CN101407766A - 一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种具有高抗三唑类杀菌剂腈菌唑的突变型木霉菌TUV－13，及其与水稻形成共生体后在促进水稻生长、提高产量、防治病害等方面的应用技术，突变型木霉菌TUV－13为原始出发菌株木霉菌T216经过诱变获得，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M208074。

Description

一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种具有高抗三唑类杀菌剂腈菌唑突变型木霉菌TUV-13及其应用。

技术背景

木霉菌(Trichoderma hazianum)自20世纪30年代以来，就用于植物病害的生物防治和改善作物的生长。长期以来人们将目光关注于木霉菌与病原菌的互作，认为木霉菌主要是通过重寄生作用防治植物病原菌引起的病害。随着近10来人们对木霉菌细胞学研究的深入，发现这种对植物病害的防治效应实际上是依赖其能否定殖在作物组织中并诱导作物防御反应基因的表达实现的。关于木霉菌在作物植株中定殖机制的研究，目前尚无定论，一些研究者认为，木霉菌可定殖黄瓜等一些作物的根系，其机制是相当精密的，木霉菌丝先缠绕根组织，然后通过表皮进入皮层组织，但不会再深入维管束组织引起病害；另一些学者认为，一些木霉菌可定殖于植物维管束内，这种共生木霉菌才是作为免疫反应诱导因子来源生物。上述观点均集中于木霉菌对作物诱导抗病性方面，但也暗示了木霉菌能够在一些作物的植株中定殖，并与作物形成一种共生体关系。目前已见报道中有关木霉菌能在其中定殖的作物有黄瓜、烟草、玉米、菜豆等。关于木霉菌与水稻互作，木霉菌能否定殖，定殖在什么部位以及能否在水稻体内转移等问题，目前国内外也未见报道。

目前，化学杀菌剂的大量使用，破坏了农业生态系统，对人类健康构成了严重的威胁，长期使用化学农药也增强了病害产生耐药性、抗药性，导致了农药的使用频率和剂量逐年增加的恶性循环，而且也影响着土壤中有益微生物，木霉菌的生防作用同样也受到影响。尤其是化学杀菌剂使用后在土壤和植物表面的残留，对木霉菌在土壤和植物表面的定殖的影响尤为明显，因此，选育出对当前大量推广应用的化学杀菌剂具有抗性的生防木霉菌，探索它们的最适生长条件，制成田间防效良好的生防制剂，将生物防治与化学防治有机结合，最大限度地发挥生物农药的作用，减少化学农药的使用，建立良好的生态平衡，是当前植物病害防治的一个良好方向。目前已有抗苯并咪唑类、酰胺类化学杀菌剂的木霉突变体成功选育的报道，还未见抗三唑类化学杀菌剂腈菌唑的报道。

发明内容

本发明第一个目的是提供一株与水稻植株形成共生体关系的抗三唑类杀菌剂腈菌唑的突变型木霉菌(Trichoderma hazianum)TUV-13CCTCC NO.M208074。

本发明的另一目的是提供一种木霉菌TUV-13与水稻形成共生体的应用，其能促进水稻生长、提高产量及防治病害。

本发明的目的是通过以下方式实现的。

一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌(Trichoderma hazianum)TUV-13的保藏号为：CCTCC NO：M208074。

所述菌株由原始出发菌株木霉菌(Trichoderma hazianum)T216CCTCC NO.M207141。经过诱变获得，能在含60～140μg/mL腈菌唑的PDA培养基上正常生长、产孢。

一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌TUV-13的应用，所述菌株能与水稻形成共生体，具有促进水稻生长、防治病害的功效。

应用过程包括以下步骤：

1)将所述菌株在PDA培养基上恒温培养3～7d，用无菌打孔器打取菌饼备用；配制稻麸粉固体培养基，用水拌湿，分装于罐头瓶中，灭菌冷却；在无菌条件下，接入菌饼常温培养，经常摇动瓶体，待木霉菌丝长满培养基并长出大量绿色分生孢子后，倒出，摊开阴干，过筛，得木霉菌固体培养物；

2)将供试水稻种子清洗，消毒，再用清水清洗，将上述木霉菌固体培养物按质量体积比为1∶50～100的比例加入泡种清水中，混匀后加入洗净的水稻种子浸泡，早稻室温下浸泡36～48小时，中、晚稻室温下浸泡20～24小时。

所述的PDA培养基含腈菌唑60～100μg/mL。

所述的稻麸粉固体培养基成分为：稻草粉6～7份，麦麸粉3～4份，另按质量加入0.5～1％硫酸铵和0.1～0.3％葡萄糖。

所述的分生孢子倒出后，在40～50℃烘干或室内自然阴干。

所述的分生孢子风干后的含水量不超过12％。

所述的分生孢子风干后过60目筛。

所述的用于水稻消毒的消毒剂为强氯精，消毒时间早稻为12～18小时，中、晚稻为6～8小时。

利用已经多次紫外线诱变的木霉菌T216作为出发原始菌株，钴源γ射线辐照诱变育种，再利用经钴源γ射线辐照筛选出的最优突变体作为出发菌株进行紫外线诱变，并利用腈菌唑作为筛选药剂，选育出抗药性木霉突变体TUV-13。

抗药突变型木霉菌TUV-13的培养形态特征

本发明的抗药突变型木霉菌TUV-13与出发菌株T216在不含腈菌唑的PDA的培养基培养性状一致：菌落生长速度快，气生菌丝发达，新鲜的菌丝呈白色或无色，羊绒状，通常形成明显的突起直达培养皿的顶部，菌落老熟时呈暗绿色；在光学显微镜下可观察到其气生菌丝均呈树状分枝，主轴比较长，二次分枝多而短，很少有再次分枝，分生孢子梗均呈瓶状，基部变细，中间膨大，以大角度伸出，终极瓶梗细长，无明显绕缩，3～5个轮状排列；分生孢子球形，绿色，单胞，光滑，完全符合木霉菌的形态特征，此外其生理生化特征也与出发菌株T216相同，由此可判断其为木霉属真菌。抗药突变型木霉菌株TUV-13与出发菌株T216的区别：一是TUV-13在含腈菌唑浓度为60～140μg/mL的PDA培养基上能正常生长、产孢，而T216则不能(见附图2)；二是TUV-13在水稻植株中定殖能力明显优于出发菌株T216。

木霉菌TUV-13固体培养产物的具体制备技术

将抗药突变型菌株TUV-13在含腈菌唑60～100μg/mL的PDA培养基上恒温培养3～7d，PDA培养基为丝状真菌常用培养基，其配方为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL。用无菌打孔器打取直径为1cm的菌饼备用。同时配制稻麸粉固体培养基(稻麸粉固体培养基成分为：稻草粉6～7份，麦麸粉3～4份，另按质量加入0.5～1％硫酸铵和0.1～0.3％葡萄糖)，用水拌湿，分装于罐头瓶中，每罐装100g。120℃间歇灭菌2次，每次15min。冷却后，在无菌条件下，每瓶接入菌饼5块，置于28℃条件下培养。培养过程中，经常摇动瓶体，待木霉菌丝长满培养基并长出大量绿色分生孢子后，倒出，摊开40～50℃烘干或室内自然阴干，其含水量不超过12％，过60目筛，牛皮纸袋包装待用。

木霉菌TUV-13与水稻形成共生体的应用技术

将供试水稻种子先用清水清洗，去除发育不良的种子，再用强氯精进行表面消毒，早稻为12～18小时，中、晚稻为6～8小时。然后用清水清洗。将上述木霉菌固体培养物按质量体积比为1∶50～100的比例加入泡种清水中，混匀后加入洗净的水稻种子，早稻浸泡36～48小时左右，中、晚稻室温下浸泡20～24小时左右，早稻便可上堆催芽播种于大田，中、晚稻可直接播种于大田。结果显示木霉菌TUV-13浸泡水稻种子，对纹枯病的防治效果可达62％左右，增加产量18～22％。

经突变型木霉菌TUV-13固体培养产物浸种处理的各盆栽水稻秧苗病情指数仅为5.78％，而对照秧苗纹枯病病情指数高达33.81％，TUV-13对水稻纹枯病的防效可达82.9％。同时对其秧苗素质调查结果表明，具有内生木霉菌的水稻秧苗不论在生长势上(苗高、叶龄)还是在生物量上(苗重、根重)，都极显著高于无共生木霉菌的秧苗，水稻秧苗素质得到显著的提高。

本发明的有益效果：

利用抗药性突变型木霉菌株TUV-13对水稻浸种处理，可在水稻体内定殖、转移，与水稻建立一种机遇性共生体关系，在这种共生体关系中，木霉菌不但对水稻未造成明显的危害，还能促进水稻生长，提高水稻产量，同时还对水稻主要病害，均具有一定的防治效果，同时可减轻由化学杀菌剂的大量使用对农业生态系统的破坏以及对人类健康构成的严重威胁。此外，由于突变型木霉菌株TUV-13对化学杀菌剂具有抗性，也可以与化学杀菌剂一起使用，将生物防治与化学防治有机结合，这对水稻栽培中病害的无害化防治，建立良好的生态平衡，具有重大的启示，对我国水稻生产及国家粮食安全战略，均具有重要作用。

哈茨木霉(Trichoderma hazianum)TUV-13

保藏日期：2008年5月19日

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心

保藏单位简称：CCTCC

保藏号为：CCTCC NO：M208074

附图说明

图1：木霉菌在水稻植株定殖动态图。

图2：诱变株TUV-13与出发菌株T216培养性状比较图。

A：诱变株TUV-13在不含有腈菌唑的PDA培养基上正常生长、产孢

a：诱变株TUV-13在含有腈菌唑100μg/mLPDA培养基上正常生长、产孢

B：原始菌株T216在不含有腈菌唑的PDA培养基上正常生长、产孢

b：原始菌株T216在含有腈菌唑100μg/mLPDA培养基上未能正常生长、产孢。

具体实施方式

以下实施方式和实施例旨在进一步说明本发明，而不是对本发明的进一步限定。

实施例1：

抗药突变型木霉菌株TUV-13的获得

第一步，钴源γ射线辐照木霉菌诱变育种。利用已经多次紫外线诱变的木霉菌株T216作为出发原始菌株，在PDA培养基上接种木霉菌株T216，在25℃恒温培养5d，产生大量绿色孢子后，用无菌水洗下，倒进装有玻璃珠的三角瓶，以180转/min在摇床上振动1～2小时，制成分生孢子悬浮液。利用钴源γ射线辐照木霉菌的主要技术参数由申请者实验确定，即将第一步所制备的木霉菌孢悬液在无菌条件下调木霉菌孢子浓度为1×10⁸个/mL，放入辐照室进行诱变，辐照剂量120000rad。然后，按每皿100μL涂布于PDA培养基上，移入恒温箱中25℃培养3～7d，从中选取生长势最好的木霉单菌落，作为第二步出发菌株。

第二步，利用经钴源γ射线辐照筛选出的最优突变体作为出发菌株，在PDA培养基上在25℃恒温培养5d，产生大量绿色孢子后，用无菌水洗下，倒进装有玻璃珠的三角瓶，以180转/min在摇床上振动1～2小时，制成分生孢子悬浮液。并在无菌条件下调木霉菌孢子浓度为1×10⁶个/mL。按体积比1∶100加入经灭菌的马铃薯汁液到装有木霉菌孢悬液的三角瓶中，25℃恒温预培养2～4h，从中分别取出6mL放入不同的直径为6cm的无菌培养皿，进行紫外线照射诱变。紫外线诱变技术中的有关技术参数由本发明专利申请人多次实验确定，即将装有木霉菌孢悬液的培养皿放在磁力搅拌器上，调整培养皿于紫外灯管垂直30cm处，先将20w紫外灯打开预热15min，去皿盖，放入灭菌的磁力搅拌头，于黑暗中边搅拌边照射，照射时间分别为5min。从经紫外线照射处理的孢悬液中取出0.1mL，涂在含腈菌唑原药浓度为60μg/mL的PDA培养基上(另室内毒力测定腈菌唑原药对出发菌T216的EC₅₀值为21.25μg/mL)，用黑布包严，移入恒温箱中25℃培养3～7d。观察见到有菌落舒展并能产孢的菌落即可能是木霉菌株的诱变耐药菌株，并从中筛选出生长势最优的木霉菌单菌落。经纯培养后，再按上述方法进行紫外线诱变，用含腈菌唑药剂的PDA培养基筛选，所不同的是筛选药剂腈菌唑浓度从70、80、90、100、110依次提高到140μg/mL。从中筛选出不同含药浓度层次上的突变体。

第三步，将上述筛选出的抗药性木霉突变体统一接入含有100μg/mL的PDA培养基上，观察它们的培养性状，从中筛选出生长最快，产孢最多的木霉菌株。经遗传稳定性实验检测，命名TUV-13。并在中国典型培养保藏中心保存登记，登记号为CCTCCNO：M208074。

实施例2

抗药突变型木霉菌株TUV-13的遗传稳定性检测

将筛选确定的抗药性突变型木霉菌纯化培养后，接种到试管中的PDA斜面培养基上，试管塞子为硅胶塞，26℃培养5d，连续转管10次，然后用塑料袋密封，4℃冰箱中保存6个月后转移至含腈菌唑原药浓度为100μg/mL的PDA平板上，观察其能正常生长与产孢，表明其抗药性稳定性遗传。

实施例3

将抗药突变型菌株TUV-13在含腈菌唑100μg/mL的PDA培养基上恒温培养3～5d，用无菌打孔器打取直径为1cm的菌饼备用。同时配制稻麸粉固体培养基(稻草粉7份，麦麸粉3份，另按固体培养基质量加入1％硫酸铵和0.1％葡萄糖)，用水拌湿，分装于罐头瓶中，每罐装100g。120℃间歇灭菌2次，每次15min。冷却后，在无菌条件下，每瓶接入菌饼5块，置于28℃条件下培养。培养过程中，经常摇动瓶体，待木霉菌丝长满培养基并长出大量绿色分生孢子后，倒出，摊开室内自然阴干，含水量不超过12％，过60目筛，牛皮纸袋包装待用。

将供试水稻种子，用清水除去秕粒，强氯精消毒14小时，洗净后，分别用抗药性突变型木霉菌固体培养产物按质量体积比1∶50的比例配制泡种液(处理)和出发菌株T216固体培养产物同比例(对照)浸种48h处理，30℃催芽，待芽长约1厘米时播种。

该实例分长沙县黄兴镇和沅江市草尾镇两个地点进行。湘矮早播种于长沙县黄兴镇，2008年3月22日泡种，3月25日播种，栽培方式为抛秧盘育秧后移栽于大田。移栽田分为8个小区，每小区100平方米，随机区组排列，突变型木霉菌TUV-13固体培养产物浸种处理的秧苗移栽于2，4，6，8小区，出发菌株T216固体培养产物浸种处理的秧苗移栽于1，3，5，7小区。沅江草尾镇供试水稻品种为8462，栽培方式为大田直播。直播田也分为8个小区，每小区200平方米，随机区组排列，突变型木霉菌TUV-13固体培养产物浸种处理的秧苗移栽于2，4，6，8小区，出发菌株T216固体培养产物浸种处理的秧苗移栽于1，3，5，7小区。两地田间肥水管理同常规，整个生育期除喷施杀虫剂外，未施用任何杀菌剂。

在长沙黄兴镇试验点，经木霉菌突变体TUV-13浸种处理的湘矮早品种，整个生育期间，木霉菌在植株上的定殖率呈现先升后降的趋势，秧苗前期木霉菌定殖率大约为65％，然后逐渐上升到80％左右；秧苗移栽本田后，到分蘖期木霉定殖率快速升高，接近100％，呈现上升趋势。此后，随着水稻的发育，进入孕穗期、抽穗期，目标木霉菌的定殖率呈现出逐步下降趋势，降至80％左右。至水稻黄熟期，目标木霉菌的定殖率下降速率加快，降到不足10％(见附图1)。

在沅江草尾镇实验地，虽然是撒播模式，浸种接种的木霉突变体TUV-13在水稻品种8642上的定殖规律与黄兴镇试验点大致相同，也是先升后降。只是撒播模式中，接入的木霉菌在水稻植株的定殖率略低于移栽区(见附图1)。

经木霉菌TUV-13浸种处理的水稻对纹枯病的防治效果为62％左右。可增产18～22％。(见表1)。

表1接种TUV-13对水稻两地田间产量及其构成比较分析

注：每点取样面积为2m²。表中数据同一列字母相同者表示差异不显著(Duncan’s新复极差法)

黄兴镇试验点有效穗p＝0.0204，结实率p＝0.508，千粒重p＝0.059，产量p＝0.0093；沅江草尾镇试验点有效穗p＝0.0064，结实率p＝0.082，千粒重p＝0.066，p＝0.0036。

实施例4

供试品种为湘矮早，为纹枯病易感品种。数取健康饱满湘矮早水稻种1600粒，经强氯精消毒14小时后，平均分配于8个培养皿中，每皿200粒；其中4皿加入2g的突变型木霉菌TUV-13固体培养产物，120ml无菌水，浸种48h，另4皿加入等量的无菌水作为对照，突变型木霉菌TUV-13固体培养产物制备方法同实施例3。此后，将水稻种均匀撒入发芽盒中(发芽盒中都装有相同重量的土，用水调和成稀泥并模拟田间环境)，每盒播200粒。放入人工气候箱中28℃恒温培养；待水稻苗长到一叶一芯时，接种纹枯病菌菌块，每盒接种8块相同大小的菌块，再放入人工气候箱培养10d，调查统计水稻秧苗纹枯病发病情况并计算防治效果。试验结果表明，经突变型木霉菌TUV-13固体培养产物浸种处理的各盆栽水稻秧苗病情指数仅为5.78％，而对照秧苗纹枯病病情指数高达33.81％，TUV-13对水稻纹枯病的防效可达82.9％(见表2)。

表2水稻纹枯病病情指数及TUV-13接种防治效果

注：差异显著性分析采用邓肯氏法，p＝0.005＜0.01。

TUV-13浸种处理水稻种子对水稻纹枯病具有较好的防治效果。同时对其秧苗素质调查结果表明，具有内生木霉菌的水稻秧苗不论在生长势上(苗高、叶龄)还是在生物量上(苗重、根重)，都极显著高于无共生木霉菌的秧苗，水稻秧苗素质得到显著的提高(见表3)

表3共生木霉菌对水稻秧苗生长的影响

注：表中数据采用邓肯氏多重方差分析，不同小写字母表示处理间达到0.05水平显著差异，不同大写字母表示处理间达到0.01水平显著差异。

实施例5

木霉菌株TUV-13在水稻植株中定殖能力观察

水稻种子经木霉菌突变体TUV-13浸种处理后，保湿培养条件下，在光学实体变焦显微镜下可观察到木霉菌株TUV-13利用水稻种子发芽时呼吸产物，在其颖壳上定殖扩繁。在水稻种子发育分化初期，TUV-13可侵入胚根与胚芽之间隆起组织，或直接侵入叶鞘组织，还可通过附着孢贴在水稻根系，并随着根系的伸长而扩展，也可通过缠绕的方式定殖在根的伸长区，还可发育成侵入器官，进入水稻根部皮层组织。随着水稻秧苗的生长发育，TUV-13也可进入新长出的叶片中，最后均定殖在水稻植株各器官的皮层细胞间隙，与水稻秧苗形成共生体关系。但不能进入水稻微管束系统与细胞中，从而区别于水稻病原菌。此外，其出发菌株T2I6仅能在无菌的盆栽条件下定殖在水稻植株中，在大田开放条件下与水稻形成共生体却较差。

这种共生体发展动态为：在大田生产环境中，水稻秧苗期、分蘖期，木霉菌TUV-13在水稻根部、茎基部、叶片上定殖率高，达80％以上。此后，木霉菌TUV-13在水稻植株中的定殖率逐步降低，到水稻黄熟期，定殖在水稻植株中的木霉菌基本消失。而出发菌株T216在大田生产条件下，在水稻植株中定殖率最高不超过40％，与水稻形成共生体能力较差，比突变型TUV-13在水稻上的定殖能力具有明显差距。

实施例6

木霉菌TUV-13与水稻形成共生体的检测

从大田生产中，采集经木霉菌浸种处理的水稻植株，对其标样进行共生木霉菌的分离回收。分离回收的方法是常规的无菌操作，对供试的幼苗根、茎、叶进行严格的表面消毒：将各部位外表清洗后，浸入75％乙醇5min，无菌水冲洗3次，再转入0.1％升汞中1min，无菌水漂洗3次，晾干后，用刀片轻轻刮除外皮(茎、叶)，然后用无菌剪刀分别将根剪成约0.5cm的小段，茎、叶剪成约0.5×0.5cm的组织块，置于加入含氯霉素和腈菌唑各100μg/mL的PDA平板中。同时做对照实验，将相同表面消毒后水稻根、茎、叶不作剪切或不刮除外皮直接种植于平板，并把空白平板打开，放置在所操作的超净工作台上10min。所有培养皿均放入28℃条件下培养。观测是否从根、茎、叶等伤口处长出的木霉菌落。当从根、茎、叶等伤口处长出的菌落疑似木霉菌时，从其边缘处切取菌丝尖端涂到新的含有腈菌唑浓度为100μg/mL的PDA平皿上，进行纯化培养。对分离得到的疑似木霉菌镜检鉴定，推定该抗药性标记木霉菌突变体已在相应的水稻植株部位定殖。

Claims (10)

1、一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌，其特征在于，所述抗药突变型木霉菌(Trichoderma hazianum)TUV-13的保藏号为：CCTCC NO：M208074。

2、根据权利要求1所述的一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌，其特征在于，所述菌株由原始出发菌株木霉菌(Trichoderma hazianum)T216CCTCC NO.M207141经过诱变获得，能在含60～140μg/mL腈菌唑的PDA培养基上正常生长、产孢。

3、一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌的应用，其特征在于，所述菌株能与水稻形成促进水稻生长、防治病害的共生体。

4、根据权利要求3所述的一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌的应用，其特征在于，应用过程包括以下步骤：

1)将所述菌株在PDA培养基上恒温培养3～7d，用无菌打孔器打取菌饼备用；配制稻麸粉固体培养基，用水拌湿，分装于罐头瓶中，灭菌冷却；在无菌条件下，接入菌饼常温培养，经常摇动瓶体，待木霉菌丝长满培养基并长出大量绿色分生孢子后，倒出，摊开阴干，过筛，得木霉菌固体培养物；

2)将供试水稻种子清洗，消毒，再用清水清洗，将上述木霉菌固体培养物按质量体积比为1∶50～100的比例加入泡种清水中，混匀后加入洗净的水稻种子浸泡，早稻室温下浸泡36～48小时，中、晚稻室温下浸泡20～24小时。

5、根据权利要求4所述的一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌的应用，所述的PDA培养基含腈菌唑60～100μg/mL。

6、根据权利要求4所述的一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌的应用，所述的稻麸粉固体培养基成分为：稻草粉6～7份，麦麸粉3～4份，另按质量加入0.5～1％硫酸铵和0.1～0.3％葡萄糖。

7、根据权利要求4所述的一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌的应用，所述的分生孢子倒出后，在40～50℃烘干或室内自然阴干。

8、根据权利要求4或7所述的一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌的应用，所述的分生孢子风干后的含水量不超过12％。

9、根据权利要求4所述的一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌的应用，所述的分生孢子风干后过60目筛。

10、根据权利要求4所述的一株与水稻形成共生体的抗药突变型木霉菌的应用，所述的用于水稻消毒的消毒剂为强氯精，消毒时间早稻为12～18小时，中、晚稻为6～8小时。

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