CN101401515A - 一种大花蕙兰组培苗染菌栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大花蕙兰组培苗染菌栽培方法。选取石斛小菇真菌为出发菌株，经10次逐级增大培养基大花蕙兰根浓度的驯化培养，分离获得一株适应大花蕙兰根生长环境的真菌。以壳斗科植物叶为真菌载体，通过真菌的扩大培养而制备生产菌。将生产菌按一定比例与普通营养土壤和树皮粉末混合物混合均匀后，作为移栽基质，选择生长良好的瓶苗移栽后充分浇水，置于温室，弱光缓苗，待幼苗恢复生长后，转入正常光照条件下常规栽培管理。

Description

一种大花蕙兰组培苗染菌栽培方法

(一)技术领域

本发明涉及一种大花蕙兰组培苗染菌栽培方法，是一种生物工程领域内的栽培技术。

(二)背景技术

大花蕙兰传统繁殖方式是分株繁殖，繁殖系数低，容易引起退化，新品种少。大花蕙兰可以利用种子进行繁殖，但种子内不含胚乳，自然条件下很难萌发，发芽率极低，难以满足大量繁殖的需要。20世纪初，法国的Bernard和Burgeff研究发现许多兰花没有菌根真菌的感染种子不能发芽、植株不能正常的生长发育，真正揭开了兰科菌根之迷。

有鉴于种子繁育的种种不足，目前国内外除育种研究外，大多数商业化兰花生产均采用组织培养的方法进行。大花蕙兰组织培养是20世纪60年代末才发展起来的技术，在40多年的时间里得到了长足的发展，目前已经形成一定的规模，建立了较为完善的技术体系，但其组培瓶苗移栽成活率与成苗效率不是特别理想，很大程度上与无菌快繁条件下共生真菌侵染效率低下有关。

随着兰花工厂化生产技术日趋成熟并得以广泛应用，出售组培瓶苗基本无利可图。相对来说，生产大苗还有一定的利润空间，但大棚育苗成本几乎占到整个组培苗生产成本的4成左右，稍有不慎也不会有什么利润。本发明采用真菌侵染大花蕙兰根的方法，大大提高了其组培瓶苗移栽成活率与成苗效率，因此减少不必要的人力、物力，减少材料及水、电等开支，从而降低了生产成本，对兰花产业健康高效的发展意义重大。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种大花蕙兰组培苗染菌栽培方法。

本发明的目的是这样实现的：本发明中所涉及的百分比除另有注明之外为质量比，本发明的产品采用这样的方法来制备的：

1.大花蕙兰菌根真菌的来源

菌种中文名称：石斛小菇

菌种学名：Mycena dendrobii

菌种来源：原菌种购自中国农业微生物菌种保藏管理中心编号ACCC50928。

2.菌根真菌的制备过程

2.1真菌培养基的制备

树皮块粉末2％，大花蕙兰根1％(用植物粉碎机粉碎，取破碎后的组织)，自来水97％，于121℃下灭菌30min备用。

2.2冻干菌粉末的活化

量取0.9％的生理盐水20ml于三角瓶内，经121℃灭菌30分钟冷却至25℃，将石斛小菇安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在25℃恒温箱中静止活化30分钟，备用。

2.3真菌驯化

将2.2步骤中的菌悬液按10％的比例接种于2.1步骤中的培养基中，于25℃，摇床培养120小时，摇床转速120转/分钟，将培养后的菌悬液按10％的比例接种于真菌培养基中，此步骤中的真菌培养基中大花蕙兰根添加量递增1％即为2％，同样的培养条件和培养时间，以此类推，转接培养10次，直至真菌培养基中大花蕙兰根添加量增至10％，结束驯化。

2.4生产菌种的分离纯化

去皮的马铃薯100g切成若干的小块加入适量水煮沸，煮沸开始计时30min。将其滤液加入琼脂20g，葡萄糖10g，加水至1L分装入三角瓶中于121℃下灭菌30min冷却至60℃左右倒入若干无菌平皿中，在无菌状态下使其冷却而凝固作为分离菌种的平板。将2.3步骤中结束驯化的菌悬液按10倍的比例逐级稀释，然后在无菌状态下涂布于分离平板中，将平板倒置于25℃恒温培养箱中，培养24小时取出，观察各平板真菌生长情况，选取菌落比较分散的平板作为分离平板，选择平板中菌根组织上或组织周围生长的菌落为生产菌进行斜面保藏。

2.5生产菌的制备

2.5.1培养载体的选择与制备

取壳斗科植物叶，清洗后，植物粉碎机粉碎，60℃烘干，121℃下湿热灭菌30min作为生产菌的培养载体待用。

2.5.2生产菌发酵剂的制备

将2.4步骤中获得的斜面保藏菌种用无菌接种环挑取若干于25℃，摇床培养24小时，摇床转速120转/分钟，检测菌悬液活菌数，如果活菌数≥10⁸个/ml，视同为培养成熟，如果活菌数＜10⁸个/ml，继续培养，直至达到10⁸个/ml，将此步骤获得的菌悬液称之为生产菌发酵剂。

2.5.3生产菌的制备

将生产菌发酵剂按2.5.1步骤中培养载体重量的25％接种于培养载体中，搅拌均匀，于25℃恒温培养5d，子实体生出后即可认为生产菌成熟。

3.大花蕙兰的移栽

3.1移栽基质的制备

将普通营养土壤和树皮粉末按1∶1的比例混合后作为移栽介质，调整介质pH5.5左右，同时调整水分，以手攥介质成团无液体渗出为宜。取上述移栽介质90-95份，成熟的生产菌发酵剂2-5份，充分混匀后作为移栽基质。

3.2大花蕙兰的移栽方法

选取生长良好，株高7-15cm，有2-3条健壮气生根的瓶苗作为移栽材料，开瓶炼苗1-2天后出瓶，流水冲洗根部残余培养基，剥除老叶。根部沾0.5％Na₃PO₄后移栽于移栽基质中，然后充分浇水，置于温室，弱光缓苗，待幼苗恢复生长后，转入正常光照条件下常规栽培管理。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更详细的描述：

实施例一：

1.大花蕙兰菌根真菌的来源

菌种中文名称：石斛小菇

菌种学名：Mycena dendrobii

菌种来源：原菌种购自中国农业微生物菌种保藏管理中心编号ACCC50928。

2.菌根真菌的制备过程

2.1真菌培养基的制备

树皮块粉末2％，大花蕙兰根1％(用植物粉碎机粉碎，取破碎后的组织)，自来水97％，于121℃下灭菌30min备用。

2.2冻干菌粉末的活化

量取0.9％的生理盐水20ml于三角瓶内，经121℃灭菌30分钟冷却至25℃，将石斛小菇安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在25℃恒温箱中静止活化30分钟，备用。

2.3真菌驯化

将2.2步骤中的菌悬液按10％的比例接种于2.1步骤中的培养基中，于25℃，摇床培养120小时，摇床转速120转/分钟，将培养后的菌悬液按10％的比例接种于真菌培养基中，此步骤中的真菌培养基中大花蕙兰根添加量递增1％即为2％，同样的培养条件和培养时间，以此类推，转接培养10次，直至真菌培养基中大花蕙兰根添加量增至10％，结束驯化。

2.4生产菌种的分离纯化

去皮的马铃薯100g切成若干的小块加入适量水煮沸，煮沸开始计时30min。将其滤液加入琼脂20g，葡萄糖10g，加水至1L分装入三角瓶中于121℃下灭菌30min冷却至60℃左右倒入若干无菌平皿中，在无菌状态下使其冷却而凝固作为分离菌种的平板。将2.3步骤中结束驯化的菌悬液按10倍的比例逐级稀释，然后在无菌状态下涂布于分离平板中，将平板倒置于25℃恒温培养箱中，培养24小时取出，观察各平板真菌生长情况，选取菌落比较分散的平板作为分离平板，选择平板中菌根组织上或组织周围生长的菌落为生产菌进行斜面保藏。

2.5生产菌的制备

2.5.1培养载体的选择与制备

取壳斗科植物叶，清洗后，植物粉碎机粉碎，60℃烘干，121℃下湿热灭菌30min作为生产菌的培养载体待用。

2.5.2生产菌发酵剂的制备

将2.4步骤中获得的斜面保藏菌种用无菌接种环挑取若干于2.1步骤中灭菌后的培养基中，于25℃，摇床培养24小时，摇床转速120转/分钟，检测菌悬液活菌数，如果活菌数≥10⁸个/ml，视同为培养成熟，如果活菌数＜10⁸个/ml，继续培养，直至达到10⁸个/ml，将此步骤获得的菌悬液称之为生产菌发酵剂。

2.5.3生产菌的制备

将生产菌发酵剂按2.5.1步骤中培养载体重量的25％接种于培养载体中，搅拌均匀，于25℃恒温培养5d，子实体生出后即可认为生产菌成熟。

3.大花蕙兰的移栽

3.1移栽基质的制备

将普通营养土壤和树皮粉末按1∶1的比例混合后作为移栽介质，调整介质pH5.5左右，同时调整水分，以手攥介质成团无液体渗出为宜。取上述移栽介质90份，成熟的生产菌发酵剂2份，充分混匀后作为移栽基质。

3.2大花蕙兰的移栽方法

选取生长良好，株高7-15cm，有2-3条健壮气生根的瓶苗作为移栽材料，开瓶炼苗1-2天后出瓶，流水冲洗根部残余培养基，剥除老叶。根部沾0.5％Na₃PO₄后移栽于移栽基质中，然后充分浇水，置于温室，弱光缓苗，待幼苗恢复生长后，转入正常光照条件下常规栽培管理。

实施例二：

1.大花蕙兰菌根真菌的来源

菌种中文名称：石斛小菇

菌种学名：Mycena dendrobii

菌种来源：原菌种购自中国农业微生物菌种保藏管理中心编号ACCC50928。

2.菌根真菌的制备过程

2.1真菌培养基的制备

树皮块粉末2％，大花蕙兰根1％(用植物粉碎机粉碎，取破碎后的组织)，自来水97％，于121℃下灭菌30min备用。

2.2冻干菌粉末的活化

量取0.9％的生理盐水20ml于三角瓶内，经121℃灭菌30分钟冷却至25℃，将石斛小菇安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在25℃恒温箱中静止活化30分钟，备用。

2.3真菌驯化

将2.2步骤中的菌悬液按10％的比例接种于2.1步骤中的培养基中，于25℃，摇床培养120小时，摇床转速120转/分钟，将培养后的菌悬液按10％的比例接种于真菌培养基中，此步骤中的真菌培养基中大花蕙兰根添加量递增1％即为2％，同样的培养条件和培养时间，以此类推，转接培养10次，直至真菌培养基中大花蕙兰根添加量增至10％，结束驯化。

2.4生产菌种的分离纯化

去皮的马铃薯100g切成若干的小块加入适量水煮沸，煮沸开始计时30min。将其滤液加入琼脂20g，葡萄糖10g，加水至1L分装入三角瓶中于121℃下灭菌30min冷却至60℃左右倒入若干无菌平皿中，在无菌状态下使其冷却而凝固作为分离菌种的平板。将2.3步骤中结束驯化的菌悬液按10倍的比例逐级稀释，然后在无菌状态下涂布于分离平板中，将平板倒置于25℃恒温培养箱中，培养24小时取出，观察各平板真菌生长情况，选取菌落比较分散的平板作为分离平板，选择平板中菌根组织上或组织周围生长的菌落为生产菌进行斜面保藏。

2.5生产菌的制备

2.5.1培养载体的选择与制备

取壳斗科植物叶，清洗后，植物粉碎机粉碎，60℃烘干，121℃下湿热灭菌30min作为生产菌的培养载体待用。

2.5.2生产菌发酵剂的制备

将2.4步骤中获得的斜面保藏菌种用无菌接种环挑取若干于2.1步骤中灭菌后的培养基中，于25℃，摇床培养24小时，摇床转速120转/分钟，检测菌悬液活菌数，如果活菌数≥10⁸个/ml，视同为培养成熟，如果活菌数＜10⁸个/ml，继续培养，直至达到10⁸个/ml，将此步骤获得的菌悬液称之为生产菌发酵剂。

2.5.3生产菌的制备

将生产菌发酵剂按2.5.1步骤中培养载体重量的25％接种于培养载体中，搅拌均匀，于25℃恒温培养5d，子实体生出后即可认为生产菌成熟。

3.大花蕙兰的移栽

3.1移栽基质的制备

将普通营养土壤和树皮粉末按1∶1的比例混合后作为移栽介质，调整介质pH5.5左右，同时调整水分，以手攥介质成团无液体渗出为宜。取上述移栽介质95份，成熟的生产菌发酵剂5份，充分混匀后作为移栽基质。

3.2大花蕙兰的移栽方法

选取生长良好，株高7-15cm，有2-3条健壮气生根的瓶苗作为移栽材料，开瓶炼苗1-2天后出瓶，流水冲洗根部残余培养基，剥除老叶。根部沾0.5％Na₃PO₄后移栽于移栽基质中，然后充分浇水，置于温室，弱光缓苗，待幼苗恢复生长后，转入正常光照条件下常规栽培管理。

Claims (5)

1、一种大花蕙兰组培苗染菌栽培方法，其特征是：选取石斛小菇真菌为出发菌株，经驯化培养，分离获得一株适应大花蕙兰根生长环境的真菌。以壳斗科植物叶为真菌载体，通过真菌的扩大培养而制备生产菌。将生产菌按一定比例与普通营养土壤和树皮粉末混合物混合均匀后，作为移栽基质，选择生长良好的瓶苗移栽后充分浇水，置于温室，弱光缓苗，待幼苗恢复生长后，转入正常光照条件下常规栽培管理。

2、根据权利要求1所述的一种大花蕙兰组培苗染菌栽培方法，其特征是：所述的真菌驯化培养的培养基为树皮块粉末2％，大花蕙兰根1％(用植物粉碎机粉碎，取破碎后的组织)，自来水97％，于121℃下灭菌30min而制备，然后将真菌培养基中大花蕙兰根添加量递增1％，同样的培养条件和培养时间，以此类推，转接培养10次，直至真菌培养基中大花蕙兰根添加量增至10％，结束驯化。

3、根据权利要求1所述的一种大花蕙兰组培苗染菌栽培方法，其特征是：所述的生产菌是将驯化菌种接种于生产菌发酵剂培养基中，25℃摇床培养24小时，摇床转速120转/分钟，检测菌悬液活菌数，如果活菌数≥10⁸个/ml，视同为培养成熟，如果活菌数＜10⁸个/ml，继续培养，直至达到10⁸个/ml，将此步骤获得的菌悬液称之为生产菌发酵剂；将生产菌发酵剂按培养载体重量的25％接种于培养载体中，搅拌均匀，于25℃恒温培养5d，子实体生出后即可认为生产菌成熟。

4、根据权利要求1所述的一种大花蕙兰组培苗染菌栽培方法，其特征是：将普通营养土壤和树皮粉末按1∶1的比例混合后作为移栽介质，调整介质pH5.5左右，同时调整水分，以手攥介质成团无液体渗出为宜。取上述移栽介质90-95份，成熟的生产菌发酵剂2-5份，充分混匀后作为移栽基质。

5、根据权利要求3所述的一种大花蕙兰组培苗染菌栽培方法，其特征是：生产菌发酵剂培养基由2％树皮块粉末，1％大花蕙兰根(用植物粉碎机粉碎，取破碎后的组织)，97％自来水组成；培养载体由取壳斗科植物叶，清洗后，植物粉碎机粉碎，60℃烘干，121℃下湿热灭菌30min而成。