CN101367801A - 吡咯并六元n杂环羟基吗啡啉类衍生物的制备方法及其在医药上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通式(I)所示新的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物或其盐、其制备方法及含有它们的药物组合物和它们作为治疗剂特别是作为蛋白激酶抑制剂的用途，其中通式(I)中的各取代基同说明书中的定义相同。

Description

吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物的制备方法及其在医药上的应用
技术领域
本发明涉及一类新的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物，特别是结构新颖的2(2-氧代吲哚啉-3-亚基)甲基-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-6，7-二氢-1H-吡咯[3，2-c]吡啶-4(5H)-酮衍生物，其制备方法及含有该衍生物的药物组合物以及其作为治疗剂特别是作为蛋白激酶抑制剂的用途。
背景技术
细胞的信号传导是一种基础的作用机制，在信号传导过程中，来自细胞外的刺激被传递到细胞内部，进而调节不同细胞的进程。这些信号可调节多种生理响应，包括细胞增殖、分化、调亡和运动等，它们以不同种类溶解因子形式存在，包括以旁分泌因子、自分泌因子和内分泌因子为主的生长因子。通过与特定跨膜受体结合，生长因子配体将细胞外信号传递到细胞内信号途径，从而引起个体细胞对细胞外信号的反应。很多信号传递过程是利用蛋白磷酸化的可逆过程，涉及到特定蛋白激酶和磷酰化酶。
蛋白激酶(Protein kinases，PKs)在信号传导过程中具有非常重要的作用。它能将ATP的γ-磷酸基转移到功能蛋白的特定氨基酸残基上，引发一系列生物反应。按照在磷酸化过程中作为底物的氨基酸类别，蛋白激酶可分为丝氨酸-苏氨酸激酶(STKs)和酪氨酸激酶(PTKs)。
酪氨酸磷酸化机理普遍存在于信号传导过程中，调控着诸如有丝分裂、细胞周期进程和分化等多种细胞功能(Hanks and Hunter，1995，FASEB J.9：576-596；Cadena and Gill，1992，FASEB J.6：2332-2337；Schlessinger and Ullrich，1992，Neuron 9：383-391；Vandergeer et al.，1994，Annu.Rev.Cell Biol.10：251-337)。当蛋白酪氨酸激酶在变异、失控的情况下表达，或在不正常的高水平下表达时，可以将正常细胞转变为肿瘤显型(neoplastic phenotype)(Chiao etal.，1994，Cancer Metast.Rev.9：63-80；Hunter，1991，Cell64：249-270)。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是主要作用于血管内皮细胞的生长因子，具有促进内皮细胞增殖、增加微血管通透性、诱导血管生成等多种功能(Hanks and Hunter，1995，FASEB J.9：576-596)。VEGF是目前所知最有效的、直接作用的血管生成素蛋白(angiogenic protein)，是一种可扩散的内皮细胞特异性有丝分裂素和血管生长因子(Ferrara N et al.，EndocrRev，1997，18，4-25；Tofimura T et al.，Hum Pharthol，1998，29，986-991)。目前所知VEGF家族包括6个成员：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生成因子(PDF)，均为二聚体糖蛋白形式，且均含有规则的8个胱氨酸残基的空间构型，具特异性，被认为是“胱氨酸结”(cysteine knot)。李凌等(李凌等.生物化学与生物物理学报，2002，34(1)，21-27)发现恶性肿瘤细胞高水平表达VEGF，并且还发现肿瘤细胞也高水平表达Flk-1，提示肿瘤局部存在VEGF自分泌与旁分泌通路。VEGF的表达与一些实体瘤的微血管密度具有相关性，并且组织中VEGF的浓度与某些实体瘤的预后有关，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌和结肠癌。已知缺氧是刺激VEGF产生的重要因素，在肿瘤细胞中缺氧诱导VEGF基因表达不光是基因转录率的提高，还有VEGF mRNA稳定性的增强。VEGFR家族已明确有VEGFR-1/Fit-1、VEGFR-2/Flk-1/KDR和VEGFR-4/FIt-4 3种，VEGFR-1和VEGFR-2为细胞表面酪氨酸激酶受体，主要位于肿瘤血管内皮细胞表面。血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)及血管内皮生长因子受体(vascularendothelial growth factor receptor，VEGFR)在肿瘤新生血管形成过程中起着重要作用成为抗肿瘤生物治疗的一个重要靶点。
目前以VEGF和VEGFR为靶点的肿瘤治疗主要有以下五种：1.基因治疗(Ellis LMet al.J Biol Chem 1998，273，1052-1057)：VEGF和VEGFR对于肿瘤血管新生起正调节作用。通过基因治疗，使VEGF和VEGFR表达减少，或阻断其信号转导通路，从而抑制二者发挥生物学活性。2.抗VEGF/VEGFR单克隆抗体(Gordon M et al.ProcAm Soc Clin Oneol，I998，I7，2IIa)：应用VEGF及VEGFR的单克隆抗体，可封闭已分泌的VEGF及VEGFR，阻止VEGF诱发的内皮信号转导，抑制血管的形成。3.小分子抑制物：由sugen公司开发研制的su系列化合物。4.可溶性VEGFR：可溶VEGFR仅具有与VEGF结合能力，却无信号转导功能。5.导向治疗：VEGF的两个主要受体Fit—1和Flk—1/KDR在肿瘤血管内皮细胞中过度表达，而VEGFR在相邻正常组织血管内皮中几乎不能检出。因此，VEGF和VEGFR为肿瘤的导向治疗提供了特异性较高的靶点，VEGF可与其他抗肿瘤药物、毒素、放射性核素等联用，用于肿瘤的导向治疗。
本发明的目的在于在酪氨酸激酶抑制剂SU-14813以及具有抗肿瘤效果的吡咯并六元N杂环A衍生物的基础上，设计了具有通式(I)所示的类似物。本发明的化合物同现有技术中具体公开的化合物具有较大的结构差异，且表现出优良的使用效果和作用。
发明内容
本发明的目的在于提供通式(I)的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物，即新型酪氨酸激酶抑制剂2(2-氧代吲哚啉-3-亚基)甲基-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-6，7-二氢-1H-吡咯[3，2-c]吡啶-4(5H)-酮类化合物以及它们的互变异构体、对映体、生理上可以接受的盐、代谢产物和代谢前体或者前药，以及它们调节蛋白激酶的活性。
其中：
R1、R2、R3、R4分别选自氢原子、卤素、烷基、芳基、杂芳基、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5或-NR5COR6，其中芳基、杂芳基、可以进一步被一个或多个烷基、烷氧基或者卤素所取代；
R5和R6各自分别选自氢原子或烷基，其中烷基可以进一步被一个或多个选自芳基、杂芳基、卤代芳基、羟基、烷氧基、芳氧基、羧酸或者羧酸酯的取代基所取代；
R7是氢原子或者烷基；
r是1～6。
本发明典型化合物包括但不限于：
Figure A200710141874D00091
Figure A200710141874D00101
Figure A200710141874D00111
Figure A200710141874D00121
或其药学上可接受的盐。
其中，所述的盐为上述通式化合物与选自以下的酸形成的盐：苹果酸、乳酸、马来酸、盐酸、甲磺酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸或三氟乙酸，优选为苹果酸或马来酸。
在本发明的另一个方面，是一种药物组合物，含有通式(I)的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物或其药学上可接受的盐、载体或赋形剂。
在本发明的另一个方面，涉及的是蛋白激酶催化活性的调节方法，包括使蛋白激酶与通式(I)的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物或其药学上可接受的盐、载体或赋形剂接触。此蛋白激酶选自受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶和丝氨酸-苏氨酸激酶。
在本发明的另一个方面，是含有通式(I)的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物在治疗与蛋白质激酶有关的疾病的药物中的用途。其中所述疾病选自与VEGFR-2，EGFR，HER-2，HER-3，HER-4，PDGFR，c-Kit，c-Met，FGFR或Flt3相关的疾病。
在本发明的另一个方面是通式(I)的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物或盐的制备方法，包括以下步骤：
氮气保护下，旋光化合物吗啡啉氨基双取代异丙醇(Ia)在1-羟基苯并三唑和N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)-碳二亚胺作用下与5-羧甲基-3-甲基-1H-吡咯-2，4-二羟酸2-叔丁酯4-乙酯在乙腈中加热得到手性的吡咯酰胺二羧酸二酯(Ib)；
氩气氛下，手性吡咯酰胺二羧酸二酯(Ib)在乙醇中与盐酸加热回流得到旋光吡咯酰胺乙酯(Ic)；
Figure A200710141874D00132
进一步，旋光吡咯酰胺乙酯(Ic)在无水四氢呋喃中和硼烷加热回流选择性还原得到手性取代吡咯乙酯(Id)；
Figure A200710141874D00133
接下来，在氩气氛下，手性取代吡咯乙酯(Id)在乙二醇中和一水合氢氧化锂加热回流，得到环合产物旋光吡咯并六元N杂环(Ie)；
Figure A200710141874D00134
室温下，旋光吡咯并六元N杂环(Ie)在无水二氯甲烷中与三氯氧磷和N’N-二甲基甲酰胺发生甲酰化反应，生成旋光吡咯并六元N杂环甲醛(If)；
Figure A200710141874D00141
最后，旋光吡咯并六元N杂环甲醛(If)在碱(如三乙胺，哌啶)存在下与不同的吲哚酮加热2～12小时即得到通式(I)所示的目标化合物手性的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉衍生物；
其中R1、R2、R3和R4的定义同上。
发明的详细说明
除非有相反陈述，下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义。
“烷基”指饱和的脂族烃基团，包括1至20个碳原子的直链和支链基团。优选含有1至10个碳原子的中等大小烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。更优选的是含有1至4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的，当被取代时，取代基可以为卤素、羟基、烷氧基、芳基、杂芳基、卤代芳基、芳氧基、羧酸、羧酸酯、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5或-NR5COR6。
“芳基”指具有至少一个芳环结构的基团，即具有共轭的π电子体系的芳环，包括碳环芳基、杂芳基和联芳基。芳基可以是被取代的或未被取代的，当被取代时，取代基可以为卤素、烷氧基、烷基、羟基、芳氧基、羧酸、羧酸酯、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5或-NR5COR6。
“杂芳基”指具有1至3个杂原子作为环原子，其余的环原子为碳的芳基，杂原子包括氧、硫和氮。所述环可以是5元或6元环。杂环芳基基团的实例包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等。杂芳基可以是被取代的或未被取代的，当被取代时，取代基可以为卤素、烷氧基、烷基、羟基、芳氧基、羧酸、羧酸酯、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5或-NR5COR6。
“羟基”指-OH基团。
“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(未取代的环烷基)。代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。烷氧基可以取代的或未取代的，当被取代时，取代基可以为卤素、羟基、烷氧基、芳基、杂芳基、卤代芳基、芳氧基、羧酸、羧酸酯、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5或-NR5COR6。
“芳氧基”指-O-芳基和-O-杂芳基，芳基和杂芳基定义同上。代表性实例包括但不限于苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基、噻吩氧基、嘧啶氧基、吡嗪氧基等及其衍生物。芳氧基可以取代的或未取代的，当被取代时，取代基可以为卤素、烷氧基、烷基、羟基、芳氧基、羧酸、羧酸酯、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5或-NR5COR6。
“卤素”指氟、氯、溴或碘，优选氟或氯。
“卤代烷氧基”指-O-(卤代烷基)。代表性实例包括但不限于三氟甲氧基、三溴甲氧基等。
“羧酸”指(烷基)C(＝O)OH。
“羧酸酯”指(烷基)C(＝O)O(烷基)。
“可选”或“可选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“可选被烷基取代的芳基”意味着烷基可以但不必存在，该说明包括芳基被烷基取代的情形和芳基不被烷基取代的情形。
“药物组合物”表示一种或多种本文所述化合物或其生理学上/药学上可接受的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，其他组分例如生理学/药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。
本发明化合物的合成方法
为了完成本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通式(I)所述的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物或其盐的制备方法，包括以下步骤：
以旋光化合物吗啡啉氨基双取代异丙醇(Ia)(根据专利US20040209937制备所得)为起始原料，氮气氛下，旋光化合物吗啡啉氨基双取代异丙醇(Ia)在1-羟基苯并三唑和N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)-碳二亚胺作用下与5-羧甲基-3-甲基-1H-吡咯-2，4-二羟酸2-叔丁酯4-乙酯在乙腈中加热回流得到手性的吡咯酰胺二羧酸二酯(Ib)；氩气氛下，手性吡咯酰胺二羧酸二酯(Ib)在乙醇中与盐酸加热回流得到旋光吡咯酰胺乙酯(Ic)；进一步，旋光吡咯酰胺乙酯(Ic)在无水四氢呋喃中和硼烷加热回流选择性还原得到手性取代吡咯乙酯(Id)；接下来，在氩气氛下，手性取代吡咯乙酯(Id)在乙二醇中和一水合氢氧化锂加热回流，得到环合产物旋光吡咯并六元N杂环(Ie)；室温下，旋光吡咯并六元N杂环(Ie)在无水二氯甲烷中与三氯氧磷和N’N-二甲基甲酰胺发生甲酰化反应，生成旋光吡咯并六元N杂环甲醛(If)；最后，旋光吡咯并六元N杂环甲醛(If)在碱(如三乙胺，哌啶)存在下与不同的吲哚酮加热2～12小时即得到通式(I)所示的目标化合物手性的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉衍生物。其中的关键技术是硼烷的选择性还原底物(Ic)以及碱性催化剂一水合氢氧化锂的催化环合底物(Id)，特别是后者，无相关文献报道此类吡咯并六元内酰胺结构的构建方法。
本发明还涉及一种药物组合物，其包括药物有效量的如本发明通式(I)所述的化合物或其盐和药学上可接受的载体。
本发明进一步涉及本发明通式(I)所示化合物或其盐在制备蛋白激酶抑制剂中的用途。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行进一步描述，但这些实施例并不限制着本发明的范围。
在以下的实施例中，化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。NMR的测定是用BrukerAVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代氯仿(CDCl3)、氘代二甲基亚砜(DMSO-D6)，内标为四甲基硅烷(TMS)，化学位移是以10-6(ppm)作为单位给出。
MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪。
薄层硅胶使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板。
柱层析一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
DMSO-D6：氘代二甲基亚砜；
CDCl3：氘代氯仿；
制备实施例：
实施例1
(R，Z)-2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00171
Figure A200710141874D00181
第一步
5-[(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基甲酰基)-甲基]-3-甲基-1H-吡咯-2，4-二羟酸(S)-2-叔丁酯4-乙酯
室温下，将(S)-1-氨基-3-吗啡啉-4-基-异丙醇1a(15.125g，94.5mmol)，5-羧甲基-3-甲基-1H-吡咯-2，4-二羟酸2-叔丁酯4-乙酯(32.34g，104mmol)，1-羟基苯并三唑(25.5g，189.06mmol)，N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)-碳二亚胺(36.2g，189.06mmol)搅拌下溶解于450ml乙腈中，再于50℃油浴反应3小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。反应液减压下蒸除溶剂，加入150ml饱和氯化钠溶液，用乙酸乙酯和四氢呋喃的混和溶剂(V:V＝4:1)萃取(200ml×5)，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml×1)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩得到75g油状物。油状物柱层析得到标题产物5-[(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基甲酰基)-甲基]-3-甲基-1H-吡咯-2，4-二羟酸(S)-2-叔丁酯4-乙酯1b(30g，浅褐色固体)，产率：70％。
MS m/z(ESI)：454.4(M+1)。
第二步
(S)-2-[(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基甲酰基)-甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
氩气保护下，将5-[(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基甲酰基)-甲基]-3-甲基-1H-吡咯-2，4-二羟酸(S)-2-叔丁酯4-乙酯1b(25.7g，56.7mmol)搅拌下溶解于70ml无水乙醇中，边用冰浴冷却边滴加71ml盐酸(12N)。加毕，撤去冰浴，反应体系于60℃油浴中反应约1.5小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。反应体系于干冰-丙酮浴中用10N的氢氧化钠溶液调节pH至7左右，有大量固体析出。混合物过滤，滤饼用乙醇洗涤。滤液减压下蒸除溶剂，用10N的氢氧化钠溶液调节pH至10左右，二氯甲烷萃取(150ml×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml×1)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩得到标题产物(S)-2-[(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基甲酰基)-甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯1c(16.9g，深绿色油状物)，产率：84％。
MS m/z(ESI)：354.3(M+1)。
第三步
(S)-2-[2-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基)-乙基]-4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
氩气保护下，将(S)-2-[(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基甲酰基)-甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯1c(16.9g，47.9mmol)溶解于143.6ml干燥的四氢呋喃中，冰浴冷却，加入硼烷的四氢呋喃溶液(143.6ml，1mol/L，143.6mmol)。加毕撤去冰浴，反应体系温度自然升至室温，于95℃油浴中回流约1小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。反应液减压下蒸除溶剂，加入150ml盐酸(2N)搅拌0.5小时，加入50ml冰水，用10N的氢氧化钠溶液调节pH至10左右，乙酸乙酯萃取(200ml×2)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml×1)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩得到标题产物(S)-2-[2-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基)-乙基]-4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯1d(15.6g，黄褐色油状物)，产率：96％。
MS m/z(ESI)：340.3(M+1)。
第四步
(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
氩气保护下，将(S)-2-[2-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基)-乙基]-4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯1d(16.2g，47.9mmol)，一水合氢氧化锂(8g，190.6mmol)搅拌下溶解于50ml乙二醇中，反应体系于135℃油浴中反应50min。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。反应液减压下蒸除溶剂，加入150ml饱和氯化钠溶液，用二氯甲烷萃取(150ml×5)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤(150ml×1)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩得到12.3g油状物。油状物柱层析得到标题产物(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮1e(7.9g，白色固体)，产率：60.6％。
MS m/z(ESI)：294.2(M+1)。
第五步
(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛
室温下，将三氯氧磷(674μl，4.04mmol)和N’N-二甲基甲酰胺(963μl，12.32mmol)搅拌下溶解于21.18ml二氯甲烷中，用冰浴控制温度在-10℃左右，搅拌15min。将(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮1e(790mg，2.7mmol)搅拌下溶解于10ml二氯甲烷中，滴加到上述反应体系中。加毕，撤去冰浴，反应体系温度自然升至室温，继续搅拌2小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，反应体系中加入冰水淬灭反应，搅拌15min。用10N的氢氧化钠溶液调节pH值至12左右，用二氯甲烷和甲醇的混和溶剂(V:V＝20:1)萃取(100ml×8)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤(150ml×1)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩得到800mg粗品。粗品柱层析得到标题产物(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛1f(650mg，白色固体)，产率：75％
MS m/z(ESI)：322.6(M+1)。
第六步
(R，Z)-2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
室温下，将(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛1f(200mg，0.623mmol)，5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮(84.67mg，0.56mmol)和六氢吡啶(30.8μl，0.31mmol)搅拌下溶解于1.09ml乙醇中，反应体系于80℃油浴中避光搅拌2小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。撤去油浴，反应体系温度自然降至室温，有大量固体析出，抽滤得到标题产物(R，Z)-2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮1(256mg，黄色固体)，产率：90％。
MS m/z(ESI)：45.5.2(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.674(s，1H，吡咯环-NH)，10.945(s，1H，吲哚-NH)，7.771～7.800(m，1H，-ArH)，7.762(s，1H，-CH＝C)，6.927～6.978(dd，1H，-ArH)，6.842～6.874(d，1H，-ArH)，4.707～4.719(d，1H，-OH)，3.900～3.915(m，1H，-CHO)，3.704～3.748(dd，2H，六环内接酰胺氮-CH2-)，3.616～3.695(dd，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.563～3.585(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.105～3.158(dd，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.433(t，2H，六环接吡咯环-CH2-)，2.545(s，3H，吡咯环-CH3)，2.420～2.431(m，2H，-CH2N，吗啡啉环内-CH2N)，2.420～2.431(m，2H，-CH2N，吗啡啉环外-CH2N)，2.304～2.330(t，2H，吗啡啉环内-CH2N)。
实施例2
(R，Z)-2-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00211
重复本发明实施例1第六步反应，不同的是使用实施例1第五步中所得到的化合物(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛1f和5-氯-1，3-二氢-吲哚-2-酮作原料，得到标题产物(R，Z)-2-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮2(42mg，黄色固体)，产率：64％。
MS m/z(ESI)：471.2(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.727(s，1H，吡咯环-NH)，11.039(s，1H，吲哚-NH)，8.003(m，1H，-ArH)，7.814(s，1H，-CH＝C)，7.166～7.141(dd，1H，-ArH)，6.890～6.869(d，1H，-ArH)，4.713～4.700(d，1H，-OH)，3.907～3.892(m，1H，-CHO)，3.626～3.567(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.152～3.099(dd，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.027～2.994(t，2H，六环接吡咯环-CH2-)，2.547(s，3H，吡咯环-CH3)，2.328～2.290(t，2H，吗啡啉环内-CH2N)。
实施例3
2-[(Z)-4-(2，3-二氟-苯基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基]-5-[(R)-2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基]-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00221
第一步
4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼烷-2-基)-1H-吲哚
氩气氛下，将4-溴-1H-吲哚3a(29.4g，150mmol)搅拌下溶解于600ml二甲基亚砜中，加入频哪醇乙硼烷(41.9g，165mmol)，醋酸钾(44.1g，450mmol)和1，1’-双(二苯膦基)二茂铁二氯化钯(3.6g，4.8mmol)，加毕，反应液于80℃油浴中搅拌22小时，薄层色谱表明原料反应完全，停止反应。反应液中加入2L水，用乙酸乙酯萃取(2L×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(2L×5)，无水硫酸钠干燥，抽滤除去干燥剂，滤液减压浓缩。所得固体柱层析后重结晶得到标题产物4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼烷-2-基)-1H-吲哚3b(20g，白色固体)，产率：60％。
MS m/z(ESI)：243.9(M+1)。
第二步
4-(2，3-二氟-苯基)-1H-吲哚
氩气氛下，将4-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂硼烷-2-基)-1H-吲哚3b(1.22g，5mmol)搅拌下溶解于20ml四氢呋喃中，加入1-溴-2，3-二氟-苯(0.97g，5mmol)，四(三苯基膦)钯(0.17g，0.15mmol)和7ml氢氧化钠溶液(2M)。加毕，反应体系在75℃油浴中搅拌过夜，薄层色谱表明原料反应完全，停止反应。反应液自然冷却至室温，用乙酸乙酯萃取(20ml×3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(10ml×1)，无水硫酸钠干燥，抽滤除去干燥剂，滤液减压浓缩。所得固体柱层析得到标题产物4-(2，3-二氟-苯基)-1H-吲哚3c(800mg，白色固体)，产率：70％。
MS m/z(ESI)：228.4(M-1)。
第三步
4-(2，3-二氟-苯基)-1，3-二氢-吲哚-2-酮
室温下，将4-(2，3-二氟-苯基)-1H-吲哚3c(744mg，3.25mmol)搅拌下溶解于12ml乙醇中，依次加入21ml叔丁醇，6.4ml冰醋酸和三溴化吡啶鎓(3.12g，9.7mmol)，加毕搅拌3小时。再加入16ml冰醋酸和锌粉(1.1g，16.25mmol)，继续搅拌1小时。反应液抽滤除去残渣，滤液减压浓缩后加入30ml乙酸乙酯，依次用10ml水，10ml饱和碳酸氢钠和10ml饱和氯化钠洗涤，用无水硫酸钠干燥，抽滤除去干燥剂，滤液减压浓缩。所得固体为标题产物4-(2，3-二氟-苯基)-1，3-二氢-吲哚-2-酮3d(780mg，白色固体)，产率：97％。
MS m/z(ESI)：246.6(M+1)。
第四步
2-[(Z)-4-(2，3-二氟-苯基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基]-5-[(R)-2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基]-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
室温下，将(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛1f(50mg，0.156mmol)，4-(2，3-二氟-苯基)-1，3-二氢-吲哚-2-酮3d(34.3mg，0.14mmol)和六氢吡啶(7.7μl，0.078mmol)搅拌下溶解于0.3ml乙醇中，反应体系于80℃油浴中避光搅拌2小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。撤去油浴，反应体系温度自然降至室温，有大量固体析出，抽滤得到标题产物2-[(Z)-4-(2，3-二氟-苯基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基]-5-[(R)-2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基]-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮3(56mg，黄色固体)，产率：73％。
MS m/z(ESI)：549.3(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.583(s，1H，吡咯环-NH)，11.164(s，1H，吲哚-NH)，7.647～7.604(m，1H，-ArH)，7.462～7.411(m，1H，-ArH)，7.342～7.308(m，1H，-ArH)，7.277～7.239(m，1H，-ArH)，7.017～6.997(d，1H，-ArH)，6.898～6.879(d，1H，-ArH)，6.716(s，1H，-CH＝C)，4.671(s，1H，-OH)，3.854(m，1H，-CHO)，3.673～3.540(m，7H，六环内-CH2N，六环外接酰胺氮-CH2，吗啡啉环2×-CH2O)，3.124～3.077(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，2.986～2.954(t，2H，六环内-CH2)，2.402～2.392(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.279～2.265(d，2H，吗啡啉环-CH2N)，1.884(s，3H，吡咯环-CH3)。
实施例4
(R，Z)-2-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00241
重复本发明实施例1第六步反应，不同的是使用实施例1第五步中所得到的化合物(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛1f和5-溴-1，3-二氢-吲哚-2-酮作原料，得到标题产物(R，Z)-2-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮4(24mg，黄色固体)，产率：50％。
MS m/z(ESI)：517.6(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.723(s，1H，吡咯环-NH)，11.047(s，1H，吲哚-NH)，8.131(s，1H，-ArH)，7.820(s，1H，-CH＝C)，7.292～7.271(dd，1H，-ArH)，6.847～6.827(d，1H，-ArH)，4.713～4.702(d，1H，-OH)，3.897(m，1H，-CHO)，3.626～3.569(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.153～3.101(dd，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.029～2.995(t，2H，六环接吡咯环-CH2-)，2.549(s，3H，吡咯环-CH3)，2.308(t，2H，吗啡啉环内-CH2N)。
实施例5
(S，Z)-2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00251
第一步
5-[(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基甲酰基)-甲基]-3-甲基-1H-吡咯-2，4-二羟酸(R)-2-叔丁酯4-乙酯
室温下，将(R)-1-氨基-3-吗啡啉-4-基-异丙醇5a(15.125g，94.5mmol)，5-羧甲基-3-甲基-1H-吡咯-2，4-二羟酸2-叔丁酯4-乙酯(32.34g，104mmol)，1-羟基苯并三唑(25.5g，189.06mmol)，N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)-碳二亚胺(36.2g，189.06mmol)搅拌下溶解于450ml乙腈中，再于50℃油浴反应3小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。反应液减压下蒸除溶剂，加入150ml饱和氯化钠溶液，用乙酸乙酯和四氢呋喃的混和溶剂(V:V＝4:1)萃取(200ml×5)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤(100ml×1)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩得到75g油状物。油状物柱层析得到标题产物5-[(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基甲酰基)-甲基]-3-甲基-1H-吡咯-2，4-二羟酸(R)-2-叔丁酯4-乙酯5b(30g，浅褐色固体)，产率：70％。
MS m/z(ESI)：454.4(M+1)。
第二步
(R)-2-[(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基甲酰基)-甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
氩气氛下，将5-[(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基甲酰基)-甲基]-3-甲基-1H-吡咯-2，4-二羟酸(R)-2-叔丁酯4-乙酯5b(23g，50.77mmol)搅拌下溶解于60ml无水乙醇中，边用冰浴冷却边滴加63.5ml盐酸(12N)。加毕，撤去冰浴，反应体系于60℃油浴中反应约1.5小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。反应体系于干冰-丙酮浴中用10N的氢氧化钠溶液调节pH至7左右，有大量固体析出。混合物过滤，滤饼用乙醇洗涤。滤液减压下蒸除溶剂，用10N的氢氧化钠溶液调节pH至10左右，二氯甲烷萃取(150ml×3)，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml×1)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩得到标题产物(R)-2-[(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基甲酰基)-甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯5c(14.6g，黄绿色油状物)，产率：81.6％。
MS m/z(ESI)：354.8(M+1)。
第三步
(R)-2-[2-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基)-乙基]-4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
氩气氛下，将(R)-2-[(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基甲酰基)-甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯5c(2.332g，6.6mmol)溶解于23ml干燥的四氢呋喃中，冰浴冷却，加入硼烷的四氢呋喃溶液(23.12ml，1mol/L，23.12mmol)。加毕撤去冰浴，反应体系温度自然升至室温，于95℃油浴中回流约1小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。反应液减压下蒸除溶剂，加入5ml的盐酸(2N)搅拌0.5小时，加入5ml冰水，用10N的氢氧化钠溶液调节pH至10左右，乙酸乙酯萃取(100ml×2)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤(50ml×1)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩得到标题产物(R)-2-[2-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基)-乙基]-4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯5d(2.1g，白色固体)，产率：93.75％。
MS m/z(ESI)：340.9(M+1)。
第四步
(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
氩气氛下，将(R)-2-[2-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基氨基)-乙基]-4-甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯5d(2.1g，6.2mmol)，一水合氢氧化锂(1.56g，37mmol)搅拌下溶解于25ml乙二醇中，反应体系于140℃油浴中反应50min。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。反应液减压下蒸除溶剂，加入50ml饱和氯化钠，用二氯甲烷萃取(80ml×3)，有机相用饱和氯化钠洗涤(80ml×1)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩后柱层析得到标题产物(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮5e(610mg，白色固体)，产率：33.9％。
MS m/z(ESI)：294.5(M+1)。
第五步
(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛
室温下，将三氯氧磷(500μl，3mmol)和N’N-二甲基甲酰胺(704μl，9mmol)搅拌下溶解于15ml无水二氯甲烷中，用冰浴控制温度在-10℃左右，搅拌15min。将(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮5e(586mg，2mmol)搅拌下溶解于8ml二氯甲烷中，滴加到上述反应体系中。加毕，撤去冰浴，反应体系温度自然升至室温，继续搅拌2小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，反应体系中加入冰水淬灭反应，搅拌15min。用10N的氢氧化钠溶液调节pH值至12左右，用二氯甲烷和甲醇的混和溶剂(V:V＝20:1)萃取(100ml×5)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠洗涤(100ml×1)，无水硫酸镁干燥，抽滤除去干燥剂，滤液浓缩后柱层析得到标题产物(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f(490mg，白色固体)，产率：78.8％。
MS m/z(ESI)：322.1(M+1)。
第六步
(S，Z)-2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
室温下，将(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f(490mg，1.53mmol)，5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮(219mg，1.45mmol)和六氢吡啶(100μl，1.0mmol)搅拌下溶解于5ml乙醇中，反应体系于80℃油浴中避光搅拌2小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。撤去油浴，反应体系温度自然降至室温，有大量固体析出，抽滤得到标题产物(S，Z)-2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮5(460mg，黄色固体)，产率：69.9％。
MS m/z(ESI)：455.2(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.674(s，1H，吡咯环-NH)，10.945(s，1H，吲哚-NH)，7.771～7.800(m，1H，-ArH)，7.762(s，1H，-CH＝C)，6.927～6.978(dd，1H，-ArH)，6.842～6.874(d，1H，-ArH)，4.707～4.719(d，1H，-OH)，3.900～3.915(m，1H，-CHO)，3.704～3.748(dd，2H，六环内接酰胺氮-CH2-)，3.616～3.695(dd，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.563～3.585(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.105～3.158(dd，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.433(t，2H，六环接吡咯环-CH2-)，2.545(s，3H，吡咯环-CH3)，2.420～2.431(m，2H，-CH2N，吗啡啉环内-CH2N)，2.420～2.431(m，2H，-CH2N，吗啡啉环外-CH2N)，2.304～2.330(t，2H，吗啡啉环内-CH2N)。
实施例6
(S，Z)-2-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00281
重复本发明实施例5第六步反应，不同的是使用实施例5第五步中所得到的化合物(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f和5-氯-1，3-二氢-吲哚-2-酮作原料，得到标题产物(S，Z)-2-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮6(87mg，黄色固体)，产率：85％。
MS m/z(ESI)：471.6(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.727(s，1H，吡咯环-NH)，11.038(s，1H，吲哚-NH)，8.006～8.001(m，1H，-ArH)，7.813(s，1H，-CH＝C)，7.166～7.140(dd，1H，-ArH)，6.889～6.869(d，1H，-ArH)，4.712～4.700(d，1H，-OH)，3.893(m，1H，-CHO)，3.723～3.689(dd，2H，六环内接酰胺氮-CH2-)，3.657～3.641(dd，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.578～3.556(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.152～3.099(dd，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.026～2.993(t，2H，六环接吡咯环-CH2-)，2.547(s，3H，吡咯环-CH3)，2.424～2.412(m，4H，-CH2N，吗啡啉环内-CH2N，吗啡啉环外-CH2N)，2.311～2.290(t，2H，吗啡啉环内-CH2N)。
实施例7
2-(Z)-[4-(2，3-二氟-苯基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基]-5-((S)-2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00291
重复本发明实施例5第六步反应，不同的是使用实施例5第五步中所得到的化合物(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f和4-(2，3-二氟-苯基)-1，3-二氢-吲哚-2-酮3d作原料，得到标题产物2-(Z)-[4-(2，3-二氟-苯基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基]-5-((S)-2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮7(49mg，红色固体)，产率：73％。
MS m/z(ESI)：549.2(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.583(s，1H，吡咯环-NH)，11.164(s，1H，吲哚-NH)，7.604～7.647(m，1H，-ArH)，7.411～7.464(m，1H，-ArH)，7.308～7.342(m，1H，-ArH)，7.239～7.277(m，1H，-ArH)，6.997～7.017(d，1H，-ArH)，6.879～6.898(d，1H，-ArH)，6.716(s，1H，-CH＝C)，4.671(s，1H，-OH)，3.854(m，1H，-CHO)，3.540～3.673(m，7H，六环内-CH2N，六环外接酰胺氮-CH2，吗啡啉环2×-CH2O)，3.095～3.124(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，2.954～2.986(t，2H，六环内-CH2)，2.392～2.402(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.265～2.279(d，2H，吗啡啉环-CH2N)，1.884(s，3H，吡咯环-CH3)。
实施例8
(S，Z)-2-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00301
重复本发明实施例5第六步反应，不同的是使用实施例5第五步中所得到的化合物(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f和5-溴-1，3-二氢-吲哚-2-酮作原料，得到标题产物(S，Z)-2-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮8(49mg，黄色固体)，产率：78％。
MS m/z(ESI)：515.2(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.720(s，1H，吡咯环-NH)，11.042(s，1H，吲哚-NH)，8.127(s，1H，-ArH)，7.813(s，1H，-CH＝C)，7.290～7.265(dd，1H，-ArH)，6.844～6.823(d，1H，-ArH)，4.712～4.699(d，1H，-OH)，3.907(m，1H，-CHO)，3.578～3.555(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.151～3.098(dd，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.025～2.992(t，2H，六环接吡咯环-CH2-)，2.547(s，3H，吡咯环-CH3)，2.306～2.290(t，2H，吗啡啉环内-CH2N)。
实施例9
(S，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基}-2-羟基-乙酰胺
Figure A200710141874D00311
第一步
2，4-二硝基-5-氟-苯乙酸
室温下，将3-氟-苯乙酸9a(31.5g，0.204mol)加入到64ml硫酸(98％)中，控制温度在35℃下滴加100ml硝酸(65％—68％)及硫酸(98％)的混合溶液(V:V＝1:1)。加毕，控温在35℃左右搅拌，薄层色谱跟踪至原料消失。将冰加入反应液中，待冰融化后过滤，得到标题产物2，4-二硝基-5-氟-苯乙酸9b(49g，浅黄色油状液体)。
MS m/z(ESI)：243.5(M-1)。
第二步
2，4-二氨基-5-氟-苯乙酸
室温下，将2，4-二硝基-5-氟-苯乙酸9b(10g，38.7mmol)搅拌下溶解于150ml甲醇中，加入钯/碳(5％，1.5g)，氢气氛下，在压强为0.3MPa下氢化。薄层色谱跟踪至原料消失，过滤两次，滤液减压浓缩得到标题产物2，4-二氨基-5-氟-苯乙酸9c(7.12g，棕色固体)，直接做下一步。
第三步
5-氟-6-氨基-2-吲哚酮
室温下，将2，4-二氨基-5-氟-苯乙酸9c(7.12g，38.7mmol)搅拌下溶解于100ml盐酸(1M)，加热回流1小时，薄层色谱跟踪至原料消失，停止反应。将反应液冷却至室温，继续用冰水浴冷却，滴加100ml氢氧化钠溶液(1M)中和反应液。用乙酸乙酯萃取反应液(125mL×4)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(100mL×1)洗涤，乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到标题产物5-氟-6-氨基-1，3-二氢-2-吲哚酮9d(5.3g，黄色固体)，产率：82.8％。
MS m/z(ESI)：165.3(M-1)。
第四步
乙酸(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-氨基甲酰基)-甲酯
室温下，将5-氟-6-氨基-2-吲哚酮9d(500mg，3.0mmol)搅拌下溶解于10ml四氢呋喃中，加入0.4ml吡啶，搅拌均匀后用丙酮和干冰使反应体系冷却至-40℃左右。将乙酰氧基乙酰氯(420mg，3.0mmol)加入到10ml四氢呋喃中，溶解后滴加到已冷却好的反应体系中，加毕撤去干冰-丙酮浴，使反应体系自然升温至室温，搅拌过液。薄层色谱跟踪至原料消失，过滤，所得固体用水洗3次即得到标题产物乙酸(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-氨基甲酰基)-甲酯9e(562mg，灰色固体)，产率：70.4％。
MS：265.3(M-1)。
第五步
N-(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-羟基-乙酰胺
室温下，将乙酸(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-氨基甲酰基)-甲酯9e(58mg，0.22mmol)搅拌下溶解于1ml甲醇中，加入1ml水和氢氧化钠(15mg，0.375mmol)，加毕，继续搅拌1小时。薄层色谱跟踪至原料消失，停止反应。反应液过滤，所得固体用水洗3次，干燥即得到标题产物N-(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-羟基-乙酰胺9f(46mg，灰白色固体)，产率：93.8％。
MS：223.7(M-1)。
第六步
(S，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基}-2-羟基-乙酰胺
室温下，将(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f(40mg，0.125mmol)搅拌下溶解于2ml乙醇中，加入N-(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-羟基-乙酰胺9f(25.1mg，0.112mmol)，加毕搅拌至溶解。向反应液中加入六氢吡啶(50μl，0.5mmol)，加毕，反应体系于80℃油浴中避光搅拌2小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。撤去油浴，反应体系温度自然降至室温，有大量固体析出，抽滤得到标题产物(S，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基}-2-羟基-乙酰胺9(51mg，黄色固体)，产率：80％。
MS m/z(ESI)：528.3(M+1)。
实施例10
(S，Z)-2-[5-氟-6-(4-氟-苄氨基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基]-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00331
第一步
5-氟-6-(4-氟-苄氨基)-1，3-二氢-吲哚-2-酮
室温下，将5-氟-6-氨基-1，3-二氢-2-吲哚酮9d(2.26g，13.6mmol)搅拌下溶解于40ml乙醇中，用冰浴将上述溶液冷却至0℃，加入4-氟-苯甲醛(1.5ml，13.6mmol)，加毕室温搅拌1小时。加入四氢硼酸钠(1.08g，28.5mmol)，回流18小时，自然冷却至室温。加入冰水，有大量固体析出，抽滤，滤饼用水洗涤(50ml×3)后经柱层析得到标题产物5-氟-6-(4-氟-苄氨基)-1，3-二氢-吲哚-2-酮10a(1.67g，白色固体)，产率：45％。
MS m/z(ESI)：275(M+1)。
第二步
(S，Z)-2-[5-氟-6-(4-氟-苄氨基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基]-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
室温下，将(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f(40mg，0.125mmol)搅拌下溶解于2ml乙醇中，加入5-氟-6-(4-氟-苄氨基)-1，3-二氢-吲哚-2-酮10a(30.7mg，0.112mmol)，加毕，搅拌至溶解。向反应液中加入哌啶(0.05ml，0.5mmol)，加毕反应液于油浴中加热回流2小时，薄层色谱表明原料反应完全，停止反应。反应液自然冷却至室温后减压抽滤，所得固体即为标题产物(S，Z)-2-[5-氟-6-(4-氟-苄氨基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基]-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮10(18mg，灰色固体)，产率：27.8％。
MS m/z(ESI)：578.6(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.503(s，1H，吡咯环-NH)，10.557(s，1H，吲哚-NH)，7.584～7.614(d，1H，-ArH)，7.359～7.400(m，2H，-ArH)，7.359(s，1H，-CH＝C)，7.140～7.184(t，2H，-ArH)，6.426(m，1H，-NH)，6.039～6.057(d，1H，-ArH)，4.684～4.696(d，1H，-OH)，4.346～4.361(d，2H，-C＝CCH2N)，3.893(m，1H，-CHO)，3.667～3.713(d，2H，六环内-CH2N)，3.596～3.627(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.564(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.07～3.12(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，2.928～2.961(t，2H，六环内-CH2)，2.468(s，3H，吡咯环-CH3)，2.417(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.297(m，2H，吗啡啉环-CH2N)。
实施例11
(S，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基}-2-羟基-2-甲基-丙酰胺
Figure A200710141874D00351
第一步
乙酸1-(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-氨基甲酰基)-1-甲基-乙酯
室温下，将5-氟-6-氨基-2-吲哚酮9d(410mg，2.47mmol)搅拌下溶解于10ml四氢呋喃中，用干冰-丙酮浴冷却至-45℃，加入332μl吡啶。将2-乙酰氧基异丁酰氯(423mg，2.71mmol)搅拌下溶解于10ml四氢呋喃中，滴加到上述反应液中，加毕撤去干冰-丙酮浴，让反应体系温度自然升至室温，搅拌过夜。薄层色谱监测反应至原料反应完全，将反应液过滤，滤饼用水洗涤，所得固体干燥后得到标题产物乙酸1-(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-氨基甲酰基)-1-甲基-乙酯11a(792mg，白色固体)，直接进行下步反应。
MS m/z(ESI)：293.7(M-1)。
第二步
N-(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-羟基-2-甲基-丙酰胺
室温下，将乙酸1-(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-氨基甲酰基)-1-甲基-乙酯11a(2.035g，6.9mmol)搅拌下溶解于20ml甲醇中，加入20ml氢氧化钠溶液(0.7M)，搅拌4小时，薄层色谱监测反应至原料反应完全，停止反应。反应液用1M的盐酸中和后，减压蒸除溶剂，柱层析后干燥得到标题产物N-(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-羟基-2-甲基-丙酰胺11b(900mg，白色固体)，产率：59.2％。
MS m/z(ESI)：253.6(M+1)。
第三步
(S，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基}-2-羟基-2-甲基-丙酰胺
室温下，将(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f(40mg，0.125mmol)，N-(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-羟基-2-甲基-丙酰胺11b(28.3mg，0.112mmol)和六氢吡啶(50μl，0.5mmol)搅拌下溶解于2ml乙醇中，反应体系于80℃油浴中避光搅拌2小时。薄层色谱监测反应至原料基本消失，停止反应。撤去油浴，反应体系温度自然降至室温，有大量固体析出，抽滤得到标题产物(S，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基}-2-羟基-2-甲基-丙酰胺11(46mg，黄色固体)，产率：74％。
MS m/z(ESI)：556.9(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.656(s，1H，吡咯环-NH)，10.951(s，1H，吲哚-NH)，9.282(s，1H，-NHCO)，7.873～7.901(d，1H，-ArH)，7.778～7.794(m，1H，-ArH)，7.670(s，1H，-CH＝C)，6.052(s，1H，-OHC(CH3)2)，4.698(d，1H，OH)，3.893(m，1H，-CHO)，3.667～3.713(d，2H，六环内-CH2N)，3.596～3.627(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.557～3.578(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.09～3.125(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，2.961～3.012(t，2H，六环内-CH2)，2.524(s，3H，吡咯环-CH3)，2.412～2.424(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.297～2.308(m，2H，吗啡啉环-CH2N)，1.376(s，6H，2×-CH3)。
实施例12
(S，Z)-2-(7-溴-5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00371
第一步
7-溴-5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮
室温下，将5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮12a(1.5g，0.01mol)搅拌下溶解于15ml乙腈，逐滴加入一溴代丁二酰亚胺(1.8g，0.01mol)，加毕过夜搅拌，有大量固体析出。薄层色谱表明原料反应完全，停止反应。反应液抽滤得到标题产物7-溴-5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮12b(2g，灰白色固体)，产率：87％。
MS m/z(ESI)：228.3(M-1)。
第二步
(S，Z)-2-(7-溴-5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
室温下，将(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f(40mg，0.125mmol)搅拌下溶解于2ml乙醇中，加入7-溴-5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮12b(25.8mg，0.112mmol)，加毕，搅拌至溶解，再加入哌啶(0.05ml，0.5mmol)，加毕反应液于油浴中加热回流2小时，薄层色谱表明原料反应完全，停止反应。反应液自然冷却至室温后减压抽滤，所得固体即为标题产物(S，Z)-2-(7-溴-5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮12(45mg，黄色固体)，产率：75.4％。
MS m/z(ESI)：533.6(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.689(s，1H，吡咯环-NH)，11.196(s，1H，吲哚-NH)，7.860～7.866(d，1H，-ArH)，7.784(s，1H，-CH＝C)，7.232～7.260(m，1H，-ArH)，4.703～4.716(d，1H，-OH)，3.896～2.909(m，1H，-CHO)，3.631～3.747(m，3H，六环内-CH2N，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.555～3.578(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.097～3.150(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.015～3.048(t，2H，六环内-CH2)，2.548(s，3H，吡咯环-CH3)，2.411～2.424(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.291～2.307(m，2H，吗啡啉环-CH2N)。
实施例13
(S，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基}-2-甲氧基-乙酰胺
Figure A200710141874D00381
第一步
5-氟-6-甲氧乙酰胺基-2-吲哚酮
室温下，将5-氟-6-氨基-2-吲哚酮9d(2.028g，12.2mmol)搅拌下溶解于30ml四氢呋喃中，加入1.3ml吡啶，用干冰-乙醇浴使反应体系冷却至—50℃左右。将甲氧乙酰氯(1.35g，12.5mmol)搅拌下溶解于20ml四氢呋喃中，滴加到上述反应体系中。加毕，撤去干冰-乙醇浴，使反应体系温度自然升至室温，搅拌过夜。薄层色谱跟踪至原料消失，过滤，所得固体用水洗涤(10ml×3)，用甲醇重结晶，即得到标题产物5-氟-6-甲氧乙酰胺基-2-吲哚酮13a(1.18g，灰色固体)，产率：40.6％。
MS m/z(ESI)：239.3(M+1)。
第二步
(S，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基}-2-甲氧基-乙酰胺
室温下，将(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f(40mg，0.125mmol)搅拌下溶解于2ml乙醇中，加入5-氟-6-甲氧乙酰胺基-2-吲哚酮13a(26.7mg，0.112mmol)，加毕，搅拌至溶解，再加入哌啶(0.05ml，0.5mmol)，加毕反应液于油浴中加热回流2小时，薄层色谱表明原料反应完全，停止反应。反应液自然冷却至室温后减压抽滤，所得固体即为标题产物(S，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-IH-吲哚-6-基}-2-甲氧基-乙酰胺13(52mg，黄色固体)，产率：85.8％。
MS m/z(ESI)：542.2(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.666(s，1H，吡咯环-NH)，10.919(s，1H，吲哚-NH)，9.313(s，1H，-NHCO)，7.841～7.869(d，1H，-ArH)，7.672(s，1H，-CH＝C)，7.546～7.562(m，1H，-ArH)，4.703～4.716(d，1H，-OH)，4.062(s，2H，-CH2O)，3.896～2.909(m，1H，-CHO)，3.652～3.720(m，3H，六环内-CH2N，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.556～3.578(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.404(s，3H，-CH3O)，3.097～3.150(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，2.982～3.015(t，2H，六环内-CH2)，2.523(s，3H，吡咯环-CH3)，2.414～2.425(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.291～2.307(m，2H，吗啡啉环-CH2N)。
实施例14
(R，Z)-2-(7-溴-5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00401
重复本发明实施例1第六步反应，不同的是使用实施例1第五步中所得到的化合物(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛1f和7-溴-5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮12b作原料，得到标题产物(R，Z)-2-(7-溴-5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮14(20mg，黄色固体)，产率：40％。
MS m/z(ESI)：533.6(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.691(s，1H，吡咯环-NH)，11.204(s，1H，吲哚-NH)，7.874～7.851(d，1H，-ArH)，7.797(s，1H，-CH＝C)，7.269～7.243(m，1H，-ArH)，4.710～4.698(d，1H，-OH)，3.900～3.890(m，1H，-CHO)，3.759～3.611(m，3H，六环内-CH2N，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.572～3.550(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.148～3.095(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.047～3.014(t，2H，六环内-CH2)，2.548(s，3H，吡咯环-CH3)，2.418～2.323(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.302～2.285(m，2H，吗啡啉环-CH2N)。
实施例15
(R，Z)-2-[5-氟-6-(4-氟-苄氨基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基]-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00402
重复本发明实施例1第六步反应，不同的是使用实施例1第五步中所得到的化合物(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛1f和5-氟-6-(4-氟-苄氨基)-1，3-二氢-吲哚-2-酮10a作原料，得到标题产物(R，Z)-2-[5-氟-6-(4-氟-苄氨基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基]-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮15(53mg，深红色固体)，产率：65.6％。
MS m/z(ESI)：578.7(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.504(s，1H，吡咯环-NH)，10.558(s，1H，吲哚-NH)，7.614～7.585(d，1H，-ArH)，7.400～7.379(m，2H，-ArH)，7.359(s，1H，-CH＝C)，7.140～7.191(t，2H，-ArH)，6.431(m，1H，-NH)，6.058～6.040(d，1H，-ArH)，4.698～4.686(d，1H，-OH)，4.346～4.361(d，2H，-C＝CCH2N)，3.894(m，1H，-CHO)，3.731～3.668(d，2H，六环内-CH2N)，3.644～3.612(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.596～3.553(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.135～3.082(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，2.928～2.961(t，2H，六环内-CH2)，2.468(s，3H，吡咯环-CH3)，2.419～2.408(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.299～2.289(m，2H，吗啡啉环-CH2N)。
实施例16
(R，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基}-2-甲氧基-乙酰胺
Figure A200710141874D00411
重复本发明实施例1第六步反应，不同的是使用实施例1第五步中所得到的化合物(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛1f和5-氟-6-甲氧乙酰胺基-2-吲哚酮13a作原料，得到标题产物(R，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基}-2-甲氧基-乙酰胺16(60mg，黄色固体)，产率：87％。
MS m/z(ESI)：543.0(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.668(s，1H，吡咯环-NH)，10.923(s，1H，吲哚-NH)，9.320(s，1H，-NHCO)，7.875～7.847(d，1H，-ArH)，7.678(s，1H，-CH＝C)，7.562～7.546(m，1H，-ArH)，4.711～4.699(d，1H，-OH)，4.063(s，2H，-CH2O)，3.729～3.653(m，3H，六环内-CH2N，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.579～3.556(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.404(s，3H，-CH3O)，2.983～3.017(t，2H，六环内-CH2)，2.525(s，3H，吡咯环-CH3)，2.412～2.424(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.289～2.306(m，2H，吗啡啉环-CH2N)。
实施例17
(R，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基·丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基}-2-羟基-2-甲基-丙酰胺
Figure A200710141874D00421
重复本发明实施例1第六步反应，不同的是使用实施例1第五步中所得到的化合物(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛1f和N-(5-氟-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-羟基-2-甲基-丙酰胺11b作原料，得到标题产物(R，Z)-N-{5-氟-3-[5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-亚甲基]-2-氧代-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基}-2-羟基-2-甲基-丙酰胺17(71mg，黄色固体)，产率：82％。
MS m/z(ESI)：556.2(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.658(s，1H，吡咯环-NH)，10.954(s，1H，吲哚-NH)，9.289(s，1H，-NHCO)，7.875～7.903(d，1H，-ArH)，7.796～7.780(m，1H，-ArH)，7.672(s，1H，-CH＝C)，6.055(s，1H，-OHC(CH3)2)，4.701(d，1H，OH)，3.722(m，1H，-CHO)，3.655～3.691(d，2H，六环内-CH2N)，3.639(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.559～3.580(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，2.986～3.019(t，2H，六环内-CH2)，2.526(s，3H，吡咯环-CH3)，2.415～2.425(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.299～2.309(m，2H，吗啡啉环-CH2N)，1.378(s，6H，2×-CH3)。
实施例18
(R，Z)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-2-(2-氧代-4-嘧啶-4-基-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00431
重复本发明实施例1第六步反应，不同的是使用实施例1第五步中所得到的化合物(R)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛1f和4-嘧啶-4-基-1，3-二氢-吲哚-2-酮作原料，得到标题产物(R，Z)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-2-(2-氧代-4-嘧啶-4-基-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮18(58mg，黄色固体)，产率：72.5％。
MS m/z(ESI)：514.2(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.573(s，1H，吡咯环-NH)，11.149(s，1H，吲哚-NH)，7.742～7.770(d，2H，吡啶环N-CH＝)，7.500～7.513(d，2H，吡啶环-CH＝)，7.226～7.265(t，1H，-ArH)，6.976～6.995(t，1H，-ArH)，6.813～6.834(d，2H，-CH＝C，-ArH)，4.666～4.677(d，1H，-OH)，3.854(m，1H，-CHO)，3.541～3.688(m，7H，六环内-CH2N，六环外接酰胺氮-CH2，吗啡啉环2×-CH2O)，3.063～3.115(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，2.946～2.979(t，2H，六环内-CH2)，2.394(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.264～2.278(d，2H，吗啡啉环-CH2N)，1.810～1.822(s，3H，吡咯环-CH3)。
实施例19
(S，Z)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-2-(5-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚甲基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00441
重复本发明实施例5第六步反应，不同的是使用实施例5第五步中所得到的化合物(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f和5-甲氧基-1，3-二氢-吲哚-2-酮作原料，得到标题产物(S，Z)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-2-(5-甲氧基-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚甲基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮19(40mg，橙红色固体)，产率：76.6％。
MS m/z(ESI)：467.2(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.846(s，1H，吡咯环-NH)，10.742(s，1H，吲哚-NH)，7.696(s，1H，-CH＝C)，7.490～7.495(m，1H，-ArH)，6.728～6.792(m，2H，-ArH)，4.699～4.711(d，1H，-OH)，3.896～3.909(m，1H，-CHO)，3.783(s，3H，-CH3O)，3.689～3.732(m，2H，六环内-CH2N)，3.654(m，1H，六环外接酰胺氮-CH2)，3.558～3.580(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.097～3.150(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，2.978～3.011(t，2H，六环内-CH2)，2.543(s，3H，吡咯环-CH3)，2.414～2.425(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.299～2.308(m，2H，吗啡啉环-CH2N)。
实施例20
(S，Z)-2-[4-(2，6-二氟-苯基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚甲基]-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00442
重复本发明实施例5第六步反应，不同的是使用实施例5第五步中所得到的化合物(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f和4-(2，6-二氟-苯基)-1，3-二氢-吲哚-2-酮作原料，得到标题产物(S，Z)-2-[4-(2，6-二氟-苯基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚甲基]-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮20(52mg，黄色固体)，产率：84.7％。
MS m/z(ESI)：549.3(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.604(s，1H，吡咯环-NH)，11.171(s，1H，吲哚-NH)，7.646～7.666(m，1H，-ArH)，7.338～7.380(m，2H，-ArH)，7.244～7.282(m，1H，-ArH)，7.008～7.027(m，1H，-ArH)，6.900～6.919(m，1H，-ArH)，6.657(s，1H，-CH＝C)，4.672～4.683(d，1H，-OH)，3.855～3.868(m，1H，-CHO)，3.541～3.673(m，7H，六环内-CH2N，六环外接酰胺氮-CH2，吗啡啉环2×-CH2O)，3.077～3.130(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，2.955～2.988(t，2H，六环内-CH2)，2.394(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.266～2.280(m，2H，吗啡啉环-CH2N)，1.856(s，3H，吡咯环-CH3)。
实施例21
(S，Z)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-2-[5-(4-甲氧基-苯基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚甲基]-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
重复本发明实施例5第六步反应，不同的是使用实施例5第五步中所得到的化合物(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f和5-(4-甲氧基-苯基)-1，3-二氢-吲哚-2-酮作原料，得到标题产物(S，Z)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-2-[5-(4-甲氧基-苯基)-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚甲基]-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮21(53mg，橙黄色固体)，产率：87.2％。
MS m/z(ESI)：543.3(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.708(s，1H，吡咯环-NH)，11.004(s，1H，吲哚-NH)，7.321～7.852(m，1H，-ArH)，7.673(s，1H，-CH＝C)，7.582～7.604(m，2H，-ArH)，7.254～7.277(m，1H，-ArH)，7.070(m，1H，-ArH)，7.016～7.038(d，2H，-ArH)，4.704～4.716(d，1H，-OH)，3.855～3.868(m，1H，-CHO)，3.806(s，3H，-CH3O)，3.659～3.728(m，3H，六环内-CH2N，六环外接酰胺氮-CH2)，3.559～3.581(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.077～3.130(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，2.990～3.024(t，2H，六环内-CH2)，2.539(s，3H，吡咯环-CH3)，2.415～2.427(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.294～2.311(m，2H，吗啡啉环-CH2N)。
实施例22
(S，Z)-2-(4-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮
Figure A200710141874D00461
重复本发明实施例5第六步反应，不同的是使用实施例5第五步中所得到的化合物(S)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-4-氧代-4，5，6，7-四氢-1H-吡咯并[3，2-c]吡啶-2-甲醛5f和4-溴-1，3-二氢-吲哚-2-酮作原料，得到标题产物(S，Z)-2-(4-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮22(43mg，橙黄色固体)，产率：74.5％。
MS m/z(ESI)：515.2(M+1)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6) 13.670(s，1H，吡咯环-NH)，11.189(s，1H，吲哚-NH)，8.562(s，1H，-CH＝C)，7.201～7.221(m，1H，-ArH)，7.042～7.081(m，1H，-ArH)，6.920～6.938(m，1H，-ArH)，4.709～4.721(d，1H，-OH)，3.902～3.915(m，1H，-CHO)，3.631～3.745(m，3H，六环内-CH2N，六环外接酰胺氮-CH2)，3.558～3.580(t，4H，吗啡啉环2×-CH2O)，3.090～3.143(q，1H，六环外接酰胺氮-CH2-)，3.011～3.035(t，2H，六环内-CH2)，2.479(s，3H，吡咯环-CH3)，2.413～2.426(m，4H，吗啡啉环-CH2N，接吗啡啉-CH2N)，2.293～2.311(m，2H，吗啡啉环-CH2N)。
实施例23
(R，Z)-2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮马来酸盐
室温下，将(R，Z)-2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮1(709mg，1.562mmol)和顺丁烯二酸(217mg，1.874mmol)搅拌下溶解于150ml甲醇中，搅拌均匀后，混合液于40℃油浴中加热搅拌20分钟。反应液减压抽滤，滤液减压浓缩后加入50ml乙腈，加毕，加热回流20分钟。反应混合物冷却至室温后减压抽滤得到标题产物(R，Z)-2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮马来酸盐23(811mg，黄色固体)，产率：91.1％
MS m/z(ESI)：455.2(M+1)。
实施例24
(R，Z)-2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]吡啶-4-酮苹果酸盐
室温下，将2-羟基-丁二酸(231mg，1.72mmol)搅拌下溶解于100ml甲醇中，再分批加入(R，Z)-2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]嘧啶-4-酮1(560mg，1.233mmol)，200ml甲醇和100ml水。加毕，反应体系于50℃油浴中避光加热搅拌至澄清，过滤，滤液减压下蒸除溶剂得到黄色固体。向所得固体中加入100ml乙腈，避光加热回流1.5小时，撤去油浴，反应体系温度自然冷却至室温，过滤得到标题产物(R，Z)-2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-次甲基)-5-(2-羟基-3-吗啡啉-4-基-丙基)-3-甲基-1，5，6，7-四氢-吡咯并[3，2-c]嘧啶-4-酮苹果酸盐24(718mg，黄色固体)，产率：99％。
MS m/z(ESI)：455.2(M+1)。
测试例：
生物学评价
例1：抑制细胞增殖测试
下面的体外试验是用来测定本发明化合物对于人类肿瘤细胞HUVEC VEGFR高表达的细胞株抑制增殖活性。
下面所述的体外细胞试验可确定受试化合物的对高表达VEGFR的肿瘤细胞的抗血管生成活性和抑制增殖活性，其活性可用IC50值来表示。此类试验的一般方案如下：首先选择高表达VEGFR的人类肿瘤细胞，以适宜细胞浓度下(exp 5000个细胞/ml medium)接种在96孔培养板上，然后将细胞在二氧化碳恒温箱内进行培养，当它们生长至85％汇合，更换培养基为加有一系列浓度梯度(一般6到7个浓度)受试化合物溶液的培养基，将培养板重新放回培养箱，连续培养72个小时。72小时后，可用sulforhodamine B(SRB)方法进行测试化合物对于抑制细胞增殖活性。IC50值可通过一系列不同浓度下，受试化合物对于细胞的抑制数值进行计算。
材料和方法：
a.二甲基亚砜(Sinophma chemical reagent company，目录T20050806号)
b.HUVEC细胞(购于Institute of biochemistry and cell biology)
c.Falcon 100mm细胞培养板(Baton Dickison Labware，Baton Dickison andcompany，目录18677号)
d.corning 96孔培养板(Corning Incorporated，目录3599号)
e.Fisher移液管(Fisher scientific，目录03-692-164号)
f.DMEM/F12细胞培养基(Gibco，目录12400-024号)
g.澳大利亚胎牛血清(Gibco，目录10099-141号)
h.磷酸盐缓冲盐水(Gibco，目录10010-072号)
i.0.25％胰岛素-EDTA(Gibco，目录25200-056号)
j.Sulforhodamine B(Sigma，目录3520-42-1号)
k.醋酸(Sinophma chemical reagent company，目录T20060508号)
l.三氯醋酸(Sinophma chemical reagent company，目录T20060305号)
m.Tris碱(Amresco，目录0826号)
n.II级A/B3型生物学安全工作橱(ThermoForma目录.HB0053-03号)
o.系列II水套式二氧化碳培养箱(ThermoForma模型：3111)
p.离心机(Fisher Scientific Marathon 8k，目录0027-02号)
q.Novastar板读取器(BMG Labtech，目录700-0081号)
r.定轨摇床(Qilinbeier，目录TS-1号)
方案：
下面的方案用来测试本发明受试化合物对于HUVEC细胞的抑制细胞增殖IC50值。
1.将HUVEC细胞殖于100mm corning培养板在生长基(以DMEM/F12+10％胎牛血清为培养液)中进行培养(37℃，5％ CO2)，直至细胞充分汇合；
2.在100mm培养板中用胎牛血清洗涤HUVEC细胞，以Tyrpsin消化细胞后，再将细胞接种在corning 96孔细胞培养板上，浓度为50000cells/ml，每个板空6孔，作为对照孔.；
3.在37℃，5％ CO2条件下，将细胞在96孔板中培养，直至达到约85％汇合；
4.用DMSO溶解受试化合物，配置20mM母液，后用DMSO稀释母液，得到一系列浓度的受试化合物的溶液，即2mM，1mM，0.2mM，20μM，2μM，0.2μM；
5.使用细胞培养基(DMEM/F12+10％胎牛血清为培养液)稀释上面所配置的化合物溶液。每个DMSO系列浓度化合物溶液稀释20倍，每次在细胞培养基中加入5μl DMSO化合物溶液和95μl培养液，确保HUVEC细胞暴露在DMSO溶液中的浓度不超过0.5％，用涡旋混合，；
6.当HUVEC细胞贴壁，生长达到85％汇合后，将培养基换为加有DMEM/F12+10％胎牛血清培养液的新培养基，每孔中再加入180μl培养液和20μl在第五步中所制备的受试化合物溶液。阴性对照细胞组，加入含有0.5％ DMSO的20μl培养液，这样HUVEC细胞暴露在受试化合物溶液中的最终浓度为100μM，10μM，5μM，1μM，0.1μM，0.01μM，and0.001μM；
7.将培养板放入恒温箱内，在37℃，5％ CO2条件下，连续培养72小时；
8.72小时后，将培养板从恒温箱中转移到无菌工作室；
9.将试药级纯水加入到TCA中制备固定剂(50％三氯醋酸-TCA)，将细胞慢慢地分层放在50μl冷TCA溶液中；
10.在4℃下，培养1小时，后用水洗涤数次以除去TCA、血清蛋白等。培养板在空气中干燥，存储待用。空白背景光学密度值的测定是在没有细胞生长的培养基中温育培养所得的数值。
11.用10％醋酸溶液制备0.4％ Sulforhodamine B溶液，并向每孔中加入50μlsulforhodamine B溶液；
12.细胞着色30分钟；
13.制备10％醋酸洗涤溶液。当着色将要完毕时，弃去着色剂，用10％的醋酸溶液快速冲洗细胞。重复上述的操作直至着色剂洗净为止，尽量减少冲洗次数以减少与蛋白结合的着色剂的去吸附。冲洗完毕后，将培养板在空气中干燥；
14.混合的着色剂溶解在一定体积的Sulforhodamine B中，增溶溶液(10mM Tris)与培养基原体积相同，将培养板在室温下放置5分钟，用摇床缓慢搅拌加快与染料的混合；
15.用分光光度测量，在波长565nm下读取吸光度值。吸光度数值为565nm下吸光度减去690nm下96孔板背景吸光度所得的数值；
16.使用如下方法计算抑制率比值：
IR＝100×(对照组吸光度值-用药组吸光度值)/对照组吸光度值％.
IC50值可通过不同浓度下化合物抑制率比值计算得到。
本发明化合物的活性
本发明化合物的生化学活性通过以上的试验进行测定，测得的IC50值见下表。
 
实施例编号 IC50(VEGFR/HUVEC)(μM)
1 0.027
2 2.4
3 0.84
5 0.012
 
20 0.01
例2：VEGF-R2激酶活性测定
本试验采用酶联吸附免疫测定法(ELISA)测定重组人类VEGF-R2蛋白体外激酶活性。
材料与试剂：
a.洗涤缓冲液(PBS-T缓冲液)：1x PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、4.3mMNa2HPO4、1.4mM KH2PO4，调pH至7.2)和0.05％ Tween-20
b.1％牛血清白蛋白(BSA，Calbiochem #136593)PBS-T缓冲液
c.中止反应缓冲液：50mM EDTA，pH 8.0
d.铕标记抗鼠IgG(PerkinElmer Life Sciences #AD0124)
e.
Figure A200710141874D00512
信号倍增液(PerkinElmer Life Sciences #1244-105)
f.
Figure A200710141874D00513
 Streptavidin包96孔黄板(PerkinElmer Life Sciences #AAAND-0005)
g.重组人类VEGF-R2激酶(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM NaCl，5mM DTT，15mM谷酰基胱氨酰甘氨酸和20％甘油(Cell signaling technology #7787)
h.10mM ATP溶液(Cellsignaling technology #9804)
i.Biotin-Gastrin Precursor(Tyr87)Peptide(Cell signaling technology #1310)
j.Phospho-Tyrosine Mouse mAb(P-Tyr-100)(Cell signaling technology #9411)
k.HTScanTM酪氨酸激酶缓冲液(4x)
1x激酶缓冲液：
60mM HEPES
5mM MgCl2
5mM MnCl2
3μM Na3VO4
(Cell signaling technology #9805)
1.1.25M DTT(1000x)(Cell signaling technology)
方案：
使用如下方案进行试验：
1.用DMSO稀释受试化合物至所需最终浓度，在每个试验中加入1μl待测化合物、一个阴性对照和空白对照(均不接受任何受试化合物)；
2.用dH2O1:1稀释6μM底物蛋白(Tyr87)，并在每个测试中加入15μl；
3.将VEGF-R2酶从-80℃直接转移到冰上，酶解冻在冰上；
4.取2.2μgVEGF-R2酶到每个测试中；
5.加入10μl DTT(1.25M)到2.5ml 4x HTScanTM酪氨酸激酶缓冲液(240mMHEPES pH 7.5，20mM MgCI2，20mM MnCI2，12μM Na3VO4)中，制得DTT/激酶缓冲液；
6.转移0.75ml DTT/激酶缓冲液到每个每个测试中，制得4x反应混合液，并在每个测试中加入7.5μl 4x反应液；
7.加入2μl ATP(10mM)至498μl dH2O中，并在每个测试中加入7.5μl；
30μl反应最终测试条件为：
60mM HEPES pH 7.5
5mM MgCl2
5mM MnCl2
3μM Na3VO4
1.25mM DTT
10μM ATP
1.5μM多肽底物
22ng VEGF-R2激酶
8.在25℃下，将反应管温育30分钟；
9.每个测试中加入30μl反应中止缓冲液(50mM EDTA，pH 8.0)中止反应；
10.在96孔streptavidin包被培养板每孔中加入25μl反应液和75μl dH2O，在室温下，振摇60分钟；
11.每孔用200μl PBS-T缓冲液洗涤3次，在纸巾上轻拍以除去剩余的液体；
12.用1％牛血清白蛋白PBS-T缓冲液1:1000稀释主要抗体Phospho-酪氨酸mAb(P-Tyr-100)，并在每孔中加入100μl稀释的p-Tyr-100抗体；
13.室温下，振摇温育60分钟；
14.按第11步所述方法进行洗涤；
15.用1％牛血清白蛋白PBS-T缓冲液1:500稀释铕标记的抗鼠IgG，并在每个孔中加入100μl稀释的抗体；
16.室温下，振摇温育30分钟；
17.每孔用PBS-T缓冲液200μl洗涤5次，在纸巾上轻拍以除去剩余的液体；
18.每孔中加入100μ 信号倍增液；
19.室温下，振摇温育5分钟；
20.在波长615nm下，用合适的时间分辨板读取器读取荧光强度。
计算抑制率比值：IR(％)＝100-100*(X-B)/(N-B)
X＝受试化合物吸光度
N＝阳性对照
B＝空白
IC50值通过受测化合物一系列浓度梯度下的IR值来计算。
本发明化合物的活性
本发明化合物的生化学活性通过以上的试验进行测定，测得的IC50值见下表。
 
实施例编号 IC50(VEGFR/bio)(μM)
1 0.001
4 0.998
11 0.003
13 0.13
16 0.11
17 0.004

Claims (11)

1.一种由通式(I)表示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure A200710141874C00021
其中：
R1、R2、R3、R4分别选自氢原子、卤素、烷基、芳基、杂芳基、-OR5、-O[CH2CH2O]rR7、-NR5R6、-COR5或-NR5COR6，其中芳基、杂芳基进一步被一个或多个选自烷基、烷氧基或者卤素的取代基所取代；
R5和R6各自分别选自氢原子或烷基，其中烷基进一步被一个或多个选自芳基、杂芳基、卤代芳基、羟基、烷氧基、芳氧基、羧酸或者羧酸酯的取代基所取代；
R7是氢原子或者烷基；
r是1～6。
2.根据权利要求1所述的吡咯并六元杂环羟基吗啡啉类衍生物或其药学上可接受的盐，其中包括：
Figure A200710141874C00022
Figure A200710141874C00031
3.一种药物组合物，其包含药物有效剂量的如权利要求1或2任何一项所述的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物或其药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体。
4.根据权利要求1所述的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述的药学上可接受的盐为化合物与选自以下的酸形成的盐：苹果酸、乳酸、马来酸、盐酸、甲磺酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸或三氟乙酸。
5.根据权利要求4所述的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物或其药学上可接受的盐，其中所述的酸为：苹果酸或马来酸。
6.如权利要求1所述的吡咯并六元杂环羟基吗啡啉化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，该方法包括以下步骤：
氮气氛下，旋光化合物吗啡啉氨基双取代异丙醇(Ia)在1-羟基苯并三唑和N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)-碳二亚胺作用下与5-羧甲基-3-甲基-1H-吡咯-2，4-二羟酸2-叔丁酯4-乙酯在乙腈中加热得到手性的吡咯酰胺二羧酸二酯(Ib)；
Figure A200710141874C00041
氩气氛下，手性吡咯酰胺二羧酸二酯(Ib)在乙醇中与盐酸加热回流得到旋光吡咯酰胺乙酯(Ic)；
Figure A200710141874C00042
进一步，旋光吡咯酰胺乙酯(Ic)在无水四氢呋喃中和硼烷加热回流选择性还原得到手性取代吡咯乙酯(Id)；
Figure A200710141874C00043
接下来，在氩气氛下，手性取代吡咯乙酯(Id)在乙二醇中和一水合氢氧化锂加热回流，得到环合产物旋光吡咯并六元N杂环(Ie)；
Figure A200710141874C00044
室温下，旋光吡咯并六元N杂环(Ie)在无水二氯甲烷中与三氯氧磷和N’N-二甲基甲酰胺发生甲酰化反应，生成旋光吡咯并六元N杂环甲醛(If)；
Figure A200710141874C00045
最后，旋光吡咯并六元N杂环甲醛(If)在碱(如三乙胺，哌啶)存在下与不同的吲哚酮加热2～12小时即得到通式(I)所示的目标化合物手性的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉衍生物；
Figure A200710141874C00051
7.一种调节蛋白激酶催化活性的方法，该方法包括将所述的蛋白激酶与权利要求1～5中任何一项所述的吡咯并六元N杂环羟基吗啡啉类衍生物或其药学上可接受的盐接触。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述蛋白激酶选自受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶或丝氨酸-苏氨酸激酶。
9.一种根据权利要求1所述的化合物在制备治疗与蛋白质激酶有关的疾病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述与蛋白质激酶有关的疾病选自与VEGFR-2，EGFR，HER-2，HER-3，HER-4，PDGFR，c-Kit，c-Met，FGFR或Flt3相关的疾病。
11.一种调节蛋白激酶催化活性的方法，其中包括将所述的蛋白激酶与权利要求3所述的组合物接触。
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