CN101376673A - 水稻脂肪合成相关基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术和植物学领域，公开了一种新的作物脂肪合成相关基因及其应用。本发明还公开了通过改变该基因表达水平或活性而改良作物中脂肪含量的方法。利用本发明的基因可改良水稻的外观和口感品质；并且，也可以利用该基因导入油料作物、薯类、玉米等作物，从而改变块茎或种子中的脂肪含量，如提高油菜种子中的脂肪(油)含量，增加出油率。

Description

水稻脂肪合成相关基因及其应用
技术领域
本发明属于基因技术和植物学领域。具体而言，本发明涉及新的水稻脂肪合成相关基因OsLFL1及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是重要的谷类作物，也是我国农业生产中最重要的粮食作物。稻米是中国人的主要口粮。在过去几十年中，我国遗传育种学家和农业专家们在水稻的增产上已经作出了很大的贡献。过去我国在育种工作中，由于常常以产量为首选目标，因此有相当一部分水稻品种的产量水平较高，但往往其内在品质如淀粉、蛋白和脂肪等营养物质的含量不平衡，食味品质如食口性差和油性较差等。由于随着人民生活水平的提高，人们对大米的品质、特别是食味和外观品质提出了新的更高的要求。稻米的营养品质和外观品质除了受环境因素、栽培技术、收获加工和烹调技术等的影响，其主要还是受品种内在基因的调控，因此培育出产量更高、食用品质更好的水稻新品种是遗传育种学家不断追求的目标。
近年研究结果表明，影响稻米品质的因素除了和直链淀粉含量以及蛋白含量有关外，很大程度上和稻米中脂肪含量有直接的关系。刘宜柏等研究表明，稻米脂肪含量高是一些名优水稻品种的特异品质性状，认为稻米脂肪含量较其它品质性状对稻米的食味有更重要的影响，在一定范围内，提高稻米脂肪含量能极显著地改善稻米食味品质。伍时照等研究结果表明，随品种米质级别的提高，脂肪含量增多，脂肪含量越高，米饭适口性和香气越好。祁祖自等认为油质鲜明是米质好坏的另一标志，通过将化学测定的脂肪含量与有经验的同志的官能鉴定的结果相比，基本是一致的，这逐渐成为鉴定稻米品质的一个有价值的参数。对于稻米的脂肪性状的遗传研究表明，其遗传方式在F2中脂肪表现为正态分布，但多数是偏低亲的，这一遗传动态展示了这一性状受多基因控制的性质，并预示了选择高脂肪含量的后代可能是较困难的。吴长明的工作也认为稻米脂肪含量是受多基因控制的数量性状(QTLs)。
然而，尽管近年来有多个控制脂肪含量的QTls位点被鉴定，但是还没有对应基因被成功克隆和功能研究的报道，更没有这些基因在生产上应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的水稻脂肪合成相关基因OsLFL1及其应用。所述基因可用于调节作物特别是粮食作物种子或块茎等组织中的脂肪含量，从而改善作物的口感或外观。
在本发明的第一方面，提供一种分离的OsLFL1蛋白，该蛋白选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽；或
(b)将SEQ ID NO：3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调节作物脂肪含量功能的由(a)衍生的多肽。
在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组：
(i)编码所述的OsLFL1蛋白的多核苷酸；或
(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，该多核苷酸编码含有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，该多核苷酸的上游还含有启动SEQ ID NO：3所示氨基酸编码基因表达的启动子区域。
在另一优选例中，该多核苷酸选自以下序列中的一种：
(a)具有SEQ ID NO：1第3916-8978位核苷酸序列；
(b)具有SEQ ID NO：2所示的序列；
(c)具有SEQ ID NO：2中第48-1256位核苷酸序列；
(d)具有SEQ ID NO：1中第3268-4428、5885-5926、6040-6126、6735-6838、8200-8282、8362-8978位核苷酸的序列。
在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。
另一方面，本发明还提供一种制备所述遗传工程化的宿主细胞的方法，所述方法包括步骤：将编码所述OsLFL1蛋白的多核苷酸或携带该多核苷酸的载体转化细胞。所述的细胞选自(但不限于)：细菌细胞、低等真核细胞、高等真核细胞。例如：大肠杆菌、链霉菌、农杆菌、酵母或植物细胞。
在本发明的第五方面，提供所述的OsLFL1蛋白或其编码基因的用途，用于改变作物组织、器官或细胞中脂肪含量。
在本发明的第六方面，提供一种改变作物中脂肪含量的方法，该方法包括调节所述作物中OsLFL1基因的表达或活性。
在本发明的第七方面，提供一种改良植物的方法，它包括步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的OsLFL1蛋白的编码序列；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述OsLFL1蛋白的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(3)选择出转入所述OsLFL1蛋白的编码序列的植物细胞或组织；
(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。
在本发明的第八方面，提供一种所述的OsLFL1或其编码基因的激动剂或拮抗剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1为在水稻突变体W378中T-DNA插入OsLFL1基因启动子区域的结构示意图。
图2显示突变体水稻中OsLFL1基因表达的RT-PCR检测。其中，L：Ladder，SP：穗，YL：幼嫩叶片，OL：老的叶片，IN：节间，ND：节，RT：根，zhll：野生型，W378：突变体，水稻RAC1基因作为内对照。
图3显示RNAi干扰转基因水稻中OsLFL1基因表达的RT-PCR检测(穗中OsLFL1基因表达检测，水稻RAC1基因作为内对照)。其中，1：野生型，2：突变体，3-7：不同株系的RNAi转基因水稻。
图4显示OsLFL1基因的启动子与GUS基因融合在水稻中的表达。其中，A：染色取样的水稻植株；B：小穗；C：花药；D和E：花粉；F-K：发育过程中的胚，由F-K依次是生长时间由短到长的胚(其中H是对G中胚的放大显示)；L：叶片；M-N：茎；O：根；P：愈伤；Q和S：萌发过程中的种子和小苗。其中箭头所指处为蓝色显示处。
图5显示了利用比较分析软件CLUSTALW 1.83分析OsLFL1蛋白的B3DNA结合结构域的结果。
图6显示了OsLFL1蛋白上DNA结合结构域和转录结构域的确定。其中，(a)为各缺失片段的构建情况；(b)为含各缺失片段的质粒酵母转化克隆的X-gal显色情况；(c)为含各缺失片段的质粒酵母转化克隆的相对β-半乳糖苷酶活性。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，通过T-DNA插入的方法首次从水稻突变体W378中克隆到一个未曾报道的基因，本发明人将之命名为OsLFL1基因。研究证实，调节或抑制OsLFL1基因的表达可调节作物种子中脂肪含量。OsLFL1基因可作为一个元件用于水稻的分子育种，以获得适当脂肪含量的水稻品种。此外，可以利用该基因导入油料作物、薯类、玉米等作物以改变块茎或种子中的脂肪含量，如提高油菜种子中的脂肪(油)含量，增加出油率。
在本发明人检测一个T-DNA插入的水稻群体时，发现一个单株出现脂肪含量比对照要高的突变体W378。利用近红外的方法测定该突变体W378水稻精米脂肪含量约为1.23％，而野生型对照水稻精米脂肪含量约为0.58％；利用索氏抽提的方法检测突变体W378水稻糙米脂肪含量为3.3％，野生型对照水稻糙米脂肪含量为2.7％。利用T-DNA标签的方法克隆了突变基因OsLFL1。利用半定量的RT-PCR对突变体中该突变基因OsLFL1的表达进行检测，发现该突变基因OsLFL1是在突变体W378中是发生过量表达的。进一步通过RNA干扰(RNAi)的方法，将该基因OsLFL1的RNAi干扰质粒利用农杆菌介导的方法导入到野生型水稻中，获得了若干转基因植株。检测这些转基因植株中OsLFL1基因的表达水平发现，部分转基因植株中OsLFL1基因的表达被成功下调。利用近红外的方法测定这些RNAi转基因水稻精米脂肪含量约为0.12-0.32％；利用索氏抽提的方法检测这些RNAi转基因水稻精米脂肪含量约为0.22-0.23％。因此，OsLFL1是一种与调节植物脂肪含量有关的基因。OsLFL1基因属于含B3DNA结合域转录因子基因家属，含有2个结构域：B3DNA结合域和转录激活域。水稻中Alignment(序列匹配)分析表明，B3DNA结合域比较保守，而转录激活结构域没有同源性。
如本文所用，所述的“作物”包括但不限于：禾本科植物、十字花科植物。更优选的，所述的禾本科植物包括但不限于：水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等；或所述十字花科植物包括但不限于：油菜。应理解，由于基因在不同植物中存在高度的保守性，尽管本文中以水稻作物作为研究对象，然而其它本身含有与OsLFL1基因同源的基因、且通过调节该基因也可发生部分组织(如种子或块茎)脂肪含量变化的植物也被包含在本发明中；另外，其它可通过导入OsLFL1而发生部分组织脂肪含量变化的植物也被包含在本发明中。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的OsLFL1蛋白或多肽”是指OsLFL1蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化OsLFL1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括OsLFL1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然OsLFL1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“OsLFL1蛋白”指具有OsLFL1蛋白活性的SEQ ID NO：3所示序列的多肽。该术语还包括具有与OsLFL1蛋白相同功能的、SEQ ID NO：3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括OsLFL1蛋白的活性片段和活性衍生物。
多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与OsLFL1蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗OsLFL1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其它多肽，如包含OsLFL1蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了OsLFL1蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有OsLFL1蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供OsLFL1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然OsLFL1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“OsLFL1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
 
氨基酸残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
 
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码本发明OsLFL1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：3的蛋白质，但与SEQ ID NO：2所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码OsLFL1蛋白的多聚核苷酸。
应理解，虽然本发明的OsLFL1基因优选得自水稻，但是得自其它植物的与水稻OsLFL1基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
本发明的OsLFL1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或OsLFL1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的OsLFL1蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码OsLFL1蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，OsLFL1蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含OsLFL1蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌；链霉菌属；农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞(尤其是非生殖植物细胞)等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得种子或块茎组织中脂肪含量发生改变的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的OsLFL1蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗OsLFL1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组OsLFL1蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激OsLFL1蛋白功能的多肽分子。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用OsLFL1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测OsLFL1蛋白的转录产物。
本发明还涉及一种改变水稻种子中脂肪含量的方法，该方法包括增加或减少所述植物中OsLFL1基因或其同源基因的表达。增加OsLFL1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过插入T-DNA序列或用强启动子驱动从而增强该OsLFL1基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该OsLFL1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。或通过RNA干扰(RNAi)的方法下调OsLFL1基因或其同源基因的表达。
减少OsLFL1基因或其同源基因表达的方法也是本领域周知的。例如，可通过RNA干扰(RNAi)或基因沉默(敲除)的技术来实现。
本发明还涉及一种改良植物的方法，它包括步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有OsLFL1蛋白DNA编码序列；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该OsLFL1蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入所述OsLFL1蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。可采用任何适当的手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。
测量作物种子或块茎中的脂肪含量的方法是本领域已知的。例如，本发明测量脂肪含量用到以下指标和手段：％(百分含量)，粗脂肪(克)占种子(克)的百分比；利用近红外的方法和索氏抽提的方法(GB/T 5512-1985)进行测量。
此外，本发明还涉及利用该基因OsLFL1导入油料植物、薯类、玉米等作物改变块茎或种子中的脂肪含量，如提高油菜种子中的脂肪(油)含量，增加出油率。
本发明还包括OsLFL1蛋白或其编码基因的拮抗剂或激动剂。由于OsLFL1的拮抗剂或激动剂可调节OsLFL1的活性或表达，因此，所述的OsLFL1的拮抗剂或激动剂也可通过对OsLFL1的影响来调节作物组织(如种子或块茎等)中脂肪含量等，从而达到性状改良的目的。
所述的OsLFL1的激动剂是指任何可提高OsLFL1的活性、维持OsLFL1的稳定性、促进OsLFL1表达、延长OsLFL1有效作用时间、或促进OsLFL1的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于提高作物组织中脂肪含量有用的物质。
所述的OsLFL1的拮抗剂是指任何可降低OsLFL1的活性、降低OsLFL1的稳定性、下调OsLFL1的表达、减少OsLFL1有效作用时间、或抑制OsLFL1的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于降低作物组织中脂肪含量有用的物质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验指南(第二版)(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)或植物分子生物学-实验手册(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
II.实施例
(A)材料与方法
本发明具体实施方式中使用到以下的材料和方法。但应理解，可采用这些方法的其它合适替换形式来实施本发明。本发明范围并不受到这些具体实施例的限制。
一.材料
本发明使用的是粳稻“中花11”(Oryza sativaL.subsp.Japonica CVZhonghua No.11)进行研究。但应理解，也可使用其它种类进行研究。
二.水稻叶片总DNA简易抽提法
1.取2cm长的水稻幼嫩叶片于1.5ml管中，加入200μl TPS抽提液，用1ml tip将叶片捣碎。
2.捣碎的叶片放入75℃水浴中温浴20min。
3.12000g×5min离心。
4.取120μl上清于0.5ml tube中加入120μl异丙醇室温5min，12000g×10min离心。
5.去上清，加入120μl-300μl 70％乙醇洗涤，12000g×5min离心。
6.去上清，干燥沉淀，加入30μl水(TE)溶解，PCR时取0.8-1.0μl(10μl PCR体系)做模板。
试剂：
TPS：100mM Tris-Cl(pH＝8.0)；
10mM EDTA(pH＝8.0)；
1M KCl。
三.TAIL-PCR
TAIL-PCR依照Liu等叙述的方法(见Plant Molecμlar Biology Reporter 16：175-181，1998)。T-DNA左端嵌套引物序列是：
T-DNA-1：CAAAATCCAGTACTAAAATCCAGA(SEQ ID NO：4)；
T-DNA-3：ATTCGGCGTTAATTCAGTACA(SEQ ID NO：5)；和
T-DNA-5：GTGTTATTAAGTTGTCTAAGC(SEQ ID NO：6)。
这三个引物分别与5个随机的简并引物AD1-AD5当中的一个配对组合进行PCR，扩增T-DNA左端的旁临序列。TAIL-PCR产物于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳进行分析。TAIL-PCR的产物直接送测序公司进行测序。
四.冻融法将质粒导入根癌农杆菌
1.根癌农杆菌YEB(Gibico)(无抗生素)固体平板挑单菌落。5ml YEB液体培养基28℃ 200rpm培养过夜。按1％接种量转入50ml YEB(500μl菌液加入)，28℃ 200rpm培养3-4小时至细菌对数期。
2.4℃ 5000g离心10min，沉淀用5ml预冷的TE(Ph7.5)洗涤一次，加入5ml YEB液体(含10～15％甘油)重新悬浮。分装成200μl一管，液氮速冻后，于-70度保存。
3.取200μl菌液+0.5-1.0ug质粒(<10μl)混匀，依次在冰上、液氮、37℃水浴各放置5min，用YEB稀释至1ml后，于28℃振摇培养2-4hr。
4.取200μl菌液涂布于含相应抗生素的YEB培养基平板上，28℃培养2-3天。
5.挑单菌落，重新在相应抗生素的YEB培养基平板上划单菌落两次。
五.水稻材料的培养
a.愈伤组织的诱导
取授粉后12-15天的水稻未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，于2％的NaClO溶液中(加2-3滴吐温20)消毒60分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和摄子挑出幼胚并接种于N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。
b.农杆菌的培养和悬浮
从YEB平板上挑取单菌落农杆菌接种到3ml含50mg/L硫酸卡那霉素(Km)的YEB液体培养基中于28℃振摇培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含Km 50mg/L的AB液体培养基中，200rpm继续振摇培养至OD600为0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于6000g 4℃离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。
c.感染和共培养
于6cm培养皿中将各种水稻受体材料浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。在转化材料转入前，事先在N6D2C培养基上铺一层无菌滤纸，并用少量新鲜AAM液体培养基湿润。共培养3天后，从共培养培养基上取出转化材料，用无菌滤纸吸干菌液和水分，然后转入选择培养基进行筛选培养。
d.愈伤组织的筛选、分化与移栽
预培养4天的幼胚与农杆菌共培养后，切去胚芽并转入选择培养基N6D2S1进行选择培养，2周后从幼胚盾片处长出的愈伤组织分成小块转到N6D2S2选择培养基上继续筛选2代(2周/代)，6周后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到再生培养基MSRCH上分化(12小时光照/天)；再生的小苗在1/2MSENH上生根壮苗，随后移入网室或人工气候室盆土栽培。
试剂：
各基础培养基大量盐份见表2(20×)。
表2(g/L)
 
AA MS N6
KH2PO4 3.4 3.4 8
KNO3 -- 38 56.6
(NH4)2SO4 -- -- 9.26
NH4NO3 -- 33 --
MgSO4·7H2O 7.4 7.4 3.7
*CaCl2·2H2O 8.8 8.8 3.32
KCl 58.8 -- --
*独立溶解后加入。
各基础培养基微量盐份见表3(100×)。
表3(mg/L)
 
AA MS N6
MnSO4.H2O 1690 1690 250
ZnSO4.7H2O 860 860 180
H3BO3 620 620 160
CuSO4.5H2O 2.5 2.5 --
Na2MoO4.2H2O 25 25 --
CoCl2.6H2O 2.5 2.5 --
KI 83 83 83
1.N6D2培养基
1)1X大量盐份；
2)1X微量盐份；
3)铁盐：FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；
4)维生素：甘氨酸2mg/L；维生素B1(VB1)1mg/L；维生素B6(VB6)0.5mg/L；烟酸0.5mg/L；肌醇100mg/L；
5)0.5g/L酪蛋白水解物(LH)，30g/L蔗糖，2mg/L 2，4-D，2.5g/L phytagel(Sigma公司)，pH5.8。
2.AB液体培养基
K2HPO4 3g/L；Na2H2PO4 1g/L；NH4Cl 1g/L；MgSO4·7H2O 300mg/L；KCl 150mg/L；CaCl2 10mg/L；FeSO4·7H2O 2.5mg/L；葡萄糖5g/L，pH7.0。
3.AAM液体培养基
1)1X AA大量盐分；1X AA微量盐分；
2)氨基酸：L-Gln 880mg/L；L-Asp 270mg/L；L-Arg 230mg/L；L-Gly 80mg/L；
3)维生素：甘氨酸2mg/L；维生素B1(VB1)1mg/L；维生素B6(VB6)0.5mg/L；烟酸0.5mg/L；肌醇100mg/L；
4)0.5g/L酪蛋白水解物(LH)，36g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，PH5.2。
4.N6D2C
N6D2，葡萄糖10g/L，乙酰丁香酮20mg/L(56℃加入)。
5.N6D2S1
N6D2，5mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，300mg/L头孢霉素。
6.N6D2S2
N6D2，50mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，300mg/L头孢霉素。
7.MSRCH
1)1X MS大量盐分，1X MS微量盐分；
2)铁盐：FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；
3)维生素：甘氨酸2mg/L；维生素B1(VB1)1mg/L；维生素B6(VB6)0.5mg/L；烟酸0.5mg/L；肌醇100mg/L；
4)6-苄基氨基嘌呤(6BA)2mg/L，荼乙酸(NAA)0.2mg/L，玉米素(Zeatin)05mg/L，激动素(KT)0.5mg/L；
5)蔗糖30g/L，50mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，PHYTAGEL(Sigma公司)2.5g/L，PH5.8。
8.1/2MSENH
1)1/2X MS大量盐分；1/2X MS微量盐分；
2)铁盐：FcSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；
3)维生素：甘氨酸2mg/L；维生素B1(VB1)1mg/L；维生素B6(VB6)0.5mg/L；烟酸0.5mg/L；肌醇100mg/L；
4)多效唑(MET)1mg/l；荼乙酸(NAA)0.5mg/l；
5)30g/L蔗糖，50mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，2.0g/L PHYTAGEL，PH5.8。
六.植物组织提取RNA
1.先将水稻幼苗在液氮中研磨成粉。将粉末分装到离心管中，每管分装100mg左右。每管加入1ml TRIZOL试剂(Invitrigen公司)，混匀，室温放置5min。加入氯仿200μl，用力振荡15sec，室温孵育2～3min。
2.4℃下离心(12000×g，15min)，混合物分为红色的酚-氯仿相(下相)、白色的中间相以及无色的上层水相。RNA在上层水相中。
3.转移上层水相(500μl)到一个新的Eppendorf管中，加入1ml无水乙醇，以沉淀RNA。
4.室温孵育10min以上，4℃条件下离心(12000×g，10min)，可见白色的RNA沉淀贴于管底壁。
5.吸弃上清，用70％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，4℃条件下离心(7500×g，5min)。
6.吸弃上清，空气中自然干燥，用DEPC水溶解沉淀，-70℃保存备用。用紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度，A260/A280>1.8。
七.RT-PCR
按照Promega厂商所建议的条件进行实验。
试剂：反转录试剂盒Reverse Transcription System(Cat.#A3500)(Promega厂商)，DNase(无RNase)(Promega厂商)，DEPC(华舜生物工程有限公司)。
八.5’RACE和3’RACE实验
试剂：RACE Kit(Cat.#3353621)(Roche厂商)，按照Roche厂商所建议的条件进行实验。
九.GUS染色
为了进一步验证OsLFL1基因的表达特征，构建了OsLFL1基因的启动子同GUS基因编码区融合的表达质粒。首先利用PCR扩增含第一内含子的OsLFL1基因启动子片断(含有第一内含子和部分编码序列)(基因序列SEQ ID NO：1中1692位到6084位)，引物序列为：
WP-1：5’-CC(KpnI)GGTACCCCCTTCTTTTCACAAGTCGACAC-3’(SEQ ID NO：18)；和WP-2：5’-CG(BamHI)GGATCCGCCGTAGTTCCTTTTGCAGAATTACT-3’(SEQ ID NO：19)。
由于PCR引物上有设计好的限制性内切酶切位点KpnI和BamHI，因此利用限制性内切酶KpnI和BamHI消化PCR片断，并将其导入到载体p1301POG(Clontech)上和GUS基因相连，构建成表达质粒OsLFL1P：：GUS。然后将该质粒导入农杆菌进行转基因植株制备。
试剂：
GUS染液：0.5mg/ml X-Gluc(Duchefa公司)，50mM KHPO4(pH 7)，0.5mMK3Fe(CN)6，0.5mM K4Fe(CN)6，20％(v/v)甲醇，0.1％(v/v)Triton-X100(华舜生物工程有限公司)。
步骤：
1.将水稻组织转入GUS染液中，500mmHg真空抽气。
2.37℃染色过夜。
3.95％乙醇脱色后观察。
十.近红外光谱测定水稻种子中脂肪含量的方法
利用近红外快速品质分析仪(FOSS，L520766，丹麦)采集待测样品的近红外吸收光谱。扫描谱区为1100-2500nm，1.8次全扫描/秒。测量前对仪器进行预热30min，然后进行样品的扫描。每个样品重复扫描3次，用配套软件中的对光谱图进行平均处理。
十一.脂肪含量的化学测定
稻米脂肪含量的测定采用Tecator索氏抽提法(GB/T 5512-1985)。
十二.RNAi干扰方法
利用PCR的方法扩增位于OsLFL1基因非保守区域的cDNA片断，基因序列SEQ ID NO：2中813位到1273位，引物为：
WDiB：5’-GG(BamHI)GGATCCACCCATGATCTTCAACTAGGAG-3’(SEQ ID NO：20)和
WDiSL：5’-TCG(SalI)GTCGACCCACTTCCCTGTCAGTCTCAC-3’(SEQ ID NO：21)；
WDis-1：5’-CG(SacI)GAGCTCACCCATGATCTTCAACTAGGAG-3’(SEQ ID NO：22)和
WDis-2：5’-CC(SacI)GAGCTCCCACTTCCCTGTCAGTCTCAC-3’(SEQ ID NO：23)。
根据PCR引物上预先设计的酶切位点利用限制性内切酶BamHI与SalI，和SacI，分别将该PCR片断以相反的方向克隆到RNAi载体p1300UGN(Zhu Y等，J.Biol.Chem.278(2003)47803-47811)上GUS基因(作为发卡结构的颈环)的两侧。构建成OsLFL1-RNAi双链RNA干扰质粒。然后将该质粒导入农杆菌进行转基因植株制备。
此外，Southern杂交和植物总DNA提取方法(CTAB)等其它方法均按照《分子克隆实验指南》(Sambrook等人，第二版，New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1995)中所描述的进行。
(B)具体实施例
实施例1 OsLFL1突变体植株的获得
T-DNA标签分离基因仍然是植物功能基因研究的最重要手段之一。T-DNA(transfer DNA)是位于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti(tumor inducing)质粒或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri(root inducing)质粒上的一段DNA，它可以从农杆菌中转移并稳定地整合到植物染色体上，因此可作为一类外源基因载体，将外源DNA转移到植物细胞，并再生出能够表达外源基因的转基因植物；也可能使插入位点基因的表达受到影响，从而产生可筛选的突变表型，由于T-DNA序列已知，一旦遗传分析确定突变表型与插入的标签连锁，即可通过IPCR或TAIL-PCR方法获得标签两端的侧翼序列，然后将侧翼序列与基因组序列相比较获得突变基因的信息。由于农杆菌转化异源宿主单子叶植物水稻非常有效，利用T-DNA建立各类突变体库是目前了解水稻整个功能基因组最广泛采用的方法。在本发明人构建的T-DNA转化群体中，发现一个种子中脂肪含量比对照提高的突变体。利用近红外的方法测定该突变体W378水稻精米脂肪含量约为1.23％，而野生型对照水稻精米脂肪含量约为0.58％；利用索氏抽提的方法检测突变体W378水稻糙米脂肪含量约为3.3％，野生型对照水稻糙米脂肪含量约为2.7％。
分别用限制性内切酶EcoRI，HindIII和PstI酶切突变体W378的基因组总DNA，Southern Blot分析T-DNA插入的拷贝数实验表明，T-DNA为单拷贝插入。本发明人利用T-DNA标签法分离了该调控水稻脂肪合成相关的基因。
实施例2 OsLFL1基因的克隆
用Tail-PCR分离T-DNA插入位点的旁邻序列表明，T-DNA插入在水稻第1染色体上，并且位于OsLFL1基因位点的启动子区域，离起始密码子ATG有186bp。见图1。
以这个旁邻序列分析出T-DNA插入的水稻染色体位点。根据比对分析从水稻BAC克隆B1142C05(来源于国际水稻基因组测序计划研究组织)获得该基因的全长序列，为SEQ ID NO：1。利用水稻抽提的总RNA，以5’和3’RACE(末端快速扩增的方法)分离出OsLFL1基因的mRNA片段并测序，整合出OsLFL1基因的编码序列SEQ ID NO：2。根据水稻通用密码子编码规律，及OsLFL1基因的编码序列SEQ ID NO：2推导出OsLFL1蛋白的序列。
实施例3 OsLFL1基因的序列分析
利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网页中“Align two sequences(bl2seq)”和“Protein-protein BLAST(blastp)”分析工具对OsLFL1基因的序列进行分析。分析结果如下：
SEQ ID NO：1显示，OsLFL1基因组序列中，1-3915区域为启动子，3916-3918位为起始密码子ATG，8734-8736位为终止密码子TAG，3268-4428、5885-5926、6040-6126、6735-6838、8200-8282、8362-8978为外显子，4429-5884、5927-6039、6127-6734、6839-8199、8283-8361为内含子。
SEQ ID NO：2显示，OsLFL1基因mRNA的编码序列中第48-50位为起始密码子ATG，1254-1256位为终止密码子TAG。
SEQ ID NO：3中，OsLFL1蛋白质编码序列中177-296位为B3DNA结合结构域，296-402位为转录激活结构域。
实施例4 OsLFL1基因的功能验证
1.RT-PCR
OsLFL1基因表达的RT-PCR分析结果表明：突变体W378中OsLFL1基因的表达比对照中花11强，见图1和图2。
2.GUS染色
OsLFL1基因的启动子与GUS基因融合在中花11中的表达实验表明：OsLFL1基因主要在花粉和幼嫩的胚中有表达，见图4。
3.RNA干扰
利用RNA干扰的方法下调中花11野生型中OsLFL1基因的表达，可使得转基因植物中OsLFL1表达明显下降，见图3。
脂肪测定显示，RNA干扰沉默OsLFL1基因后，利用近红外的方法测定这些RNAi转基因水稻的精米脂肪含量约为0.12-0.32％(野生型为0.58％)；利用索氏抽提的方法检测这些RNAi转基因水稻的糙米脂肪含量约为2.2-2.6％(野生型为2.7％)。
上述实验都说明本发明人分离的OsLFL1基因能够控制水稻种子中脂肪合成过程。因此，OsLFL1基因的过量表达导致水稻种子中脂肪含量提高而通过RNAi下调OsLFL1基因的表达导致水稻种子中脂肪含量降低。
采用常规的基因技术，如将SEQ ID NO：3所示的OsLFL1氨基酸序列的第13位Leu改为Ile，构成OsLFL1蛋白变异体(OsLFL1-M)。如前所述类似的方法，利用农杆菌制备转入了OsLFL1-M基因且能够高表达OsLFL1-M的转基因植物(水稻)，其种子的脂肪含量可显著提高。
实施例5 DNA结合结构域和转录结构域的确定
根据全长OsLFL1蛋白序列和已知B3DNA结合结构域的B3蛋白如ABI3、LEC2和FUS3等，利用本领域技术人员熟悉的比较分析软件(CLUSTALW1.83)，OsLFL1蛋白的B3DNA结合结构域位于SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的第177位到296位，见图5。
为了验证B3转录因子OsLFL1是否具有转录激活功能，本发明人利用DupLEX-ATM酵母双杂交系统中的部分质粒载体来进行激活功能实验(酵母单杂交)。PCR扩增(a片断，引物为，WEX-1B：5’-GC(BamHI)GGATCCCGATGCGGGGGGAGGAGAGATG-3’(SEQ ID NO：7)和WEX-7：5’-GCG(XhoI)CTCGAGTCACATGTGAGGCCCAGACTTTG-3’(SEQ ID NO：8))获得OsLFL1基因全长编码片断。根据PCR引物上有预先设计的酶切位点BamHI和XhoI，将PCR片断以翻译融合导入到效应(Effector)质粒载体pEG202(HIS3，2um，Apr，ADH构成性启动子，LexA DNA结合区域)(DupLEX-ATM system)(OriGene Technologies，Rockville，MD)多克隆位点上，获得的质粒WEX-1B/7-pEG202。该质粒翻译产生的融合蛋白含有OsLFL1全长序列、LexA DNA结合域和SV40核定位序列，它能通过LexA DNA结合域结合在报告质粒pSH18-34(Clontech公司产品)(URA3，2μm，Apr，LexAops-lacZ)的LacZ mini启动子区域，如果外源的OsLFL1蛋白具有转录激活能力，那么可以激活lacZ基因的表达，从而产生β-半乳糖苷酶催化底物X-gal，使得酵母转化子显蓝色。本发明人将饵质粒WEX-1B/7-pEG202和报告质粒pSH18-34共同转化到酵母EGY48(MATσtrpl his3 ura3leu2：：LexAop-LEU2；Clontech公司产品)的感受态细胞中。获得的酵母转化子在添加X-gal的缺陷二种氨基酸(-His-Ura)的SD培养基上显较强的蓝色。这说明表明OsLFL1转录因子全长蛋白具有较强的转录激活能力。为了确定OsLFL1转录因子的转录激活区域，进一步对该OsLFL1蛋白的各区段进行缺失分析(PCR扩增片断的方法)。扩增不同位置的缺失片断的PGR引物见表3。
表3
Figure A200710045352D00241
缺失片断的融合表达效应质粒的构建和酵母单杂交实验同前，对所获得的酵母转化子不仅进行定性的显色分析，还利用ONPG底物对其β-半乳糖苷酶的相对活性进行定量测定。
实验结果表明，OsLFL1蛋白C端296aa-402aa区段(e片断)具有较强的转录激活能力，提示其是转录激活区域，见图6。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
                                序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>水稻脂肪合成相关基因及其应用
<130>074113
<160>23
<170>PatentIn version 3.3
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Claims (10)

1.一种分离的OsLFL1蛋白，其特征在于，该蛋白选自下组：
(a)具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调节作物脂肪含量功能的由(a)衍生的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组：
(i)编码权利要求1所述的OsLFL1蛋白的多核苷酸；或
(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码含有SEQID NO:3所示氨基酸序列的多肽。
4.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自以下序列中的一种：
(a)具有SEQ ID NO:1第3916-8978位核苷酸序列；
(b)具有SEQ ID NO:2所示的序列；
(c)具有SEQ ID NO:2中第48-1256位核苷酸序列；
(d)具有SEQ ID NO:1中第3268-4428、5885-5926、6040-6126、6735-6838、8200-8282、8362-8978位核苷酸的序列。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
7.权利要求1所述的OsLFL1蛋白或其编码基因的用途，其特征在于，用于改变作物组织、器官或细胞中脂肪含量。
8.一种改变作物中脂肪含量的方法，其特征在于，该方法包括调节所述作物中OsLFL1基因的表达或活性。
9.一种改良植物的方法，其特征在于，它包括步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求1所述的OsLFL1蛋白的编码序列；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述OsLFL1蛋白的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(3)选择出转入所述OsLFL1蛋白的编码序列的植物细胞或组织；
(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。
10.一种权利要求1所述的OsLFL1或其编码基因的激动剂或拮抗剂。
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