CN101392007B

CN101392007B - 一种以线粒体为靶点的抗肿瘤锰配合物及其制备和应用

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Publication number: CN101392007B
Application number: CN200810234976XA
Authority: CN
Inventors: 陈秋云; 黄娟; 高静; 郭文洁
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2008-11-05
Filing date: 2008-11-05
Publication date: 2011-05-04
Anticipated expiration: 2028-11-05
Also published as: CN101392007A

Abstract

本发明涉及一种具有抗肿瘤和具有自噬功能的小分子化合物及其制备和应用。所说的小分子化合物是锰配合物L¹MnCl₂和L²MnCl，，其中L¹代表2-二吡啶甲胺基丙酸乙脂；L²代表2-二吡啶甲胺基丙酸。是与配体L¹或L²和Mn Cl₂为主要原料化学合成得到。本发明提供的二吡啶甲基胺类配体的锰配合物，对肿瘤细胞A549，Hela、HepG-2，和Eca109生长均有强的抑制作用，能抑制钙离子诱导的线粒体肿胀能以自噬的方式诱导肿瘤细胞凋亡；可作为新的以线粒体为靶点抗肿瘤活性药物和用于耐药性肿瘤治疗的肿瘤细胞自噬剂。

Description

一种以线粒体为靶点的抗肿瘤锰配合物及其制备和应用

技术领域

本发明涉及具有抗肿瘤和具有自噬功能新型小分子化合物及其制备技术领域，特指一类作为新的靶向性抗肿瘤和肿瘤细胞自噬功能的小分子药物及其制备方法。

背景技术

传统的化疗药物通过破坏DNA的结构、抑制相关蛋白质的表达、干扰肿瘤组织的代谢等来杀死肿瘤细胞，但是化疗药物的选择性差，在取得治疗效果的同时，常出现不同程度的毒副作用，杀死肿瘤细胞的同时，也可以导致机体正常细胞的损伤、死亡。因此，研发新型、强效、低毒的抗肿瘤药物是生命科学领域的重要课题。随着顺铂在抗肿瘤方面的应用(Clarke M J，Zhu F，Frasca DR，Chem.Rev.，1999，99(9)：2511)，引起无机药物化学研究的热潮，无机药物化学已经成为一门新兴交叉学科。早期无机抗肿瘤药物多是围绕着经典铂类抗肿瘤药物即以顺铂为模式的二价铂类配合物进行的，科学工作者在铂类抗肿瘤药物领域进行了大量研究工作，这些研究工作大多是围绕着经典铂类抗肿瘤药物即以顺铂为模式的二价铂类配合物进行的，已有四项铂类抗肿瘤专利报道(CN86106751抗肿瘤铂配合物及其制备和应用；CN 87104027新顺铂铬合物，其小鼠抗肿瘤组合物及其制备过程；CN 89106648.9铂-(IV)-二胺复合物；.CN.95103058.2新的抗肿瘤铂络合物)，但铂类抗肿瘤药物具有毒副作用和交叉耐药性等缺点(杨宁，国际泌尿系统杂志，2006，26(6)，849)。顺铂剂量依赖的肾毒性限制了其临床治疗肿瘤的效果。随后许多非铂族金属的配合物，都显示对人和实验动物肿瘤有效，如膦基-烃基VIII族金属络合物具有良好在抗肿瘤方面的应用(CN 92104058.X制备膦基-烃基VIII族金属络合物及含有这些络合物的抗肿瘤组合物方法其小鼠抗肿瘤组合物及其制备过程)。已报道的抗肿瘤配合物主要包括过渡金属钛、钒、铌、钼、铼、钌、铑、铱、铂以及铜和金等重金属元素配合物(DreicerR.，Propert K.J.，Roth B.J.，et al，Cancer，1997，79(1)：110.曲平，何华，化学进展，2006，18(12)，1646。李风华，吴红星，林华宽，高等学校化学学报，2006，27(10)，1800)。这些配合物多数是以DNA为靶点，体外与小牛胸腺DNA显示较强的插入作用，键合常数达10⁴-10⁵，多数配合物对肿瘤细胞识别功能弱，干扰正常细胞的DNA的功能。因此高效低毒性新的靶向性抗肿瘤配合物的设计和合成是一个挑战(Hambley T W，J.Chem.Soc.Dalton Trans.2007，4929-4937)。

线粒体(mitochondria)除了作为能量工厂提供ATP、还能生成活性氧(ROS)，参与细胞氧化还原信号转导，调控细胞凋亡，甚至被誉为“细胞死亡的开关”。1999年Science发表系列论文(如Comeback M A，Science 1999：1475)，集中阐述了线粒体功能及相关疾病的研究进展，强调线粒体生物医学的研究是当代生命科学和分子医学最活跃的新生长点和前沿之一。目前，线粒体已被证实参与多种疾病的发生、发展过程。线粒体作为“细胞死亡的开关”成为抗肿瘤药物研究的靶点(Armstrong J S，Brit.J.Pharm.，2007，151，1154)。

自噬(Autophagy)是指隔离膜包裹细胞质和(或)细胞器形成自噬体，然后与溶酶体融合成自噬溶酶体并在其中降解的过程。自噬性细胞死亡的特征为细胞质

中出现大量的自噬体和自噬溶酶体。如果自噬体中吞噬的细胞器以线粒体为主，则称为线粒体自噬。最近发现，在线粒体膜电位下降，线粒体介导的凋亡不能顺利进行时(如caspases被抑制)，通过自噬，可以诱导细胞死亡，这一点对于治疗耐药的抗凋亡肿瘤细胞有着特殊的意义(Song SW & Finkel T，Nature Cell Biology 2007，9，869)。总之，自噬性细胞死亡在肿瘤发生、发展中发挥重要的作用，近两年来，通过诱导肿瘤细胞自噬的方式治疗肿瘤已成为一种新的趋势。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤和具有自噬功能新型小分子化合物及其制备方法和应用。

本发明用化学方法合成了一类新的锰配合物，并运用物理手段确定了配合物的结构。体外抗肿瘤活性测试研究了配合物对肿瘤细胞的影响，发现锰配合物对肿瘤细胞A549，Hela、HepG-2，Eca109生长均有强的抑制作用，锰配合物以自噬的方式诱导肿瘤细胞凋亡；可作为新的以线粒体为靶点抗肿瘤活性药物和用于耐药性肿瘤治疗的肿瘤细胞自噬剂。

一种锰配合物，是一氯(2-二吡啶甲胺基丙酸)合锰，分子式C₁₅H₁₆ClN₃O₂Mn，结构如式1，或二氯(2-二吡啶甲胺基丙酸乙酯)合锰，分子式C₁₇H₂₁Cl₂N₃O₂Mn，结构如式2：

式1 式2

式1简写为：L²MnCl，其中L²代表2-二吡啶甲胺基丙酸，结构式为式3：

式2简写为：L¹MnCl_2.，其中L¹代表2-二吡啶甲胺基丙酸乙酯，结构式为式4：

式3 式4

制备上述所说锰配合物的方法是：

将配体(2-二吡啶甲胺基丙酸乙脂)(L¹)和MnCl₂按摩尔比1:1溶于乙醇溶液中，控制在30-80℃；最佳反应温度为50℃，反应时间2-8小时，最佳反应时间为3小时，去溶液获得黄色锰配合物：[L¹MnCl₂]。

或者是：

将配体(2-二吡啶甲胺基丙酸)(L²)和MnCl₂按摩尔比1:1溶于乙醇溶液中，加入NaOH 0.05-0.40克，最佳用量0.25克，控制在20-65℃；最佳反应温度为48℃，反应时间3-10小时，最佳反应时间为6小时，蒸去甲醇获得淡黄色锰配合物：[L²MnCl]。

上述所说的锰配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。特别是用于制备以线粒体为靶点抗肿瘤活性药物和用于制备耐药性肿瘤治疗的肿瘤细胞自噬剂。

本发明用化学方法合成了两个新的二吡啶甲基胺类配体的锰配合物，并运用物理手段确定了配合物的结构。体外抗肿瘤活性测试研究了配合物对肿瘤细胞的影响，发现锰配合物对肿瘤细胞A549，Hela、HepG-2，和Eca109生长均有强的抑制作用。两个锰配合物均能能抑制钙离子诱导的线粒体肿胀，说明这两个锰配合物与线粒体有直接作用。且配合物[L²MnCl]以自噬的方式诱导肿瘤细胞凋亡；可作为新的以线粒体为靶点抗肿瘤活性药物和用于耐药性肿瘤治疗的肿瘤细胞自噬剂。

附图说明

图1是锰配合物[L²MnCl]对50μ molCa²⁺诱导的小鼠肝脏线粒体肿胀的影响。

锰配合物[L²MnCl]剂量依赖性地对抗Ca²⁺诱导的线粒体肿胀。不同浓度的锰配合物在30℃下孵育线粒体悬液3分钟后，加入CaCl₂(终浓度为50μ mol/L)，在540nm处用酶标仪测定8分钟内的吸光强度，每30秒测一次。CsA(环孢菌素A)和EGTA(Ca²⁺鳌合剂)为阳性对照药。

图2是锰配合物[L²MnCl]增加Hela细胞中酸性泡状细胞器的形成。

锰配合物[L²MnCl]增加Hela细胞中酸性泡状细胞器的形成。Hela细胞经过不同处理后，MDC(50μmol/L)避光染色15分钟，confocal拍照(×400).

A：control

B：[L²MnCl]40μmol/L 6h

C：3-MA(10mM)预处理1h，[L²MnCl]40μ mol/L 6h

D：Rapamycin 1μmol/L 6h

图3是锰配合物[L²MnCl]显著增加MDC染色后Hela细胞内的蓝色荧光强度。

A：control B：L³Mn 40μmol/L 6h C：3-MA(10mM)预处理1h，L³Mn 40μmol/L 6h。^*p<0.05，VS A，#p<0.05，VS C.

具体实施方式

试剂和原料

实验中所用试剂均为分析纯，除特别注明外，未经进一步处理。元素分析用Carlo-Erba-1106型元素分析仪测定，红外光谱用Fr-IR169(固体用KBr压片)。

抗肿瘤试验试剂如下：(1)RPMI1640培养基(RPMI1640+10％小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHCO₃ 2.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)。(2)高糖DMEM培养基(DMEM+10％小牛血清+HEPES 3.5g/l+NaHCO₃ 2.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)。(3)MTT(美国Amresco公司产品)。

实施例1：

将配体(2-二吡啶甲胺基丙酸乙脂)(L¹)和MnCl₂按摩尔比1:1溶于乙醇溶液中，控制在50℃；反应时间3小时，蒸去溶液获得黄色锰配合物：[L¹MnCl₂]。Yield：80％.分子式：C₁₇H₂₁Cl₂N₃O₂Mn。元素分析：实测值C，48.40％；H，4.93％；N，9.46；Mn，12.81％；计算值C，48.03；H，4.98；N，9.88；Cl，16.68；Mn，12.92％。红外光谱数据(IR，cm-1)：2936，1735cm^-1，1624，1575，1493，1035，841，806，506。

将配体(2-二吡啶甲胺基丙酸)(L²)和MnCl₂按摩尔比1：1溶于乙醇溶液中，加入NaOH 0.25克，控制在48℃；反应时间6小时，蒸去甲醇获得谈黄色锰配合物：[L²MnCl]。Yield：78％.80％.分子式：C₁₅H₁₆ClN₃O₂Mn。元素分析：实测值C，55.47％；H，4.93％；N，12.86；Mn，16.61％；计算值C，55.39％；H，4.96％；N，12.92；Mn，16.89％。红外光谱数据(IR，cm-1)：2936，1624，1570，1493，1035，841，806，506。

实施例2：

将配体(2-二吡啶甲胺基丙酸乙脂)(L¹)和MnCl₂按摩尔比1:2溶于乙醇溶液中，控制在80℃；反应时间2小时，蒸去溶液获得黄色锰配合物：[L¹MnCl₂]。Yield：50％.分子式C₁₇H₂₁Cl₂N₃O₂Mn。

将配体(2-二吡啶甲胺基丙酸)(L²)和MnCl₂按摩尔比1:2溶于甲醇溶液中，加入NaOH 0.050克，控制在65℃；反应时间10小时，蒸甲醇获得淡黄色锰配合物：[L²MnCl₂]。Yield：59％.C₁₅H₁₆ClN₃O₂Mn

实施例3：

将配体(2-二吡啶甲胺基丙酸乙脂)(L¹)和MnCl₂按摩尔比1:1溶于水溶液中，控制在30℃；反应时间8小时，蒸去溶液获得黄色锰配合物：[L¹MnCl₂]。Yield：45％.分子式C₁₇H₂₁Cl₂N₃O₂Mn。

将配体(2-二吡啶甲胺基丙酸)(L²)和MnCl₂按摩尔比1:1溶于甲醇溶液中，加入NaOH 0.40克，控制在20℃；反应时间3小时，蒸去甲醇获得淡黄色锰配合物：[L²MnCl]。Yield：42％.分子式C₁₅H₁₆ClN₃O₂Mn

实施例4：抗肿瘤活性测定

以实施例1得到的配合物为受试化合物

筛选的细胞株有：人肝癌细胞株(A549、Hepg2，Eca109，Hela)(由江苏大学药学院提供)。测定采用溴化四氮唑蓝(MTT)法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性溴化四氮唑蓝还原为难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值。

操作步骤如下：

3.1.1接种：取处于指数生长期，状态良好的细胞一瓶，加入适量胰蛋白酶

消化液，消化使贴壁细胞脱落，用含12％小牛血清的RPMI1640(或DMEM)培养液配成细胞悬液，计数，并将细胞密度调整稀释至2.2*10⁴/ml.取细胞悬液接种于96孔板上，180ul/孔(含肿瘤细胞4000/孔)。

3.1.2培养：将培养板转入恒温CO₂培养箱中，在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养24小时。

3.1.3加药：受试化合物先用DMSO或超纯水配制成0.1M浓度，再作4个稀释度，浓度依次为10^-4M，10^-5M，10^-6M，10^-7M。加入受试化合物，20ul/孔，培养48小时。每组设3个平行孔，并重复3次。

3.1.4染色：

3.1.4.1将MTT加入96孔板(贴壁细胞)中，20ul/孔，置于培养箱中孵育4小时，吸弃孔内上清液，加入DMSO100 ul/孔，置平板摇床上震荡5分钟。

3.1.4.2将MTT加入96孔板中(悬浮细胞)，20ul/孔，置于培养箱中孵育4小时，再加入20％ SDS 50 ul/孔，置于培养箱中过夜。

3.1.5测定：酶标仪设定波长为570nm，参考波长为630nm，测定96孔板每孔吸光值，记录结果并计算细胞抑制率，以判断受试药物的抗肿瘤活性。

3.3数据处理：

3.3.1细胞抑制率的计算：

抑制率＝(对照组平均OD值-给药组平均OD值)/对照组平均OD值×100％

IC50的计算：根据中国药科大学新药筛选中心提供的IC50软件计算所得。

MTT法测试结果示于表1。

表1 锰配合物对癌细胞抑制作用MTT实验数据

锰配合物[L²MnCl]对四种癌细胞半数抑制率需要的化合物浓度IC50分别为小于10umol/L，锰配合物[L¹MnCl₂]四种癌细胞半数抑制率需要的化合物浓度为IC50为在12-21umol/L。而MnCl₂在小于300umol/L对肿瘤细胞的生长没有抑制作用。这说明本发明的锰配合物可作为抗癌药用先导物。

实施例5：锰配合物与线粒体作用实验：

肿胀程度根据线粒体悬液在波长为540nm处的吸光值的变化进行测定。制备的肝脏线粒体按0.5～1.0mg蛋白·ml^-1重悬于线粒体缓冲液(125mmol·L^-1 sucrose，50mmol·L^-1KCl，2mmol·L^-1KH₂PO₄，5mmol·L^-1 succinate acid，5μmol·L^-1rotenone，10mmol·L^-1 Hepes，pH7.4)中，加入50μmol·L^-1 Ca²⁺(30°C)。检测加入Ca²⁺后5min内吸光值的变化(ΔA)，ΔA值越大，表明线粒体肿胀度越高。在观察化合物作用的实验中，化合物先加入线粒体悬液中，孵育3min，加入Ca²⁺，每30S测一次吸光值。最后以时间为横坐标，ΔA 540nm为纵坐标作图。

实验结果示于图1：由图1的结果可以看出：对照组CsA组的吸光值下降较小(0.075)，说明线粒体悬液较稳定。50μmol·L^-1Ca²⁺可以诱发线粒体明显肿胀，△A₅₄₀达0.32。50μmol·L^-1配合物预处理可以明显对抗50μmol·L^-1Ca²⁺诱发的线粒体肿胀、而100μmol·L^-1配合物[L²MnCl]几乎可以完全对抗Ca²⁺诱发的线粒体肿胀(△A₅₄₀与EGTA组接近)。实验结果表明配合物以剂量依赖方式对抗Ca²⁺诱发的线粒体肿胀功能，表明我们合成的锰配合物[L²MnCl]与线粒体有直接的作用。配合物[L¹MnCl₂]作用与[L²MnCl]同。

实施例6：[L²MnCl]自噬实验

MDC染色法检测锰配合物处理后Hela细胞中自噬空泡的形成步骤：

(1)将Hela细胞接种于24孔板中，细胞密度为1.2＊10⁴个/孔。

(2)在37℃，5％CO₂的恒温孵箱中培养24小时后，移去培养基，设三组，A，control；B，40μmol/L锰配合物；C，3-MA预处理1小时后，加40μmol/L锰配合物，继续培养6小时。

(3)移去培养基，每孔加300μl的PBS，洗两遍。

(4)避光配置MDC染料，浓度为50μmol/L。每孔加入100μlMDC染料，37℃孵育15分钟。

(5)移去MDC染料，每孔加300μlPBS，放脱色摇床上洗5分钟，洗两遍。

(6)加抗荧光淬灭剂，用共聚焦显微镜拍荧光照片。(×400)

结果示于图2。从图2可以看出，40μ mol/L的锰配合物[L²MnCl]处理Hela细胞后，酸性泡状细胞器生成增加，但此作用可被3-MA(自噬阻断剂)所阻断，Rapamycin(雷帕霉素)做阳性对照。由此说明可以诱导Hela细胞发生自噬。

40μ mol/L的锰配合物[L²MnCl]处理Hela细胞6小时，经MDC染色，细胞内的平均荧光强度明显地比正常组细胞强，但是经过3-MA(自噬阻断剂)预处理后，细胞内的平均荧光强度没有明显的变化。由此进一步说明锰配合物[L²MnCl]诱导Hela细胞发生自噬(图3)。

Claims

1.一种作为肿瘤细胞自噬剂的锰配合物，是一氯(2-二吡啶甲胺基丙酸)合锰，分子式C₁₅H₁₆ClN₃O₂Mn，其结构如式1，或者是二氯(2-二吡啶甲胺基丙酸乙酯)合锰，分子式C₁₇H₂₁Cl₂N₃O₂Mn，其结构如式2：

式1 式2。

2.一种制备权利要求1所说的锰配合物的方法，其特征是，

将配体2-二吡啶甲胺基丙酸乙脂和MnCl₂按摩尔比1∶1溶于乙醇溶液中，控制在30-80℃反应时间2-8小时，去溶液获得权利要求1中式2的锰配合物；

或者是：将配体(2-二吡啶甲胺基丙酸和MnCl₂按摩尔比1∶1溶于甲醇溶液中，加入NaOH 0.40克，控制在20反应时间3小时，蒸去甲醇获得权利要求1中式1的锰配合物。

3.权利要求1所说的锰配合物在制备耐药性肿瘤治疗的肿瘤细胞自噬剂中的应用。