senil, prejuí-zo cognitivo suave, ou demência tipo Alzheimer.

Mais preferivelmente o distúrbio neurodegenerativo é mal de Al-zheimer, mal de Parkinson ou mal de Huntington.

A invenção também refere-se a uma composição farmacêuticacompreendendo, como ingredientes ativos, um agonista de ERRy, em formalivre ou em forma de um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Um outro aspecto da presente invenção é o uso de uma compo-sição farmacêutica compreendendo, como ingredientes ativos um agonistade ERRy preferivelmente GSK4716 ou GSK9089, em forma livre ou em for-ma de um sal do mesmo farmaceuticamente aceitável para a preparação deuma composição farmacêutica para a prevenção, retardo de progressão, outratamento de diabetes preferivelmente diabetes tipo 2, resistência à insuli-na, doença metabólica / síndrome metabólica, dislipidemia, obesidade, super- peso, doenças neurodegenerativas como mal de Parkinson, mal de Al-zheimer, mal de Huntington, ou aperfeiçoamento da capacidade de resistên-cia a exercício.

A invenção também refere-se a um processo para a prevenção,retardo de progressão ou tratamento de diabetes preferivelmente diabetestipo 2, resistência à insulina, doença metabólica / síndrome metabólica, disli-pidemia, obesidade, super - peso, doenças neurodegenerativas como mal deParkinson, mal de Alzheimer, mal de Huntington, ou aperfeiçoamento da ca-pacidade de resistência a exercício, compreendendo administração a umanimal de sangue quente, incluindo ser humano, em sua necessidade dequantidades terapeuticamente eficazes em conjunto de uma composiçãofarmacêutica compreendendo, como ingredientes ativos um agonista deERRy preferivelmente GSK4716 ou GSK9089, em forma livre ou em formade um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção po-dem ser preparadas em uma maneira conhecida per se e são aquelas apro-priadas para administração enteral, tal como oral ou retal, e parenteral amamíferos (animais de sangue quente), incluindo ser humano, compreen-dendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto farmacologi-camente ativo, sozinho ou em combinação com um ou mais veículos farma-ceuticamente aceitáveis, especialmente apropriados para aplicação enteralou parenteral.

Estas preparações farmacêuticas para administração enteral, talcomo oral, e também retal ou parenteral, a homeotermas, com as prepara-ções compreendendo o composto farmacológico ativo tanto sozinho comojunto com usuais substâncias auxiliares farmacêuticas. Por exemplo, as pre-parações farmacêuticas consistem em cerca de 0,1% a 90%, preferivelmen-te de cerca de 1% a cerca de 80%,-do-composto ativo. Preparações farma-cêuticas-para administração enteralrou parenteral, e também ocular estão,por exemplo, em formas de dose unitária, como comprimidos revestidos,comprimidos, cápsulas ou supositórios e também ampolas. Estes são prepa-rados em uma maneira que é conhecida per se, por exemplo, usando con-vencionais processos de mistura, granulação, revestimento, solubilização, ouliofilização. Assim, preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obti-das através de combinação de composto ativo com excipientes sólidos, sedesejado granulando uma mistura que foi obtida, e, se requerido ou neces-sário, processando a mistura ou granulado em comprimidos ou núcleos decomprimidos revestidos após adição de apropriadas substâncias auxiliares.

A dosagem do composto ativo pode depender de uma variedadede fatores, como o modo de administração, espécies homeotérmicas, idadee/ou condição individual.

Pacientes preferidos para os usos ou processos de acordo coma presente invenção são pacientes ou animais sofrendo de diabetes (preferi-velmente diabetes tipo 2), IGM (preferivelmente IGT), obesidade ou super -peso, doença metabólica, dislipidemia, doença neurodegenerativa, ou baixacapacidade de resistência a exercício.

Λ Ainda em uma concretização preferida a presente invenção refe-re-se a composições, usos ou processos de acordo com a presente inven-ção para a prevenção, ou retardo de progressão, de diabetes (preferivelmen-te diabetes tipo 2), em um paciente sofrendo de IGM (preferivelmente IGT).

Por isso a invenção também refere-se:

- a um processo para a prevenção ou retardo de progressão de diabetes tipo2, compreendendo administração a um animal de sangue quente, incluindoser humano, sofrendo de IGM, preferivelmente IGT, de uma quantidade te-rapeuticamente eficaz de um agonista de ERRy.

- uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuti-camente eficaz de um agonista de ERRy em combinação com um ou maisveículos farmaceuticamente aceitáveis para a prevenção, ou retardo de pro-gressão de diabetes tipo 2, em um paciente sofrendo de IGM, preferivelmente IGT.

- o uso de um agonista de ERRy ou um sal farmaceuticamente aceftável domesmo, para a fabricação de um medicamento para a prevenção, ou retardode progressão de diabetes tipo 2, em um paciente sofrendo de IGM, preferi-velmente IGT.

A invenção também refere-se a qualquer uma das composiçõesfarmacêuticas aqui descritas, processos ou usos, em que o agonista deERRy exibe uma EC50 compreendida entre 0,001 e 10 micromolar, por e-xemplo, em um ensaio FRET de ERRy (habilidade do agonista de ERRy in-duzir uma resposta FRET aumentada) ou em qualquer dos ensaios aquidescritos. Preferivelmente o agonista de ERRy exibe uma IC50 compreendidaentre 0,001 e 1 micromolar nos ensaios aqui descritos (por exemplo, ensaioFRET de exemplo 1 abaixo).Dosagens preferidas, para aqueles ingredientes da combinaçãofarmacêutica de acordo com a presente invenção que são comercialmentedisponíveis, são especialmente dosagens comercialmente disponíveis tera-peuticamente eficazes.

A dosagem do composto ativo pode depender de uma variedadede fatores, tais como o modo de administração, espécies homeotérmicas,idade e/óü condição individual.

O correspondente ingrediente ativo ou um sal fármaceuticamen-te aceitável do mesmo também pode ser usado em forma de um hidrato ouincluir outros solventes usados para cristalização.

Para estas indicações, a exata dosagem é claro irá variar de-pendendo do composto empregado, modo de administração e tratamentodesejado. O composto pode ser administrado através de qualquer rota con-vencional, não-oral ou preferivelmente oralmente.

Resultados terapêuticos esperados são obtidos quando adminis-trados em uma dosagem diária de cerca de 0,01 a 100 mg/kg, doses maispreferidas variaram de 0,1 a 50 mg/kg.

Para os mamíferos maiores, uma dosagem diária total está nafaixa de cerca de 0,01 a 100 mg/kg do composto, convenientemente admi-nistrada em doses divididas 2 a 4 vezes por dia em forma de dosagem unitá-ria contendo, por exemplo, de cerca de 10 a cerca de 100 mg do compostoem forma de liberação sustentada.

Uma outra dosagem oral diária preferida está entre 1 mg e 1 g,preferivelmente entre 10 mg e 500 mg, por exemplo, 10 mg, ou entre 10 mge 200 mg.

Apropriadas doses unitárias para administração oral contêm, porexemplo, cerca de 10 a cerca de 500 mg do ingrediente ativo, isto é, agonis-ta de ERFty Apropriadas doses para administração parenteral contêm, porexemplo, cerca de 10 a cerca de 500 mg ou 10 a cerca de 200 mg do com-posto.

Os compostos podem ser administrados em maneira similar apadrões conhecidos para usos nestas utilidades. A dosagem diária apropria-da para um particular composto dependerá de um número de fatores tal co-mo sua relativa potência de atividade. Aqueles versados na técnica são intei-ramente capazes de determinar a dosagem terapauticamente eficaz.

O composto da invenção pode ser administrado em base livre oucomo um sal de amônio quaternário ou de adição ácida farmaceuticamenteaceitável. Tais sais podem ser preparados em maneira convencional e exi-1 bem a mesma ordem de atividade como as formas livres. Se estes compos-tos têm, por exemplo, pelo menos um centro básico, eles podem formar saisde adição ácida. Correspondentes sais de adição ácida também podem serformados tendo, se desejado, um centro básico adicionalmente presente. Oscompostos tendo um grupo ácido (por exemplo, COOH) também podemformar sais com bases. Por exemplo, os compostos a serem combinadospodem estar presentes como um sal de sódio, como um maleato ou comoum dicloridrato. O ingrediente ativo ou um seu sal farmaceuticamente aceitá-vel também pode ser usado em forma de um hidrato ou incluir outros solven-tes usados para cristalização.

Composições farmacêuticas de acordo com a invenção podemser preparadas em uma maneira conhecida per se e são aquelas apropria-das para administração enteral, tal como oral ou retal, e parenteral a mamí-feros (animais de sangue quente), incluindo ser humano, compreendendouma quantidade terapeuticamente eficaz do composto farmacologicamenteativo, sozinho ou em combinação com um ou mais veículos farmaceutica-mente aceitáveis, especialmente apropriados para aplicação enteral ou pa-renteral.

A estrutura dos agentes ativos identificados por números de có-digo, nomes genéricos ou comerciais pode ser tomada da edição atual docompêndio-padrão "The Merck Index" ou de bases de dados, por exemplo,Patents International (por exemplo, IMS World Publications). O seu corres-pondente conteúdo é aqui incorporado por referência. Aqueles versados natécnica são inteiramente capazes de identificar os agentes ativos e, baseadonestas referências, da mesma maneira capacitados para fabricação e testede indicações e propriedades farmacêuticas em modelos testes padrões, invitro e in vivo.

A atividade farmacológica pode, por exemplo, ser demonstradaem um estudo clínico ou no procedimento teste como essencialmente descri-to a seguir em uma maneira conhecida por aqueles versados na técnica.

Preferidos agonistas de ERRy para os usos e processos da'presente invenção são GSK4716 ou GSK9089 e opcionalmente em qual-1 quer caso seus sais farmacêuticos.

Parte Experimental

Os seguintes exemplos são realizados com agonistas de ERRypara mostrar sua atividade reivindicada.

Exemplos

Os exemplos abaixo são não-limitantes e são meramente repre-sentativos de vários aspectos e características da presente invenção.

Exemplo 1 - Ensaio de seleção para isolar agonistas de ERRyEnsaio FRET para detectar ligação e compostos úteis para realizar a presen-te invenção (vide figura 1.1)

O ensaio FRET é desenhado para detectar ativação de ERRyinduzida por agonista na presença do co-ativador peptídeo PGC-1a. Os se-guintes componentes foram adicionados em um volume final de 50 μL:(His)6-hERRy LBD ou GST-hERRy LBD, anticorpo anti-(His)6 marcado com

Európio ou anticorpo anti-GST marcado com Európio e peptídeo. PGC-1αmarcado com Cy5 (Cy5-RPCSELLKYLTT (SEQ ID NO. 4) com ácido ter-minal C, fabricado e marcado em AnaSpec). Mistura 1 conteve anticorpo,hERRy LBD em tampão em um volume de 19 μί e foi adicionada a 30 μί deMistura 2 que conteve peptídeo-Cy5 em tampão (1. 6xHis-ERRy-LBD, 3,6mg/mL, PM 27 KDa; 2. Cy5-peptídeo PGC-1 de AnaSpec; 3. Outros compo-nentes tampões de Sigma; 4. EU-antiHiSe-Ab de Perkin Elmer; e 5. Compos-tos testes). Os ensaios foram realizados em placas negras de 384 cavidadese incubadas em temperatura ambiente por 3 horas antes de sinais FRETserem medidos usando um leitor de placa Wallac Victor 2 (Perkin Elmer). Arazão de sinais de emissão (665 nm / 615 nm) foi usada para determinar aresposta de ensaio FRET. Em alguns casos, a razão de sinal FRET parafundo foi usada e esta é simplesmente definida como a razão FRET na pre-sença de proteína ou razão FRET na ausência de proteína. Os compostostestes foram dissolvidos em DMSO em 10 mM e usados como indicado.

(a) Tabela 1 Lista de Reagentes

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A habilidade de compostos agonistas para induzir uma aumen-tada resposta FRET entre o complexo de anticorpo anti-(His)6 marcado comEurópio/(His)6-hERRy LBD e Cy5-RPCSELLKYLTT (SEQ ID NO. 4) foi ava-liada através do uso de dois compostos descritos na literatura como agonis-tas de ERRy, GSK4716 (Glaxo-Smith-Kline; AJQ710) e GSK9089 (Glaxo-Smith-Kline; LCN446). Ver-ZuercherWJ1 Gaillard S, Miller-Orband LA, et al.(2005), "Identification and structure-activity relationship of phenolic acyl hy-drazones as selective agonists for the estrogen-related orphan nuclear re-ceptors ERRp e ERR/, J Med Chem; 48:3107-9). Os compostos foram so-lubilizados em DMSO 10 mM e a faixa de concentração da titulação foi de100 μΜ descendo para 2 nM. A concentração final de DMSO foi de 2%. Umcontrole DMSO (sem composto) em 2% também foi preparado. Todas asamostras foram feitas em duplicata. Como mostrado na Figura 1.2, AJQ710foi capaz de induzir um aumento de até 60% no sinal FRET na mais altaconcentração testada. A resposta FRET é dependente de dose e uma EC5020 de 2,1 μΜ foi derivada dos dados. Similarmente, LCN446 também induziuuma resposta FRET dependente de dose tendo uma resposta máxima de70% em concentrações saturantes de composto com uma EC5O de 0,54 μΜ.Ambas EC5O1S foram similares aos valores reportados de 1,3 μΜ e 0,13 μΜpara os equivalentes AJQ710 e LCN446, respectivamente.

Exemplo 2

Caracterização de AJQ710 sobre função mitocondrial em miotu-bos de camundongo primário

Mioblastos de camundongo primário de camundongos FVB fo-ram isolados e mantidos como descrito em Bare et ai. Para experimentação,mioblastos de camundongo foram crescidos para 80% de confluência emmeios F-10/Ham's contendo soro bovino fetal 20%, penicilina / streptomicina1% e 2,5 ng/mL bFGF (recombinante humano). As células foram então re-vestidas para 700 000 células por cavidade em placas de 6 cavidades, edeixadas diferenciar em miotubos por 36 a 48 horas em DMEM contendosoro eqüino 5% e penicilina / streptomicina. As células foram tratadas com oagonista de ERRy/β AJQ710 por 24 horas. Ensaios realizados incluíram aná-lise de expressão de gene através de PCR quantitativa de tempo real (RT-PCR), citocromo c ELISA, ensaio de citrato sintase, ensaio de oxidação deácido graxo, e um ensaio de respiração. Para os ensaios de RT-PCR, cito-cromo c ELISA e citrato sintase, miotubos foram tratados com AJQ710 nasseguintes concentrações: 1 μΜ, 3 μΜ, 10. μΜ, e 30 μΜ. Para o ensaio deoxidação de ácido graxo, miotubos íoram tratados com AJQ710 nas seguin-tes concentrações: 10 μΜ, e 30 μΜ. Para o ensaio de respiração, miotubosforam tratados com AJQ710 em uma concentração de 30 μΜ. Cada dose foitestada em triplicata, e um conjunto de cavidades tratado com um volumeequivalente de DMSO usado foi incluído em cada leitura experimental parapropósitos de controle.

Para o propósito de avaliação de expressão de gene por RT-PCR, ARN foi isolado de Iisatos de células, e ADNc foi subseqüentementesintetizado a partir deste ARN. Para isolamento de ARN, células foram ho-mogeneizadas em TRIzoI (Invitrogen, número de catálogo 15596-026, Carls-bad, CA), e ARN total foi isolado seguindo as instruções do fabricante. ARNfoi quantificado usando o espectrofotômetro.Transcrição reversa foi realizada usando o kit BD Sprint Po-werScript de BD Biosciences (número de catálogo 639562). PCR de temporeal quantitativa para os seguintes genes foi realizada usando sondas inicia-doras Assay-on-Demand de Applied Biosystems (Ver Post-text Table 8-1para números de catálogos):): B2M, ERRϒ, ERRβ, ERRα, PGC-1a, PGC-Ιβ,PPARa, PPARy, PPARõ, COX-4, citocromo c, UQCRB, CPT-Ib1 LCAD,MCAD, IDH3a, ATP-5b, UCP-2, e UCP-3.

PCR quantitativa de tempo real foi realizada e analisada seguin-do as instruções do fabricante (Applied Biosystems). Especificamente, ampli-ficação foi realizada em triplicata, em 10 μL de mistura de reação. A misturade reação incluiu: IXtaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosys-tems, número de catálogo 4304437), 1X de sonda iniciadora Assay-on-Demand, e 2 μι. de amostra de ADNc. Expressão de gene foi calculada atra-vés de normalização de ADNc total como medido através de controle deB2M endógena (Applied Biosystems, número de catálogo Mm00437762 m1).As amostras foram inicialmente incubadas por 2 minutos a 50°C para ótimaatividade uracil-N-glicosilase. O programa PCR partiu com uma desnatura-ção a 95°C por 10 minutos, seguida por 40 ciclos de 95°C/15 segundos e60°C/1 minuto em um ciclizador térmico de 384 cavidades (Perkin-Elmer Ap-plied Biosystems). Cada corrida de amplificação conteve controles "nenhummolde" (tampão e iniciadores somente). Dados de amplificação foram cole-tados através do detetor 7700 Sequence e analisados usando o softwareSequenee Detection System desenvolvido por Perkin-Elmer (Applied Biosys-tems). O número de ciclo fracionário refletindo um resultado PCR positivo échamado o limite de ciclo (Ct).

Valores de expressão de gene médios foram calculados paracada grupo em relação a B2M, usando 2 (como descrito por Applied Bi-osystems, Foster City, CA) com a expressão nas células tratadas com veícu-lo (0 μΜ) normalizada para um valor de 1. Os dados são expressos comomédia ± média de erro padrão (n = 3 cavidades réplicas). Significância esta-tística foi medida usando teste de Student.

O ensaio imuno-sorvente ligado a enzima citocromo c (ELISA)foi realizado usando o kit Rat/Mouse Cytochrome c Immunoassay de R&DSystems (número de catálogo MCTCO, R&D Systems, Minneapolis, MN) se-guindo as intruções do fabricante.

O ensaio de citrato sintase foi realizado seguindo o procedimen-to descrito acima neste pedido de patente.

A respiração foi medida em miotubos incubados com AJQ7101 por 24 horas de acordo com o processo publicado com modificações (St-Pierre1 et al., JBC1 278(29):26597-603 (2003)). Células foram lavadas umavez com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e tratadas port 5 mi-nutos a 37°C com 2 mL de tripsina (Mediatech, número de catálogo 25-052-Cl). Sem remoção de tripsina, 10 mL de DMEM plus FBS 10% foram adicio-nados em cada cavidade. As células foram transferidas para um tubo de 15mL e centrifugadas por 5 minutos em 100 rpm. As células foram lavadasuma vez com o meio e peletizadas antes de serem ressuspensas no tampãode ensaio contendo glicose a 25 mM (Sigma, número de catálogo G-5400),piruvato a 1 mM (Invitrogen, número de catálogo 11360-070) e albúmina òèsoro bovino 2% (BSA) (MP Biomedicals, número de catálogo 103703) em D-PBS (Invitrogen, número de catálogo 14040-133). A suspensão de células foidiluída para 1x106 células por mL no tampão de ensaio e mantida a 37°C atéusada. Consumo de oxigênio foi medido com um eletrodo Clark de acordocom as instruções providas por Hansatech (Norfolk, UK). Metade da suspen-são de células foi usada para cada medição. As concentrações de oligomici-na (MP Biomedicals, número de catálogo 151786) e FCCP (4-(triflúor metóxi)carbonil cianèto fenil hidrazona) (Sigma, número de catálogo C2920) foram 2μg/mL e 2 a 5 μΜ, respectivamente. Os experimentos foram realizados emtriplicata. A taxa de respiração foi medida através de cálculo de inclinação dofluxo de consumo de oxigênio usando software provido pelo fabricante.

Manipulações de dados e geração de gráfico foram realizadosusando Microsoft Excel e GraphPad Prism 4 software. Dados são apresen-tados como média ± erro médio padrão. Em todos os experimentos, cadadose foi testada em triplicata. A única exceção a isto foram as medições derespiração onde o experimento foi repetido três vezes. Análise estatística foirealizada usando um teste t de Student de duas caudas.

Resultados

Examinou-se a expressão de vários ,marcadores de expressãode gene mitocondrial em miotubos de camundongo diferenciados tratadoscom AJQ710 nas seguintes concentrações: 30 μΜ, 10 μΜ, 3 μΜ e 1 μΜ. So-luções estoques foram preparadas de modo que um volume constante desolução de fármaco foi adicionado a cada cavidade de células. Todos os e-feitos foram comparados ao véiculo (DMSO) sozinho. Caminhos mitocondri-ais / genes examinados incluíram fosforilação oxidativa, oxidação de ácidograxo, ciclo de Krebs, ATP sintase, e proteínas desacopladas. Adicionalmen-te, expressão de reguladores transcricionais funcionalmente relacionados aERRy foi examinada. Para quase todos os genes examinados, verificou-seum aumento dependente de dose em expressão de gene seguindo trata-mento com AJQ710. Todos os resultados de expressão de gene são de tra-tamento com AJQ710 de 24 horas.

Genes da fosforilação oxidativa demonstraram uma elevada ex-pressão com crescentes concentrações de AJQ710. Expressão de COX-4 foiaumentada por 2 vezes, citocromo c por 3,7 vezes (isto é, a partir de 1.0Gene/B2M sem tratamento com AJQ710 para 3,7 Gene/B2M quando tratadocom AJQ710 em uma concentração de 30 μΜ), e UQCRB por 2 vezesquando tratados com AJQ710 em uma concentração de 30 μΜ.

Similarmente, três genes examinados que são associados comoxidação de ácido graxo, foram mostrados serem regulados ascendente-mente em uma maneira dependendo de dose seguindo tratamento de 24horas com AJQ710. Expressão de CPT-Ib foi aumentada por 3 vezes (istoé, a partir de 1.0 Gene/B2M sem tratamento para 3.0 Gene/B2M quando tra-tados com AJQ710 em uma concentração de 30 μΜ), LCAD por 2,8 vezes, eMCAD por 1,6 vezes seguindo tratamento 30 μΜ de AJQ710.

Dois outros genes mitocondriais foram examinados, IDH3a, umcomponente do ciclo de Krebs, e ATP-5b, uma enzima de síntese de ATP1demonstraram uma indução dependente de dose em expressão com dosescrescentes de AJQ710. Expressão de IDH3oc foi aumentada acima de 2 ve-zes (isto é, de 1.0 Gene/B2M sem tratamento com AJQ710 para 2.0 Ge-ne/B2M quando tratados com AJQ710 em uma concentração de 30 μΜ), eATP-5b foi aumentado por 1,6 vezes após 24 horas de tratamento com 30μΜ de AJQ710.

Mediu-se expressão de ARNm para proteínas desacopladasUCP-2 e UCP-3. UCP-2 mostrou regulação ascendente marginal em expres-são com todas as doses dè AJQ710, com sua mais alta expressão, 1,5 ve-zes, seguindo tratamento 10 μΜ. UCP-3 mostrou um aumento dependentede dose em expressão, com um aumento de acima de 3 vezes, isto é, a par-tir de 1.0 Gene/B2M sem tratamento com AJG710 para 3,0 Gene/B2M se-guindo tratamento 30 μΜ de AJQ710.

Mediu-se a expressão da família ERR em resposta a tratamentoae miotubos com agonisia. AJQ710 ativa signiíicanternente ambos ERRy eERRp, mas não ativa ERRa e ERs (Zuercher, et al., J. Med. Chem.,48(9):3107-9 (2005)). A expressão de ERRa foi aumentada em uma maiorextensão que ERRp ou ERRyseguindo tratamento com AJQ710. ERRyfoielevado para 1,4 vezes a expressão, ERRp mostrou um aumento de 1,5 ve-zes em expressão, e ERRa mostrou um aumento de 3,7 vezes em expres-são com tratamento 30 μΜ de AJQ710.

Os co-ativadores PGC-1 α e PGC-1 β também foram examinadospara expressão de gene. expressão destes transcritos mostrou um similaraumento em expressão dependente de dose, com PGC-Ia de expressãoelevada 1,9 vezes (isto é, de 1.0 Gene/B2M sem tratamento com AJQ710para 1.9 Gene/B2M quando tratado com AJQ710 em uma concentração de30 μΜ) e PGC-1 β elevou 1,8 vezes.

Examinou-se ainda examinamos expressão de gene para asPPARs, uma família de receptores nucleares que desempenha um importan-te papel em metabolismo de lipídeo. PPARa e PPARÔ não mostraram mu-dança em expressão seguindo tratamento com AJQ710. PPARy mostrou umaumento dependente de dose em expressão com uma expressão máximade 2,2 vezes (isto é, a partir de 1.0 Gene/B2M sem tratamento com AJQ710para 2.2 Gene/B2M seguindo tratamento com AJQ710 30 μΜ.Para avaliar atividade mitocondrial no nível de proteína, uma ci-tocromo c ELISA foi realizada. Citocromo c é um elemento crítico da cadeiade transporte de elétrons, e quantidades da proteína servem como um bio-marcador para número mitocondrial e atividade de fosforilação oxidatíva.

Nós observamos um aumento dependente de dose de citocromo c com tra-tamento com composto, com um aumento de 88% quando miotubos foramtratados com AJQ710 30 μΜ por 24 horas (Figura 2.1).

Para medir a atividade mitocondrial, atividade de citrato sintasefoi determinada. Esta enzima é freqüentemente usada como um indicador deteor ou atividade mitocondrial em músculo humano (Kelley, et al., Diabetes,51(10):2944-50 (2002)). Citrato sintase catalisa a etapa inicial do ciclo deKrebs, que fornece substrato para fosforilação oxidativa. Miotubos tratadoscom AJQ710 30 μΜ por 24 horas mostraram um aumento de 28% em ativi-dade citrato sintase, enquanto tratamento com 10 μΜ e 3 μΜ mostrou umaumento de 8% e 9%, respectivamente (Figura 2.2).

Investigou-se ainda se indução de expressão de gene mitocon-drial tem um impacto sobre fosforilação oxidativa. Respiração celular foi me-dida em miotubos primários de camundongo tratados com AJQ710 por 24horas. Consistente com a indução de expressão dos componentes de cadeiarespiratória, respiração basal foi aumentada por 37% em células de músculotratadas com AJQ710, comparadas com controles tratados com veículo (Fi-gura 2.3). Respiração insensível a oligomicina, o vazamento de prótons, foiaumentado por 36%, embora este aumento não fosse estatisticamente signi-ficante. Na presença de FCCP, taxa de respiração foi aumentada por 32%por AJQ710, como comparado às células de controle tratadas com veículo(Figura 2.3). Estes resultados indicam que um agonista de ERRy pode au-mentar capacidade oxidativa mitocondrial através de respiração acoplada.

O aperfeiçoamento em função mitocondrial que pode ser obser-vado a partir dos ensaios acima indicou benefícios terapêuticos nas indica-ções aqui reivindicadas.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra o diagrama de configuração de ensaio FRET.A Figura 2 mostra a resposta FRET induzida por agonista.

A Figura 3 mostra níveis de expressão de proteína de citocromoc em miotubos de camundongo tratados com NVR-AJQ710-NX-2.

A Figura 4 mostra atividade de citrato sintase em miotubos decamundongo tratados com NVP-AJQ710-NX-2.

A Figura 5 mostra medição de respiração celular em miotubosde camundongo primários tratados com NVP-AJQ710-NX-2.

Exemplo 3 - Peso corporal / obesidade

Camundongos obesos de dieta induzida são usados para o es-tudo em 21-23 semanas de idade. No primeiro dia do estudo, animais sãojejuados em 7:30 a.m. Medição de peso corporal e coleta de amostra desangue basal são conduzidas em 10:30 a.m. Animais são assinalados emdois grupos (n = 10/grupo) com os valores de glicose de plasma e pesos decorpos ajustados entre os dois grupos. Os animais são dosados oralmentecom veículo (água) ou composto em 30 mg/kg em um volume de dose de 5mL/kg. Dose diária de veículo ou o composto é administrada ao mesmotempo cada dia para um total de 28 dias. Medições diárias de peso corporale tomada de alimento são tomadas durante o estudo. Compostos diminuempeso corporal nos animais tratados, mas não afetam tomada de alimento.Análises de massa magra e gordura são realizadas em intervalos semanaisdurante o período de.28 dias usando o EchoMRi Whole Body CompositionAnalyzer. Explorações são realizadas usando os apropriados retentores detamanho providos pelo fabricante. Animais que são administrados com ofármaco mostram uma diminuição em massa de gordura e um concomitanteaumento em massa magra. No dia 24 do estudo, animais foram colocadosno sistema CLAMS (Columbus Instruments, Columbus, OH) que mede o vo-lume de oxigênio consumido (VO2) de volume de dióxido de carbono produ-zido (VCO2) através de amostragem de ar em câmaras seladas. O VO2 é amedida da capacidade oxidativa total dos animais. O quociente respiratório(RQ) é calculado como a razão de volume de CO2 produzido dividido pelovolume de O2 consumido e é uma medida de utilização de substrato. Se osanimais usam gordura como a principal fonte de combustível, a razão estámais próxima de 0,7, enquanto se a fonte de combustível é carboidrato, oRQ está mais próximo de 0,7. Animais tratados eom fármaco mostram umamaior capacidade oxidativa comparados aos animais controles. Devido auma maior capacidade para queimar gordura, animais tratados exibem me-nores níveis de RQ. No último dia do estudo (dia 28), animais são dosadoscom veículo ou composto em 10:30 a.m. Amostras de sangue de cauda sãotomadas êm 12:30 p.m. Animais então sofrem eutanásia com dióxido decarbono. Amostras de sangue terminais são coletadas via perfuração cardí-aca para análise química de sangue.

Exemplo 4 - Diabetes tipo 2 / doença metabólica

Camundongos obesos induzidos por dieta são usados para oestudo em 21-23 semanas de idade. No primeiro dia do estudo, animais sãojejuados em 7:30 a.m. Medição de peso corporal e coleta de amostra desangue basal são conduzidas a 10:30 a.m. Níveis de glicose em plasma sãoentão determinados. Animais foram divididos em dois grupos (n = 10/grupo)com os valores de glicose em plasma e pesos de corpos ajustados entre osdois grupos. Em 12 p.m., os animais são dosados oralmente com veículo(água) ou composto em 30 mg/kg em um volume de dose de 5 mL/kg. Em1:00 p.m. uma amostra de sangue (em 0 minuto) é tomada seguida por umteste de tolerância a glicose oral (OGTT) em 1 g/kg (glicose 20% em água)em um volume de dose det5 mL7kg. Amostras de sangue são coletadas em30, 60 e 120 minutos seguindo a administração de glicose. Os animais sãore-alimentados após o OGTT. Os animais são administrados com uma dosediária de veículo ou o composto 12:00 p.m. cada dia por um total de 15 dias.Medições diárias de peso corporal e tomada de alimento são realizadas du-rante o estudo. Dois adicionais OGTTs são realizados durante o estudo nosdias 7 e 14, seguindo o protocolo descrito acima para o OGTT no dia 1. A-nimais tratados com fármaco mostram um aperfeiçoamento em tolerância aglicose comparados aos animais controles, como medido pela área sob acurva durante um OGTT. A magnitude de aperfeiçoamento no OGTT aumen-ta em uma maneira dependente de tempo a partir do dia 7 para dia 14. Noúltimo dia do estudo (dia 15), camundongos são jejuados em 7:30 a.m. edosados com veículo ou composto em 10:30 a.m. Amostras de sangue decauda são tomadas em 12:30 p.m. Animais então sofrem eutanásia com dió-xido de carbono. Amostras de sangue terminais são coletadas via perfuraçãocardíaca para análise química de sangue.

Coleta e análise de sangue

Amostras de sangue são tomadas durante o estudo via sangra-mento dé cauda. Concentrações de glicose em plasma são determinadasusando um medido de glicose (Ascensia Elite, Bayer Corp., Mishawaka, IN).Amostras de sangue foram coletadas em tubos (Microvette CB300, Aktien-gesellschaft & Co., Numbrecht, Germany) que contém lítio heparina paraprevenir coagulação de sangue. Antes de coleta de cada amostra de san-gue, 1 μι de coquetel inibidor de protease diluído 1:10 (Sigma, St. Louis,MO) é adicionado aos tubos de amostra. Após coleta de amostra de sangue,os tubos são mantidos sobre gelo antes de serem centrifugados. A porçãoplasma das amostras de sangue é obtida por centrifugação em 10 000 χ gpor 10 minutos a 40C e então estocada a -80°C. Níveis de glucagons e insu-lina em plasma são determinados através de ensaios Luminex usando kitMouse Endocrine Lincoplex (Linco Research, Inc., St. Charles, MO). Animaistratados com fármaco, isto é, agonistas de ERRy mostram uma diminuiçãoem níveis de insulina em plasma comparados aos animais controles. Níveisde:ccilesterol total e ácido graxo, triglicerídeo em plasma são determinadosusando um ensaio fluorescente baseado em Amplex Red kit (Molecular Pro-bes, Eugene, OR). Análise química de sangue é realizada usando um siste-ma de química seca automatizado (SPOTCHEM EZ Analyzer, Heska, FortCollins, CO). Animais tratados com os agonistas de ERRy mostram um re-duzido peso corporal ou aperfeiçoado perfil de lipídeo.

Exemplo 5 - Dislipidemia

Camundongos obesos induzidos por dieta são usados para oestudo em 21-23 semanas de idade. No primeiro dia do estudo animais sãojejuados em 7:30 a.m. Medição de peso corporal e coleta de amostra desangue basal conduzidas em 10:30 a.m. Animais foram divididos em doisgrupos (n = 10 / grupo) com os valores de glicose em plasma e pesos decorpos ajustados entre os dois grupos. Os animais são dosados oralmentecom veículo (água) ou composto em 30 mg/kg em um volume de dose de 5mL/kg. Dose diária de veículo ou o composto é administrada ao mesmotempo cada dia para um total de 15 dias. Medições diárias de peso corporale tomada de alimento são tomadas durante o estudo. Análises de massamagra e gordura são realizadas duas vezes durante o período de 15 diasusando ó EchoMRI Whole Body Composition Analyzer. Explorações são rea-lizadas usando os apropriados fixadores de tamanho providos pelo fabrican-te. No último dia do estudo (dia 15), camundongos são jejuados em 7:30a.m. e dosados com veículo ou composto em 10:30 a.m. Amostras de san-gue de cauda são tomadas em 12:30 p.m. Animais então sofrem eutanásiacom dióxido de carbono. Amostras de sangue terminais são coletadas viaperfuração cardíaca para análise química do sangue.

Coleta e análise de sangue

Amostras de sangue são tomadas durante o estudo via sangra-mento de cauda. Concentrações de glicose em plasma são determinadasusando um medido de glicose (Ascensia Elite, Bayer Corp., Mishawaka, IN).Amostras de sangue foram coletadas em tubos (Microvette CB300, Aktien-gesellschaft & Co., Numbrecht, Germany) que contem lítio heparina paraprevenir coagulação de-sangue. Antes de coleta de cada amostra de san-gue, 1 μl de coqueteLinibidor de protease diluído 1:10 (Sigma; St. Louis,MO) é adicionado aos tubos de amostra. Após coleta de amostra de sangue,os tubos são mantidos sobre gelo antes de serem centrifugados. A porçãoplasma das amostras de sangue é obtida por centrifugação em 10 000 χ gpor 10 minutos a 4°C e então estocada a -80°C. Níveis de insulina em plas-ma são determinados através de ensaios Luminex usando kit Mouse Endo-crine Lincoplex (Linco Research, Inc., St. Charles, MO). Níveis de colesteroltotal e ácido graxo, triglicerídeo em plasma são determinados usando umensaio fluorescente baseado em Amplex Red kit (Molecular Probes, Eugene,OR). Animais tratados com fármaco, isto é, agonistas de ERRy mostramuma diminuição de níveis de colesterol e ácido graxo livre, triglicrídeos emplasma comparados aos animais controles. Análise química de sangue érealizada usando um sistema de química seca automatizado (SPOTCHEM

EZ Analyzer, Heska, Fort Collins, CO).

Exemplo 6 - Capacidade de resistência a exercício

Para medir capacidade de exercício, camundongos C57Bl6 deidade e peso ajustados são corridos sobre moinho de roda com degrau mo-torizado com um incentivo de placa de choque (Exer-6, Columbus Instru-ments, Còlumbus, OH). Os camundongos são aclimatizados ao moinho deroda com degraus antes do início do experimento. No dia um, os camundon-gos são exercitados partindo em 9 am por 2 horas. A velocidade do moinhode roda com degraus é constante para a primeira hora, e aumentada por 2metros / minuto cada 15 minutos na segunda hora. A inclinação do moinhode roda com degraus é mantida constante durante o experimento. A capaci-dade dos camundongos correrem é avaliada através de medição de tempo evelocidade do moinho com rodas com degraus até cada camundongo estarexausto e incapaz de permanecer sobre o moinho de roda com degraus. Adistância total corrida e o trabalho realizado são calculados como medidasde capacidade de exercício. Consumo de oxigênio durante exercício, referi-do como capacidade oxidativa máxima, é também medida para determinar atolerância dos animais aos exercícios. Os animais são então divididos emdois conjuntos (n = 10 cada), com capacidade de exercício ajustada entre osdois grupos. Em 12 p.m., os animais são dosados oralmente-com-veículo(água) ou composto, isto é, agonistas de ERRy em 30 mg/kg em um volumede dose de 5 mUkg. Dose diária de veículo ou o composto é administradaem 12:00 p.m. para um total de 28 dias. Medições diárias de peso corporal etomada de alimento são tomadas durante o estudo. Nos dias 14 e 27 do es-tudo, os animais são avaliados para capacidade de exercício como descritoacima. Animais tratados com fármaco são capazes de correrem por tempo edistância mais longos comparados a animais controles. Estes animais tam-bém demonstram um aumento em capacidade oxidativa máxima com rela-ção aos sujeitos controles. A magnitude da diferença nestes parâmetros decapacidade de exercício entre os animais tratados e os controles aumentado dia 14 para dia 27 do estudo. No dia 28, os animais são dosados comveículo ou composto em 12 p.m. e amostras de sangue de cauda são toma-das 12:30 p.m. Animais então sobrem eutanásia com dióxido de carbono, etecidos são coletados para análise de metabólitos e expressão de gene.Amostras de sangue terminais são coletadas via perfuração cardíaca paraanálise química do sangue. Amostras de sangue foram coletadas em tubos(Microvette CB300, Aktiengesellcschaft & Co., Numbrecht, Germany) quecontem lítio heparina para prevenir coagulação de sangue. Antes de cadacoleta de amostra, 1 μί de coquetel inibidor de protease 1:10 (Sigma, St.Louis, MO) é adicionado aos tubos de amostras. Após coleta de amostra desangue, os tubos são mantidos sobre gelo antes de serem centrifugados. Aporção de plasma das amostras de sangue é obtida por centrifugação em 10000 χ g por 10 minutos a 4°C e então estocadas a -80°C. Níveis de coleste-rol total e ácido graxo, triglicerídeos em plasma são determinados usandoum ensaio fluorescente baseado em kit Amplex Red (Molecular Probes, Eu-gene, OR). Análise química de sangue é realizada usando um sistema dequímica seca automatizado (SPOTCHEM EZ Analyzer, Heska, Fort Collin,CO). Animais tratados com fármaco, isto é, agonistas de ERRy mostramuma diminuição em níveis de colesterol e ácido livre, triglicerídeos em plas-ma comparados aos animais controles.

Exemplo 7 - Doenças neurodegenerativas

O efeita positivo sobre doenças neurodegenerativas é avaliadoatravés do seguinte experimental.

Animais

Camundongos B6CBAF1/J Fêmeas são transplantadas com o-vários de camundongos fêmeas B6CBATg(Hdexon1)62Gpb/1 J (R6/2, Man-giarini et al., 1996) e são obtidos de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Mai-ne), e procriados para camundongos machos B6CBAF1/J (The Jackson La-boratory, Mainne) em casa. Em uma amostra de 45 camundongos (machose fêmeas) de nossa colônia, o comprimento de repetição mede 119-130 cm.Camundongos (transgênicos R6/2 (TG), η = 27, machos =14, fêmeas = 13),derivados de 7 ninhadas, são testados a partir de 21 dias até 70 dias de ida-de e sofrem eutanásia em 84 dias (vide Fig. 1 para detalhes de pontos detempo de testes). Camundongos são alojados em uma temperatura de 21-23°C e umidade de 30-70% controladas com alimento e água disponíveis adIib., usando um ciclo de luz - escuro reverso (10 am luzes desligadas, 10 pmluzes ligadas). Genótipos são determinados a partir de DNA de cortes detesoura de cauda tomados em 3 semanas de idade. DNA é isolado usandoum kit de Qiagen (Valencia, CA). Repetições CAG são talhadas por PCRusando Ihiciadores marcador - FAM (5'-ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3') e (5'-GGCGGCTGAGGAAGCTGAGGA-3') em tampão AM(Tris-HCI a 67 mM [pH 8,8], NH4SO4 a 16,6 mM, MgCI2 a 2,0 mM, BSA 0,17mg/mL, 2-mercaptoetanol a 10 mM), DMSO 10%, dNTPs a 200 mM, inicia-dores 8 ng^L com Taq polimerase 0,5 U/mL. Condições de ciclização foram90" @ 94SC, 25 X (30" @ 94eC, 30" @ 65eC, 90" @ 72aC), 10' @ 72SC. Osprodutos de PCR são talhados usando um ABI sequencer e os pacotes desoftware Genescan and Genotyper. O tamanho da repetição CAG é de 85 bpmenos que o tamanho do produto de PCR. Todos os experimentos são rea-lizados de acordo com e aprovados pelo Institutional Animal Care and UseCommittee at NIBRI.

Dosagem de composto (por exemplo, aqui descritos agonistasde ERRyGSK4716 ou GSK9089) camundongos são pesados semanalmentea partir de 21 dias até 84 dias de idade. Em 21 dias de idade, os animais sãodivididos em dois grupos-e-dosados oralmente com veículo (água) ou com- ηposto em 30 mg/kg em um volume de dose de 5 mL/kg. Dose diária de veí-culo ou o composto é administrada ao mesmo tempo cada dia para um totalde 63 dias. Testes para fenótipo comportamental é realizado no fim do perí-odo de tratamento. A idade de morte de cada camundongo é anotada. Ani-mais tratados com fármaco, isto é, agonistas de ERRy mostram uma sobre-vivência prolongada comparados a animais não-tratados.

Testes Comportamentais

Roda de Corrida

Camundongos são colocados individualmente em gaiolas equi-padas com uma roda de correr (23 cm de diâmetro, Mini Mitter CompanyInc., Bend OR). Cada rotação da roda é detectada por um magneto e anota-da por VitaIView Data Acquisiton Software V 4.0 (Mini Mitter Company Inc.como acima), em compartimentos de 3 minutos. Gaiolas de roda de corrersão alojadas em gabinetes (8 gaiolas / gabinete) para minimizar luz e pertur-bação sonora (luzes desligadas em 10 a.m., luzes ligadas em 10 p.m.). Ati-vidade de corrida é anotada continuamente por 6-8 dias (maioria alojada por7-8 dias WT, n = 12, R6/2 n = 21). Atividade de corrida na roda durante fases1 iluminadas e escuras é calculada usando ActiView V 1.2 (Mini Mitter Com-pany Inc. como acima). Medições são calculadas de atividades de corridadiárias ou da seção média de cada exposição às rodas de corrida (3°, 4°, e5° dia inteiro em rodas de corrida em 4,5-5,5 semanas, ou 8,5-9,5 semanas).Medições incluem: (1) o número máximo de rotações por compartimento -tempo (3 minutos) durante o 3o, 4o, e 5o dia, (2) a atividade média por com-partimento - tempo durante as fases iluminadas e escuras, derivada de cadadia sucessivo nas rodas de corrida, (3) a atividade na luz média e no escuromédia por compartimento de tempo, derivada de atividades feitas médiassobre o 3°, 4° e 5° dia nas rodas de corrida, (4) o número de interrupçõestomados durante as fases de noite do 3o, 4o, e 5o noite, (5) o número total derotações corridas sobre o 3°, 4°, e 5° dia inteiro rias rodas de corrida. Ativi-dade (por exemplo, número de rotações e/ou atividade média) é aperfeiçoa-da quando os compostos agonistas de ERRy são administrados.Rotarod

A aparelhagem rotarod (Ugo Basile, Varese, Italy) é usada paramedir coordenação motora e equilíbrio. O eixo é coberto com borracha lisapara prevenir que o camundongo agarre o eixo. Teste é realizado aproxima-damente meio caminho através de fase escura, usando uma luz vermelha(25 W) para iluminação. Seguindo 15-20 minutos habituação ao ambiente deteste, camundongos recebem 3 experimentos (pelo menos 10 minutos entreexperimentos) sobre um protocolo de aceleração (4-40 rpm em 10 minutos)similar a outros protocolos publicados. A latência para queda é medida. Seum camundongo cai do rotarod em menos que 20 s, ele é recolocado imedi-atamente (até 3 vezes). Camundongos são testados por 4 dias em linha ba-se (4 semanas de idade) e por 3 dias em 8 semanas de idade. Latência mé-dia para queda por camundongo em linha base e 8 semanas de idade é cal-culada e usada para gerar médias de grupo.

O tempo que o camundongo está sobre o rotarod é aumentadopelos compostos agonistas de ERFty.

Resistência de aperto

Uma escala de peso de mola (Fisher Scientific1 Tustin, CA) comum trapézio ligado é pendurada a partir de uma fixação de parede. Camun-dongos são deixados agarrar o trapézio com suas patas dianteiras, enquantoo observador puxava suavemente sua cauda para baixo. O peso puxadomenos peso corporal é usado para análise. Camundongos recebem 5 expe-rimentos, dos quais os 3 melhores escores são usados para análises. Oscompostos agonistas de ERRy aperfeiçoam resistência de aperto.

A invenção foi descrita acima através de referência a concretiza-ções preferidas mas, como aqueles versados na técnica apreciarão, muitasadições, omissões e modificações são possíveis todas dentro do escopo dasreivindicações abaixo.

Todas as patentes e referências de literatura de patente nesterelatório descritivo são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.Em caso de inconsistências, a presente descrição, incluindo as definições einterpretações, prevalecerá.

Outras concretizações serão, evidentes para aqueles versadosna técnica. Deve ser entendido que a descrição detalhada anterior é providasomente para clareza e é meramente exemplar. O espírito e escopo da pre-sente invenção não são limitados aos exemplos acima, mas são abrangidospelas reivindicações que se seguem.

Claims (12)

1. Processo para prevenção, retardo de progressão ou tratamen-to de uma doença ou condição selecionada de diabetes, resistência à insuli-na, doença metabólica / síndrome metabólica, dislipidemia, obesidade, super- peso, doenças neurodegenerativas como mal de Parkinson, mal de Ai-zheimer, mal de Huntington, ou aperfeiçoamento da capacidade de resistên-cia a exercício, compreendendo administração a um animal de sangue quen-te, incluindo ser humano, em sua necessidade, de umã quantidade terapeu-ticamente eficaz de um agonista de ERRy.

2. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um agonista de ERRy em combinação com umou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis para a prevenção, retardo deprogressão ou o tratamento de uma doença de uma doença ou condiçãoselecionada de diabetes, resistência à insulina, dislipidemia, capacidade deresistência a exercício, obesidade, super - peso, doenças neurodegenerati-vas como maí de Parkinson, mal de Alzheimer, mal de Huntington, ou aper-feiçoamento da capacidade de resistência a exercício.

3. Uso de um agonista de ERRy ou um seu sal farmaceutica-mente aceitável, para a fabricação de um medicamento para a prevenção,retardo de progressão ou o tratamento_de uma doença ou condição selecio-nada de diabetes, resistência à insulina,-doença metabólica / síndrome me-tabólica, dislipidemia, obesidade, super - peso, doenças neurodegenerativascomo mal de Parkinson, mal de Alzheimer, mal de Huntington, ou aperfeiço-amento da capacidade de resistência a exercício.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, processo como definidona reivindicação 1 ou uma composição farmacêutica como definido na rei-vindicação 2 em que a doença tratada é selecionada de diabetes tipo 2, do-ença metabólica / síndrome metabólica, dislipidemia, doenças neurodegene-rativas, como mal de Parkinson, mal de Alzheimer ou mal de Huntington.

5. Uso de acordo com a reivindicação 3, processo como definidona reivindicação 1 ou uma composição farmacêutica como definido na rei-vindicação 2 para o aperfeiçoamento da capacidade de resistência a exerci-cio.

6. Processo para a prevenção ou retardo de progressão de dia-betes tipo 2, compreendendo administração a um.animal de sangue quente,incluindo ser humano, sofrendo de IGM, de uma quantidade terapeuticamen-te eficaz de um agonista de ERRy.

7. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um agonista de ERRy em combinação com umou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis para a prevenção, ou retardode progressão de diabetes tipo 2, em um paciente sofrendo de IGM.

8. Uso de um agonista de ERRy ou um seu sal farmaceutica-mente aceitável, para a fabricação de um medicamento para a prevenção,ou retardo de progressão de diabetes tipo 2, em um paciente sofrendo de IGM.

9. Uso, processo para tratamento ou uma composição farmacêu-tica como definidos em qualquer uma das reivindicações anteriores em queo agonista de ERRy é selecionado de GSK4716 ou GSK9089, òu em òàdacaso, um seu sal farmaceuticamente aceitável.

10. Uso, processo para tratamento ou uma composição farma-cêutica como definidos em qualquer uma das reivindicações anteriores ondea dosagem oral diária de agonista de ERRy está entre 10 e 500 mg ou entre 10 e 200 mg.

11. Uso, processo para tratamento ou uma composição farma-cêutica como definidos em qualquer uma das reivindicações anteriores ondeo agonista dè ERRy exibe uma EC5O compreendida entre 0,001 e 10 micro-molar ou entre 0,001 e 1 micromolar.

12. Uso, processo para tratamento ou uma composição farma-cêutica como definidos em qualquer uma das reivindicações anteriores ondeo agonista de ERRy exibe uma EC5O compreendida entre 0,001 e 10 micro-molar ou entre 0,001 e 1 micromolar, em um ensaio FRET ERRy, por exem-plo, ensaio de exemplo 1, ou qualquer outro ensaio aqui descrito.