CN101412989A - 一种利用解脂亚罗酵母菌脂肪酶分两步催化油脂合成生物柴油的方法与所得到的柴油 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用解脂亚罗酵母菌CGMCC No.2707的粗脂肪酶酶液及其固定化脂肪酶分别催化废弃动、植物油脂水解、酯化反应，合成生物柴油方法；并提供了该脂肪酶粗酶液和固定化酶的制备方法。该方法中油脂水解和酯化反应均使用脂肪酶为催化剂，不使用强酸强碱，具有反应条件温和、污染小的优点，整个脂肪酸甲酯/乙酯生产过程中不使用有机溶剂，反应安全、效率高。

Description

一种利用解脂亚罗酵母菌脂肪酶分两步催化油脂合成生物柴油的方法与所得到的柴油

【技术领域】

本发明属于生物化工技术领域。更具体地，本发明涉及一种使用生物酶催化油脂合成生物柴油的方法与所得到的柴油。

【背景技术】

生物柴油的燃烧性能可以与石化柴油相媲美，是一种新型无污染的可再生能源，其研究和应用受到了广泛的关注。

目前生产生物柴油的方法主要是化学法，化学法使用高温高压、反应能耗高、副反应多、原料要求严格。研究使用生物酶法合成生物柴油的绿色化工方法正在成为生物柴油行业的热点。酶法合成生物柴油普遍具有反应条件温和、副反应少、反应中无污染物排放等许多优点

CN1557913A公开了一种在有机介质反应体系中利用脂肪酶转化油脂生产生物柴油的新方法，该方法是以短链醇ROH作为反应酰基受体，使用一些对酶活性没有负面影响的相对亲水的有机溶剂作为反应介质，所述的溶剂例如是叔丁醇、1，4-二氧六环等，这种有机溶剂的加入量是油脂体积的20％-200％，利用生物酶催化油脂原料进行转酯反应，合成生物柴油。

CN1456674A公开了一种利用其自制固定化脂肪酶在有机相中催化脂肪酸和醇的酯化反应。该方法中所用的有机溶剂为沸程40-150℃的石油馏出物。

酶催化合成生物柴油中使用的固定化脂肪酶大都采用NOVO435。北京化工大学谭天伟等发明了我国自主知识产权的脂肪酶及其固定化方法。他利用纺织物为载体制成固定脂肪酶，并且利用该固定化酶生产生物柴油的中试装置已通过专家鉴定。

上述酶法合成生物柴油方法将甲醇与油脂等摩尔比混和后，使用固定化脂肪酶催化转酯反应得到粗生物柴油。此反应体系中产生甘油、水和脂肪酸甲酯。甘油会黏附在固定化酶颗粒上，减少了酶与底物油脂的接触机会，降低了反应速率，并且该体系中使用甲醇浓度也对固定脂肪酶产生不可逆的毒害。酶催化生物柴油合成反应由于甘油屏蔽与甲醇毒害两方面原因，使得该酯交换反应转化率低

清华大学刘德华等的研究结果表明，叔丁醇亲水性强于正己烷(CN1884440“以叔丁醇作为新型有机介质反应体系可以促进甲醇等短链醇在油脂中溶解，有效降低短链醇对微生物细胞反应活性的负面影响”)，能加大甘油和水的溶解性能。因此使用叔丁醇作溶剂，可以减少甘油对酶的屏蔽作用。为了减少甲醇对固定化脂肪酶的毒害，刘德华等采用对脂肪酶无毒害作用的甲酸甲酯替代甲醇，利用甲酸甲酯和油脂发生酯交换反应，增强酶的稳定性，延长酶的寿命。而且该酯交换反应不产生甘油，不会在固定化酶表面产生甘油屏蔽。

虽然专利CN1884440解决了甘油对固定化脂肪酶的空间屏蔽问题，但和已有的生物酶催化的转酯反应体系相似，均使用有机溶剂做为底物或产物的溶解介质。有机溶剂良好的溶解性能增加醇与动植物油脂的混合度，利于反应底物在固定化脂肪酶表面发生界面反应，催化合成脂肪酸酯。然而，反应体系中使用的有机溶剂沸程很低(如石油醚、叔丁醇，沸程介于40-90℃)，易燃易爆，增加了工业化生产的危险性，增加设备的投入强度，同时由于使用大量溶剂，其生产效率受到影响。

本发明提供解脂亚罗酵母菌CGMCC No.2707的粗脂肪酶酶液与固定化脂肪酶的制备方法，解决了反应过程中的关键问题即反应的催化剂脂肪酶的生产。并提供了利用上述脂肪酶分两步催化油脂合成生物柴油的方法。第一步：利用粗脂肪酶酶液将油脂水解成脂肪酸，此过程中产生甘油水溶液，与脂肪酸易分离。第二步：利用第一步得到的粗脂肪酸与等摩尔的甲醇或乙醇反应，使用固定化脂肪酶作催化剂，得到粗脂肪酸甲酯(粗生物柴油)，粗甲酯经蒸馏后即得生物柴油。第二步反应为酶催化脂肪酸和醇的酯化反应，反应过程中不产生甘油，不存在甘油对固定化酶的屏蔽作用，相对提高了酶的使用寿命，简化了产物分离；同时脂肪酸可以与醇以任意比例混溶，不需要使用有机溶剂助溶，提高了生产效率，极大的增加了安全性，降低了设备投入与生产成本。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的一个目的是利用解脂亚罗酵母菌(Yarrowia lipolytica)CGMCCNo.2707脂肪酶的两步合成生物柴油的方法。

本发明的另一个目的是常用所述方法得到的柴油。

[技术方案]

本发明公开了一种使用解脂亚罗酵母菌CGMCC No.2707(见中国发明专利申请200810172116.8，申请日2008年11月11日)脂肪酶的两步合成生物柴油的方法，即第一步，使用脂肪酶发酵液将油脂水解成脂肪酸；第二步，用固定化脂肪酶催化脂肪酸和甲醇或乙醇合成生物柴油。

其中第一步水解油脂反应原理如下：

第二步合成脂肪酸甲酯或乙酯反应原理如下：

具体地，本发明是按照下述方案实现的。

(1)所述脂肪酶制备方法如下：

粗脂肪酶酶液的制备：按照申请号200810172116.8、发明名称《一株高产脂肪酶的解脂亚罗酵母突变株、培养方法及其酶应用》的中国发明专利申请所描述的方法制备，本申请将CN200810172116.8发明专利申请全文加以引用。将解脂亚罗酵母菌CGMCC No.2707菌株在茄子瓶斜面培养12—24小时后接种于发酵罐培养，培养80—100小时后，测得水解酶活达到8000u/ml以上时下罐。收集下罐后发酵液，通过转速1900转/分的三足离心机除去发酵液中固形物与菌体细胞，即得到粗脂肪酶酶液。

固定化脂肪酶的制备：按所述粗脂肪酶酶液总重量的1‰—5‰把固定化助剂加入到该粗脂肪酶酶液中，再按照载体与所述粗脂肪酶酶液的体积比1:1-1.5，让其载体与前面得到的粗脂肪酶酶液混合，使得每克载体的上酶量达到8000U-13000U，然后在温度50℃下进行干燥，使得有酶载体的水分达到4-8重量％，即得到固定化脂肪酶。固定化脂肪酶可在4℃冰箱内保存有效期不低于3个月。

(2)油脂水解步骤：首先往反应器中加入油脂，然后按照每克油脂为50-100单位加入前面制备的解脂亚罗酵母菌CGMCC No.2707粗脂肪酶酶液，在所述油脂与水的重量比1:0.2-1:1.2、每克油0.05-0.2g十二烷基磺酸钠或硬脂酸钠为乳化剂，水相pH5.5-7.0、温度20-55℃与100-300转/分振荡的条件下进行水解反应12-36小时。当所述油脂的水解率达到90％以上时，该反应液用2-4N酸进行酸化，使得水相pH为3.5-5.5，再用温度60-80℃的水洗涤，静置分层，得到含有6.1-8.3重量％甘油的水相与含少量水的粗脂肪酸相，将粗脂肪酸脱水得到用于酯化步骤的脂肪酸。该步骤得到的甘油水相可进一步提纯分离，制备高纯度工业甘油或药用甘油。

优选地，油脂水解步骤是在脂肪酶催化油脂水解的具体步骤参见申请号：200810110995.1、发明名称：一种利用脂肪酶水解油脂生产脂肪酸的方法的中国发明专利申请，本申请将该发明专利申请全文加以引用。

(3)酯化步骤：将步骤(2)得到的粗脂肪酸与甲醇或乙醇按照摩尔比1:1-1:1.5进行混合，然后按照每克脂肪酸重量的10％加入步骤(1)得到的固定化脂肪酶，在30℃下振荡或搅拌进行酯化反应3-24小时，得到脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯，经气相色谱检测得脂肪酸甲酯或乙酯转化率达到90％。将得到粗脂肪酸甲酯或乙酯在真空度93-98KPa下进行减压蒸馏，收集190-220℃馏分为精脂肪酸甲酯或乙酯。

在本发明中，所述的脂肪酶生产菌种为解脂亚罗酵母菌CGMCCNo.2707，也可为Candida rugosa ATCC14830(美国)。

所述酶活测定方法为该技术领域人员熟知的橄榄油测定法。

在本发明的意义上，所述固定化助剂应该理解是对酶蛋白起保护作用的物质，例如它选自聚乙烯醇、山梨醇、吐温80、PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)或MgSO₄的固定化助剂。当然，在本发明中，对酶蛋白起保护作用的物质也都可以使用，它们也在本发明的保护范围之内。

在本发明的意义上，所述固定化载体应该理解是一些可载带脂肪酶并将其脂肪酶固定的物质，例如它选自棉布、丝绸及丙纶、涤纶、锦纶、晴纶、氨纶或维纶纺织物。当然，在本发明中，对载带脂肪酶并将其脂肪酶固定的其它物质也都可以使用，它们也在本发明的保护范围之内。

根据本发明的一个实施方案，该方法还包括在步骤(3)中加入以粗脂肪酸的重量计1％-10％除水剂，以提高油脂或脂肪酸的转化率，同时还缩短反应达到的平衡时间。

在本发明的意义上，所述的除水剂应该理解是通过物理方式将水分子吸附在自身的结构中的物质。所述的除水剂例如是一种或多种选自硅胶、氧化铝凝胶、分子筛、活性炭或活性白土的除水剂。优选地，所述的除水剂是硅胶或分子筛。

在本发明中，所述的油脂是一种或多种选自猪油、鱼油、菜子油、大豆油、花生油、玉米油、棉籽油、椰子油、棕榈油、米糠油和它们的油脚、皂脚的C_14-22动植物油脂或废动植物油脂的油脂。

所述的油脚、皂脚是油脂碱炼分出的残渣，其主要成分是成为钠皂形式的脂肪酸和中性油脂，较好的利用方式是作为脂肪酸的原料。例如大豆油脚、花生油脚、酸化油脚。

在本发明中，所述水解反应所达到的油脂水解率是按照下式计算得到的：

油脂皂化价的检测方法参照GB/T5534-1995《动植物油脂皂化值的测定》。

在本发明方法的酯化步骤中得到的脂肪酸甲酯或乙酯主要是含有油酸、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸的C_16-18脂肪酸甲酯或乙酯。它们各自含量因原料的不同而会有差别，但对于最后产品性能没有非常明显的影响。

在本发明方法的酯化步骤中，所述的醇为甲醇或乙醇。

所述减压蒸馏其使用设备为本技术领域人员熟知的设备，例如：减压水蒸汽蒸馏使用的是普通实验室使用的蒸馏设备，它们由真空泵、电加热装置、搅拌器、蒸馏烧瓶和冷凝管组成。真空泵是由常州华东真空泵厂以商品名ZX-4型旋片式真空泵销售的产品，电加热装置是北京中兴伟业仪器有限公司以商品名ZDHW型调温电热套销售的产品，搅拌器是由江苏金坛市江南仪器厂以商品名JJ—1型精密增力电动搅拌器销售的产品，蒸馏烧瓶和冷凝管是由天津光明玻璃仪器有限公司以商品名蒸馏烧瓶销售的产品。

所述三足离心机为本技术人员熟知的设备，如张家港市新华化工机械有限公司生产的型号SSP450离心机。

所述酯化反应使用设备为本技术领域人员熟知的设备，如江苏太仓市实验室设备厂生产的THZ-C恒温振荡器。

根据一个优选实施方案，步骤(3)得到的粗生物柴油经蒸馏后可以得到纯度95％—98％的生物柴油，可以应用于工业、农业等技术领域。

在本发明中，所述酯化反应所达到的酯化率是按照下式计算得到的：

在本发明中，所述脂肪酸甲酯纯度是按照EN-14103《脂肪和油脂衍生物脂肪酸甲酯、酯和亚麻酸甲酯含量的测定》进行测定的。

[有益效果]

本发明方法中制备并使用解脂亚罗酵母菌CGMCC No.2707的粗脂肪酶酶液和固定化脂肪酶，解决了生物酶法生产生物柴油产业化过程中催化剂生产的关键问题。技术路线采用粗脂肪酶酶液催化油脂水解、固定化脂肪酶催化粗脂肪酸酯化，两步法生产生物柴油。

与已报道的酶法合成生物柴油的转酯化方法相比，本发明方法优越性在于：

1、采用生物酶法两步法催化合成脂肪酸甲/乙酯。第一步水解反应，游离脂肪酶催化进行的水解反应中产生甘油水，甘油易分离且纯度高；第二步酯化反应即利用固定化脂肪酶合成脂肪酸甲/乙酯时无甘油产生，避免了甘油对固定化酶的屏蔽作用，相对的延长了酶的使用寿命。该方法中催化剂寿命可达12批次，极大增加了酶法生产生物柴油的工业化可行性。

2、固定化脂肪酶合成脂肪酸甲/乙酯时直接采用脂肪酸与短链醇，使得两种底物可以以任意比互溶，反应过程中不再需要有机溶剂，使生产效率提高了约0.2-2倍，极大的增加了安全性，降低了生产成本。

3、与转酯化合成生物柴油低碳醇酯的方法步骤比较如下表：

 

转酯反应	两步法(本发明)
		原料除杂、脱胶、脱臭	原料除杂、脱胶、脱臭
酯化反应	水解反应
		甘油分离	甘油分离
脱溶	酯化反应
		分离	分离
调质	调质

与转酯化酶法合成生物柴油相比，本发明方法主要工序与其工序数目相同。但两步法在水解步骤中产生甘油易分离，水相甘油浓度高达重量计6.1％-8.3％；酯化步骤中无甘油产生，不存在甘油对酶的毒害作用，相对的延长了酶的使用寿命。而且本方法不使用有机溶剂，提高了整个反应的安全性，同时和相比较有溶剂系统理论上生产效率得以提高。

4、和利用固定化脂肪酶催化转酯化反应相比，两步法固定化脂肪酶直接催化脂肪酸，不存在位置专一性问题，提高了反应速率(转酯化反应进行甘油2号碳原子的转酯化反应时存在空间障碍，具有位置专一性，反应转化率较慢)。

5、固定化酶催化转酯反应产物中主要成分为甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯，成份较复杂；本发明固定化脂肪酶催化脂肪酸的酯化反应，只有脂肪酸酯一种产物，易于纯化分离。

6、本发明中固定化脂肪酶催化脂肪酸与甲/乙酯发生酯化反应，其反应历程与转化率可以使用简单的酸碱滴定方法检测。而转酯化反应必须使用气相色谱分析方法对反应中甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯及其脂肪酸甲酯进行检测。相比而言，本发明中采用的酯化反应检测方法简单，检测及时，适合工厂产业化应用。

【具体实施方式】

下述的实施例说明本发明而不是对本发明的保护范围加以限制。

实施例1

粗脂肪酶酶液制备：将解脂亚罗酵母菌株(Yarrowia lipplytica CGMCCNO.2707)在茄子瓶斜面培养12小时后接种于发酵罐培养，培养90小时后，测得水解酶活达到8500u/ml后下罐，收集下罐后发酵液，采用张家港市新华化工机械有限公司生产的型号SSP450离心机在转速1900转/分条件下离心，取出发酵液中固形物与菌体细胞，即得所述粗脂肪酶酶液。

固定化脂肪酶制备：以脂肪酶发酵液总重量计，先将2‰聚乙烯醇、1‰吐温80、2‰ PVP和1‰ MgSO₄固定化助剂加入到脂肪酶发酵液中，混匀。以丝绸(约1：1.5，该载体重量与所述粗脂肪酶酶液的比)与所述粗脂肪酶酶液混合，使得每克载体的上酶量达到8000U-13000U，50℃下干燥，使得酶载体水分达到5重量％，即可得到固定化脂肪酶。

在100ml磨口带塞锥形瓶中加入50g市售豆油，然后加入5000U所述粗脂肪酶酶液，25ml蒸馏水，2.5g硬脂酸钠为乳化剂，水相pH5.5-7.0、温度45℃，130转/分振荡的条件下水解反应12-18小时。采用酸度滴定法测得油脂转化率达90％时，使用3N硫酸酸化直到水相pH4.5，用70-80℃的热水充分洗涤，静置分层，放出水层，得到粗脂肪酸，粗脂肪酸脱水后进行下一步酯化反应。

取上述脂肪酸1.39g，加入乙醇292ul，加入固定化脂肪酶0.14g，反应在30℃、190转/分条件下振荡反应8h，酸价分析法测得脂肪酸乙酯转化率达83％。将得到的一定数量的脂肪酸乙酯在真空度95KPa下进行减压蒸馏，收集210-220℃的馏分为所述精脂肪酸乙酯。

实施例2

与实施例1的实施方式相同，只是在100ml磨口带塞锥形瓶中加入20g市售豆油，然后加入12ml(酶活480U/ml)Candida rugosa 14830脂肪酶发酵液，在45℃下以120转/分保温振荡进行反应。采用实施例1中制备脂肪酸的方法得到所述用于参加酯化反应的粗脂肪酸。

取上述脂肪酸1.39g，加入乙醇291ul，加入实施例1中固定化脂肪酶0.14g，反应在30℃、190转/分条件下振荡反应8h，采用酸价分析方法测得最终脂肪酸乙酯转化率达81％。

实施例3

与实施例1的实施方式相同，只是在100ml磨口带塞锥形瓶中加入20g购自秦皇岛金海粮油食品有限公司的大豆酸化油，然后加入0.4ml(酶活5000U/ml)解脂亚罗酵母菌株CGMCC NO.2707粗脂肪酶酶液，然后在40℃下采用实施例1中制备脂肪酸的方法，130转/分保温振荡进行反应，得到用于参加酯化反应的粗脂肪酸。

取实施例1中所述脂肪酸1.40g，加入甲醇202ul，加入实施例1中所述固定化酶0.14g，反应在30℃、190转/分条件下振荡反应8h，采用实施例1中检测方法最终脂肪酸甲酯转化率达82％。

将得到的一定数量的脂肪酸甲酯在真空度95KPa下进行减压蒸馏，收集190-210℃的馏分为所述精脂肪酸甲酯。脂肪酸甲酯按照EN-14103《脂肪和油脂衍生物脂肪酸甲酯、酯和亚麻酸甲酯含量的测定》方法测定，其纯度达到95％。

实施例4

与实施例1的实施方式相同，只是取实施例1中所述脂肪酸1.40g，加入乙醇292ul，加入实施例1中固定化脂肪酶0.14g，反应初始时加入0.4g分子筛，反应在30℃、190转/分条件下振荡反应8h，采用实施例1中检测方法最终脂肪酸乙酯转化率达到90％。

实施例5

与实施例1的实施方式相同，只是在1000ml四口烧瓶中加入500g豆油，加入30000U的解脂亚罗酵母菌株CGMCC NO.2707粗脂肪酶酶液，40℃下190转/分保温振荡反应。采用实施例1中制备脂肪酸的方法得到所述用于参加酯化反应的脂肪酸。

取上述粗脂肪酸400g，加入甲醇59ml，甲醇每间隔3h，分四次流加。加入实施例1中所述固定化脂肪酶16g，反应在30℃、190转/分条件下反应12h，反应过程中加入10g分子筛，所得产物采用酸价分析法测得脂肪酸甲酯转化率达80％。该固定化酶循环使用催化反应达12批次。将收集到的粗脂肪酸甲酯在真空度95KPa下进行减压蒸馏，收集190-210℃的馏分为精脂肪酸甲酯。

将该脂肪酸甲酯以EN-14103《脂肪和油脂衍生物脂肪酸甲酯、酯和亚麻酸甲酯含量的测定》方法测定，精脂肪酸甲酯中脂肪酸甲酯含量达到96％。

本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以对本发明做出各种变化和修改，但所有等效的技术方案都属于本发明的范畴，本发明保护范围是由本申请权利要求书所限定的。

Claims (10)

1、一种使用解脂亚罗酵母菌(Yarrowia lipolytica)LW1脂肪酶分两步催化油脂生产生物柴油的方法，其特征在于该方法步骤如下：

(1)所述脂肪酶制备：

粗脂肪酶酶液的制备：

将解脂亚罗酵母菌LW1菌株在茄子瓶斜面培养12—24小时后接种于发酵罐培养，培养80—100小时后，测得水解酶活达到8000u/ml以上时，其发酵液通过离心分离除去该发酵液中固形物与菌体细胞，得到粗脂肪酶酶液；

固定化脂肪酶的制备：按粗脂肪酶酶液总重量的1‰—5‰把固定化助剂加入到粗脂肪酶酶液中，再按照载体与粗脂肪酶酶液的体积比1:1-1.5，让其载体与前面得到的粗脂肪酶酶液混合，使得每克载体的上酶量达到8000U-13000U，然后在温度50℃下进行干燥，使得有酶载体的水分达到4-8重量％，即得到固定化脂肪酶；

(2)油脂水解步骤：首先往反应器中加入油脂，然后按照每克油脂为50-100单位加入前面制备的解脂亚罗酵母菌CGMCC No.2707粗脂肪酶酶液，在所述油脂与水的重量比1:0.2-1:1.2、每克油0.05-0.2g十二烷基磺酸钠或硬脂酸钠为乳化剂，水相pH 5.5-7.0、温度20-55℃与100-300转/分振荡的条件下进行水解反应12-36小时；当所述油脂的水解率达到90％以上时，该反应液用2-4N酸进行酸化，使得水相pH为3.5-5.5，再用温度60-80℃的水洗涤，静置分层，得到含有6.1-8.3重量％甘油的水相与含少量水的粗脂肪酸相，将粗脂肪酸脱水得到用于酯化步骤的脂肪酸；得到的甘油水相进一步提纯分离，制备高纯度工业甘油或药用甘油；

(3)酯化步骤：将步骤(2)得到的粗脂肪酸与甲醇或乙醇按照摩尔比1:1-1:1.5进行混合，然后按照每克脂肪酸重量的10％加入步骤(1)得到的固定化脂肪酶，在30℃下振荡或搅拌进行酯化反应3-24小时，得到脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯，经气相色谱检测得脂肪酸甲酯或乙酯转化率达到90％；再将得到粗脂肪酸甲酯或乙酯在真空度93-98KPa下进行减压蒸馏，收集190-220℃馏分为精脂肪酸甲酯或乙酯生物柴油。

2、根据权利要求1所述的生产生物柴油的方法，其特征在于所述的脂肪酶是解脂亚罗酵母菌株LW1，其编号CGMCC NO.2707，也可以是Candida rugosa ATCC 14830。

3、根据权利要求1所述的生产生物柴油的方法，其特征在于所述的固定化助剂是一种或多种选自聚乙烯醇、山梨醇、吐温80、PVP或MgSO₄的固定化助剂。

4、根据权利要求1所述的生产生物柴油的方法，其特征在于所述的固定化载体选自棉布、丝绸、及丙纶、涤纶、锦纶、晴纶、氨纶或维纶纺织物。

5、根据权利要求1所述的生产生物柴油的方法，其特征在于所述的油脂是一种或多种选自猪油、菜子油、大豆油、花生油、棉籽油、椰子油、棕榈油或大豆油脚、皂脚或酸化油的油脂。

6、根据权利要求1所述的生产生物柴油的方法，其特征在于所述的醇是甲醇或乙醇，所述甲醇或乙醇可以一次或多次加入。

7、根据权利要求1所述的生产生物柴油的方法，其特征在于所述油脂水解步骤在转速100—130转/分与温度20-45℃下进行。

8、根据权利要求1所述的生产生物柴油的方法，其特征在于在步骤(3)中加入所述的除水剂硅胶或分子筛，其加入量是所述油脂重量的1％-10％。

9、根据权利要求1-8中任一权利要求所述方法所得到的生物柴油，其特征在于它含有油酸、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸的C_16-18脂肪酸甲酯或乙酯。

10、根据权利要求9所述的生物柴油，其特征在于它的C_16-18脂肪酸甲酯或乙酯含量是95-98重量％。