CN101368968B - 早期糖尿病周围神经病变的检测芯片及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
一种早期糖尿病周围神经病变的检测芯片，包括基片、反应池和检测微阵列，基片是上表面沉积有琼脂糖凝胶薄膜的玻片，琼脂糖凝胶薄膜的表面设置有反应池，反应池由中空正方形的硅橡胶框围成，反应池的池面上点有检测微阵列，检测微阵列的尺寸为5行×m列，其中m是介于3～7的自然数，每一行的所有蛋白微型固相检测点的成分都相同，5行蛋白微型固相检测微阵列点分别是HIgG蛋白微型固相检测点、Mc抗COPE蛋白微型固相检测点、Mc抗DEFA1蛋白微型固相检测点、Mc抗NOTCH1蛋白微型固相检测点和Mc抗BCL-6蛋白微型固相检测点。还提供制备所述检测芯片的方法。所述检测芯片特别适于用来检测早期糖尿病周围神经病变。
Description
技术领域
本发明涉及一种早期糖尿病周围神经病变的检测芯片及其制备和应用，属医疗器械分子诊断的技术领域。
背景技术
随着经济的发展和人们生活方式的改变，以及人口老龄化，糖尿病患者的数量迅速增加。糖尿病周围神经病变是糖尿病致残、致死的主要原因，其诊断目前主要通过临床表现计分，并结合电生理检查技术来明确，但上述现有方法操作复杂，检查准确性受患者配合度的限制，且对早期周围神经病变的敏感度均较差，难以成为有效的筛查手段，不能提供适应目前糖尿病周围神经病变患者所需要的早期准确诊断的高通量标准化检测。
血清蛋白质水平改变常出现于疾病病理及功能改变的更早期，具有成为预警和早期诊断指标的潜力。目前，对于血清中特异性蛋白的检测主要依赖于ELISA技术，费用昂贵，而且需要较大量的标本和试剂，限制了其在大规模筛选中的应用。蛋白芯片技术将各种蛋白质有序地固定于载体上成为检测用的芯片，集微电子、微机械、化学物理技术、计算机技术为一体，可同时对多种蛋白质进行检测分析，逐步发展成为临床诊断等领域的重要技术手段。
但是，蛋白芯片的制备与分析也同时面临着更多的挑战。首先，受血清蛋白质浓度限制，检测灵敏度难于达到应用研究中的要求；其次，蛋白质本身复杂的分子结构与各向异向性，为蛋白质在芯片上的有效固定增添了难度；此外，多个分析物的同时分析也为发展新的分析模式提出了要求。
本发明利用质谱技术鉴定出的糖尿病周围神经病变患者外周血清中具有临床诊断意义的标志性蛋白COPE、DEFA1、NOTCH1和BCL-6，构建了一种用于临床诊断糖尿病周围神经病变的检测芯片，通过优化试验条件实现了有效固定待测蛋白质抗体于基片，质量控制稳定，数据分析标准化，检测结果可信度高的要求，为糖尿病周围神经病变提供了一种非侵入性，敏感度和特异性均较好的筛检手段，以解决现有糖尿病周围神经病变不易早期确诊和检测成本高的问题。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种早期糖尿病周围神经病变的检测芯片。该检测芯片包括基片1、反应池2和检测微阵列3，其特征在于，基片1是上表面沉积有琼脂糖凝胶薄膜10的玻片11，琼脂糖凝胶薄膜的表面设置有反应池2，反应池2由中空正方形的硅橡胶框4围成，反应池2的个数为n，n介于1～12，硅橡胶框4的边长介于0.2mm～10mm，每个反应池2的池面上点有检测微阵列3，检测微阵列3是由蛋白微型固相检测点排列而成的5行×m列的矩形阵列，其中m是介于3～7的自然数，每一行的所有蛋白微型固相检测点的成分都相同，5行蛋白微型固相检测微阵列点分别是HIgG蛋白微型固相检测点30、Mc抗COPE蛋白微型固相检测点31、Mc抗DEFA1蛋白微型固相检测点32、Mc抗NOTCH1蛋白微型固相检测点33和Mc抗BCL-6蛋白微型固相检测点34。
本发明的第二个目的是提供所述检测芯片的制备方法。
实现上述目的，本发明采用以下技术方案，现详细说明如下。
一种早期糖尿病周围神经病变的检测芯片的制备方法，其特征在于，以HIgG、Mc抗COPE、Mc抗DEFA1、Mc抗NOTCH1和Mc抗BCL-6为原料，具体操作步骤：
第一步制备基片1
将1.0wt％～2.0wt％琼脂糖溶液30ml与10nmol/L NaIO4溶液10ml混合，搅拌均匀，得到混和液40ml，备用，用传统方法洗涤玻片11并晾干，用胶框将1.0ml～4.0ml混和液封闭在玻片11上，室温冷却，氮气吹干，琼脂糖凝胶薄膜10沉积于玻片11的表面，制得基片1；
第二步制备五种不同蛋白的溶液
用BPS分别稀释五种蛋白：HIgG、Mc抗COPE、Mc抗DEFA1、Mc抗NOTCH1和Mc抗BCL-6至它们的浓度介于10μg/ml～200μg/ml，得五种不同蛋白的溶液；
第三步制备检测微阵列3
用点样仪或点样针将第二步制得的蛋白溶液的液滴点在基片1的表面上，每行用一种抗体溶液点出m个液滴作为m个微型检测点，m是介于3～7的自然数，第一行用五种蛋白溶液中的一种，第二行用剩余四种蛋白溶液中的一种，余类推，点完五行后，在基片1的表面上形成一个由5×m个微型检测点组成的矩形阵列，将基片1放入湿盒中，室温孵育过夜，PBS洗涤2次，以BSA封闭未反应的醛基，制得检测微阵列3；
第四步制备反应池2
用透明黏合剂将边长介于0.2mm～10mm的中空正方形的硅橡胶框4以第三步制得的检测微阵列3正好落在其中空部分中的方式黏贴在基片1的琼脂糖凝胶薄膜10上，形成反应池2，至此制得早期糖尿病周围神经病变的检测芯片。
用上法制得的早期糖尿病周围神经病变的检测芯片是n＝1的检测芯片。n是反应池2的个数，n介于1～12，当n>1时，只需重复n—1次上法的第三～第四步，得反应池2的个数为n的早期糖尿病周围神经病变的检测芯片。
本发明的第三个目的是提供使用上述检测芯片检测早期糖尿病周围神经病变的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。现详细说明如下。
一种用上述检测芯片检测早期糖尿病周围神经病变的方法，其特征在于，具体操作步骤：
第一步检测芯片预处理
检测芯片在室温放置5min～15min，在反应池2中加入10μl～100μl PBS，37℃水浴15min～30min，加入50μl浓度为3wt％的H2O2，室温下封闭10min，PBS冲洗2次，加入50μl浓度为1wt％的BSA，室温下封闭10min～20min；
第二步标记抗体
以1×PBS280μl、灭菌甘油400μl～600μl、40wt％的海藻糖100μl和Cy3-BSA20μl配制标记缓冲液，稀释并标记Mc抗HIgG、Mc抗COPE、Mc抗DEFA1、Mc抗NOTCH1和Mc抗BCL-6浓度达0.5g/L～2g/L；
第三步加待检血清标本
将待检血清标本以1:3～7倍用PBS缓冲液稀释，加入反应池2中，37℃下孵育20min～1h，PBS洗涤基片1；
第五步激光扫描及数据分析处理
使用LuxScan10K-A扫描仪和GenePixTMPro3.0芯片图像分析软件测定各点的荧光强度，用Excel软件进行数据分析，至此实现对样品的检测。
与现有技术比较，本发明具有下述特点：
1、以质谱技术为基础，利用蛋白芯片技术，通过检测血清中糖尿病周围神经病变相关蛋白的存在与含量，为其早期诊断提供依据，具有重要临床应用价值。
2、检测方法简便，成本低廉
以血清为待检样品，需要样品量少，一张芯片可检测数位至数十位患者的血清，适合人群筛查使用。
3、信息通量高，特异性强、灵敏度高
每次检测可提供一份血清中四种糖尿病周围神经病变差异性表达蛋白的相关信息，使糖尿病周围神经病变的诊断符合率由原来的50％(传统体格检查方法)提高到接近80％。
4、稳定的质量控制，检测结果准确可靠
高度纯化单克隆抗体蛋白保证了芯片抗体质量的稳定，同时每个反应池有独立的质控微阵列，检测结果以智能化分析软件判定，减少导致了检测误差的因素。
附图说明
图1是本发明的检测芯片示意图，图中，1是基片，2是反应池，3是检测微阵列，4是硅橡胶框，A-A处有纵向截面。
图2是图1所示的本发明的检测芯片在A-A处的纵向截面图，图中，10是琼脂糖凝胶薄膜，11是玻片。
图3是检测微阵列3的结构示意图，图中，30是HIgG蛋白微型固相检测点，31是COPE蛋白微型固相检测点，32是DEFA1蛋白微型固相检测点、33是NOTCH1蛋白微型固相检测点，34是BCL-6蛋白微型固相检测点。
具体实施方法
现结合附图和实施例，详细说明本发明的技术方案。
实施例1—3完全按照上述的检测芯片制备方法所述的具体操作步骤进行操作，以下每个实施例仅列举关键技术数据。
实施例1
第一步中，琼脂糖溶液的浓度为1.0wt％，封闭在玻片11上的混和液为1.0ml；第二步中，用BPS稀释HIgG、Mc抗COPE、Mc抗DEFA1、Mc抗NOTCH1和Mc抗BCL-6至浓度为10μg/ml；第三步中，m＝3第四步中，硅橡胶框4的边长为0.2mm。
实施例2
第一步中，琼脂糖溶液的浓度为1.5wt％，封闭在玻片11上的混和液为2.5ml；第二步中，用BPS稀释HIgG、Mc抗COPE、Mc抗DEFA1、Mc抗NOTCH1和Mc抗BCL-6至浓度为100μg/ml；第三步中，m＝5；第四步中，硅橡胶框4的边长为5mm。
实施例3
第一步中，琼脂糖溶液的浓度为2.0wt％，封闭在玻片11上的混和液为4.0ml；第二步中，用BPS稀释HIgG、Mc抗COPE、Mc抗DEFA1、Mc抗NOTCH1和Mc抗BCL-6至浓度为200μg/ml；第三步中，m＝7；第四步中，硅橡胶框4的边长为10mm。
实施例4用检测芯片检测早期糖尿病周围神经病变
本实施例的实施过程与上述用检测芯片检测早期糖尿病周围神经病变的技术方案的描述完全一致，本实施例仅列举关键的技术数据。
第一步中，检测芯片室温放置15min，在每个反应池2中加入10μlPBS，37℃水浴30min，加入1.0wt％BSA50μl，室温下封闭20min；第二步中，以1×PBS280μl、灭菌甘油600μl、40wt％的海藻糖100μl和Cy3-BSA20μl配制标记缓冲液，稀释并标记Mc抗HIgG浓度达1g/L；第三步中，将待检血清标本以1:7倍用PBS缓冲液稀释，加人反应池2中，37℃下孵育1h；第四步中，在反应池2中加标记的Mc抗HIgG40μl，37℃下孵育1h，加甘油与2.0wt％PBS1:1混和制剂封片；第五步中，使用LuxScan10K-A扫描仪扫描Cy3通道，调整扫描参数Power至95，PMT至900，曝光时间为335.5s，用GenePixTMPro3.0芯片图像分析软件测定各点的荧光强度，用Excel软件进行数据分析，至此实现对样品的检测。
Claims (3)
1.一种早期糖尿病周围神经病变的检测芯片，包括基片(1)、反应池(2)和检测微阵列(3)，其特征在于，基片(1)是上表面沉积有琼脂糖凝胶薄膜(10)的玻片(11)，琼脂糖凝胶薄膜(10)的表面设置有反应池(2)，反应池(2)由中空正方形的硅橡胶框(4)围成，反应池(2)的个数为n，n介于1～12，硅橡胶框(4)的边长介于0.2mm～10mm，每个反应池(2)的池面上点有检测微阵列(3)，检测微阵列(3)是由蛋白微型固相检测点排列而成的5行×m列的矩形阵列，其中m是介于3～7的自然数，每一行的所有蛋白微型固相检测点的成分都相同，5行蛋白微型固相检测微阵列点分别是HIgG蛋白微型固相检测点(30)、Mc抗COPE蛋白微型固相检测点(31)、Mc抗DEFA1蛋白微型固相检测点(32)、Mc抗NOTCH1蛋白微型固相检测点(33)和Mc抗BCL-6蛋白微型固相检测点(34)。
2.一种早期糖尿病周围神经病变的检测芯片的制备方法，其特征在于，以HIgG、Mc抗COPE、Mc抗DEFA1、Mc抗NOTCH1和Mc抗BCL-6为原料，具体操作步骤：
第一步制备基片(1)
将1.0wt％～2.0wt％琼脂糖溶液30ml与10nmol/L NaIO4溶液10ml混合，搅拌均匀，得到混和液40ml，备用，用传统方法洗涤玻片(11)并晾干，用胶框将1.0ml～4.0ml混和液封闭在玻片(11)上，室温冷却，氮气吹干，琼脂糖凝胶薄膜(10)沉积于玻片(11)的表面，制得基片(1)；
第二步制备五种不同蛋白的溶液
用PBS分别稀释五种蛋白HIgG、Mc抗COPE、Mc抗DEFA1、Mc抗NOTCH1和Mc抗BCL-6至它们的浓度介于10μg/ml～200μg/ml，得五种不同蛋白溶液；
第三步制备检测微阵列(3)
用点样仪或点样针将第二步制得的抗体溶液的液滴点在基片(1)的表面上，每行用一种抗体溶液点出m个液滴作为m个微型检测点，m是介于3～7的自然数，第一行用五种抗体溶液中的一种，第二行用剩余四种抗体溶液中的一种，余类推，点完五行后，在基片(1)的表面上形成一个由5×m个微型检测点组成的矩形阵列，将基片(1)放入湿盒中，室温孵育过夜，PBS洗涤2次，以BSA封闭未反应的醛基，制得检测微阵列(3)；
第四步制备反应池(2)
用透明黏合剂将边长介于0.2mm～10mm的中空正方形的硅橡胶框(4)以第三步制得的检测微阵列(3)正好落在其中空部分中的方式黏贴在基片(1)的琼脂糖凝胶薄膜(10)上，形成反应池(2)，至此制得早期糖尿病周围神经病变的检测芯片。
3.根据权利要求2所述的早期糖尿病周围神经病变的检测芯片的制备方法，其特征在于，n是反应池(2)的个数，n介于1～12，当n＞1时，只需重复n-1次权利要求2所述的方法的第三～第四步，得反应池(2)的个数为n的早期糖尿病周围神经病变的检测芯片。
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| 刘志红 等.琼脂糖凝胶蛋白芯片片基的制备及应用.《分析化学》.2007,第35卷(第5期),775-778. * |
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