CN101379079A - HERV-W干扰群相关病毒的被膜和hASCT受体之间的相互作用所必需的肽结构域 - Google Patents

HERV-W干扰群相关病毒的被膜和hASCT受体之间的相互作用所必需的肽结构域 Download PDF

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Abstract

本发明涉及属于HERV－W干扰群的病毒的被膜和hASCT受体之间的相互作用所必需的肽结构域，该肽结构域包括N端点和C端点。所述肽结构域在其N端点和C端点被定义，在其N端点，通过氨基酸(Z)α－脯氨酸－半胱氨酸－X－半胱氨酸形成的模式进行定义，其中Z是任何氨基酸，α是2至30间的整数，且X是任何氨基酸；在其C端点，通过氨基酸丝氨酸－天冬氨酸－Xa－Xb－Xc－Xd－Xe－天冬氨酸－Xf－Xg－(Z)β形成的模式进行定义，其中Xa、Xb、Xc、Xd、Xe、Xf、Xg是任何氨基酸，Z是任何氨基酸，β是15至25间的整数，优先20。所述肽结构域在所述N端点和所述C端点之间包括选自下列模式的至少一个模式：由氨基酸半胱氨酸－酪氨酸－X2－X3－X4－X5－X6－半胱氨酸形成的模式，其中X2、X3、X4、X5、X6是任何氨基酸；以及由氨基酸半胱氨酸－X7－X8－X9－X10－X11－X12－X13－X14－X15－半胱氨酸－色氨酸形成的模式，其中X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15是任何氨基酸。

Description

HERV-W干扰群相关病毒的被膜和hASCT受体之间的相互作用所必需的肽结构域
本发明涉及引起HERV-W干扰群(HERV-W interference group)的反转录病毒被膜和hASCT受体家族之间的相互作用的多肽结构域。
人内源性反转录病毒(HERVs)组成人基因组的8％，并且既与病理现象有关也与非病理现象有关。
人内源性反转录病毒家族W(HERV-W)来源于感染性反转录病毒元件，其在2,500万至4,000万年前整合入该种系。HERV-W被膜蛋白，也称为合胞素(syncytin)，是一种参与胎盘的合胞滋养层的形成的融合糖蛋白。它由原病毒基因座ERVW1的env基因编码，并以gPr73前体的形式合成，该gPr73前体被特异切割成两个成熟蛋白质，表面亚基gp50(SU)和跨膜亚基gp24(TM)。
在体外，HERV-W家族的合胞素诱导细胞进行细胞融合，这依赖于其与ASCT家族(h-ASCT2，hASCT1)的氨基酸的受体-转运蛋白的相互作用。随后，系统发生研究表明，合胞素与一组反转录病毒有关，该反转录病毒组具体包括猫内源性病毒RD114、猴内源性病毒BaEV、猿反转录病毒和鸟反转录病毒——鸟网状内皮组织增殖病毒REV-A和脾坏死病毒SNV，全部都共同具有2型钠依赖型中性氨基酸的受体-转运蛋白或hASCT2(Rasko等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.96，pp.2129-2134；Tailor等，1999 Journalof Virology，vol.73(5)May 1999，P.4470-4474)。因此，用该反转录病毒组的病毒侵染细胞将导致特异地氨基酸转运减少(Rasko等，1999)。通过与ASCT家族的受体相关的干扰(相互作用)，用这些反转录病毒之一侵染细胞(或在细胞这些被膜之一中表达)防止了该同一细胞受到这些反转录病毒中的另一种的侵染或防止了与表达另一种被膜的另一种细胞进行融合。通过与ASCT家族的受体相关的干扰，使细胞受这些反转录病毒之一侵染而防止了受到这些反转录病毒的另一种的侵染。所有这些反转录病毒属于同一个HERV-W病毒干扰群。
被膜和ASCT受体之间的结合机制仍不清楚，目前，无论在HERV-W被膜蛋白的SU中还是在同一干扰群的反转录病毒的SU中，都尚未鉴定出结合ASCT受体的结构域。然而，这个主题是重要的，因为被膜/ASCT受体相互作用的抑制将另外能够防止反转录病毒进入细胞，从而阻断其复制循环，阻断被膜/ASCT受体相互作用和/或细胞融合的现象——其在转移细胞的增殖中或在耐药现象中可能涉及肿瘤形成(举例说明，参见出版物“Cellfusion:A hidden enemy？，Cancer Cell:May 2003，vol.3)，阻断可能与神经系统疾病有关的被膜/ASCT受体相互作用和/或细胞融合的现象，甚至抑制涉及滋养层分化的细胞-细胞融合(避孕接种疫苗)。而且，被膜/hASCT受体相互作用的抑制可通过对抗作用于可能由该被膜/hASCT受体相互作用导致的局部免疫抑制而防止肿瘤增殖。实际上，已经表明，一方面，用该反转录病毒组的病毒(特别是诱导免疫缺陷的那些病毒)侵染细胞引起氨基酸转运的特异减少(Rasko等，PNAS，vol.96.pp 2129-2134(1999))，另一方面，在氨基酸的转运受损和免疫抑制之间的直接联系被提出(Espinosa A，Villarreal LP.，T-Ag inhibits implantation by EC cell derived embryoid bodies.Virus Genes.2000；20(3):195-200；JE，Battini JL，Gottschalk RJ，Mazo I，Miller AD.，The RD114/simian type D retrovirus receptor is a neutral amino acidtransporter.Proc Natl Acad Sci USA，1999，Mar 2；96(5):2129-34)。因此，对于神经系统疾病，已知的是，hASCT受体参与中性氨基酸的特异性转运，以及对于传递信息，神经细胞主要利用多肽属性的神经递质。因此，Env-HERV-W蛋白与受体——其通常不得不转运神经递质合成所需的氨基酸——的结合能够通过降低诸如氨基酸等生理激动剂经由ASCT受体的进入而影响神经元合成神经递质的能力。而且，如果神经元——其细胞间网络形成对于在大脑和脊髓中传播的信息的传递所必需的连接点——在由Env-HERV-W蛋白诱导的若干神经元的融合之后形成合胞体，则用于信息传递的所有网络都被中断并连接于相同的融合“细胞包”，而且，每一细胞的神经递质产生活性不再个体化或与特异于该活性的上游或下游传导通路(树突和轴突)建立联系。
令人惊奇地，本发明人已经鉴定出这样的多肽区域，其引起属于HERV-W干扰群的病毒的被膜和hASCT受体之间的相互作用。
因此，本发明涉及属于HERV-W干扰群的病毒的被膜和hASCT受体之间的相互作用所必需的肽结构域，其特征在于它开始于N端并结束于C端，并且在于:
■所述N端由基序定义，所述基序由氨基酸(Z)α-脯氨酸-半胱氨酸-X-半胱氨酸组成，
其中
Z是任何氨基酸，
α是2和30之间的整数，
X是任何氨基酸，
所述基序选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.29以及SEQ ID No.44至SEQ ID No.72
■所述C端由基序定义，所述基序由氨基酸丝氨酸-天冬氨酸-Xa-Xb-Xc-Xd-Xe天冬氨酸-Xf-Xg-(Z)β组成，
其中
Xa、Xb、Xc、Xd、Xe、Xf、Xg是任何氨基酸，
Z是任何氨基酸，
β是15和25之间的整数，优选是20，
所述基序选自SEQ ID No.30至SEQ ID No.40，
并且所述特征在于所述肽结构域在所述N端和所述C端之间包括选自下列基序的至少一个基序:
■由氨基酸半胱氨酸-酪氨酸-X2-X3-X4-X5-X6-半胱氨酸组成的基序，
其中X2、X3、X4、X5、X6是任何氨基酸，
该基序对应于SEQ ID No.41，
■由氨基酸半胱氨酸-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-半胱氨酸-色氨酸组成的基序，
其中X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15是任何氨基酸，
该基序对应于SEQ ID No.42或SEQ ID No.73。
根据本发明，肽结构域的表述被理解为表示识别hASCT受体所需的HERV-W干扰群的病毒被膜的最小区域。
本发明的肽结构域可通过包括下列步骤的遗传工程技术来获得:
-培养在根据本发明的核苷酸序列的帮助下转化的微生物或真核细胞，和
-回收通过所述微生物或所述真核细胞产生的肽结构域。
该技术对于本领域普通技术人员是熟知的。对于与其有关的进一步细节，可参考下面的书:Recombinant DNA Technology I，Editors Ales Prokop，Raskesh K Bajpai；Annals of the New York Academy of Sciences，Volume 646，1991。本发明的肽结构域也可由本领域普通技术人员熟知的常规的肽合成方法来加以制备。
干扰群的表述被理解为表示所有这样的病毒，对于该病毒，细胞受其成员之一侵染(表达)通过受体干扰而防止了该病毒组的另一成员侵染所述细胞。
任何氨基酸的表述被理解为表示特别选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸的氨基酸。
hASCT受体的表述被理解为表示任何钠依赖型的中性氨基酸转运蛋白。
基序的表述被理解为表示对应于根据本发明的肽结构域的目标特定区的连续氨基酸，其由HERV-W病毒干扰群的所有病毒表达。
优选地，α是3至18之间的整数。
优选地，在SEQ ID No.1至SEQ ID No.29中的Pro Cys Xaa Cys基序的X或Xaa是选自天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸的氨基酸:这些序列优选地是那些选自SEQ ID No.44至SEQ ID No.72的序列。
优选地，Xa、Xb、Xc或在SEQ ID Nos.30至40的第3、4和5位的氨基酸是甘氨酸，Xd或在SEQ ID Nos.30至40的第6位的氨基酸Xaa是选自脯氨酸和缬氨酸的氨基酸；Xe或在SEQ ID Nos.30至40的第7位的氨基酸Xaa是选自谷氨酰胺、亮氨酸和苏氨酸的氨基酸；Xf或在SEQ ID Nos.30至40的第9位的氨基酸Xaa是选自赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺的氨基酸，Xg或在SEQ ID Nos.30至40的第10位的氨基酸是选自丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和缬氨酸的氨基酸。
优选地，β是整数20。
优选地，X2或在SEQ ID No.41的第3位的氨基酸Xaa是选自天冬酰胺、苏氨酸、谷氨酸、组氨酸的氨基酸，X3或在SEQ ID No.41的第4位的氨基酸Xaa是选自组氨酸、丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸的氨基酸；X4或在SEQ ID No.41的第5位的氨基酸Xaa是选自酪氨酸、苏氨酸、丙氨酸的氨基酸，X5或在SEQ ID No.41的第6位的氨基酸Xaa是选自谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸的氨基酸，X6或在SEQ ID No.41的第7位的氨基酸Xaa是选自亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸的氨基酸。
优选地，X7或在SEQ ID No.42的第2位的氨基酸Xaa是选自脯氨酸、苏氨酸、精氨酸和天冬酰胺的氨基酸；X8或在SEQ ID No.42的第3位的氨基酸Xaa是选自甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺的氨基酸；X9或在SEQ ID No.42的第4位的氨基酸Xaa是选自甘氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸的氨基酸，X10或在SEQ ID No.42的第5位的氨基酸Xaa是赖氨酸或缺失；X11或在SEQ ID No.42的第6位的氨基酸Xaa是选自赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的氨基酸，X12或在SEQ ID No.42的第7位的氨基酸Xaa是选自甘氨酸、天冬酰胺的氨基酸；X13或在SEQ ID No.42的第8位的氨基酸Xaa是选自谷氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸的氨基酸，X14或在SEQ ID No.42的第9位的氨基酸Xaa是选自缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸的氨基酸，X15或在SEQ ID No.42的第10位的氨基酸Xaa是选自缬氨酸、异亮氨酸的氨基酸。
优选地，
SEQ ID No.73的第2位的氨基酸Xaa选自脯氨酸、苏氨酸、精氨酸和天冬酰胺，
SEQ ID No.73的第3位的氨基酸Xaa选自甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺，
SEQ ID No.73的第4位的氨基酸Xaa选自甘氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸，
SEQ ID No.73的第5位的氨基酸Xaa选自赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸，
SEQ ID No.73的第6位的氨基酸Xaa选自甘氨酸、天冬酰胺，
SEQ ID No.73的第7位的氨基酸Xaa选自谷氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸，
SEQ ID No.73的第8位的氨基酸Xaa选自缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸，
SEQ ID No.73的第9位的氨基酸Xaa选自缬氨酸、异亮氨酸。
根据本发明如上所述，结构域中的缺失是可能的。根据本发明的具体实施方式，X10是缺失的。
本发明还涉及编码上述根据本发明的肽结构域的核苷酸序列。
这类序列可以通过化学合成方法和遗传工程，利用本领域普通技术人员熟知的技术并描述在例如Sambrook，J.等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual，1989中的技术加以制备。
本发明还涉及衍生自根据本发明的肽结构域的表位，其特征在于它诱导针对属于HERV-W干扰群的病毒的免疫应答。
表位的表述被理解为表示由位于B或T淋巴细胞的表面的受体或循环抗体识别的根据本发明的肽结构域的全部或一部分。
免疫应答的表述被理解为表示所有这样的生物学机制，该生物学机制允许多细胞生物体维持组成该生物体的细胞和组织的一致性(coherence)，或确保其在对改变其组成的分子结构或将外源分子引入该生物体的任何攻击进行应答时的完整性。
本发明还涉及编码如上所定义的表位的核苷酸序列。如上所示，这类序列可通过化学合成方法和遗传工程，利用本领域普通技术人员熟知的并描述在例如Sambrook，J.等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，1989中的技术加以制备。
本发明还涉及表达载体，其特征在于它包括根据本发明的核苷酸序列，以及其表达所需的元件。
作为表达载体，可以提及例如质粒，痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒、痘病毒或反转录病毒类型的病毒载体，沙门氏菌或BCG类型的细菌载体。
其表达所需的元件的表述被理解为表示得能够从核苷酸序列获得肽的任何元件，例如，具体为启动子、转录终止子、复制起点以及优选地，选择标记。
本发明的载体还可以包括将肽靶向特定细胞小室所必需的序列。
本发明还涉及用根据本发明的至少一种表达载体转化的宿主微生物或细胞。
作为适合本发明目的的微生物的例子，可以提及酵母，例如下列科中的那些酵母:优选的是，酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharoyces)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊氏酵母属(Hanseluna)、Yarowia属、Schwaniomyces属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)和乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)；以及细菌，例如大肠杆菌(E.coli)和下列科中的那些细菌:乳酸菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、沙门氏菌(Salmonella)、链球菌(Streptococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces)。
作为转化的宿主细胞的例子，可以提及来源于诸如哺乳动物、爬行类动物、昆虫等动物的那些细胞。优选的真核细胞是来源于中国仓鼠的细胞(CHO细胞)、来源于猴的细胞(COS和Vero细胞)、来源于幼仓鼠肾脏的细胞(BHK细胞)、来源于猪肾脏的细胞(PK 15细胞)以及来源于兔肾脏的细胞(RK13细胞)、人骨肉瘤细胞系的细胞(143 B细胞)、人HeLa细胞系和人肝瘤细胞系的细胞(Hep G2细胞类型)、以及昆虫细胞系的细胞(例如，草地夜蛾)、人胚肾细胞系的细胞(例如，HEK293T)。宿主细胞能够以在悬液中或在培养瓶中的培养物，以组织培养物、器官培养物等形式加以提供。
本发明还涉及定向针对根据本发明的肽结构域或针对根据本发明的表位的抗体。
抗体的表述被理解为既表示完整抗体又表示抗体片段。
根据本领域普通技术人员已知的常规方法，可以通过诸如细菌等原核生物、或通过诸如酵母等真核生物、哺乳动物、植物、昆虫或动物的细胞、或通过胞外生产系统获得重组抗体。
根据本领域普通技术人员已知的常规技术能够制备单克隆抗体，该常规技术诸如其一般原理在下文重新描述的杂交瘤技术。
在第一种情况下，通常，动物——通常为小鼠(或者，在体外免疫的背景下为培养的细胞)以目标靶抗原免疫，其B淋巴细胞随后能够产生抗所述抗原的抗体。这些产抗体的淋巴细胞随后与“不死的”骨髓瘤细胞(在实施例中为鼠源的)融合，以产生杂交瘤。然后，从如此获得的异源细胞混合物中，选择能够产生特定抗体并能够无限增殖的细胞。每一杂交瘤以克隆形式增殖，各自引起单克隆抗体的产生，该单克隆抗体对于目标抗原相关的识别特性可以通过例如ELISA、通过一维或二维免疫转移、通过免疫荧光或在生物传感器的帮助下进行检测。如此选择的单克隆抗体接下来根据亲和层析技术加以纯化。
抗体片段的表述被理解为表示针对属于HERV-W干扰群的病毒进行免疫应答的任何抗体片段。例如，这些抗体片段可以通过蛋白质水解而获得。因此，它们可以通过酶促消化获得，得到Fab类型的片段(用木瓜蛋白酶处理；Porter RR，1959，Biochem.J.，73:199-126)或F(ab)’2类型的片段(用胃蛋白酶处理；Nisonoff A.等，1960，Science，132:1770-1771)。它们也可通过重组途径制备(Skerra A.，1993，Curr.Opin.Immunol.，5:256-262)。适于本发明的方案的另一种抗体片段包括Fv片段，其是二聚体，由Fab片段的可变轻链(VL)结构域和可变重链(VH)结构域的非共价结合组成，因此是两个多肽链的组合。为了改善由于两个多肽链的解离所引起的Fv片段的稳定性问题，该Fv片段可以通过将合适的连接肽插入VL结构域和VH结构域之间的遗传工程加以修饰(Huston P.等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85:5879-5883)。随后，表达scFv片段(“单链片段可变区”)被使用，因为它由单个多肽链组成。使用优选由15至25个氨基酸组成的连接肽使得将一个结构域的C端连接到另一个结构域的N端成为可能，因此构成结合性质与其完整形式的抗体的结合性质类似的单体分子。VL和VH结构域的两种方向都是合适的(VL-连接肽-VH和VH-连接肽-VL)，因为它们表现出相同的功能性质。当然，本领域普通技术人员已知的并表现出上文所定义的免疫特性的任何片段都适于本发明的目的。
本发明还涉及至少一种根据本发明的肽结构域、至少一种根据本发明的表位、至少一种根据本发明的抗体或至少一种根据本发明的核苷酸序列在制备药物中的应用，所述药物用于抑制、预防或治疗在动物——优选人——体中由属于HERV-W干扰群的病毒引起的感染。根据本发明的肽结构域可具体用于靶向表达hASCT家族的受体的细胞，以转导信号以及调节氨基酸的流动(癌症治疗)。
肽的组成型表达所需的元件的表述被理解为表示特异于真核细胞的遍在启动子。作为肽的诱导型表达所需的元件，可以提及调控抗四环素的大肠杆菌操纵子的元件(Gossen M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:5547-5551(1992))。
至少一种根据本发明的肽结构域、至少一种根据本发明的表位、或至少一种根据本发明的核苷酸序列的应用特别适合于制备拟用于在动物——优选人——体中预防由属于HERV-W干扰群的病毒引起的感染的药物。至少一种根据本发明的抗体的应用特别适合于制备拟用于在动物——优选人——体中抑制或治疗由属于HERV-W干扰群的病毒诱发的感染或病状的药物。
本发明还涉及药物组合物，其包括作为活性物质的至少一种根据本发明的肽结构域、至少一种根据本发明的表位、或可选地至少一种根据本发明的核苷酸序列，特别是置于所述肽结构域或表位的组成型和/或诱导型表达所需元件的调控之下的核苷酸序列，与药学上适宜的载体的组合。本发明还涉及药物组合物，其包括作为活性物质的至少一种根据本发明的抗体，与同药学上适宜的载体的组合。
当然，根据药物组合物的成分，本领域普通技术人员将容易确定药学上适宜的载体，以及确定将使用的肽结构域、表位、核苷酸或抗体的量。
在根据本发明的用于口服、舌下给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药、局部给药、气管内给药、直肠给药或经皮给药的药物组合物中，根据本领域普通技术人员熟知的常规步骤，活性物质能够以单位给药形式或作为与常规药物载体的混合物进行给药，并拟通过经口途径给药，例如以片剂、明胶胶囊、口服溶液等的形式，或以栓剂的形式通过直肠途径给药，或特别以注射溶液的形式通过肠胃外途径给药，特别是通过静脉内、皮内或皮下途径等给药。对于局部施用，活性物质能够以乳剂、软膏剂、洗剂、滴眼剂进行使用。
当制备片剂形式的固体组合物时，活性物质与可药用的赋形剂混合，该可药用的赋形剂也称为药物载体，例如，明胶胶囊、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石、阿拉伯胶或类似物。片剂可以用蔗糖、用纤维素衍生物或用其它合适的材料进行包衣。能够对该组合物进行处理，使得它们具有延长的或迟延的活性并且使得它们连续释放预定量的活性物质。通过将活性物质与稀释剂混合并将该混合物倒入软或硬明胶胶囊中获得明胶胶囊形式的制剂也是可能的。获得糖浆剂形式或以滴剂形式给药的制剂也是可能的，其中所述活性物质与增甜剂、杀菌剂诸如特别是羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯、以及风味增强剂或合适的着色剂混合。粉末或水分散性颗粒可含有以与本领域普通技术人员熟知的分散剂或润湿剂或悬浮剂的混合物为形式的活性物质。对于肠胃外给药，使用了水悬浮体、等渗盐水或无菌溶液注射用溶液，其含有分散剂、药理学上相容的润湿剂，诸如特别是聚乙二醇或丁二醇。
根据本发明的药物或药物组合物可另外包括活化剂，该活化剂诱导药物治疗的效果或者通过具体增加主要药物治疗的生物利用度来增强或补充主要药物治疗的效果。
剂量取决于病症的严重性，并根据常规步方案调整。作为指导，当活性物质是单克隆抗体时，每周剂量为1至10mg/kg，结合可药用的赋形剂。
本发明还涉及用于检测和/或量化属于HERV-W干扰群的病毒或者检测和/或量化针对所述病毒的免疫应答的诊断组合物，其包括至少一种根据本发明的肽结构域、至少一种根据本发明的表位、至少一种根据本发明的核苷酸序列、或至少一种根据本发明的抗体。
如果期望确定患者是否对属于HERV-W干扰群的病毒具有免疫应答，包括至少一种根据本发明的肽结构域、至少一种根据本发明的表位、至少一种根据本发明的核苷酸序列的诊断组合物是特别合适的，而包括至少一种根据本发明的抗体的诊断组合物特别适合于检测和/或量化属于HERV-W干扰群的病毒。
本发明还涉及在生物样品中检测和/或量化属于HERV-W干扰群的病毒的方法，所述生物样品取自易于受属于HERV-W干扰群的病毒感染的个体，其特征在于所述方法包括由下列组成的步骤:
-使所述生物样品与至少一种根据本发明的抗体在使得所述病毒和所述抗体之间能够形成复合物的条件下接触，和
-通过合适的方式检测和/或量化所述复合物的形成。
生物样品的表述被理解为表示易于含有所述病毒的人或动物来源的生物样品，例如血液、血浆、血清、尿液、脑脊液的样品，或者诸如胎盘、睾丸、前列腺和乳房等组织的样品。
接触的步骤是本领域普通技术人员常规上已知的步骤。
通过在极小分子的免疫分析领域内已知的任何检测方式，例如直接检测，即没有一个结合配偶体或多个结合配偶体的中间阶段，以及间接检测，即通过一个结合配偶体或多个结合配偶体的中间阶段，而进行该检测/量化步骤。
本发明的抗体或抗体片段和病毒间的结合的直接检测可以通过例如表面等离子共振或通过在具有导电聚合物的电极上进行的循环伏安法而进行。在该情况下，本发明的抗体用于免疫捕获所有或部分病毒，该所有或部分病毒随后被洗脱。可以通过本领域普通技术人员已知的任何洗脱方法例如pH冲击法进行洗脱。
在间接检测的情况下，本发明方法的第二步可根据常规ELISA竞争测定技术进行。本发明的抗体随后用作用于捕获样品中的所有或部分病毒的结合配偶体。然后，通过待测样品中可含有的病毒的全部或一部分与先前标记的已知量的病毒之间的竞争，进行该检测。
表达标记被理解为表示能够直接或间接产生可检测信号的标记物的连接。这些标记物的非限制性名单由下列组成:
■酶，其产生例如能够通过比色法、荧光法、发光法可检测的信号，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、β-半乳糖苷酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶，
■生色团，例如发光显色的化合物，
■放射性分子，例如32P、35S或125I，
■荧光分子，例如荧光素、罗丹明(rhodomine)、阿历克斯红(alexa)或藻蓝蛋白，和
■颗粒，例如金或磁性乳胶颗粒、脂质体。
间接标记系统也可被使用，例如，通过另一配体/抗配体对进行。所述配体/抗配体对是本领域普通技术人员熟知的，并且下列的配对可作为例子提及:生物素/抗生蛋白链菌素、生物素/抗生物素蛋白、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/该多核苷物的互补链。在该情况下，是结合到所述结合配偶体的所述配体。抗配体可以通过在前述段落中描述的标记物进行直接检测或本身可以通过配体/抗配体进行检测。
这些间接系统在某些条件下可以导致信号的扩增。该信号扩增技术是本领域普通技术人员已知的，并可参考本申请人以前的专利申请FR98/10084或WO95/08000，或者参考文章J.Histochem.Cytochem.，(1997)，45:481-491。
分子的标记广为本领域普通技术人员所知，并例如由Greg T.Hermanson在Bioconjugate Techniques，1996，Academic Press Inc.，525B Street，San Diego，CA92101 USA中加以描述。
取决于所用标记的类型，例如使用酶，本领域普通技术人员将加入使所述标记可见的试剂。
这类试剂广为本领域普通技术人员所知，并具体描述于Principles andPractice of Immunoessay，2nd edition，Edited by C.Price，D.G.Newman，Stockton Press，1997，345Park Avenue South，New York中。
本发明还涉及上述组合物在生物样品或样本中体外筛选属于HERV-W干扰群的病毒中的应用。具体而言，例如SRV1和SRV2(涉及猴免疫缺陷机制的病毒)的病毒的早期筛选，使得能够在免疫缺陷出现之前提供适于宿主的治疗。而且，涉及胎盘病理学的HERV-W的早期筛选使得能够调节该HERV-W的表达，例如，在先兆子痫期间调节。
本发明还涉及根据本发明的肽结构域或根据本发明的表位、或根据本发明的抗体在抑制属于HERV-W干扰群的病毒的被膜和ASCT受体之间的相互作用中的应用。这使得特别是获得避孕免疫疗法成为可能。
本发明还涉及根据本发明的肽结构域在鉴定化学或生物分子中的应用，所述化学或生物分子与该肽结构域的全部或部分的相互作用阻断属于HERV-W干扰群的病毒被膜和hASCT受体之间的相互作用。例如，当使用HERV-W的根据本发明的肽结构域时，这使得能够获得特别是对于获得避孕治疗是高度适合的化学或生物分子。应用这类化学分子来抑制属于HERV-W干扰群的病毒被膜和ASCT受体之间的相互作用是具有治疗益处的。
作为指导，两种允许筛选化学或生物分子的一般方法在下面被描述，该化学或生物分子能够抑制env/受体相互作用。
在当可能产生可溶被膜的情况下，根据ELISA型方法，在捕获阶段使用表达至少一种hASCT受体的细胞，确定化学或生物分子是否改变env/受体相互作用是可取的。因此，在96孔板上，表达目标hASCT受体的细胞被培养或吸附，并且env/受体相互作用通过应用标记的可溶被膜(组氨酸标签，GPF融合)进行检测，从而能够产生可以测定的参考信号。如果在所述可溶被膜与化学或生物分子预温育后观察到信号减少，这表示所述化学或生物分子改变env/受体相互作用。可选地，应用由目标被膜包装并表达可检测标记(LacZ)的假型反转录病毒载体并进行相同检测是可能的。经由融合抑制的测量，能够选择目标分子。表达目标受体的细胞(细胞-受体)，例如HeLa或XC-RDR细胞，以及以组成型表达标记物(例如LacZ)并瞬时或稳定表达目标被膜的细胞(细胞-env-LacZ)被使用；通过与HERV-W env的胞质内结构域交换，目标被膜在其胞质内尾的水平下被事先修饰，以便使其以组成型成融合(Cheynet等，79(9):5586-5593，2005)。两种细胞类型的接触，“细胞-受体”过量而“细胞-env-LacZ”不足量，引起多核巨细胞或合胞体的形成，其含有一种或两种来源于“细胞-env-LacZ”的蓝色核和数十种来源于“细胞-受体”的白色核。在存在改变env/受体相互作用的化学或生物分子的情况下进行的相同共培养导致合胞体的数量和它们的核含量的降低。在CCD相机的帮助下这类测量的自动化是可能的。
本发明还涉及根据本发明的肽结构域在产生抗体中的应用，所述抗体阻断属于HERV-W干扰群的病毒被膜和hASCT受体之间的相互作用。
本发明还涉及确定属于HERV-W干扰群的病毒被膜和hASCT受体之间的相互作用所需的多肽区的方法，其特征在于:
■鉴定所述病毒的前体被膜的核苷酸和/或肽序列
■信号部分被排除在外
■丝氨酸-天冬氨酸-Xa-Xb-Xc-Xd-Xe-天冬氨酸-Xf-Xg是检测的结构域
其中
Xa、Xb、Xc、Xd、Xe、Xf、Xg是对应于SEQ ID No.43的任何氨基酸
■在对应于SEQ ID No.43的所述丝氨酸-天冬氨酸-Xa-Xb-Xc-Xd-Xe-天冬氨酸-Xf-Xg结构域之后，15至25个(优选15至20个)氨基酸之间的C端被排除在外。
优选地，Xa、Xb、Xc是氨基酸，其为甘氨酸，Xd是选自脯氨酸和缬氨酸的氨基酸，Xe是选自谷氨酰胺、亮氨酸和苏氨酸的氨基酸，Xf是选自赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和谷氨酰胺的氨基酸，Xg是选自丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和缬氨酸的氨基酸。
为了本发明的目的，所述病毒的前体被膜的核苷酸序列和/或肽序列通过本领域普通技术人员已知的任何方法(可具体参考Maniatis(ed.1989))进行鉴定。
通过本领域普通技术人员已知的任何方法将所述信号部分排除在外，特别是在“Improved Prediction of Signal Peptide:SignalP 3.0”Jannick 
Figure A200780004699D0018103011QIETU
Bendtsen，Henrik Nielsen，Gunnar von Hiejne and 
Figure A200780004699D0018103023QIETU
 Brunak，J.Mol.Biol.，340:783-795，2004中所描述的方法。
所述结构域通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行检测，也就是说使用Blast或Fasta类软件(具体参见Altschul SF，Gish W，Miller W，Myers EW，Lipman DJ.，Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.1990Oct 5；215(3):403-10)。
本发明还涉及能够通过上述方法获得的肽结构域。
附图以解释性实例的方式给出，并且不具有限制性。它们将使得读者能够更好地理解本发明。
图1图解说明了来源于Env-W的可溶重组蛋白的表型特征和性质。具体而言，图1a图解说明了包括SU和TM亚基(Env-Gp60)的全部或部分的最大可溶重组蛋白，以及相应于SU亚基(EnvSU)的可溶重组蛋白。图1b表示EnvSU重组蛋白分别与XC hASCT2细胞和XC hASCT1细胞的结合测试的流式细胞术分析，所述XC hASCT2细胞和XC hASCT1细胞分别表达hASCT2与hASCT1受体。图1c图解说明了结合TE671细胞(对照hASCT2)、TE671RD细胞(阻断hASCT2)和TE671galv细胞(阻断Pit1)的干扰测试。
图2图解说明了结合至hASCT2受体的ERV-W被膜的最小结合结构域的定义(RBD表示受体结合结构域)。具体而言，图2a描述了从EnvSU设计出的所有缺失突变体。图2a表示来源于EnvSU的重组蛋白与表达hASCT2受体的XC hASCT2细胞的结合测试的流式细胞术分析，具体而言，Env197、Env168和Env144突变体的结合以及Env69-317、Env169-317和Env117突变体的结合缺陷。
图3a图解说明了对应于HERV-W被膜蛋白前体的区域21-144的、根据本发明的结构域(RBD)内部的免疫原性肽的定义。图3b示出了在通过免疫原性肽产生的抗体(抗SU-EnvW)的帮助下对RBD与其受体结合的抑制，以及在非特异性抗体(抗TM-EnvW)存在下对RBD-受体结合的缺乏抑制。
图4表示属于同一干扰群的反转录病毒被膜序列的比对，并示出了信号肽、SU(表面单元)亚基和TM(跨膜)亚基的边界以及受体结合位点。序列是HERV-W(人内源性反转录病毒家族W)、RD114(猫内源性反转录病毒)、REV(鸟网状内皮组织增殖病毒)、BAEV(狒狒内源性病毒(菌株M7))、SRV1(猿反转录病毒SRV-1)、SRV2(猿反转录病毒SRV-2)和MPMV(猿Mason-Pfizer病毒)。
具体实施方式
下列实施例以举例说明的方式给出，并且不具有限制性。它们将使得能够更好地理解本发明。
实施例1:重组被膜的分子和表型特征
HERV-W被膜SU亚基的构建和产生
由含有HERV-W被膜基因(538个氨基酸)的表达载体phCMV-Env-W(Blond J Virol，Vol74(7):3321-3329，2000)，设计允许可溶重组被膜蛋白表达的载体phCMVEnv-Gp60(clone PH74，Blond等.J Virol Vol 73(2):1175-1185，1999)。
以如下所述步骤来构建可溶被膜(Gp60，1-435)。
(1)在SU和TM亚基之间的天然切割位点RNKR(AA 314至317)被突变成AAAR，以使得产生融合蛋白，该融合蛋白稳定且不具有被切割然后由二硫桥重新组合的两个SU-TM亚基。
(2)对应于氨基酸436至538的跨膜(tm)和胞质内(CYT)区域被缺失，以获得可溶蛋白质。
(3)具有组成(GGGS)3、其后是多聚组氨酸尾(RGS-HHHHHH)的间隔臂被添加于C端位置，以允许通过IMAC纯化该蛋白以及通过抗组氨酸单克隆抗体(Qiagen，RGS H6)进行检测。
以表达该可溶被膜的载体phCMVEnv-Gp60开始，构建载体phCMV-EnvSU，允许SU蛋白质的产生。可溶SU是在紧接序列AAAR的下游含有序列RGS-HHHHHH的C端多聚组氨酸尾的融合蛋白，以允许通过IMAC纯化该蛋白以及通过抗组氨酸单克隆抗体(Qiagen，RGS H6)进行检测。
通过载体phCMV-Env-W、phCMV-EnvGp60和phCMV-EnvSU产生的各种蛋白质的示意性结构被描述于图1a中。
可溶被膜的产生
通过磷酸钙沉淀，表达质粒phCMV-EnvGp60或phCMV-EnvSU被转染到HEK293T细胞中。在无血清培养基中产生48小时之后，收集含有GP60或SU被膜的上清液，并在0.45μm膜上过滤，以除去细胞碎片。在聚丙烯酰胺凝胶上并通过与抗组氨酸单克隆抗体(Quiagen，RGS H6)的蛋白质印迹进行直接分析。GP60和SU蛋白以可溶形式正确表达。
通过流式细胞术进行的结合测试和分析
在用表达任一人受体hASCT的载体转染XC细胞(大鼠肉瘤)并随后如上所述选择克隆之后，以组成型表达hASCT2(XChASCT2)或hASCT1(XChASCT1)受体的稳定系XChASCT2和XChASCT1得以建立(Frendo等，Mol.Cell Biol.，Vol 23(10):3566-3574，2003)。下列人细胞被描述于BlondJ Virol，Vol 74(7):3321-3329，2000中。TE671细胞表达hASCT2。TE671RD细胞组成型表达属于同一干扰群从而识别hASCT2受体的RD114被膜(猫内源性反转录病毒)。TE671galv细胞组成型表达GALV(长臂猿白血病病毒)被膜，其属于另一干扰群并识别PiT1受体。
细胞在PBS溶液中洗涤，并通过脱附作用，利用在PBS中的0.02％乙二胺四乙酸收获细胞。总共106个细胞与1ml的含有该可溶被膜(Gp60或SU)的过滤上清液在37℃下温育1小时。细胞用含有2％胎牛血清的PBA(PBS和0.5％的叠氮钠)洗涤，并在4℃下用抗组氨酸单克隆抗体(RGSH6，Quiagen)标记1小时。细胞用PBA洗涤一次，并在4℃下用偶联于异氰酸荧光素的二抗温育1小时。细胞用PBA洗涤两次，并用流式细胞术分析。
使用靶细胞XChASCT2，本发明人证明了对应于该被膜的可溶形式的重组蛋白Gp60具有与野生型被膜的重组蛋白相同的表型特征，即，它能够结合表达hASCT2受体的XC细胞。
使用靶细胞XChASCT2、XChASCT1、TE671、TE671RD、TE671galv，本发明人证明了对应于该被膜的SU亚基的重组蛋白表现出与野生型被膜的重组蛋白相同的表型特征。首先，该SU亚基能够结合两种受体hASCT1和hASCT2(图1b)。而且，该蛋白就人细胞TE671和衍生细胞TE671RD和TE671galv进行检测。可溶SU蛋白结合到表达hASCT2受体的TE6781细胞和PiT1受体被阻断的TE671galv细胞，但该可溶SU蛋白不结合hASCT2受体被阻断的TE671RD细胞(图1c)。SU重组蛋白和RD114反转录病毒特异性地发生干扰。
实施例2:用于W被膜的SU部分与其hASCT2受体的相互作用的结构域的鉴定
为鉴定被膜结合hASCT2受体的区域边界，本发明人构建了一组从N末端和C末端的缺失突变体。SU亚基的结构域通过PCR获得，并被亚克隆到表达载体pHCMV-EnvSU中并进行测序。通过磷酸钙沉淀，表达质粒phCMV-EnvSU、Env69-317、Env197、Env168、Env169-317、Env117和Env144(图2a)被转染到HEK293T细胞中。蛋白质的产生和分析条件与实施例1中描述那些细节相同。
EnvSU、Env69-317和Env197蛋白质以可溶形式正确表达。使用组成型表达hASCT2的XC细胞，本发明人证明了Env197蛋白能够结合在所述细胞的表面上表达的受体，如SU亚基(1-317)。因此，成熟SU亚基的前176个残基(从而缺乏其信号肽)足以结合到表达hASCT2受体的细胞表面。该21-68区的缺失导致与还表明其所包括受体结合结构域(RBD)的受体结合的丧失。另一方面，截短的Env168蛋白表现出较低的结合hASCT2受体的能力。
为了在上清液中获得各种截短的蛋白质之间的当量，本发明人将SU的N端区的两个较小的结构域(Env117和Env144)融合于SU亚基的C端区(Env169-317)，后一结构域不结合hASCT2。Env117和Env144蛋白的表达水平是类似的，并且所述蛋白以可溶形式表达。结合测试表明，仅Env144蛋白能够结合表达hASCT2受体的细胞。Env117蛋白不与所述细胞表面结合表明该117-144区内部至少一个结合决定子的丧失。
因此，用于W被膜与其受体的相互作用的结构域的边界由氨基酸21至144所限定。
应该注意到，一般而言，拟分泌或用于膜表达的蛋白质(包括被膜蛋白)在颗粒内质网(ER)中合成。在ER中新合成蛋白质的转运受N端信号肽的制约(Walter和Lingappa 1986)。信号肽的疏水区启动穿入网状组织的膜，带动在其后的该新合成肽的剩余部分。由于转运与合成同时开始，所以是正在被翻译的肽穿过ER膜。当蛋白质通过ER的内腔时，该信号序列被特异的细胞酶、信号肽酶切割(Walter P，Johnson AE:Signal sequence recognitionand protein targeting to the endoplasmic reticulum membrane.Annu.Rev.CellBiol.1994，10:87-119)。Env转运进入ER被糖蛋白的(疏水性)跨膜结构域所停止，该糖蛋白锚定于磷脂膜。在ER内腔中，拟变成胞质外的区(SU和部分TM)被折叠(二硫桥形成)、糖基化和寡聚化。在寡聚化后，经历成熟作用的蛋白质被转运入高尔基体中，在那里它们经历新的聚糖成熟过程并由识别基序R/KXXR的弗林蛋白酶型的内切蛋白酶切割而产生两个SU和TM亚基。
由于在含有酪氨酸(脂族/芳族(Y-X-X))的胞质内尾上存在的基序，该成熟蛋白被靶向原生质膜。
实施例3:被膜与其受体结合的体外抑制检测(肽的定义和兔抗体的产生)
通过实施例2中定义的区域和通过SU亚基的潜在抗原性区域的确定，进行肽(112-129，TGMSDGGGVQDQAREKHV+C，19个氨基酸)的定义。半胱氨酸被添加于C端位置，用于KLH(钥孔血蓝蛋白，cf.Frendo等，Mol.Cell Biol.Vol23(10):3566-3574，2003)偶联。该肽被用于兔免疫，随后亲和纯化多克隆抗体，该多克隆抗体定向针对该兔的血清中含有的区域112-119。
Env144蛋白在37℃下与抗SU多克隆抗体或与抗TM多克隆抗体预温育一小时。Env144蛋白-抗SU抗体复合物的形成显著降低了被膜与表达hASCT2受体细胞的结合。相比之下，不定向针对RBD的抗体的使用并未对Env144蛋白与hASCT2受体的结合造成不利影响。
实施例4:定向针对HERV-W被膜蛋白的生成
三只雌性六周龄的BALB/c小鼠(IFFA-Credo)通过直接注射含有HERV-W被膜的基因的裸质粒DNA(phCMV-env-W)进行免疫。该注射在基因枪的帮助下通过皮内途径进行。对每只小鼠首先进行五次2μg DNA的注射，随后两次4μg DNA的注射进行加强。收集血清，并确定每一血清的抗体滴度。由于抗体滴度太低，所以制备细胞裂解物。
细胞裂解物的制备
横纹肌肉瘤细胞TelCeB6(ATCC CRL8805)用质粒phCMV-env-W转染。在约20小时后以及合胞体的存在下，在含有0.5％曲拉通(Triton)的PBS缓冲液中制备细胞提取物。通过Bradford测定该蛋白提取物。env-W抗原浓度对应于9.5μg/μl的总蛋白。
用细胞裂解物的提取物免疫小鼠
同一小鼠首先通过腹膜内途径接受10μg的细胞裂解物的注射，随后通过腹膜内途径注射2×100μg的细胞裂解物进行加强。在与骨髓瘤细胞融合前三天，通过静脉内途径，用22μg的可溶被膜蛋白Gp60进行另一注射，该可溶被膜蛋白Gp60通过如实施例1所述的质粒phCMV-Env-Gp60获得并根据下列条件在注射前预先纯化到Ni-NTA树脂(Quiagen)上:在pH8的磷酸盐缓冲液中结合、在pH8的磷酸盐缓冲液和在pH6的乙酸铵中洗涤、在pH3.5的乙酸铵中洗脱以及用真空离心蒸发浓缩器(speed vac)浓缩。如此获得的47μg真核Gp60蛋白被保留用于通过上述静脉内途径注射。在融合后，通过免疫荧光，在转染并结合的细胞(TeLCeb6)上，检测杂交瘤上清液，通过功能性ELISA检测，使用总蛋白浓度为9.2μg/μl的Env-W蛋白和作为阴性对照的、总蛋白浓度为13.3μg/μl的Env AS蛋白来进行抗体筛选，并且选择最有效的抗体。
单克隆抗体2H1H8、12C7A3和1F11B10由此获得。单克隆抗体2H1H8和12C7A3定向针对Env-HERV-W蛋白的SU区的非糖基化N端部分。如在Env144的帮助下进行的蛋白质印迹测定所示，单克隆抗体2H1H8和12C7A3定向针对RDB。如在Env 169-317的帮助下进行的蛋白质印迹测定所示，单克隆抗体1F11B10定向针对Env-HERV-W蛋白的SU区的糖基化C端部分。该抗体不识别Env144。
实施例5:被膜与其受体结合的体外抑制测试和在单克隆抗体的帮助下通过细胞与细胞融合测试(共培养)合胞体形成的体外抑制测试
用于表达被膜糖蛋白的质粒通过磷酸钙沉淀以100和500ng的量被转染入细胞TELCeB6中(Cosset等，Journal of Virology，69(10):6314-6322(1995))。表达该被膜的细胞在转染后20小时与支持体分离，并在37℃下分别与抗HIV 23A5单克隆抗体、抗TM Env-HERV-W 6A2B2单克隆抗体(先前获得)、抗SU Env-HERV-W 2H1H8 12C7A3和1F11B10单克隆抗体(以1/50稀释)预温育1小时。接下来，它们以相同的浓度(0.4×105个细胞/孔)再接种到12孔板中。然后将上皮样癌指示的人细胞(Epithelioid-carcinoma-indicating human cells)(海拉癌细胞株(Hela)，ATCC CCL-2)以每孔2×105个细胞的量加入到该转染的细胞中，并且持续共培养24h。然后，可以进行XGa1(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖)染色，以对细胞TELCeB6的核进行染色(Cosset等，Journal of Virology，69(10):6314-6322(1995))。之后根据供应商的推荐进行May-Grünwald和Giemsa溶液(MERCK)染色。所观察到的融合对应于“从内部”的融合，也就是说，以表达被膜的细胞开始的细胞与细胞的融合，不同于“从外面”的融合——对应于病毒体-细胞(一个或多个)融合后合胞体的形成。
下面表1中描述的结果表示所计算的融合细胞的数量。
表1
 
抗体 23A5 6A2B2 2H1H8 1F11B10 12C7A3
100ng 261 231 130 223 ND
500ng 217 273 73 210 11
ND:未测定
上文所描述的结果表明，Env蛋白-抗SU 2H1H8和12C7A3抗体复合物的形成显著降低了被膜与表达hASCT2受体的细胞的结合以及细胞融合。相比之下，不定向针对rdb的抗体(6A2B2或1F11B10)的应用并未显著地给被膜的结合和细胞融合带来不利影响，如通过与用抗HIV 23A5对照抗体获得的结果相比而观察到的。
实施例6:被膜蛋白和hASCT2受体之间的体内相互作用以及合胞体的体内形成的研究
为验证体外获得的结果，设计动物模型。横纹肌肉瘤细胞TelCeB6(ATCC CRL8805)，在添加有南美血清(South American serum)的DMEM培养基(Gibco Invitrogen 41966-029)中培养，在LipofectAMINE PLUSTM试剂盒(Gibco Invitrogen)的帮助下，根据下面详细描述的步骤，分别用浓度为2μg/μl、对应于以有义方向克隆的HERV-W env基因的DNA(DNA 409)，用浓度为1.5μg/μl、对应于以反义方向克隆的HERV-W env基因的DNA(DNA 410)和用浓度为1.3μg/μl、对应于突变的HERV-W env基因的DNA(DNA LQMV)，对该横纹肌肉瘤细胞TelCeB6进行转染。用DNA 409转染的细胞能够表达融合的W被膜蛋白，用DNA 410转染的细胞不能表达该被膜蛋白，而用DNA LQMV转染的细胞能够表达融合的突变W被膜蛋白。
1).步骤:
第一天:TelCeB6细胞的培养:
-直径100mm的培养皿的接种→50-70％汇合；
-于37℃，在5％CO2下，在补料DMEM培养基(每培养皿6ml)中培养24小时。
第二天:用LipofectAMINE PLUS TM 试剂盒转染:
1  DNA的预络合(precomplexing)
-在15ml Falcon管(目录号2096)中混合未添加有上述DNA——即2μl409或3μl 410或3μl LQMV——的750μl培养基；
-涡旋搅拌PLUS试剂并将20μl的该试剂加入到DNA溶液中；
-在1400rpm下立即涡旋搅拌10秒；
-在室温下温育15分钟。
2  细胞的制备
-用5ml非补料培养基更换。
3 LipofectAMINE的稀释
在用于培养皿的管中，混合30μl的LipofectAMINE试剂与750μl的非补料培养基。
4  DNA的络合
混合780μl稀释的LipofectAMINE和772μl预络合DNA溶液(总共:1552μl)；
在1400rpm下立即涡旋搅拌10秒，
在室温下温育15分钟。
5 通过或未通过注射抗Env抗体处理的靶细胞移植的受体动物的转染和产生
在培养皿中1552μl的沉积；
于37℃在5％ CO2下温育2-3小时；
用具有6ml补料培养基的转染培养基更换；
于37℃在5％ CO2下温育1小时；
通过腹膜内途径(IP)注射入SCID小鼠(体积为1ml)，每个培养皿的1/5达到70％汇合，额外注射或不注射抗Env蛋白抗体(1/100稀释的单克隆抗体2H1H8、多克隆抗体69(抗-SU)和71(抗-TM))。
耐受该移植物并允许该移植的细胞在体内传播的动物产生，同时在腹膜腔内产生假性腹水。
第三天:
通过腹腔灌洗，从每只动物收集细胞:注射2ml空气，随后注射2ml生理盐水，然后按摩并回收2ml的腹膜液(用于在移植的动物中腹膜腔内植入的细胞的回收的步骤)；
在“倒置相差”显微镜下观察，同时对合胞体进行计数，和/或于载玻片上染色后在“倒置相差”显微镜下观察；
在锥虫蓝存在下(排除死细胞)，在具有方格室的载玻片上扩散之后进行直接读数。用“广角”透镜(40)在每个视野下对已经互相融合的细胞数目进行计数，这使得对超过约一百个细胞进行计数成为可能，以得到一系列具有统计代表性的计数。
每一样品的细胞整分试样在甲醇/丙酮(v/v)存在下被固定，然后储存在-20℃下，直到获得结晶紫染色(1％)。对染色的载玻片进行照相。
2)小鼠:
2只小鼠的组用下列接种:
在没有抗体的情况下，用三类质粒(DNA 409、410和LQMV)转染的细胞(3×2＝6只小鼠)
在存在单克隆抗体2H1H8的情况下，用三类质粒(DNA 409、410和LQMV)转染的细胞(3×2＝6只小鼠)。
3)结果:
通过在方格计数室上的直接读数确定的每100个细胞中的融合细胞数在下面的表2中示出:
表2
ECP(锥虫蓝)读数:合胞体的直接读数
 
品系 S1* 计数 S2* 计数 均值
409对照 19 22 20.5
409+2H1H8 3 4 3.5
410对照 8 11 9.5
410+2H1H8 2 3 2.5
LQMV对照 8 5 6.5
LQMV+2H1H8 1 1 1
S1*和S2*＝小鼠1和小鼠2
每一个数表示每一研究视野下的融合且可见的细胞的数目。因为一些细胞可能在光路中重叠，所以在对照中看起来融合的细胞的计数大于零。然后，通过在载玻片上对细胞进行染色，核实合胞体的真实性以及细胞堆积的鉴别，其中可见在由连续的单个和单一细胞膜划界的空间中含有多个细胞核。而且，显示出在融合过程中的细胞的照片使通过相差显微镜分析的融合的真实性以及在对照中的等同现象的完全缺失能够客观化。
为使由表2中示出的数所表示的初步分析在统计学上客观化，进行Chi-2检验(卡方检验)，以比较表2中的数据。
在没有载玻片染色之后的二次分析或在对照中从未见过的融合过程中的典型细胞的研究的情况下，考虑了初步读数的“背景噪音”的统计分析的结果如下:
i)体内致病效应的特异性的统计确认:
表达的Env(409):平均计数每100个细胞有20.5个阳性，
反义Env(410):平均计数每100个细胞有9.5个阳性，
突变Env(LQMV):平均计数每100个细胞有6.5个阳性，
对照的平均值(410和LQMV):9.5+6.5/2＝8％.
Env对对照410:Chi-2＝5.89(p<0.02)
Env对对照LQMV:Chi-2＝9.83(p<0.002)
Env对两种对照(410和LQMV):Chi-2＝7.69(p<0.01)
对照410对对照LQMV:Chi-2＝0.61(差异不显著)。
因此，对照是统计上等价的，并且不存在与对照的类型有关的“真实”差异。
从该分析阶段(未排除与伪像有关的背景噪音，并通过互相比较两种类型的对照(其证明是等价的))获得的结果在统计上是非常显著的(总p<0.01)。通过染色，随后的效应特异性分析仅仅是确认在Env蛋白存在条件下体内获得的效应特异性，从而验证动物模型的合胞体的体内研究，该动物模型的融合是通过HERV-W Env诱导的。
ii)所检测的抗体对体内致病效应的治疗活性的统计确认:
表达的Env(409):平均计数每100个细胞有20.5个阳性，
表达的Env(409)+单克隆抗体2H1H8:平均计数每100个细胞有3.5个阳性。
单独的Env对注射抗体2H1H8:Chi-2＝15.38(p<0.001)
所得到的结果示出了单克隆抗体的统计上显著的效应(由于机会(p)小于0.001得到的结果概率)。通过染色，随后的效应特异性分析仅仅是确认在Env蛋白存在条件下体内获得的效应特异性，从而验证对该动物模型的治疗效应。
实施例7:HERV-W Env蛋白与具有或不具有1或2型hASCT受体的细胞结合的体内研究以及通过注射定向针对HERV-W Env的抗体来抑制该结合的体内研究
1)材料
可溶蛋白:经0.45μm过滤的上清液，含有可溶蛋白(用质粒460(被膜-间隔物-His6)转染的293T细胞)。
通过与抗-RGS-His抗体的蛋白质印迹确认表达。
抗体:单克隆抗体2H1H8(IgG，5.50mg/ml)。
细胞:XChASCT2，表达hASCT2受体的细胞克隆XC(ATCC CCL-165，大鼠细胞)。
DMEM培养基(Gibco Invitrogen 41966-029)，含有南美血清。
在1.5ml Eppendorf管中预温育、温育、标记。
2)步骤
1 将XChASCT1、XChASCT2细胞和对照细胞XChASCT(腹膜内)IP接种入SCID小鼠
将达到培养瓶的1/5的70％汇合以2ml体积注射入小鼠。
2 预温育
在细胞培养箱中，伴随着不时的搅拌(每隔15分钟)，可溶蛋白上清液(293T细胞系的过滤上清液)与单克隆抗体2H1H8(990μl上清液与10抗体(以1/100稀释))在37℃下温育1小时。
3 接种
单独的蛋白质或与所述抗体一起IP(腹膜内)接种入小鼠，该小鼠用细胞(每点1×106个细胞，即直径100mm的汇合培养皿的1/5)移植。
在抗体(200微升)注射后，在腹膜内维持6小时，伴随着不时的腹腔灌注(每30-60分钟)。
4 通过移植小鼠的腹腔灌洗回收细胞
-在+4℃下，以3000转离心5分钟。
-细胞沉淀的回收以及在标记培养基中稀释(在+4℃下维持，直到固定)。
5 标记
-一抗:
该沉淀被溶解在100μl的抗-RGS His抗体(100倍稀释-Quiagen)的PBA缓冲液(PBS，具有2％胎牛血清和0.1％叠氮钠)中，维持在+4℃。
在冰中1小时，伴随着不时的搅拌(每隔15分钟)。
在PBA缓冲液(每管1ml)中洗涤，维持在+4℃。
-二抗:
在+4℃下，以3000转离心5分钟。
沉淀被溶解在100μl的抗小鼠抗体-FITC(20倍稀释-DAKO，目录号F0479，在PBA缓冲液中)中，维持在+4℃。
在冰中1小时，伴随着不时的搅拌(每隔15分钟)。
在PBA缓冲液(每管1ml)中洗涤2次，维持在+4℃。
沉淀溶解在500μl PBA中，维持在+4℃，并通过FACS分析。
可选地，在-20℃下，在丙酮/甲醇(50％/50％)中于载玻片上固定并用伊文斯蓝复染之后，通过IF进行分析。
3)小鼠:
2只小鼠的组用下列接种:
在没有抗体的情况下，每一类型的细胞(表达2种类型的受体hASCT1和hASCT2，而不表达作为对照的受体hASCT的细胞)(3×2＝6只小鼠)；
具有Env蛋白和单克隆抗体2H1H8的所述三种类型的细胞(3×2＝6只小鼠)。
4)结果
利用显微镜的免疫荧光(IF)读数的结果示于下面的表3中:
表3
IF读数:同一视野下，荧光细胞数/总细胞数(NF/NT)
 
品系 NF/NT 均值
XC对照 1/18，0/10 1/28
XC+2H1H8 0/20 0/20
XChASCT1对照 12/40，3/12，9/25 24/77
XChASCT1+2H1H8 1/25，0/18，1/30 2/73
XChASCT2对照 8/22，15/35 23/57
XChASCT1+2H1H8 1/45 1/45
每一个数表示每一研究视野下发荧光而可见的细胞的数目。因为一些细胞可以非特异性方式具有嵌入荧光，所以在对照条件下出现荧光的细胞计数在两个计数的视野的一个中大于零(两个视野的平均值＝1/28，即0.036％，这对于这样的读数技术的背景噪音是完全合理的)。然后，将Env蛋白结合至它们的hASCT1或hASCT2受体的细胞的真实性通过细胞荧光光度术加以确认。
为了在统计上使表3所示的分析客观化，进行Chi-2检验，以比较在下述条件下获得的数据，根据所述条件，(i)与移植的对照细胞相比，Env蛋白质可以结合到存在于被移植到SCID小鼠中的细胞的表面上的受体hASCT1(对照hASCT1)或hASCT2(对照hASCT2)，所述移植的对照细胞不具有注射入相应的动物中的Env蛋白能够结合的受体(对照X)并且在抗Env抗体存在下不发出膜荧光；和(ii)与注射定向针对Env-SU的单克隆抗体相比，Env蛋白可结合到存在于被移植到SCID小鼠中的细胞的表面上的受体hASCT1(对照hASCT1)或hASCT2(对照hASCT2)。
统计分析的结果如下所示:
i)体内致病效应的特异性的统计确认:
对照hASCT1:平均计数77个细胞有24个阳性，
对照hASCT2:平均计数57个细胞有23个阳性，
hASCT-细胞:平均计数28个细胞有1个阳性。
Env+移植hASCT1对hASCT-:Chi-2＝8.62(p<0.01)
Env+移植hASCT2对hASCT-:Chi-2＝12.53(p<0.001)
Env+移植hASCT1对env+移植hASCT2:Chi-2＝1.21(差异不显著)。
在自身的表面上表达hASCT1或hASCT2受体的细胞因此实际是统计上等价的，并且在试验条件下在Env与亚型1或2相关的受体结合方面没有差异。
根据应用在自身的表面不表达受体hASCT1或hASCT2的任一种的细胞来移植的对照动物获得的结果，应用表达膜受体hASCT1或hASCT2的细胞来移植的动物得到的结果是统计上显著的。
这些结果确认了在动物模型中在Env蛋白存在的条件下体内获得的效应的特异性。
ii)所检测的抗体对体内致病效应的治疗活性的统计确认:
Env+移植对照hASCT1:平均计数77个细胞有24个阳性，
Env+移植hASCT1+单克隆抗体2H1H8:平均计数73个细胞有2个阳性。
Env+单独的移植hASCT1对注射抗体2H1H8:Chi-2＝21.14(p<0.001)
所得到的结果示出了单克隆抗体的统计上显著的效应(由于机会(p)小于0.001得到的结果概率)。
Env+移植hASCT2:平均计数57个细胞有23个阳性
Env+移植hASCT2+单克隆抗体2H1H8:平均计数45个细胞有1个阳性。
Env+单独的移植hASCT2对注射抗体2H1H8:Chi-2＝20.31(p<0.001)。
所得到的结果示出了单克隆抗体的统计上显著的效应(由于机会(p)全部小于0.001得到的结果概率)。
针对适合对照的动物模型的确认能够证明抗体通过显著抑制HERV-WEnv蛋白的致病效应而可以具有治疗活性。
实施例8:干扰群的序列比对
反转录病毒HERV-W(蛋白质序列数据库(swiss-prot)Q9UQF0)、RD114(蛋白质序列数据库Q98654)、REV(蛋白质序列数据库P31796)、BAEV(蛋白质序列数据库P10269)、SRV1(蛋白质序列数据库P04027)、SRV2(蛋白质序列数据库P51515)和MPMV(蛋白质序列数据库P07575)的被膜的蛋白序列在MacVector软件的帮助下，利用ClustalW程序，进行比对。信号肽、SU(表面单位)亚基和TM(跨膜)亚基被指出。受体结合位点加下划线。
序列表
Figure A200780004699E00352
Figure A200780004699E00361
Figure A200780004699E00371
Figure A200780004699E00381
Figure A200780004699E00391
Figure A200780004699E00401
Figure A200780004699E00411
Figure A200780004699E00421
Figure A200780004699E00431
Figure A200780004699E00451
Figure A200780004699E00461
Figure A200780004699E00471
Figure A200780004699E00481
Figure A200780004699E00491
Figure A200780004699E00501
Figure A200780004699E00511
Figure A200780004699E00521
Figure A200780004699E00541
Figure A200780004699E00551
Figure A200780004699E00561
Figure A200780004699E00571
Figure A200780004699E00581
Figure A200780004699E00591
Figure A200780004699E00601
Figure A200780004699E00611
Figure A200780004699E00621
Figure A200780004699E00631
Figure A200780004699E00641
Figure A200780004699E00651
Figure A200780004699E00661

Claims (17)

1.属于HERV-W干扰群的病毒的被膜和hASCT受体之间的相互作用所必需的肽结构域，其特征在于它开始于N端并结束于C端，并且在于:
所述N端由选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.29的基序进行定义，
所述C端由选自SEQ ID No.30至SEQ ID No.40的基序进行定义，
并且所述特征在于所述肽结构域在所述N端和所述C端之间包括至少一个选自SEQ ID No.41、SEQ ID No.42和SEQ ID No.73的基序。
2.核苷酸序列，其编码如权利要求1所述的肽结构域。
3.来源于如权利要求1所述的肽结构域的表位，其特征在于该表位诱导针对属于HERV-W干扰群的病毒的免疫应答。
4.核苷酸序列，其编码如权利要求3所述的表位。
5.表达载体，其特征在于它包括如权利要求2或4所述的核苷酸序列，以及所述表达载体进行表达所需的元件。
6.微生物或宿主细胞，其以如权利要求5所述的至少一种表达载体转化。
7.抗体，其定向针对如权利要求1所述的肽结构域或针对如权利要求3所述的表位。
8.至少一种如权利要求1所述的肽结构域或至少一种如权利要求3所述的表位或至少一种如权利要求7所述的抗体或至少一种如权利要求2或4所述的、处于所述肽结构域或表位的组成型和/或诱导型表达所必需的元件的调控之下的核苷酸序列在制备药物中的应用，所述药物用于抑制、预防或治疗在动物——优选人——体中由属于HERV-W干扰群的病毒引起的感染。
9.药物组合物，其包括作为活性物质的至少一种如权利要求1所述的肽结构域、至少一种如权利要求3所述的表位、或可选地至少一种如权利要求2或4所述的、处于所述肽结构域或表位的组成型和/或诱导型表达所必需的元件的调控之下的核苷酸序列、或可选地至少一种如权利要求7所述的抗体，与药学上适宜的载体的组合。
10.用于检测和/或量化属于HERV-W干扰群的病毒和/或量化针对属于HERV-W干扰群的病毒的免疫应答的诊断组合物，其包括至少一种如权利要求1所述的肽结构域、至少一种如权利要求3所述的表位、或至少一种如权利要求2或4所述的核苷酸序列、或至少一种如权利要求7所述的抗体。
11.检测和/或量化在生物样品中的属于HERV-W干扰群的病毒的方法，所述生物样品取自易于受所述病毒感染的个体，其特征在于该方法包括下列步骤:
-使所述生物样品与至少一种如权利要求7所述的抗体在使所述病毒和所述抗体之间能够形成复合物的条件下相接触，和
-通过任何合适的方式检测和/或量化所述复合物的形成。
12.如权利要求10所述的组合物在体外筛选生物样品或样本中的属于HERV-W干扰群的病毒中的应用。
13.如权利要求1所述的肽结构域或如权利要求3所述的表位或如权利要求7所述的抗体在抑制属于HERV-W干扰群的病毒的被膜和hASCT受体之间的相互作用中的应用。
14.如权利要求1所述的肽结构域在鉴定生物或化学分子中的应用，所述生物或化学分子与全部或部分所述肽结构域之间的相互作用阻断属于HERV-W干扰群的病毒的被膜和hASCT受体之间的相互作用。
15.如权利要求1所述的肽结构域在产生抗体中的应用，所述抗体阻断属于HERV-W干扰群的病毒的被膜和hASCT受体之间的相互作用。
16.确定属于HERV-W干扰群的病毒的被膜和hASCT受体之间的相互作用所必需的多肽区的方法，其特征在于:
■鉴定所述病毒的前体被膜的核苷酸和/或肽序列
■信号部分被排除在外
■检测丝氨酸-天冬氨酸-Xa-Xb-Xc-Xd-Xe-天冬氨酸-Xf-Xg基序，该基序对应于SEQ ID No.43
其中Xa、Xb、Xc、Xd、Xe、Xf、Xg是任何氨基酸
■在与SEQ ID No.43相对应的所述丝氨酸-天冬氨酸-Xa-Xb-Xc-Xd-Xe-天冬氨酸-Xf-Xg基序之后的15至25个之间的氨基酸的C端被排除在外。
17.肽结构域，其可通过如权利要求16所述的方法获得。
CN2007800046997A 2006-02-09 2007-02-09 HERV-W干扰群相关病毒的被膜和hASCT受体之间的相互作用所必需的肽结构域 Active CN101379079B (zh)

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