CN1560620A - 瘤胃液或青贮饲料发酵液中l-和d-型乳酸定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于乳酸分析技术范围的一种瘤胃液或青贮饲料发酵液中L－和D－型乳酸定量分析方法。该方法利用手性试剂L－薄荷醇作为衍生化试剂与乳酸对应异构体进行酯化反应，得乳酸薄荷醇酯，然后在气相色谱仪上进行分析，显示对应乳酸对应异构体L－和D－型乳酸的不同谱图，根据此谱图拆分和定量分析出瘤胃液或青贮饲料发酵液中L－和D－型乳酸和计算出L－乳酸和D－乳酸含量。解决了现有技术方案中L－和D－乳酸拆分操作复杂、成本高、灵敏度低和拆分不完全等问题。该方法具有成本低、拆分完全、灵敏度高以及可以同时测定乳酸对应异构体和其它短链脂肪酸的优点。该技术方案主要用于牛羊等反刍动物瘤胃发酵参数测定以及青贮饲料品质评定。
Description
技术领域
本发明属于乳酸分析技术范围，涉及一种瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸定量分析方法。
背景技术
牛羊等反刍动物依赖瘤胃微生物的发酵作用获得所需的营养物质。随着人们对优质牛羊肉和奶制品需求量的提高，在牛羊等反刍动物的饲养过程中势必使用大量的淀粉类碳水化合物饲料和优质的青贮饲料。
淀粉类碳水化合物饲料在瘤胃微生物的发酵作用下，分解产生挥发酸、乳酸等多种短链脂肪酸，是动物体的能量来源。在正常发酵情况下，瘤胃中的乳酸主要是L-型乳酸，D-型乳酸所占比例很小(约占总乳酸20％，甚至没有)；它们作为合成挥发酸的中间代谢产物在瘤胃中的浓度仅1mmol/L左右。但是，当突然或大量饲喂富含淀粉类易消化碳水化合物饲料时，瘤胃中乳酸含量会明显增加、瘤胃pH迅速降低、动物反刍减少、采食量下降、饲料转化效率降低。当瘤胃pH低于5.0时，总乳酸浓度可升高至100～150mmol/L，D-乳酸的比例也会高达50％以上。由于D-乳酸在机体内不容易代谢，从而导致了乳用反刍动物产奶高峰期和肉用反刍动物强度肥育期十分普遍的D-乳酸中毒(D-lactic acidosis)。准确检测瘤胃液中乳酸含量和两种对映异构体的比例，对于调控反刍动物瘤胃发酵环境、研究反刍动物酸中毒机理，以及预防D-乳酸中毒的发病机理至关重要。
发酵良好的优质青贮饲料能够有效的保存青绿植物的营养成分。丰富的乳酸含量可以提高动物的适口性，是冬季和早春季节反刍动物的最佳粗饲料来源。正常发酵情况下，青贮饲料中的乳酸主要为L-乳酸，而D-乳酸含量很少。L-乳酸含量的高低是评定青贮质量的一项关键指标。
为了检测瘤胃液或青贮饲料发酵液中乳酸含量和其对映异构体的比例，目前通常采用的技术方案有以下三种：(1)化学法测定总乳酸含量；(2)利用L-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶的酶学检测方法；(3)利用甲基化环糊精手性流动相在高效液相色谱上分离乳酸的对映异构体。然而，这些技术方案存在的问题是：(1)化学法仅能够测定乳酸的总量，无法判定两种对映异构体的比例。同时，化学法操作步骤复杂，强酸强碱的应用使本方法更具危险性；(2)酶学方法所需的L-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶价格非常昂贵，而且反应耗时长，误差来源多；(3)使用甲基化环糊精手性流动相的液相色谱分析法本身就需要消耗大量流动相化学试剂，手性流动相化学物质的价格又普遍偏高，因此使用甲基化环糊精手性流动相分析乳酸对映异构体的成本很高。此外，本拆分方案在液相色谱上难以实现1.5的基线分离度，因此无法准确计算乳酸的两种对映异构体的相对含量。同时，液相色谱法的检测灵敏度低，当瘤胃液或青贮饲料发酵液中乳酸含量较低时，不宜采用此方法检测。
L-薄荷醇是一种常见的化工原料。由于L-薄荷醇与乳酸的酯化反应(或衍生化反应)生成的乳酸薄荷醇酯具有清凉芳香的特点，人们通常将乳酸薄荷醇酯作为香料原料应用到牙膏、香水、洗发产品、烟草和食品添加剂等产品之中。但是，关于利用L-薄荷醇自身的对映异构特点与乳酸进行酯化反应，以实现L-和D-乳酸在气相色谱上完全拆分和定量检测的问题，并未引起人们的注意。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以借助一种常见的手性试剂与乳酸进行的酯化反应来实现成本低、灵敏度高的瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸定量分析方法，其特征在于：在从瘤胃液或青贮饲料发酵液中萃取的乳酸中，加入手性试剂L-薄荷醇作为衍生化试剂，并与乳酸对应异构体进行酯化反应得乳酸薄荷醇酯，然后在气相色谱仪上进行分析，显示对应乳酸对应异构体L-和D-型乳酸的不同谱图，根据此谱图拆分和定量分析出瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸，分析过程如下：
1).萃取瘤胃液或青贮饲料发酵液中的乳酸：将牛羊瘤胃液或青贮饲料发酵液，先离心沉淀，取上清液与去蛋白溶液均匀混合，然后冷冻使其中蛋白质凝固，待上清液解冻后再以离心方式去蛋白，将上清液置于玻璃分液漏斗中，再用常规方法萃取后，将萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩，得含有萃取液的乳酸液。
2).酯化反应：在含有萃取液的乳酸液中按(w/w)比例加入衍生化试剂L一薄荷醇、滴入硫酸催化剂和苯，回流酯化反应后，得乳酸的薄荷醇衍生化产物乳酸薄荷醇酯；
3).气相色谱分析：当乳酸薄荷醇酯冷却后，加入蒸馏水，混和均匀，以离心沉淀，取含乳酸薄荷醇酯上清液1μl，在配有氢火焰离子检测器的气相色谱仪上进行分析，得对应异构体的L-和D-型乳酸的不同谱图，根据此谱图可拆分和定量分析出瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸。
4).定量分析：对照质谱仪进行的L-和D-乳酸分析结果，确定L-乳酸和D-乳酸的保留时间分别为5.625min和5.722min。根据样本测定与标准液中L-乳酸和D-乳酸的峰面积值，计算出样本中L-乳酸和D-乳酸含量。
所述去蛋白溶液为20～40％(w/v)偏磷酸。
所述瘤胃液或青贮饲料发酵液的乳酸含量中加入L-薄荷醇的(w/w)比例为1∶(2～5)。
本发明的有益效果是解决了现有技术方案中L-和D-乳酸拆分操作复杂、成本高、灵敏度低和拆分不完全等问题。作为乳酸的衍生化试剂，L-薄荷醇购买方便、成本低、使用安全。L-薄荷醇与D-和L-乳酸的酯化反应具有条件成熟、操作简单、可以批量处理试验样品的特点。使用气相色谱的氢火焰离子检测器提高了检测的灵敏度，使瘤胃液或青贮饲料发酵液中乳酸对应异构体比例的微小变化检测成为可能。色谱操作条件实现了1.5的基线分离度，L-和D-乳酸在此技术方案下可以完全拆分和定量计算出瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸的含量。
本发明的分析方法在分析瘤胃液或青贮发酵液中L-和D-型乳酸时还具有意想不到的效果：瘤胃液中存在的乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸经过薄荷醇酯化处理后，不但没有干扰乳酸对应异构体的分离，而且还可以在相同的色谱条件下检测出来。本技术方案使反刍动物瘤胃液或青贮饲料发酵液中乳酸的两种对应异构体和其他短链脂肪酸可以同时定量检测，节省了短链脂肪酸分析所需的经费和时间。
附图说明
图1为瘤胃液或青贮饲料发酵液中乳酸对应异构体L-和D-型乳酸的色谱分析图。
具体实施方式
本发明提供一种可以借助一种常见的手性试剂与乳酸进行的酯化反应来实现成本低、灵敏度高的瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸定量分析方法，其特征在于：在从瘤胃液或青贮饲料发酵液中萃取的乳酸中，加入手性试剂L-薄荷醇作为衍生化试剂，并与乳酸对应异构体进行酯化反应得乳酸薄荷醇酯，然后在气相色谱仪上进行分析，显示对应乳酸对应异构体L-和D-型乳酸的不同谱图，根据此谱图拆分和定量分析出瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸，分析过程如下：
1).萃取瘤胃液或青贮饲料发酵液中的乳酸：将牛羊瘤胃液或青贮饲料发酵液，先离心沉淀，取上清液与去蛋白溶液均匀混合，然后冷冻使其中蛋白质凝固，待上清液解冻后再以离心方式取去蛋白，将上清液置于玻璃分液漏斗中，再用常规方法萃取后，将萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩，得含有萃取液的乳酸液。
2).酯化反应：在含有萃取液的乳酸液中按(w/w)为1∶(2～5)的比例加入衍生化试剂L-薄荷醇、滴入硫酸催化剂和苯，回流酯化反应后，得乳酸的薄荷醇衍生化产物乳酸薄荷醇酯；
3).气相色谱分析：当乳酸薄荷醇酯冷却后，加入蒸馏水，混和均匀，以离心沉淀，取含乳酸薄荷醇酯上清液1μl，在配有氢火焰离子检测器的气相色谱仪上进行分析，得对应异构体的L-和D-型乳酸的不同谱图，根据此谱图可拆分出瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸。
4).定量分析：对照质谱仪进行的L-和D-乳酸分析结果，确定L-乳酸和D-乳酸的保留时间分别为5.625min和5.722min。根据样本测定与标准液中L-乳酸和D-乳酸的峰面积值，计算出样本中L-乳酸和D-乳酸含量。
上述去蛋白溶液为20～40％(w/v)偏磷酸溶液。
现例举具体实施例对本发明予以进一步说明。
1).萃取瘤胃液或青贮饲料发酵液中的乳酸：
(1)牛羊瘤胃液或青贮饲料发酵液的提取与制备：采集高精料饲喂牛或羊的瘤胃液或制备青贮饲料发酵液，将发酵液以10,000×g离心10min，取10ml上清液与2ml 25％(w/v)偏磷酸溶液均匀混合，置-20℃下冷冻6h以上，以使其中蛋白质凝固，待上清液解冻后再以10,000×g离心2次，每次10min，取去蛋白的二次离心上清液备用；
(2)乳酸的萃取：取5ml经2次离心去蛋白的上清液置玻璃分液漏斗中，用15ml乙醚或乙醇溶液分3次萃取乳酸，用旋转蒸发仪对含乳酸的乙醚萃取液减压浓缩至2ml；
2).酯化反应：在2ml含乳酸的乙醚浓缩液中加入0.2g L-薄荷醇、1滴硫酸催化剂和2ml苯，回流酯化反应1小时，得乳酸的薄荷醇衍生化产物乳酸薄荷醇酯；
3).气相色谱分析：当乳酸薄荷醇酯冷却后，加入2ml蒸馏水，混和均匀，以10,000×g离心10min，取上清液待用；取乳酸薄荷醇酯1μl，在配有氢火焰离子检测器的气相色谱仪上实现L-和D-型乳酸的拆分与定量分析，仪器的色谱分析条件为：HP-55％苯基甲基硅氧烷毛细管色谱柱(30.0m×320μm×0.25μm)；N2载气；柱压15.00psi；柱箱程序升温100℃保持1min，15℃/min的升温速率至240℃，保持5min，色谱仪至260。后运行5min；进样口温度250℃，压力15.00psi，总流量65.4ml/min；氢火焰离子检测器温度250℃，H2流量35.0ml/min，空气流量350ml/min，尾吹气流量25ml/min下进行气相色谱分析，分析结果如图1所示。
3).气相色谱分析：对照质谱仪进行的L-和D-乳酸分析结果，确定L-乳酸和D-乳酸的保留时间分别为5.625min和5.722min。根据样本测定与标准液中L-乳酸和D-乳酸的峰面积值，计算出样本中L-乳酸和D-乳酸含量。
Claims (3)
1.一种瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸定量分析方法，其特征在于：在从瘤胃液或青贮饲料发酵液中萃取的乳酸中，加入手性试剂L-薄荷醇作为衍生化试剂，并与乳酸对应异构体进行酯化反应得乳酸薄荷醇酯，然后在气相色谱仪上进行分析，显示对应乳酸对应异构体L-和D-型乳酸的不同谱图，根据此谱图拆分和定量分析出瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸，分析过程如下：
1).萃取瘤胃液或青贮饲料发酵液中的乳酸：将牛羊瘤胃液或青贮饲料发酵液，先离心沉淀，取上清液与去蛋白溶液均匀混合，然后冷冻使其中蛋白质凝固，待上清液解冻后再以离心方式去蛋白，将上清液置于玻璃分液漏斗中，再用常规方法萃取后，将萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩，得含有萃取液的乳酸液；
2).酯化反应：在含有萃取液的乳酸液中按(w/w)比例加入衍生化试剂L-薄荷醇、滴入硫酸催化剂和苯，回流酯化反应后，得乳酸的薄荷醇衍生化产物乳酸薄荷醇酯；
3).气相色谱分析：当乳酸薄荷醇酯冷却后，加入蒸馏水，混和均匀，以离心沉淀，取含乳酸薄荷醇酯上清液1μl，在配有氢火焰离子检测器的气相色谱仪上进行分析，得对应异构体的L-和D-型乳酸的不同谱图，根据此谱图可拆分出瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸；
4).定量分析：对照质谱仪进行的L-和D-乳酸分析结果，确定L-乳酸和D-乳酸的保留时间分别为5.625min和5.722min，根据样本测定与标准液中L-乳酸和D-乳酸的峰面积值，计算出样本中L-乳酸和D-乳酸含量。
2.根据权利要求1所述瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸定量分析方法，其特征在于：所述去蛋白溶剂为20～40％(w/v)偏磷酸溶液。
3.根据权利要求1所述瘤胃液或青贮饲料发酵液中L-和D-型乳酸定量分析方法，其特征在于：所述瘤胃液或青贮饲料发酵液中乳酸含量与L-薄荷醇的添加量比例(w/w)为1∶(2～5)。
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