CN101386854A - 碱菀液泡膜Na+/H+反向转运蛋白的基因和氨基酸序列及基因制备方法和扩增引物 - Google Patents

Abstract

碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白的基因和氨基酸序列及基因制备方法和扩增引物，它涉及一种Na⁺/H⁺反向转运蛋白的基因和氨基酸序列及基因制备方法和扩增引物。本发明TvNHX1序列为SEQ ID NO：1；氨基酸序列为SEQID NO：2。基因制备方法：一、NaCl处理，再提取、纯化碱菀RNA；二、反转录；三、PCR扩增。扩增引物为wfF和wfR。经序列同源性BlastX分析本发明TvNHX1序列与其它物种中的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因的序列具有明显差异。碱菀Na⁺/H⁺反向转运蛋白与菊花、菊芋、花柴柴、水稻、海篷子、玉米及拟南芥的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白氨基酸序列的同源性均小于93％。

Description

碱菀液泡膜Na+/H+反向转运蛋白的基因和氨基酸序列及基因制备方法和扩增引物

技术领域

本发明涉及一种Na⁺/H⁺反向转运蛋白的基因和氨基酸序列及基因制备方法和扩增引物。

背景技术

全球土壤盐渍化问题日益严重，作物产量和生态环境因盐胁迫受到严重影响。盐胁迫对植物主要产生两方面的不利影响，一方面是渗透胁迫导致质膜渗透势下降从而引起细胞膨压的丧失和水分的丧失；另一方面是在细胞内产生特异的离子毒害，高浓度的盐离子会影响到细胞内重要的生化过程。Na⁺的平衡是盐胁迫下重要的离子平衡，植物的耐盐性主要是通过自身的Na⁺平衡调节基因来实现的。植物自身的Na⁺平衡调节基因以限制Na⁺内流、将Na⁺外排、将Na⁺在液泡中区隔化等方式降低细胞质中的Na⁺的浓度，以减轻Na⁺的毒害作用。定位在液泡膜上的Na⁺/H⁺反向转运蛋白可以将Na⁺运入并储存在液泡中，不仅能使Na⁺远离代谢位点，减轻离子毒害，还可以利用储存在液泡中的Na⁺作为渗透调节剂调节渗透压，所以将Na⁺在细胞中区隔化是Na⁺平衡的最为重要和有效的调节方式。

发明内容

本发明为采用基因工程技术提高植物的耐盐性提供了碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白的基因和氨基酸序列及基因制备方法和引物。

本发明碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

上述碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因按以下步骤制备：

一、先NaCl处理碱菀，再提取、纯化碱菀RNA；

二、用Primescript反转录酶反转录合成cDNA第一链；

三、PCR扩增：PCR反应体系为10μL，由1μL10 × buffer、0.8μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP、0.1μL浓度为10μmol/L的引物wfF、0.1μL浓度为10μmol/L的引物wfR、1μLcDNA第一链、0.1μL ExTaq和6.9μL ddH₂O组成；PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s、56℃退火复性30s、72℃延伸140s、30个循环，72℃延伸10min；即得到碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因；

其中步骤三中引物wfF的序列为：5′-GCCAAGATGGTGTTCGATTCC-3′，

引物wfR的序列为：5′-GAATTCGAGCTCCGTTTAATTGGTTTC-3′。

本发明碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因扩增引物为wfF和wfR；

引物wfF的序列为：5′-GCCAAGATGGTGTTCGATTCC-3′，

引物wfR的序列为：5′-GAATTCGAGCTCCGTTTAATTGGTTTC-3′。

碱菀(Tripolium vulgare Nees)属于盐生植物，具有很强的耐盐性，能在盐碱地上生长。本发明提供了碱菀泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因(TvNHX1)及其编码的氨基酸序列为采用基因工程技术提高植物的耐盐性奠定了物质基础。

经序列同源性BlastX分析本发明碱菀泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因(TvNHX1)序列与其它物种中的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因的序列具有明显差异。碱菀Na⁺/H⁺反向转运蛋白与菊花、菊芋、花柴柴、水稻、海篷子、玉米及拟南芥的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白氨基酸序列的同源性分别为93％、88.4％、89.7％、72.7％、72％、69.4％和69.1％。

将本发明碱菀泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因(TvNHX1)克隆到酵母诱导表达载体pYES2上，构建酵母诱导表达载体pYES2-TvNHX1，然后转化野生型酵母菌株。在含有200mmol/L NaCl和30μg/mL潮霉素(HYG)的YPG诱导培养基中分别培养野生型酵母菌株、转化空载体(pYES2)酵母菌株和转化pYES2-TvNHX1载体的酵母菌株，并测定其耐盐性。检测结果发现碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因在酵母能够表达，并能增强酵母菌株对NaCl和潮霉素的耐受性。用本发明碱菀泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因构建植物表达载体pBI-TvNHX1，并采用蘸花法转化拟南芥，实验发现TvNHX1基因在拟南芥中的超量表达提高了转基因拟南芥植株的耐盐性。实验结果证明本发明碱菀泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因具有增强耐盐性的功能和抵御盐胁迫的作用。

本发明碱菀泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因能够构建原核表达载体和真核表达载体，并能够在原核细胞及植物中表达。本发明碱菀泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白可用于蛋白质结构和功能的研究以及抗原制备。本发明碱菀泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因及其编码的氨基酸序列为采用基因工程技术提高植物的耐盐性奠定了物质基础。

附图说明

图1是具体实施方式七中步骤二PCR扩增得到的TvNHX1的cDNA PCR产物的凝胶电泳图；图2是具体实施方式七中步骤四得到的TvNHX1的cDNA3′末端PCR产物的凝胶电泳图；图3是具体实施方式七中步骤五得到的TvNHX1的cDNA5′末端PCR产物的凝胶电泳图；图4是具体实施方式七得到碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因PCR产物的凝胶电泳图；图5是具体实施方式七对比实验中三种菌株在不同浓度的盐胁迫下菌株长势图；图6是具体实施方式七对比实验中三种菌株在NaCl浓度为0.2mol/L的YPG培养基中的生长图；图7是具体实施方式七对比实验中三种菌株在HYG浓度为30μg/mL的YPG培养基中的生长图；图8是具体实施方式七中转基因拟南芥转到200mmol/LNaCl的GM培养基中继续培养20天后的生长情况图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因序列如SEQ ID NO：1所示。

本实施方式碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因长1644bp，编码547个氨基酸。本实施方式碱菀泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因(TvNHX1)序列与其它物种中的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因的序列具有明显差异。

具体实施方式二：本实施方式碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本实施方式碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白的分子量为60.3KD，理论等电点pI为6.34。本实施方式碱菀Na⁺/H⁺反向转运蛋白与菊花、菊芋、花柴柴、水稻、海篷子、玉米及拟南芥的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白氨基酸序列的同源性分别为93％、88.4％、89.7％、72.7％、72％、69.4％和69.1％。

本实施方式碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因编码的氨基酸的N末端1～18个氨基酸及C末端氨基酸与其它植物中液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白的氨基酸序列明显不同；经多序列比对Clustalw分析，本实施方式碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白比对序列中第480～502个氨基酸同其它植物中液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白的氨基酸序列也存在很大差异。

具体实施方式三：本实施方式碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因按以下步骤制备：一、先NaCl处理碱菀，再提取、纯化碱菀RNA；

二、用Primescript反转录酶反转录合成cDNA第一链；

三、PCR扩增：PCR反应体系为10μL，由1μL 10×buffer、0.8μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP、0.1μL浓度为10μmol/L的引物wfF、0.1μL浓度为10μmol/L的引物wfR、1μL cDNA第一链、0.1μL ExTaq和6.9μL ddH₂O组成；PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s、56℃退火复性30s、72℃延伸140s、30个循环，72℃延伸10min；即得到碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因；

其中步骤三中引物wfF的序列为：5′-GCCAAGATGGTGTTCGATTCC-3′，

引物wfR的序列为：5′-GAATTCGAGCTCCGTTTAATTGGTTTC-3′。

本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无注明则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂或试剂盒使用操作手册或说明。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤一中采用SDS法提取碱菀RNA，并用脱氧核糖核酸酶I(DNase I)去除DNA，再用植物RNA提取纯化试剂盒纯化碱菀RNA。其它步骤及参数与实施方式三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：步骤一中碱菀在提取、纯化RNA前先用浓度为50mmol/L的NaCl溶液浇土培苗，然后NaCl浓度每隔12h递增50mmol/L，直至浇土培苗用NaCl溶液中NaCl浓度增加至300mmol/L，再取碱菀叶片提取、纯化碱菀RNA。其它步骤及参数与实施方式三相同。

具体实施方式六：本实施方式碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因扩增引物为wfF和wfR；

引物wfF的序列为：5′-GCCAAGATGGTGTTCGATTCC-3′，

引物wfR的序列为：5′-GAATTCGAGCTCCGTTTAATTGGTTTC-3′。

具体实施方式七：本实施方式碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因按以下步骤制备：一、先用浓度为50mmol/L的NaCl溶液浇土培苗，然后NaCl浓度每隔12h递增50mmol/L，直至浇土培苗用NaCl溶液中NaCl浓度增加至300mmol/L，再取碱菀叶片提取、纯化碱菀RNA；其中采用SDS法提取碱菀RNA，并用DNase I去除DNA，再用植物RNA提取纯化试剂盒纯化碱菀RNA；

二、按ReverTra Ace试剂盒操作用反转录酶合成cDNA第一链，再用兼并引物PCR扩增得到TvNHX1保守区cDNA；其中兼并引物NHXF的序列为：5′-CCACCTAT(AT)AT(AT)TT(CT)AATGC(AGC)GG(AG)TT-3′，

兼并引物NHXR的序列为：5′-CAC(AT)ACACC(CT)TC(AG)CC(CAG)AAGAC(AG)AG(AC)CT-3′；PCR扩增反应体系为20μL：6.2μL ddH₂O、2μL 10×buffer、1.6μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP、4μL浓度为10μmol/L的引物NHXF、4μL浓度为10μmol/L的引物NHXR、2μL cDNA第一链和0.2μL rTaq；PCR扩增反应条件为95℃预变性2min，94℃变性40s、72℃退火复性45s、退火温度降低1℃/循环、72℃延伸1min、10个循环，94℃变性40s、50℃退火复性45s、72℃延伸1min、30个循环；

三、根据TvNHX1保守区cDNA设计3′RACE引物JWF、3′RACE巢式引物JWF1、5′RACE引物JWR和5′RACE巢式引物JWR1，其中

3′RACE引物JWF序列为：5′-TGCCGGGTTCCAGGTTAAGAAG-3′，

3′RACE巢式引物JWF1序列为：5′-GCAGGTGCTCAATCAGGATCAAAC-3′，

5′RACE引物JWR序列为：5′-CTCCCAACTCAAGAGAGCCAATA-3′，

5′RACE巢式引物JWR1序列为：5′-GGTGAAAGATATCACGGTACCAACA-3′；

四、用Primescript反转录酶反转录合成3′RACE cDNA第一链，然后进行PCR扩增，PCR反应体系为20μL：12.6μL ddH₂O、2μL 10×buffer、1.6μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP、0.4μL浓度为10μmol/L的引物3′RACE引物JWF、2μL 10×UPM(通用引物)、1μL 3′RACE cDNA第一链和0.4μL rTaq；PCR反应条件为95℃预变性3min，94℃变性45s、66℃退火复性45s、退火温度降低1℃/循环、72℃延伸3min、10个循环，94℃变性45s、52℃退火复性45s、72℃延伸3min、30个循环，得到3′末端PCR产物；之后进行3′RACE巢式PCR，3′RACE巢式PCR反应体系为20μL：12.6μL ddH₂O、2μL 10×buffer、1.6μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP、0.4μL浓度为10μmol/L的引物3′RACE巢式引物JWF1、2μL NUP(通用引物)、1μL 10×3′末端PCR产物(模板)和0.4μLrTaq；PCR反应条件为95℃预变性3min，94℃变性45s、66℃退火复性45s、退火温度降低1℃/循环、72℃延伸3min、10个循环，94℃变性45s、52℃退火复性45s、72℃延伸3min、30个循环，即得到TvNHX1的cDNA3′末端；

五、用Primescript反转录酶反转录合成5′RACE cDNA第一链，然后进行PCR扩增，PCR反应体系为20μL：12.6μL ddH₂O、2μL 10×buffer、1.6μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP、0.4μL浓度为10μmol/L的引物5′RACE引物JWR、2μL 10×UPM(通用引物)、1μL 5′RACE cDNA第一链和0.4μL rTaq；PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s、58℃退火复性30s、72℃延伸1min、40个循环，72℃延伸10min，得到5′末端PCR产物；之后进行5′RACE巢式PCR，5′RACE巢式PCR反应体系为20μL：12.6μL ddH₂O、2μL10×buffer、1.6μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP、0.4μL浓度为10μmol/L的引物5′RACE巢式引物JWR1、2μLNUP(通用引物)、1μL100 × 5′末端PCR产物(模板)和0.4μL rTaq；PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s、58℃退火复性30s、72℃延伸1min、40个循环，72℃延伸10min，即得到TvNHX1的cDNA5′末端；

六、用TvNHX1的cDNA5′末端和cDNA3′末端序列拼接得到TvNHX1的全长cDNA序列(如SEQ ID NO：3所示)，再利用DNAMAN软件确定开放读码框序列，并根据TvNHX1全长cDNA分析确定TvNHX1编码区，然后设计编码区PCR扩增引物wfF和wfR；

七、用Primescript反转录酶反转录合成cDNA第一链；

八、PCR扩增：PCR反应体系为10μL，由1μL 10×buffer、0.8μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP、0.1μL浓度为10μmol/L的引物wfF、0.1μL浓度为10μmol/L的引物wfR、1μL cDNA第一链、0.1μL ExTaq和6.9μL ddH₂O组成；PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s、56℃退火复性30s、72℃延伸140s、30个循环，72℃延伸10min；即得到碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因。

本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无注明则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂或试剂盒使用操作手册或说明。

本实施方式步骤四和步骤五中Primescript反转录引物按照Smart^TM RACEcDNA Amplification试剂盒说明书合成。

本实施方式步骤六中拼接得到TvNHX1的全长cDNA序列长2259bp，5’端非编码区268bp，3’端非编码区347bp，编码区1644bp，编码547个氨基酸的多肽。

对本实施方式步骤二PCR扩增得到的TvNHX1的cDNA PCR产物进行凝胶电泳，凝胶电泳结果如图1所示，图1中“M”泳道标样为Marker(DL2000Marker，2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，“1”泳道标样为TvNHX1的cDNA PCR产物。

对本实施方式步骤四得到的TvNHX1的cDNA3′末端PCR产物进行凝胶电泳，凝胶电泳结果如图2所示，图2中“M”泳道标样为Marker(DL2000Marker)，“1”泳道标样为TvNHX1的cDNA3′末端PCR产物。

对本实施方式步骤五得到的TvNHX1的cDNA5′末端PCR产物进行凝胶电泳，凝胶电泳结果如图3所示，图3中“M”泳道标样为Marker(DL2000Marker)，“1”泳道标样为TvNHX1的cDNA5′末端PCR产物。

对本实施方式得到碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因PCR产物进行凝胶电泳，凝胶电泳结果如图4所示，图4中“M”泳道标样为Marker(DL2000Marker)，“1”泳道标样为碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因PCR产物。

对比实验：

将本实施方式得到的碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因克隆到载体pMD18-T上形成重组质粒pT-TvNHX1，然后用BamH I和EcoR I双酶切重组质粒pT-TvNHX1和酵母表达载体pYES2(购自于Invitrogen公司)，再将TvNHX1连接到载体pYES2上得到酵母诱导表达载体pYES2-TvNHX1，之后用pYES2-TvNHX1转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经蓝白斑反应初步筛选阳性重组子，并通过BamH I/EcoR I双酶切和菌落PCR鉴定阳性重组子；再采用醋酸锂法将pYES2-TvNHX1转化至野生型酵母菌W303-1A中(可用PCR鉴定阳性转化子)。

对菌株进行不同浓度的盐胁迫并测定其生长势，将野生型酵母菌株W303-1A、转化pYES2空载体的酵母菌株W303-1A(pYES2)和转化载体pYES2-TvNHX1的酵母菌株W303-1A(pYES2-TvNHX1)在含有不同浓度NaCl的YPG培养基中培养48h后测定其OD₆₀₀值。在NaCl浓度为0mol/L时，三种菌株的生长势基本相同；随着NaCl浓度的增加，三种菌株的生长势都呈下降趋势；在0.25mol/L NaCl胁迫条件下，W303-1A和W303-1A(pYES2-TvNHX1)的生长势无明显的差别，当NaCl的浓度增至0.75mol/L时，W303-1A和W303-1A(pYES2)的生长受到明显的抑制，而W303-1A(pYES2-TvNHX1)的生长受到的影响很小；当NaCl浓度达到1mol/L时，三种菌株的生长均受到明显的影响(菌株长势如图5所示，图5中“○”曲线为W303-1A长势曲线，“△”曲线为W303-1A(pYES2)长势曲线，“■”曲线为W303-1A(pYES2-TvNHX1)长势曲线)。

将野生型酵母菌株W303-1A、转化pYES2空载体的酵母菌株W303-1A(pYES2)和转化pYES2-TvNHX1表达载体的酵母菌株W303-1A(pYES2-TvNHX1)接种于NaCl浓度为0.2mol/L的YPG培养基，生长情况如图6所示(“1”横排表示W303-1A的生长情况，“2”横排表示W303-1A(pYES2)的生长情况，“3”横排表示W303-1A(pYES2-TvNHX1)的生长情况)，W303-1A菌株及W303-1A(pYES2)菌株对0.2mol/L NaCl很敏感，而W303-1A(pYES2-TvNHX1)菌株对0.2mol/L NaCl则表现出很高的耐性。

将野生型酵母菌株W303-1A、转化pYES2空载体的酵母菌株W303-1A(pYES2)和转化pYES2-TvNHX1表达载体的酵母菌株W303-1A(pYES2-TvNHX1)接种于HYG浓度为30μg/mL的YPG培养基，生长情况如图7所示(“1”横排表示W303-1A的生长情况，“2”横排表示W303-1A(pYES2)的生长情况，“3”横排表示W303-1A(pYES2-TvNHX1)的生长情况)，TvNHX1表现出抑制W303-1A菌株对HYG的敏感性；HYG是一种应答电化学质子梯度而在细胞内积累的毒性物质，由此也证明TvNHX1编码的是液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白。

首先用BamHI和Sac I将pBI-iL2质粒上的iL2切除，然后用BamH I和Sac I从pT-TvNHX1质粒上切下TvNHX1基因片段再插入到pBI-iL2质粒的BamH I/SacI位点，得到重组质粒，再用重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞JM109，经菌落PCR和BamH I/Sac I双酶切鉴定阳性重组子，获得植物表达载体pBI-TvNHX1。用pBI-TvNHX1转化农杆菌菌株C58C1(可采用菌落PCR和PCR产物的Sma I酶切鉴定阳性转化子菌株)。

采用蘸花法转化拟南芥：①将含有pBI-TvNHX1的农杆菌菌株C58C1培养到OD₆₀₀值为0.8～1.0，取约40mL菌液加入50mL离心管中，在8000r/min的条件下离心10min，弃去上清液后控干；

②然后向离心管中加入20mL转化培养基并漩涡混匀，再加入20mL转化培养基，于4℃ 8000r/min条件下离心5～10min，弃去上清液；

③重复步骤②一次；

④加入转化培养基40mL和16μL Silwet L-77；

⑤将拟南芥花序在菌液中蘸1min；

⑥收获转化种子；既得到转基因拟南芥植株种子。

将转基因拟南芥植株种子播种于含100mmol/L NaCl的GM培养基(1/2MS盐、500×Vita mine 0.2％、pH5.7的MES-KOH5％、蔗糖1％、琼脂0.8％)中，18天后转到200mmol/L NaCl的GM培养基中继续培养筛选20天(转基因拟南芥生长情况如图8所示)，再将绿色抗性苗移出。对成株转基因拟南芥进行PCR检测，证实TvNHX1转入拟南芥，并表现出耐盐性。

碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因转入拟南芥中后，转基因拟南芥对NaHCO₃的抗性高于非转基因的拟南芥。证明碱菀的液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因TvNHX1也能提高转基因植物对NaHCO₃的抗性。

序列表

<110>哈尔滨师范大学

<120>碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白的基因和氨基酸序列及基因制备方法和扩增引物

<160>9

<210>1

<211>1644

<212>DNA

<213>碱菀属(Tripolium)

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1644)

<400>1

<210>2

<211>547

<212>PRT

<213>碱菀属(Tripolium)

<400>2

<210>3

<211>2259

<212>DNA

<213>碱菀属(Tripolium)

<400>3

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3′RACE引物JWF。

<400>4

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3′RACE巢式引物JWF1。

<400>5

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′RACE引物JWR。

<400>6

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′RACE巢式引物JWR1。

<400>7

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因扩增引物wfF。

<400>8

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因扩增引物wfR。

<400>9

Claims (6)

1、碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因，其特征在于碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因序列如下所示：

ATGGTGTTCGATTCCGGGTTATTGCTTGGGAAACTGGGTATGGATGGATTGGGTACCTCTGAGTATTCATCAGTTGTATCTATGAACTTGTTTGTTGCTCTTCTTTGTGCGTGTATTGTCATTGGTCATCTTTTGGAAGAAAATCGATGGATGAACGAATCTATCACCGCGCTTCTCATTGGTATATGCACAGGTGTTGTTATCTTGTTAATTAGTGGAGGAACAAATTCGTATCTTCTAGTCTTTAGTGAAGATCTTTTCTTCATTTATCTTCTTCCACCTATTATATTTAATGCCGGGTTCCAGGTTAAGAAGAAACATTTTTTTCGCAATTTCATGACCATTATGCTATTTGGTGCTGTTGGTACCGTGATATCTTTCACCATTATCTCACTTGGTGCTTTAAATATTTTCAGCAGGATGAATATTGGCTCTCTTGAGTTGGGAGATTATCTTGCAATTGGTGCAATCTTTTCTGCAACCGATTCTGTTTGCACTTTGCAGGTGCTCAATCAGGATCAAACCCCTTTATTGTACAGTCTGGTCTTTGGGGAAGGAGTTGTGAATGATGCCACATCAGTTGTCATATTCAATGCAGTTCAAAACTTTGATTTATCTCAAATCACAACTGCTGTCGCTTTTCAGTTGATCGGAAATTTCTTCTATCTATTTATCACAAGCACGCTTCTAGGAGCTGGAGCTGGGCTACTAAGTGCATATATTATAAAGAAGTTATACTTTGGGAGGCATTCAACTGATCGGGAAGTTGCCATAATGATACTTATGGCCTATCTTTCTTACATGCTAGCTGAGTTATTCTATTTGAGTGGCATTCTCACAGTGTTCCTCTGTGGAATTGTGATGTCCCATTACACTTGGCATAATGTCACTGAGAAATCTTGAGTAACTACCAAGCACGCTTTTGCAACTTTATCATTTATTGCAGAGTTATTTATCTTTCTTTATGTCGGTATGGATGCTTTAGATATTGAGAAGTGGAGCTTTGTACAGGACAGCCCGGGGACATCAGTTGAAGTGACTGCAATTTTATTGGGATTGATTTTGGTTGGAAGAGCAGCCTTTGTCTTCCCCTTATCATTTTTATCCAACTTAACAAAGAAGGCTCACCAAGAGAAAATCGATTTTAGGCAGCAGGTTTTAATATGGTGGGCTGGTCTTATGAGAGGCGCTGTGTCTATGGCCCTTGCTTATAACCAGTTTACCAAGGAAGGCCACACACAATTGAAGGGGAATGCAATAATGATTACAAGTACCATCAGTGTTGTCCTTTTCAGTACAATGGTATTTGGTCTGATCACGCAGCCTCTTGTGAGACTCTTGTTGCCTGCACCCAAAGGCTTGAACCGAATGATTTCTTCTGAACCAACAACCCTTAAATCCTTCATCGTGCCCCTTCTGGGAAATGGTGAGGATTCAGAAGCAGATTTAGGTCACCACATCCCTCGTCCAACCAGTTTACGAATGCTTCTTTCAACACCTTCTCACAGTGTTCACCGTTATTGGAGAAAATTCGATAATGGCTTCATGCGTCCTGTTTTTGGTGGTCGTGGTTTCGTGCCATTCGTTCCTGGTTCACCAACAGAACAAAGTACTCATCATCTTGTGGATGAAGAAACCAATTAA。

2、碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因编码的氨基酸序列，其特征在于碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因编码的氨基酸序列如下所示：

MVFDSGLLLGKLGMDGLGTSEYSSVVSMNLFVALLCACIVIGHLLEENRWMNESITALLIGICTGVVILLISGGTNSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKHFFRNFMTIMLFGAVGTVISFTIISLGALNIFSRMNIGSLELGDYLAIGAIFSATDSVCTLQVLNQDQTPLLYSLVFGEGVVNDATSVVIFNAVQNFDLSQITTAVAFQLIGNFFYLFITSTLLGAGAGLLSAYIIKKLYFGRHSTDREVAIMILMAYLSYMLAELFYLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTEKSRVTTKHAFATLSFIAELFIFLYVGMDALDIEKWSFVQDSPGTSVEVTAILLGLILVGRAAFVFPLSFLSNLTKKAHQEKIDFRQQVLIWWAGLMRGAVSMALAYNQFTKEGHTQLKGNAIMITSTISVVLFSTMVFGLITQPLVRLLLPAPKGLNRMISSEPTTPKSFIVPLLGNGEDSEADLGHHIPRPTSLRMLLSTPSHSVHHYWRKFDNGFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTEQSTHHLVDEETN。

3、碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因制备方法，其特征在于碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因按以下步骤制备：

一、先NaCl处理碱菀，再提取、纯化碱菀RNA；

二、用Primescript反转录酶反转录合成cDNA第一链；

三、PCR扩增：PCR反应体系为10μL，由1μL 10×buffer、0.8μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP、0.1μL浓度为10μmol/L的引物wfF、0.1μL浓度为10μmol/L的引物wfR、1μL cDNA第一链、0.1μL ExTaq和6.9μL ddH₂O组成；PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s、56℃退火复性30s、72℃延伸140s、30个循环，72℃延伸10min；即得到碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因；

其中步骤三中引物wfF的序列为：5′-GCCAAGATGGTGTTCGATTCC-3′，

引物wfR的序列为：5′-GAATTCGAGCTCCGTTTAATTGGTTTC-3′。

4、根据权利要求3所述的碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因制备方法，其特征在于步骤一中NaCl处理碱菀按以下步骤进行：先用浓度为50mmol/L的NaCl溶液浇土培苗，然后NaCl浓度每隔12h递增50mmol/L，直至浇土培苗用NaCl溶液中NaCl浓度增加至300mmol/L。

5、根据权利要求3所述的碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因制备方法，其特征在于步骤一中采用SDS法提取碱菀RNA，并用脱氧核糖核酸酶I去除DNA，再用植物RNA提取纯化试剂盒纯化碱菀RNA。

6、碱菀液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因扩增引物，其特征在于碱菀液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因扩增引物为wfF和wfR；

引物wfF的序列为：5′-GCCAAGATGGTGTTCGATTCC-3′，

引物wfR的序列为：5′-GAATTCGAGCTCCGTTTAATTGGTTTC-3′。

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