CN101413940B - 一种肽用于调控奶牛瘤胃发酵的体外应用及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肽用于调控奶牛瘤胃发酵的体外应用及检测方法，可准确测定肽对瘤胃发酵参数的影响：产气量、pH值、氨态氮值、挥发性脂肪酸和MCP指标是瘤胃发酵的重要指标，对他们的测定可以直接了解活体瘤胃内发酵的具体情况，还可准确测定肽对瘤胃内微生物酶活性的影响：淀粉酶、蛋白水解酶和羧甲基纤维素酶活性是瘤胃内主要的酶活指标，对他们的测定可以直接了解活体瘤胃内微生物的变化情况。本发明方法具有方便易学，操作简便，重复性高，数值准确，模拟逼真性强的特点，能有效地确定奶牛瘤胃内肽适宜的大致浓度。能够为今后更深入的理论研究、更准确的配制奶牛日粮、减少蛋白饲料的浪费，提高奶制品质量做出科学依据和理论指导。

Description

一种肽用于调控奶牛瘤胃发酵的体外应用及检测方法

(一)技术领域

本发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种调控奶牛瘤胃发酵的体外技术。 

(二)背景技术

近年来，人们研究发现由蛋白酶解所产生的小肽片段除了具有营养作用以外，还具有一些特殊的生理作用。在动物生产中不仅能保持动物肌体的健康，更能够提高畜产品质量。但是对于肽在奶牛瘤胃内的作用机理尚不明确。 

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种使用的方法快速，可重复，易操作，数值准确，模拟逼真性强等特点的肽用于调控奶牛瘤胃发酵的体外应用及检测方法。 

本发明的目的是这样实现的：它包括以下步骤： 

(1)人工瘤胃模拟装置：用内径为32mm，长200mm，刻度体积为100ml的医用注射器作为发酵器，用可以精确控温±0.5℃的水浴摇床作为控温装置； 

(2)人工瘤胃缓冲液的配制：取得瘤胃液以后加入混合培养液：400ml蒸馏水+0.1ml微量元素溶液+200ml缓冲溶液+200ml常量元素溶液+1ml刃天青溶液+40ml还原剂溶液，并混匀，加热至39℃，同时使用CO₂饱和；其中微量元素溶液：CaCl₂·2H₂O 13.2g、MnCl₂·4H₂O10.0g、CoCl₂·6H₂O 1.0g、FeCl₃·6H₂O 8.0g、蒸馏水至100ml；缓冲溶液：NH₄HCO₃ 4.0g、NaHCO₃35g、蒸馏水至1000ml；常量元素：Na₂HPO₄—5.7g、KH₂PO₄—6.2g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、蒸馏水至1000ml；刃天青溶液：0.1％(w/v)；还原剂溶液：NaOH 4.0ml、Na₂S·9H₂O 625.0mg、蒸馏水95ml；每个注射器吸入瘤胃液与缓冲液1:2混合液共30ml； 

(3)在瘤胃微生物培养液发酵管中添加肽，各处理组均按氨基氮：淀粉为1：4.5的比例添加玉米淀粉作为微生物生长能源，每个处理组设发酵2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h共七个时间点用于采样，每个时间点设三个重复，每个重复一支发酵管；在各时间点测定发酵管内发酵液的产气量、pH值、氨氮浓度、VFA浓度和MCP的产量； 

(4)人工瘤胃液的采集：在试验奶牛晨饲2h后，分别从每头牛瘤胃中抽取300ml瘤胃液，混合，用4层精细纱布过滤，灌入到预热达39℃并始终通有CO₂的保温瓶中； 

(5)体外产气量的测定：每个注射器吸入瘤胃液与培养液的混合液后用自制的堵头密封保持厌氧，记录活塞的位置；注射器在39℃水浴，在48小时内读取活塞位置，计数点为2h、4h、6h、8h、24h、48h。用计数点活塞位置减去活塞的初始位置，即为在相应时间内饲料发酵的产气量；

(6)瘤胃发酵液pH值的测定：发酵物样品被采集后，采用Sartorius PB-20型酸度计对发酵物样品进行pH值测定； 

(7)瘤胃发酵液氨氮浓度的测定：采用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水；试剂包括：A液；苯酚显色剂(1L) 

1)称取0.05g亚硝基铁氰化钠(Na₂Fe(CN)₅NO·2H₂O)溶解于0.5L蒸馏水中； 

2)称取10g干燥苯酚(C₆H₅OH)，移入上述1L的容量瓶中，用蒸馏水定容至1L； 

3)将上述1L的溶液小心移入棕色瓶内，在2～10℃下避光保存，保质期6个月； 

B液：次氯酸盐试剂(1L) 

1)5g氢氧化钠(NaOH)溶于烧杯中，加入600ml蒸馏水； 

2)37.85g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·7H₂O)适当加热溶解摇匀； 

3)冷却后，加100ml次氯酸钠(含氯5.25％)混匀； 

4)蒸馏水定容至1L； 

5)1#滤纸过滤后，在2～10℃下，避光保存于聚乙烯瓶中，保质期6个月； 

氨标准溶液： 

1)贮备液为32mg/dl； 

2)1.0045gNH₄Cl溶于800ml去氨蒸馏水中； 

3)用稀释的盐酸滴定至pH值为2； 

4)蒸馏水定容至1L； 

5)用贮备液配制以下溶液：32，16，8，4，2，1，0mg/dl标准溶液； 

(8)瘤胃液样品采集： 

1)用两层精细纱布过滤瘤胃液。 

2)加入2ml新配制的25％偏磷酸于8ml两层纱布过滤的瘤胃液中，封盖，摇匀。 

3)若不立即测定在-20℃保存。 

4)分析前在11～12,000rpm下离心20min，上清液用于分析。 

测定步骤： 

1)漩涡振荡上清液； 

2)用“Digifiex”自动进样器，吸取40μl瘤胃液或标准液加40μl蒸馏水至贴好标签的试管中，同时设重复； 

3)吸取A液2.5ml加入每个试管，漩涡振荡； 

4)吸取B液2.0ml加入每个试管，漩涡振荡； 

5)在37℃水浴中加热30min； 

6)550nm下读数(波长为500～660nm)；若显色太重，用较小的波长测定，或将样品用蒸馏水1:1稀释； 

7)用线性回归估测标准曲线； 

8)吸收值代入方程，对于瘤胃液NH₃-N，计算结果*1.25校正偏磷酸误差； 

(9)瘤胃发酵液VFA浓度的测定：试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水； 

岛津GC-2010型气相色谱仪，气相色谱条件：柱箱温度120℃、色谱柱为长30m，内径0.22mm，薄膜厚度0.25μm的中极性毛细管柱、SPL230℃、压力97.7kPa、氢气流量40ml/min、空气流量400ml/min、FID240℃；采用外标法，配制一系列已知浓度的色谱标准酸。样品注入量为1μl，即将乙酸400μl，丙酸400μl和丁酸200μl用超纯水定容至100ml，然后用气相色谱仪绘制色谱图，计算各酸的保留时间和峰面积，按单点法将样品测定结果-峰面积值换算成各挥发性脂肪酸的摩尔浓度(mmol/L)； 

样品处理：取四层纱布过滤的瘤胃液5mL，10000g离心10min；移取上清液1mL至小离心管中，并加入冰后的25％的偏磷酸0.25mL，静置30min；然后10000g离心15min，取上清液直接进行测定； 

(10)瘤胃发酵液中微生物蛋白MCP的测定：量取50mL经4层纱布过滤的瘤胃液，于39℃下150g离心5min；准确量取30mL上清液于4℃下20000g离心20min，沉淀加入30mL蒸馏水轻轻摇动溶解后于4℃下20000g离心20min，沉淀经生理盐水和蒸馏水冲洗后再重复加入蒸馏水离心一次，以充分消除饲料氮源后，收集细菌沉淀备用，将上述高速离心收集的细菌沉淀小心无损地转移到消化管中，按凯氏微量定氮法常规测定。 

本发明的技术特点有： 

1.使用的方法快速，可重复，易操作。 

2.可准确测定肽对瘤胃发酵参数的影响：产气量、pH值、氨态氮值、挥发性脂肪酸和MCP指标是瘤胃发酵的重要指标，对他们的测定可以直接了解活体瘤胃内发酵的具体情况。 

3.可准确测定肽对瘤胃内微生物酶活性的影响：淀粉酶、蛋白水解酶和羧甲基纤维素酶活性是瘤胃内主要的酶活指标，对他们的测定可以直接了解活体瘤胃内微生物的变化情况。 

本发明是一种研究肽对奶牛瘤胃发酵影响的方法，属于大农业畜牧兽医领域，本发明方法具有方便易学，操作简便，重复性高，数值准确，模拟逼真性强的特点。通过测定产气、pH、氨态氮、挥发性脂肪酸、瘤胃微生物蛋白及瘤胃内典型的三种酶活性，能有效地确定奶牛瘤胃内肽适宜的大致浓度。能够为今后更深入的理论研究、更准确的配制奶牛日粮、减少蛋白饲料的浪费，提高奶制品质量做出科学依据和理论指导。

本发明方法能够模拟出肽在活体瘤胃内对其发酵影响的实际情况，为本学科发明研究提供了理论基础，利用奶牛作为实验动物，通过体外发酵，模拟出肽在活体瘤胃内的发酵情况，对选定的发酵参数与酶活性指标进行测定，直观了解了肽对活畜瘤胃发酵的影响，并初步找到了肽的适宜添加量。 

(四)附图说明

图1为第一种具体实施方式的预处理流程示意图； 

图2为第二种具体实施方式的预处理流程示意图。 

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明： 

一、实施例1：不同浓度肽对人工瘤胃发酵参数的影响 

1、试验材料 

(1)人工瘤胃模拟装置 

用内径为32mm，长200mm，刻度体积为100ml的医用注射器作为发酵器，用可以精确控温的(±0.5℃)的水浴摇床作为控温装置。 

(2)人工瘤胃缓冲液(Menke液)的配制 

缓冲液的配制按照Menke等(1979)的方法进行。取得瘤胃液以后加入混合培养液：400ml蒸馏水+0.1ml微量元素溶液A+200ml缓冲溶液B+200ml常量元素溶液C+1ml刃天青溶液+40ml还原剂溶液。并混匀，加热至39℃，同时使用CO₂饱和。 

微量元素溶液(A)：CaCl₂·2H₂O-13.2g、MnCl₂·4H₂O-10.0g、CoCl₂·6H₂O-1.0g、FeCl₃·6H₂O-8.0g、蒸馏水至----100ml 

缓冲溶液(B)：NH₄HCO₃—4.0g、NaHCO₃—35g、蒸馏水至----1000ml 

常量元素(C)：Na₂HPO₄—5.7g、KH₂PO₄—6.2g、MgSO₄·7H₂O—0.6g、蒸馏水至----1000ml 

刃天青溶液：0.1％(w/v) 

还原剂溶液：NaOH—4.0ml、Na₂S·9H₂O—625.0mg、蒸馏水---95ml 

每个注射器吸入瘤胃液与缓冲液(1:2)混合液共30ml。 

2、试验设计 

在瘤胃微生物培养液发酵管中添加肽。各处理组均按氨基氮:淀粉为1:4.5的比例添加玉米淀粉作为微生物生长能源。每个处理组设发酵2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h共七个时间点用于采样，每个时间点设三个重复，每个重复一支发酵管。 

在各时间点测定发酵管内发酵液的产气量、pH值、氨氮浓度、VFA浓度和MCP的产量。 

3、人工瘤胃液的采集

在试验奶牛晨饲2h后，分别从每头牛瘤胃中抽取300ml瘤胃液，混合，用4层精细纱布过滤，灌入到预热达39℃并始终通有CO₂的保温瓶中，迅速返回实验室。 

4、样品测定流程与检测方法，结合图1： 

(1)体外产气量的测定 

每个注射器吸入瘤胃液与培养液的混合液后用自制的堵头密封保持厌氧，记录活塞的位置。注射器在39℃水浴，在48小时内读取活塞位置，计数点为2h、4h、6h、8h、24h、48h。用计数点活塞位置减去活塞的初始位置，即为在相应时间内饲利发酵的产气量。 

(2)瘤胃发酵液pH值的测定 

瘤胃液中的CO₂对瘤胃pH值有很大影响。发酵物样品被采集后，应立即进行测定。否则，部分CO₂被释放后，可造成瘤胃pH值的测定有较大误差。采样后立即用Sartorius PB-20型酸度计对发酵物样品进行pH值测定。 

(3)瘤胃发酵液氨氮浓度的测定 

试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水。 

试剂： 

A液：苯酚显色剂(1L) 

1)称取0.05g亚硝基铁氰化钠(Na₂Fe(CN)₅NO·2H₂O)溶解于0.5L蒸馏水中。(此过程应戴防护手套) 

2)小心称取10g干燥苯酚(C₆H₅OH)，移入上述1L的容量瓶中，用蒸馏水定容至1L。 

3)将上述1L的溶液小心移入棕色瓶内，在2～10℃下避光保存，保质期6个月。 

B液：次氯酸盐试剂(1L) 

1)5g氢氧化钠(NaOH)溶于烧杯中，加入600ml蒸馏水。 

2)37.85g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·7H₂O)适当加热溶解摇匀。 

3)冷却后，加100ml次氯酸钠(含氯5.25％，确保新鲜)混匀。 

4)蒸馏水定容至1L。 

5)1#滤纸过滤后，在2～10℃下，避光保存于聚乙烯瓶中，保质期6个月。 

氨标准溶液 

1)贮备液为32mg/dl 

2)1.0045gNH₄Cl溶于800ml去氨蒸馏水中。 

3)用稀释的盐酸滴定至pH值为2。 

4)蒸馏水定容至1L。 

5)用贮备液配制以下溶液；32，16，8，4，2，1，0mg/dl标准溶液。 

(4)瘤胃液样品采集： 

1)用两层精细纱布过滤瘤胃液。 

2)加入2ml新配制的25％偏磷酸于8ml两层纱布过滤的瘤胃液中，封盖，摇匀。 

3)若不立即测定在-20℃保存。 

4)分析前在11～12,000rpm下离心20min，上清液用于分析。 

测定步骤： 

1)漩涡振荡上清液。 

2)用“Digiflex”自动进样器，吸取40μl瘤胃液或标准液加40μl蒸馏水至贴好标签的试管中，同时设重复。 

3)吸取A液2.5ml加入每个试管，漩涡振荡。 

4)吸取B液2.0ml加入每个试管，漩涡振荡。 

5)在37℃水浴中加热30min。 

6)550nm下读数(波长为500～660nm)。若显色太重，用较小的波长测定，或将样品用蒸馏水1:1稀释。 

7)用线性回归估测标准曲线。 

8)吸收值代入方程，对于瘤胃液NH₃-N，计算结果^*1.25校正偏磷酸误差。 

(5)瘤胃发酵液VFA浓度的测定 

试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水。 

岛津GC-2010型气相色谱仪。气相色谱条件：柱箱温度120℃、色谱柱为长30m，内径0.22mm，薄膜厚度0.25μm的中极性毛细管柱、SPL230℃、压力97.7kPa、氢气流量40ml/min、空气流量400ml/min、FID240℃。采用外标法，配制一系列已知浓度的色谱标准酸。样品注入量为1μl，即将乙酸400μl，丙酸400μl和丁酸200μl用超纯水定容至100ml，然后用气相色谱仪绘制色谱图，计算各酸的保留时间和峰面积，按单点法将样品测定结果-峰面积值换算成各挥发性脂肪酸的摩尔浓度(mmol/L)。 

样品处理：取四层纱布过滤的瘤胃液5mL，10000g离心10min；移取上清液1mL至小离心管中，并加入冰后的25％的偏磷酸0.25mL，静置30min；然后10000g离心15min，取上清液直接进行测定。 

(6)瘤胃发酵液中微生物蛋白MCP的测定 

按图中程序，量取50mL经4层纱布过滤的瘤胃液，于39℃下150g离心5min；准确量取30mL上清液于4℃下20000g离心20min，沉淀加入30mL蒸馏水轻轻摇动溶解后于4℃下20000g离心20min，沉淀经生理盐水和蒸馏水冲洗后再重复加入蒸馏水离心一次，以充分消  除饲料氮源后，收集细菌沉淀备用。将上述高速离心收集的细菌沉淀小心无损地转移到消化管中，按凯氏微量定氮法常规测定。 

5、统计分析 

各项指标的测定数据经Excel2003初步整理后，均采用SAS统计软件包中的GLM过程进行方差分析和显著性检验，多重比较采用Duncan法测验，利用Means过程计算平均数及标准差。 

二、实施例2：不同浓度肽对人工瘤胃酶活的影响 

1、试验材料 

同上 

2、试验设计 

同上 

在各时间点测定发酵管内发酵液中微生物淀粉酶活性、蛋白酶活力和羧甲基纤维素酶的活力。 

3、样品测定流程与检测方法，结合图2. 

根据瘤胃微生物发酵的条件和特点，选择淀粉酶、蛋白酶和羧甲基纤维素酶(以羧甲基纤维素钠为底物，主要是内切葡萄糖苷酶，即endo-1，4-β-D-glucanase，简称EG)三个指标按图2进行瘤胃微生物酶活性的测定。 

(1)淀粉酶活性的测定 

采集瘤胃液，离心，取上清液，用淀粉酶试剂盒测定(南京建成)。 

(2)蛋白酶酶活性的测定 

试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水。 

试剂： 

1％酪蛋白底物：1.0g酪蛋白溶于100ml0.01mol/LNaOH。 

0.01mol/LNaOH：0.4gNaOH用蒸馏水定容至1000ml容量瓶中。 

10％三氯乙酸：10g三氯乙酸溶于100ml蒸馏水中。 

0.4mol/L Na₂CO₃：42              预处理流程            1000ml容量瓶中。 

0.5mol/L HCl：量取4            Pretreatment Process   

蒸馏水中。 

酪氨酸储备液：0.1g干燥L-酪氨酸用0.5mol/L HCl定容至100ml。测定方法： 

以1ml1％的酪蛋白为底物，加入4ml瘤胃液，在38℃条件下厌氧培养4小时，然后加入5mL10％三氯乙酸除去未分解的酪蛋白，以4000rpm离心15分钟，取上清1ml，分别加入5ml  0.4mol/L Na₂CO₃溶液和1ml Folin-phenol(酚)试剂，混合后显色15分钟，在680nm处测定吸光度。依标准曲线计算酪氨酸生成量。每分钟催化酪蛋白水解生成lug酪氨酸的酶量定义为一个酶活单位。 

取酪氨酸储备液0、2、4、6、8、10ml，用水稀释至10ml。按同样操作方法，测定标准曲线。 

(3)羧甲基纤维素酶酶活性的测定 

试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水。 

试剂： 

0.2M磷酸缓冲液(pH6.0)： 

分别称取71.64g十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)和31.21g二水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)，各自溶解于1000ml蒸馏水配成0.2M的贮存液，121℃灭菌15min保存；量取磷酸氢二钠溶液12.3ml和磷酸二氢钠溶液87.7ml，混合均匀，配制成100ml，pH6.0的磷酸缓冲液。 

0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)底物溶液： 

称取0.5g羧甲基纤维素钠用50mM，pH6.0磷酸缓冲液定容至100ml。 

DNS溶液： 

甲液(6.9g结晶酚溶于15.2ml10％氢氧化钠溶液，蒸馏水稀释至69ml，加6.9g亚硫酸钠)与乙液(255g酒石酸钾钠溶于300ml10％氢氧化钠溶液中，再加入880ml1％3，5一二硝基水杨酸溶液)混合呈黄棕色，棕色试剂瓶中放置7～10天后使用。 

葡萄糖标准溶液： 

称取1g分析纯的葡萄糖溶于小烧杯中，完全转移到1L容量瓶中，定容，此时葡萄糖浓度为1.0mg/ml，为母液；用移液管移取0、10、20、30、40、50、60ml母液到100ml容量瓶中，定容，制成每升溶液中分别含葡萄糖0、100、200、300、400、500、600mg的标准溶液。(4)标准曲线的绘制： 

取1ml系列浓度的葡萄糖溶液加到15ml刻度试管中，加入2mlDNS溶液，沸水浴10min后迅速流水冲洗冷却，用蒸馏水定容至15ml，以0.0mg/kg为空白，550nm下测定吸光度；以吸光度为横坐标、葡萄糖浓度为纵坐标作标准曲线，并得出回归方程。 

纤维素酶活力测定方法： 

以羧甲基纤维素钠溶液为底物，酶活单位(IU)定义为每min每ml酶液作用于底物生成的葡萄糖的量(μmol)。取1ml底物溶液加到15ml刻度试管中，50℃水浴中振荡30min，加入0.2ml处理后的酶液，50℃水浴中振荡反应60min，迅速取出并加入2mlDNS溶液终止反  应，沸水浴10min后迅速流水冲洗冷却，用蒸馏水定容至15ml，摇匀，部分转移至10ml的离心管中，在3.2×103rpm下离心15min，550nm下测定吸光度。空白样制作系将0.2ml处理后的酶液换成0.2ml50mM，pH6.0磷酸缓冲液，其余不变。 

酶活(IU)＝[(Cmg/L×15ml)/葡萄糖分子量]/(60min×0.2ml酶液) 

4、统计分析 

各项指标的测定数据经Excel2003整理后，采用SAS统计软件包中的GLM过程进行方差分析和显著性检验，多重比较采用Duncan法测验，利用Means过程计算平均数及标准差。 

三、试验效果 

瘤胃pH值总的变化趋势是发酵后各组pH值先降低后升高，且均处在正常范围之内，差异不显著；发酵液的氨氮浓度值随时间变化的趋势是，在发酵的24h内，各组氨氮浓度值先升高，再降低；各处理组在24h的发酵过程中，微生物蛋白产量呈现降-升-降-升的动态变化趋势，且10g/L组、20g/L组变化相近。综合各指标，人工瘤胃内适宜的肽浓度在15～20g/L。 

通过试验结果分析，可以看出，该试验取得了良好的效果，达到了预期目的。不仅能在相对简单的条件下顺利完成试验，而且试验成本低，环境污染程度小。

Claims (1)

1.一种肽用于调控奶牛瘤胃发酵的体外的检测方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)人工瘤胃模拟装置：用内径为32mm，长200mm，刻度体积为100ml的医用注射器作为发酵器，用可以精确控温±0.5℃的水浴摇床作为控温装置；

(2)人工瘤胃缓冲液的配制：取得瘤胃液以后加入混合培养液：400ml蒸馏水+0.1ml微量元素溶液+200ml缓冲溶液+200ml常量元素溶液+1ml刃天青溶液+40ml还原剂溶液，并混匀，加热至39℃，同时使用CO₂饱和；其中微量元素溶液：13.2g CaCl₂·2H₂O、10.0g MnCl₂·4H₂O、1.0g CoCl₂·6H₂O、8.0g FeCl₃·6H₂O和蒸馏水至100ml；缓冲溶液：4.0g NH₄HCO₃、35g NaHCO₃和蒸馏水至1000ml；常量元素：5.7g Na₂HPO₄、6.2g KH₂PO₄、0.6g MgSO₄·7H₂O和蒸馏水至1000ml；刃天青溶液：0.1％w/v；还原剂溶液：4.0ml NaOH、625.0mg Na₂S·9H₂O、蒸馏水95ml；每个注射器吸入瘤胃液与缓冲液1∶2混合液共30ml；

(3)在瘤胃微生物培养液发酵管中添加肽，各处理组均按氨基氮：淀粉为1∶4.5的比例添加玉米淀粉作为微生物生长能源，每个处理组设发酵2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h共七个时间点用于采样，每个时间点设三个重复，每个重复一支发酵管；在各时间点测定发酵管内发酵液的产气量、pH值、氨氮浓度、VFA浓度和MCP的产量；

(4)人工瘤胃液的采集：在试验奶牛晨饲2h后，分别从每头牛瘤胃中抽取300ml瘤胃液，混合，用4层精细纱布过滤，灌入到预热达39℃并始终通有CO₂的保温瓶中；

(5)体外产气量的测定：每个注射器吸入瘤胃液与培养液的混合液后用自制的堵头密封保持厌氧，记录活塞的位置；注射器在39℃水浴，在48小时内读取活塞位置，计数点为2h、4h、6h、8h、24h、48h；用计数点活塞位置减去活塞的初始位置，即为在相应时间内饲料发酵的产气量；

(6)瘤胃发酵液pH值的测定：发酵物样品被采集后，采用Sartorius PB-20型酸度计对发酵物样品进行pH值测定；

(7)瘤胃发酵液氨氮浓度的测定：采用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水：

试剂包括：A液：苯酚显色剂(1L)

1)称取0.05g亚硝基铁氰化钠(Na₂Fe(CN)₅NO·2H₂O)溶解于0.5L蒸馏水中；

2)称取10g干燥苯酚(C₆H₅OH)，移入1L的容量瓶中，用蒸馏水定容至1L；

3)将上述1L的溶液小心移入棕色瓶内，在2～10℃下避光保存，保质期6个月；

B液：次氯酸盐试剂(1L)

1)5g氢氧化钠(NaOH)溶于烧杯中，加入600ml蒸馏水；

2)37.85g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·7H₂O)适当加热溶解摇匀；

3)冷却后，加入100ml次氯酸钠混匀；

4)蒸馏水定容至1L；

5)1#滤纸过滤后，在2～10℃下，避光保存于聚乙烯瓶中，保质期6个月；

氨标准溶液：

1)贮备液为32mg/dl；

2)1.0045gNH₄Cl溶于800ml去氨蒸馏水中；

3)用稀释的盐酸滴定至pH值为2；

41蒸馏水定容至1L；

5)用贮备液配制以下溶液：32，16，8，4，2，1，0mg/dl标准溶液；

(8)瘤胃液样品采集：

1)用两层精细纱布过滤瘤胃液；

2)加入2ml新配制的25％偏磷酸于8ml两层纱布过滤的瘤胃液中，封盖，摇匀；

3)若不立即测定在-20℃保存；

4)分析前在11～12,000rpm下离心20min，上清液用于分析；

测定步骤：

1)漩涡振荡上清液；

2)用“Digifiex”自动进样器，吸取40μl瘤胃液或标准液加40μl蒸馏水至贴好标签的试管中，同时设重复；

3)吸取A液2.5ml加入每个试管，漩涡振荡；

4)吸取B液2.0ml加入每个试管，漩涡振荡；

5)在37℃水浴中加热30min；

6)550nm下读数；若显色太重，用较小的波长测定，或将样品用蒸馏水1∶1稀释；

7)用线性回归估测标准曲线；

8)吸收值代入方程，对于瘤胃液NH₃-N，计算结果*1.25校正偏磷酸误差；

(9)瘤胃发酵液VFA浓度的测定：试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或去离子水；

岛津GC-2010型气相色谱仪，气相色谱条件：柱箱温度120℃、色谱柱为长30m，内径0.22mm，薄膜厚度0.25μm的中极性毛细管柱、SPL230℃、压力97.7kPa、氢气流量40ml/min、空气流量400ml/min、FID240℃；采用外标法，配制一系列已知浓度的色谱标准酸；样品注入量为1μl，即将乙酸400μl，丙酸400μl和丁酸200μl用超纯水定容至100ml，然后用气相色潜仪绘制色谱图，计算各酸的保留时间和峰面积，按单点法将样品测定结果-峰面积值换算成各挥发性脂肪酸的摩尔浓度(mmol/L)；

样品处理：取四层纱布过滤的瘤胃液5mL，10000g离心10min；移取上清液1mL至小离心管中，并加入冰后的25％的偏磷酸0.25mL，静置30min；然后10000g离心15min，取上清液直接进行测定；

(10)瘤胃发酵液中微生物蛋白MCP的测定：量取50mL经4层纱布过滤的瘤胃液，于39℃下150g离心5min；准确量取30mL上清液于4℃下20000g离心20min，沉淀加入30mL蒸馏水轻轻摇动溶解后于4℃下20000g离心20min，沉淀经生理盐水和蒸馏水冲洗后再重复加入蒸馏水离心一次，以充分消除饲料氮源后，收集细菌沉淀备用，将上述高速离心收集的细菌沉淀小心无损地转移到消化管中，按凯氏微量定氮法常规测定。

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