CN101429167B

CN101429167B - 新的镉离子人工抗原螯合剂制备方法

Info

Publication number: CN101429167B
Application number: CN2008101621827A
Authority: CN
Inventors: 郭明; 庞铄权; 孔新刚
Original assignee: Zhejiang Forestry College
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2008-11-18
Filing date: 2008-11-18
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2028-11-18
Also published as: CN101429167A

Abstract

一种新的镉离子人工抗原螯合剂制备方法，以4-硝基邻苯二胺为原料经过缩合、溴化、消除等一系列反应化学合成了6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉，简称BATDQ，以该新螯合剂先与镉离子螯合形成Cd-BATDQ，再与载体蛋白质偶联合成人工抗原Cd-BATDQ-BSA，通过免疫BALB/c小鼠，然后通过杂交瘤制备技术获得针对重金属镉螯合物的单克隆抗体，用于检测环境、食品、水体中重金属镉的残留。本发明具有快速、灵敏、成本低、特别适合大批量样品现场快速检测的特点，尤其是本新螯合剂的成功合成，为镉离子人工抗原的合成提供了全新的、低成本的、稳定而灵敏的核心原料，应用推广前景广阔。

Description

新的镉离子人工抗原螯合剂制备方法

技术领域

本发明涉及一种新的双功能螯合剂，尤其是镉离子人工抗原的新螯合剂的制备方法。

背景技术

在重金属免疫分析技术中需进行人工抗原的合成，合成重金属人工抗原是利用双功能螯合剂先与重金属形成稳定的螯合物(半抗原分子)，再与载体蛋白质偶联形成重金属-螯合剂-载体蛋白质人工抗原，相对于重金属镉而言，目前已有的化合物中很难找到合适的双功能螯合剂，有的结构不太适合，有的价格过于昂贵，不易大量应用，阻碍了重金属镉人工抗原的有效合成。如CN10106337“重金属镉单克隆抗体的制备方法”中采用日本进口的1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’-四乙酸作为镉离子的双功能螯合剂，售价高达300元/mg，推广与应用受到限制，故寻找具有自主产权的用于镉人工抗原合成的双功能螯合剂，并进而制备相应的单克隆抗体，进行重金属镉残留污染的快速检测具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对重金属镉的双功能螯合剂6- 溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的制备方法，并公开基于此双功能螯合剂的人工抗原合成和单克隆抗体的制备方法和检测结果，以进一步验证本螯合剂在人工抗原合成中的应用效果。

本发明的目的通过如下措施实现：

新螯合剂BATDQ的制备方法包括如下步骤：

1)6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉的合成：

将2g4-硝基邻苯二胺和1.13g丁二酮放入250mL单口烧瓶中，以50mL无水乙醇为溶剂，加热回流2h，冷却至室温后抽滤，加30mL无水乙醇结晶提纯，所得产物即为6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉；

2)6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的合成：

取0.5g第一步产物6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉、0.202g偶氮二异丁腈与1.14g N-溴代琥珀酰亚胺置于干燥的250mL单口圆底烧瓶中，再取40mL CCl₄加入烧瓶中，装上回流冷凝管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到80℃的油浴中，强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后，将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水浴锅中蒸馏、冷却，得6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉；

3)6-硝基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：

在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加入1.99mL亚氨基二乙酸二乙酯、10mL干燥的乙腈和2.63g无水碳酸钾粉末，搅拌下向反应混合液中滴加溶有1.805g6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的10mL干燥的乙腈，回流8-10h，冷却，滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体，往上述油状液中加入含3.48g Ba(OH)₂·8H₂O的饱和溶液，室温下充分搅拌至油状液均转化为白色沉淀，抽滤钡盐并用蒸馏水充分浸泡、洗涤。然后将此钡盐转移到15mL水中，将混合物加热煮沸，加入硫酸至清液中不再出现混浊，过滤除去硫酸钡，再用沸水煮洗硫酸钡残渣3次，将滤液和洗涤液合并，冰箱中冷却8-10h得到6-硝基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；

4)6-氨基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：

将100mL乙醇和2.025g6-硝基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉加入到250mL装有温度计、机械搅拌器的三口瓶中，搅拌加入1.2g钯碳催化剂和5.29g水合肼在80-85℃条件下反应4h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙

酸)二甲胺基喹喔啉；

5)6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：

取5.05g溴乙酰溴溶于30mL三氯化碳中，2.105g碳酸氢钠溶于100mL水中，冰浴中将碳酸氢钠溶液缓慢滴入到溴乙酰溴溶液中，取18.722g 6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉装入三口烧瓶中，温度保持在50-60℃，快速搅拌的同时把溴乙酰溴和碳酸氢钠混合液缓慢地滴入6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氢氧化钠溶液控制反应体系的pH为12.0，滴加完毕，升温到90℃，搅拌，将溶剂全部蒸出，加入50mL浓盐酸，过滤分离出NaCl，然后往盐酸提取液中加入150mL无水乙醇，产生白色沉淀，4℃存放8-10h，用50％的乙醇水溶液重结晶，得6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉(6-bromine acetamido-2，3-(N，N，N′，N′-tetraacethyl)dimethylamino-quinoxaline，简称BATDQ)，即为本发明的新螯合剂。

本发明的有益效果是应用本双功能螯合剂偶联率通过原子吸收分光光度法检测达到11-15∶1，符合要求，原料和人工等成本价格为30元/mg，成本低；合成人工抗原免疫原性强，稳定性好，所制备的抗血清效价达到3×10⁵；获得的单克隆抗体检出限低为1pbb、特异性强，制备过程简单。

具体实施方式

本发明下面用结构式表示各原料合成新螯合剂的反应路线：

本螯合剂的合成以4-硝基邻苯二胺为核心原料，经过缩合、溴化、消除、还原、酰化一系列反应化学合成了6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉化合物，一方面它具有的四乙酸结构能与镉离子形成稳定的螯合物，另一方面溴乙酰氨基团上的溴在弱碱性条件下极易与蛋白分子上的氨基发生缩合反应，形成了镉离子-螯合剂-载体蛋白质复合物，从而实现了重金属镉离子人工抗原的合成。

这种新型螯合剂的成功合成为重金属镉人工抗原合成提供了较为简便的手段，为重金属镉的酶免疫分析技术奠定了基础。同时，将新合成的人工抗原通过小鼠免疫、细胞融合等生物学技术最后获得高效价、高灵敏度的单克隆抗体，进而建立起一套针对重金属镉的可靠免疫学速测技术。

本申请是对传统的重金属镉离子检测技术的有益补充，为重金属镉污染残留的在线速测方法提供了新途径，以快速、灵敏、成本低、便于对多个样品进行在线操作等优点决定了能更好的适应重金属镉分析任务重、要求高的特点，其技术特点适合重金属镉快速检测的发展方向。经文献检索和市场调查，6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成及基于此螯合剂的重金属镉单克隆抗体在国内外尚未见报道和应用。

因合成镉单克隆抗体所需BATDQ螯合剂的量不多，所以均以实验室设备制备，反应中涉及的用量以克、毫克、毫升计量，如需大批量推广，再折算成千克、升计量，并用工业化手段采用反应釜等相应设备生产，这是同行技术人员易于掌握的。又因权利要求书中的各原料、加入量、反应条件都给出了单个数值，不是区间值，属最佳方案，所以下面只给出一个最佳实施例。

最佳实施例：

本新螯合剂的合成方法包括下列步骤：

1)6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉的合成：

2)6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的合成：

将100mL乙醇和2.025g6-硝基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉加入到250mL装有温度计、机械搅拌器的三口瓶中，搅拌加入1.2g钯碳催化剂和5.29g水合肼在80-85℃条件下反应4h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；

取5.05g溴乙酰溴溶于30mL三氯化碳中，2.105g碳酸氢钠溶于100mL水中，冰浴中将碳酸氢钠溶液缓慢滴入到溴乙酰溴溶液中，取18.722g6-氨基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉装入三口烧瓶中，温度保持在50-60℃，快速搅拌的同时把溴乙酰溴和碳酸氢钠混合液缓慢地滴入6-氨基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氢氧化钠溶液控制反应体系的pH为12.0。滴加完毕，升温到90℃，搅拌，将溶剂全部蒸出，加入50mL浓盐酸，过滤分离出NaCl，然后往盐酸提取液中加入150mL无水乙醇，产生白色沉淀，4℃存放8-10h，用50％的乙醇水溶液重结晶，得6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N＇，N＇-四乙酸)二甲胺基喹喔啉，简称为BATDQ。

用本新螯合剂合成重金属镉人工抗原的方法按如下步骤进行：

1)人工抗原的合成：

取BATDQ0.8mg，用pH为7.5，0.1mol·L^-1的磷酸盐缓冲液定容至2mL，加入0.4mg的CdCl₂，搅拌使其混合均匀，反应30min，将5mg牛血清白蛋白(BSA)用磷酸盐缓冲液定容至2mL，室温下，将其缓慢加入BATDQ和CdCl₂的混合溶液中，并用KOH调节pH到9.5，室温下搅拌反应20min，存放于4℃冰箱反应8-10h。

将充分反应的混合液在使用前用10mmol·L^-1的EDTA和去离子水冲洗过的截留分子量为30KD的超滤管，在3000rpm/min的条件下离心10min，用pH为7.4，0.1mol·L^-1Tris-HCl不断冲洗，直至保留液中不再含游离的小分子物质为止，用Tris-HCl稀释至5mL，-20℃冰箱保存，待用；

2)包被原的合成：

用新合成的双功能螯合剂BATDQ先与重金属镉离子螯合形成Cd-BATDQ

螯合物，再以人血清白蛋白(HSA)为载体，合成Cd-BATDQ-HSA包被抗原；

3)原子吸收法对偶联结果的鉴定：

分别配制镉标液(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg·L^-1)，做标准曲线，将偶联产物取1mL稀释20倍用原子吸收法检测镉的含量。经原子吸收分光光度法检测人工抗原Cd-BATDQ-BSA、 Cd-BATDQ-HSA中镉离子的含量分别为20.0mg·L^-1、26.0mg·L^-1，经计算两种人工抗原的偶联率分别为11-12:1、14-15:1，偶联比率符合制备抗体要求。

4)SDS-PAGE法对偶联结果的鉴定：

采用SDS-PAGE不连续电泳，以Tris-HCl作为缓冲体系，10％分离胶，5％浓缩胶。样品在浓缩胶上电泳时以恒定电流(20mA)电泳，待其转入分离胶后恒定电流(30mA)，电泳至溴酚蓝距分离胶底边1cm左右停止。卸开电泳槽，取出胶板，固定液固定40min，敏化30min，水洗4次，银染，最后显色呈像。电泳结果显示，人工抗原Cd-BATDQ-BSA、Cd-BATDQ-HSA在电泳中的泳动速度明显落后于其相应的载体蛋白，且偶联后的人工抗原与原载体蛋白相比增加的分子量在6000D左右。

用人工抗原制备重金属镉单克隆抗体的方法包括如下步骤：

1)小鼠免疫及抗血清制备：

选用6周龄雌性BALB/c小鼠8只，将人工抗原与佐剂(完全或不完全)按1:1比例混合，注射器双推法使其混合均匀，初次免疫将人工抗原与完全佐剂乳化，腹腔、皮下、颈部每只小鼠注射0.2mL，一免3周后进行二免，剂量和途径同第一次，从二免开始佐剂换用不完全佐剂，每隔两周分别进行三免、四免，四免后采血清，检测效价，取效价高的继续加强免疫，加强免疫时抗原不加任何佐剂；

加强免疫3天后，摘眼球取小鼠血液于灭菌的康氏管内，室温放置1h，在超净工作台用无菌管把血块和管壁剥离，37℃恒温2h后，4℃冰箱中反应8-10h，使血清充分析出，收集血清，将血清1000rpm/min离心10min，收集上清，将血清分装，-20℃保存；

2)抗血清效价检测：

用pH为9.6，0.05mol·L^-1碳酸盐包被缓冲液将包被抗原Cd-BATDQ-HSA稀释为2μg·mL^-1，100μL/孔，包被到酶标板上，4℃反应8-10h；

倾去板孔液，用pH为7.4，0.15mol·L^-1碳酸盐洗涤液洗涤3次，3min/次，拍干；

加入10％小牛血清作为封闭液，200μL/孔，37℃孵育3h，同前洗涤；

加入用抗血清稀释液按400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200倍稀释的抗血清，设置空白对照，并用正常小鼠血清作为阴性对照，37℃孵育1h，洗涤；

加入1:5000稀释的羊抗小鼠酶标IgG-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h，同前洗涤；

加入邻苯二胺底物显色，100μL/孔，37℃显色15min；

加入2mol·L^-1H₂SO₄终止显色反应，50μL/孔，终止反应5min；

于492nm波段处测吸光值，以样品孔的OD值大于阴性孔的OD值的2倍为阳性，经间接ELISA法检测抗血清的效价达到1×10⁵。

3)细胞融合：

(1)在无菌条件下，制备饲养细胞，取效价高的BALB/c小鼠，最后加强免疫三天后，制备免疫脾细胞，并准备对数生长期的Sp2/0瘤细胞；

(2)取1.0×10⁸个脾细胞，2.0-5.0×10⁷个Sp2/0细胞按1:1-10的比列加入到50mL融合管中，轻轻摇匀；

(3)1000r/min离心10min，弃上清液；

(4)将融合管置于掌心轻轻摩擦，以防止细胞沉淀，使细胞松散均匀成糊状；

(5)将融合管置于37℃水浴中，吸取1mL 37℃预热的聚乙二醇4000，缓慢加入融合管中，边加边轻轻摇匀，60S内加完；

(6)在90S内缓慢滴加无血清的DMEM(Dulbecco＇S ModifiedEagle Media)培养基30-40mL，终止融合；

(7)37℃静止10min后，1000r/min，离心10min，弃上清液；

(8)将融合管置于手掌，摩擦使之松散，加入60-80mL HAT培养基使细胞悬浮，混匀，分装于带有饲养细胞的96孔细胞培养板里，100μL/孔，37℃、5％ CO₂培养。

4)阳性孔的筛选及克隆：

细胞融合后12-16d筛选，采用有限稀释法：

(1)制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，细胞计数，用含12％血清的HT培养基稀释至每毫升含5、10和15个细胞3种不同的稀释度；

(2)每种杂交瘤细胞分装于培养有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度分装32孔，每孔量为0.1mL，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、1和1.5；

(3)37℃、5％ CO₂湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即用间接ELISA法检测抗体效价；

(4)取抗体检测阳性孔的细胞继续扩大培养并冻存。

5)腹水型单抗的制备：

(1)腹腔注射液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5mL；

(2)7-10天用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞腹腔接种，每只小鼠注射5×10⁵个细胞；

(3)间隔5天后，观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即用16号针头采集腹水，连续采2-3次，每只小鼠采5-10mL腹水；

(4)将腹水在2000rmp/min条件下离心5min，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80℃冻存，或冻干保存。

6)腹水型单抗的纯化：

(1)用微孔滤膜过滤腹水，除去较大的凝块及脂肪滴，在4℃，10000rmp/min的条件下离心15min，除去细胞残渣及小颗粒物质；

(2)饱和硫酸铵法进行粗提；

(3)DEAE离子交换层析法对单抗进行纯化

至此，本发明对新螯合剂的制备方法、基于本螯合剂的人工抗原的合成及对应镉螯合物单克隆抗体的制备，都作了完整而清楚的介绍，穿插介绍了人工抗原偶联结果的两种鉴定方法，抗血清效价的检测方法，进行验证。

为更进一步说明本发明，下面再介绍抗体效价的检测，镉标准曲线的建立、抑制率的计算，并以水果中重金属镉离子的含量为例介绍快速检测法，便于公众全面了解本发明。

为检测抗体效价的需要，介绍包被抗原的合成方法：

取BATTDQ 0.8mg，用pH为7.5，0.1mol·L^-1的磷酸盐缓冲液定容至2mL，加入0.4mg的CdCl₂，搅拌使其混合均匀，反应30min，将5mg人血清白蛋白用磷酸盐缓冲液定容至2mL，室温下，将其缓慢加入BATDQ和CdCl₂的混合溶液中，并用KOH调节pH到9.5，室温下搅拌反应20min，存放于4℃冰箱反应8-10h。

将充分反应的混合液用使用前用10mmol·L^-1的EDTA和去离子水冲洗过的截留分子量为30KD的超滤管在3000rpm/min的条件下离心10min，用pH为7.4，0.1mol·L^-1 Tris-HC1不断冲洗，直至保留液中不再含游离的小分子物质为止，用Tris-HC1稀释至5mL，-20℃冰箱保存，待用。

为检测抗体的检测限，下面介绍重金属镉标准曲线的建立：

1、包被以最佳包被抗原浓度(2μg·mL^-1)包被酶标板，100μL/孔，4℃冰箱过夜，洗涤液洗板5次；

2、封闭10％的小牛血清，200μL/孔，37℃反应3h，洗涤液洗板5次；

3、加样取系列浓度(0、10、50、100、250、500、1000和5000ng·mL^-1)的金属镉标液加入适宜浓度的EDTA中，按1:1的体积比加入最佳稀释浓度的抗血清，室温下反应30min，100μL/孔，37℃反应1h，洗涤液洗板5次；

4、加酶标二抗要求稀释HRP标记的羊抗鼠抗体IgG-HRP，将稀释后的IgG-HRP按100μL/孔加入酶标板，37℃反应1h，洗涤液洗板5次；

5、显色配好的OPD显色液显色10min，100μL/孔；

6、终止加2mol·L^-1的硫酸，50μL/孔；

7、读数在酶标仪上测420nm处的吸光度，并计算抑制率；

8、抑制率的计算

然后以I％为纵坐标，以标样的自然对数浓度值为横坐标，做标准曲线。

下面以水体中重金属镉含量的快速检测为例加以说明：水体样品的前处理：取水样1000μL，用0.45μm的微孔滤膜过滤出去杂质，加入1000μg·mL^-1的镉标液5μL，配置成5μg·mL^-1的液体样品。

1、包被以最佳包被抗原浓度(4μg/mL)包被酶标板，100μL/孔，4℃冰箱反应8-10h，洗涤液洗板5次；

3、加样将样品和最佳稀释浓度的抗血清按1:1的体积，充分混合，室温下反应30min，100μL/孔，37℃反应1h，洗涤液洗板5次；

4、加酶标二抗将按要求稀释后的HRP标记的羊抗鼠抗体，100μL/孔加入酶标板，37℃反应1h，洗涤液洗板5次；

5、显色加入配好的OPD显色液(使用前配制)显色10min，100μL/孔；

6、终止加2mol·L^-1的硫酸，50μL/孔，终止5min；

7、读数在酶标仪上测420nm处的吸光度；

8、数据处理根据每个样品的I％值就可根据标准曲线求出相对应样品的浓度。

本发明中使用的许多化学原料如DMEM、HAT、HT、Tris-HCl、EDTA等都可以从市售获得，相应的使用方法在该产品的说明书中有明示，不细述。

Claims

1. 一种新的镉离子人工抗原螯合剂制备方法，其特征在于包括下列步骤：

1)6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉的合成：

2)6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的合成：

取0.5g第一步产物6-硝基-2，3-二甲基喹喔啉、0.202g偶氮二异丁腈与1.14gN-溴代琥珀酰亚胺置于干燥的250mL单口圆底烧瓶中，再取40mLCCl₄加入烧瓶中，装上回流冷凝管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到80℃的油浴中，强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后，将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水锅中蒸馏、冷却，得6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉；

3)6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：

在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加入1.99mL亚氨基二乙酸二乙酯、10mL干燥的乙腈和2.63g无水碳酸钾粉末，搅拌下向反应混合液中滴加溶有1.805g 6-硝基-2，3-二溴甲基喹喔啉的10mL干燥的乙腈，回流8-10h，冷却，滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体，往上述油状液中加入含3.48g Ba(OH)₂·8H₂O的饱和溶液，室温下充分搅拌至油状液均转化为白色沉淀，抽滤钡盐并用蒸馏水充分浸泡、洗涤，然后将此钡盐转移到15mL水中，将混合物加热煮沸，加入硫酸至清液中不再出现混浊，过滤除去硫酸钡，再用沸水煮洗硫酸钡残渣3次，将滤液和洗涤液合并，冰箱中冷却8-10h得到6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；

4)6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：

将100mL乙醇和2.025g 6-硝基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉加入到250mL装有温度计、机械搅拌器的三口瓶中，搅拌加入1.2g钯碳催化剂和5.26g水合肼在80-85℃条件下反应4h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉；

5)6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成：

取5.05g溴乙酰溴溶于30mL三氯化碳中，2.105g碳酸氢钠溶于100mL水中，冰浴中将碳酸氢钠溶液缓慢滴入到溴乙酰溴溶液中，取18.722g 6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉装入三口烧瓶中，温度保持在50-60℃，快速搅拌的同时把溴乙酰溴和碳酸氢钠混合液缓慢地滴入6-氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氢氧化钠溶液控制反应体系的pH为12.0，滴加完毕，升温到90℃，搅拌，将溶剂全部蒸出，加入50mL浓盐酸，过滤分离出NaCl，然后往盐酸提取液中加入150mL无水乙醇，产生白色沉淀，4℃存放8-10h，用50％的乙醇水溶液重结晶，得螯合剂6-溴乙酰氨基-2，3-(N，N，N′，N′-四乙酸)二甲胺基喹喔啉，简称BATDQ。