CN101365792A - 抗乙型肝炎病毒核酶核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在CUC位点切割乙型肝炎病毒(HBV)的核酶。适当的核酶可以是，例如，在HBV RNA的GGCUCUCUCGUCCC、CCUCAGCUCUGUAUCG或GAGGA CUCUUGGA识别序列切割。提供有用的核酶DNA、载体系统和药物组合物，例如用于治疗HBV感染。

Description

抗乙型肝炎病毒核酶核酸
发明领域
本发明属于重组DNA技术领域，尤其涉及核酶技术，特别涉及抗乙型肝炎病毒(HBV)核酶的设计。
发明背景
世界范围内乙型肝炎病毒(HBV)感染很多人。接种疫苗是行之有效的预防措施，然而对于感染HBV的人来说，已经长久期待一种高效的疗法。介入治疗提供给HBV患者唯一的希望是通过阻止HBV的复制从而降低疾病的进展。已经提出很多抗HBV的疗法，并且可在一定程度上减轻该疾病，但是没有提供与该病毒作斗争的有效的疗法。
HBV基因组由3.2kb的部分双链环状DNA组成。HBV利用前基因组RNA进行复制。前基因组RNA表征为3.5kb的序列，比基因组(3.2kb)长，通过病毒聚合酶反转录。这种RNA的两端具有独特的由60个碱基组成的茎-环结构，这种茎-环结构称为ε环。已知5’端的ε环在前基因组RNA的包衣壳化中起到重要作用，并且也在反转录前为聚合酶提供结合位点。
通过利用重组DNA/RNA以调节基因表达并且特异靶向病毒基因组以终止其复制的方法已经提供了十分有效的治疗工具。核酶是特异靶序列的催化性RNA分子，以前已经被用来除去HBV。已经设计了抗HBV的锤头结构核酶来减少前基因组RNA和其蛋白质的mRNA。这些核酶被设计成能靶向HBV前基因组RNA上的三个不同位点(von Weizsacker等人，1992)。其他研究人员设计锤头结构核酶可结合并适度切割ε-环区(Beck和Nassal，1995)。锤头型核酶也被用来靶向HBV序列中编码基因X的RNA序列(Kim等人，1999，及Weinberg等人，2000)。
由于设计和合成方法的原因，先前设计的抗HBV的锤头结构核酶不能有效切割它们的靶。根据本发明的HBV核酶可在体外完全切割靶HBV序列。利用根据本发明的两个或更多核酶可导致在两个或更多不同的位点切割靶HBV信使RNA或者前基因组RNA。严格地，核酶是切割靶RNA的RNA分子。一些文献使用该术语来描述转录为RNA的DNA分子，因此产生了核酶本身。在本说明书中，术语“核酶DNA”指可转录为核酶本身的DNA。
发明概述
本发明的核酶及其在体内转录的相应核酶DNA分子被设计成能切割在HBV信使RNA或者前基因组RNA中的CUC位点。众所周知，通常核酶的治疗用途是通过使用配对物DNA，通常将其并入载体诸如质粒载体的方式来完成的。
根据本发明的核酶的设计和构建将在下文详细描述，本文通过制备三个名为MAZI、SGIII和DGII的锤头结构核酶举例说明。表1显示相对于HBV序列(表示为cDNA)这些示例的核酶在HBV mRNA上的切割位点。
从GCG(Acc.No.Y07587)获得HBV序列(AYW菌株)、ε-环区域(1848-1910)的上游500个碱基和下游500个碱基的序列。利用计算机程序‘mfold’(http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html)预测HBVRNA的二级结构以确定无NUX位点，即不涉及形成链的强结合，并针对无NUX位点设计的锤头型核酶设计二级结构。选择的NUX位点全部都是CUC位点。
通过已经设计的三个反式作用锤头结构核酶作为实例，作为HBV RNA有效切割剂的全部三个锤头结构核酶在5′端由稳定环为先导并且后面有一个或多个额外的茎环结构。通常在反式作用元件的3′端后有顺式作用核酶。整个说明书中常常将核酶的设计称为RNA核苷酸，这些RNA核苷酸是在HBV RNA靶位点有效的分子种类。然而值得注意的是体内施用的可实现切割HBV RNA的治疗剂则需存在于合适的载体系统中的相应的DNA多核苷酸。
一方面，本发明提供一种包含至少一个DNA载体的载体系统，该载体包含在对人类细胞有效的启动子控制下的靶向切割的锤头型核酶DNA序列，其一旦转录为RNA将在CUC切割位点切割从编码HBV RNA的靶基因转录的mRNA。
核酶DNA序列与启动子的连接可以是直接的，并且仅仅需要使用单个载体。然而，优选间接连接，其可增强启动子的作用。通常这样的间接连接将需要两个或更多载体。因此，本发明包括包含至少两个DNA载体的载体系统，其中第一个载体包含对人类细胞有效的第一启动子，第一启动子有效连接于可表达产生能作用于第二启动子的激活蛋白的基因，和第二个载体包含有效连接于上述靶向切割锤头结构核酶DNA序列的第二启动子。核酶DNA序列可包含在两个或更多位点切割HBV RNA的复合序列。本文使用的术语“载体系统”是包含单个载体或者试剂盒或者组合物或者两个或更多载体的通用术语。
此外，本发明包括核酶DNA，其本身和包含在载体内的核酶DNA序列，该核酶DNA进一步包含，靶向切割核酶序列的下游，3′自催化的锤头结构核酶DNA序列，因此当核酶DNA转录为RNA时它表现为双锤头结构，具有靶向HBV RNA的靶向切割核酶的第一和第二茎及3′自催化核酶的第一和第二茎，及常规的连接这两个锤头的第三茎。第三茎优选在接近HBV核酶序列3′端有至少4个碱基，并能与接近自催化核酶序列3′端的至少4个碱基的互补序列碱基配对，以至于当碱基配对时形成所述的常规茎连接靶向切割核酶和3′自催化核酶的锤头。
本文使用的动词“包含(comprise)”，无论以任何语法形式出现，意指由...组成(consist of)或包括(include)。
附图简述
图1描述本发明MAZI核酶的靶向切割核酶序列。
图2描述本发明SGIII核酶的靶向切割核酶序列。
图3描述本发明DGII核酶的靶向切割核酶序列。
图4显示在切割位点附近连接了HBV RNA的MAZI核酶。
图5显示在切割位点附近连接了HBV RNA的SGIII核酶。
图6显示在切割位点附近连接了HBV RNA的DGII核酶。
图7表明以反式/顺式双核酶与自催化核酶结合的MAZI核酶。
图8表明以反式/顺式双核酶与自催化核酶结合的SGIII核酶。
图9表明以反式/顺式双核酶与自催化核酶结合的DGII核酶。
图10、11和12是含溴化乙锭琼脂糖凝胶的照片，包含人类HBV RNA及与MAZI、SGIII和DGII核酶孵育，MAZI、SGIII和DGII核酶分别相应于本发明载体系统提供的核酶DNA序列；这些照片表明在孵育4小时后HBV RNA如何已经被切割。
图13是显示本发明3-质粒载体系统的示意图，第一个质粒包含驱动从T7聚合酶基因转录mRNA的CMV启动子，第二个质粒包含驱动从T7聚合酶基因转录mRNAT7的启动子，第三个质粒包含驱动从核酶DNA盒转录RNA的T7启动子，其中核酶DNA盒在三个不同位点靶向HBV RNA。
图14是慢病毒载体包装和被膜构建体示意图。
pCMVΔR8.91(http：//www.medecine.unige.ch/～salmon/main/R891.GIF)及pCMV-VSV-G(www.brc.riken.jp/lab/cfm/map/pCMV-VSV-G％20map.pdf)。
图15是慢病毒载体基因转移构建体pHR cRT7HBVRz示意图，其包含HBV核酶MAZI、DGII和SGIII的表达系统。与红色荧光蛋白融合的T7RNA聚合酶在CMV启动子调控下表达，并且从它们的各自的DNA盒克隆下游转录MAZ、DG和SG核酶。这些载体用于结合包装质粒以生成Lenti-HBVRz病毒。
图16是HBV靶序列表达构建体的示意图。pHBV1是包含HBV基因组1-1579(Accession no.Y07587)片段的哺乳动物表达载体。该载体存在MAZIRz的切割位点。pHBV2也是包含HBV片段1500-3182(Accession no.Y07587)的哺乳动物表达载体。该载体存在核酶DGII和SGIII的切割位点。
图17是用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶染色的照片，显示利用慢病毒递送MAZI、SGIII和DGII后HBV靶序列的切割。
优选实施方案描述
本发明的核酶可以是锤头型。核酶具有能在目标靶位点切割RNA的催化序列。锤头型核酶的催化序列通常是这种形式(5′到3′)(1)cuganga...和(2)...gaa，其中n指任何核苷酸。在本发明中n优选u。它们通过稳定结构分隔，稳定结构优选茎环。本发明的核酶DNA可以具有这种形式(以胸腺嘧啶取代尿嘧啶)。
对于本发明的目的，HBV RNA中最优选的靶序列是
MAZI：        5’        ggcucucucguccc   3’(SEO ID NO：1)
SGIII：       5’        ccucagcucuguaucg 3’(SEQ.ID NO：2)
DGII：        5’        gaggacucuugga    3’(SEQ ID NO：3)
下划线部分是对于本发明的锤头型核酶所需的三个碱基的必要序列。
催化序列的即时上游和下游是靶向结合(即靶识别)序列。靶是RNA，并且也是一种RNA的核酶与靶RNA互补，(不考虑存在于靶中的额外的c核苷酸，见下文所解释的)。
涉及优选靶和结合到靶上的核酶的序列概括如下：
MAZI
(a)5′ggcucu         c*        ucguccc        3′(靶RNA)
(b)3′ccgaga-cat.seq.-s.l.-cat seq.-agcaggg   5′(rz RNA)
(c)5′ggctct-cat.seq.-s.l.-cat seq.-tcgtccc   3′(rz DNA；链1)
(d)3′ccgaga-cat.seq.-s.l-cat seq.-agcaggg     5′(rz DNA；链2)
SGIII
(a)5’ccucagcu       c*      uguaucg           3’(靶RNA)
(b)3′ggagucga-cat.seq.-s.l.-cat.seq-acauagc   5′(rz RNA)
(c)5’cctcagct-cat.seq.-s.l.-cat.seq.-tgtatcg  3’(rz DNA；链1)
(d)3’ggagtcga-cat.seq.-s.l.-cat.seq.-acatagc  5’(rz DNA；链2)
DGII
(a)5’gaggacu         c*     uugga               3’(靶RNA)
(b)3′cuccuga-cat.seq.-s.l.-cat.seq.-aaccu       5′(rz RNA)
(c)5’gaggct-cat.seq.-s.l.-cat.seq.-ttgga        3’(rz DNA；链1)
(d)3’ctcctga-cat.seq.-s.l.-cat.seq.-aacct       5’(rz DNA；链2)
(*＝切割的核苷酸，cat.seq.＝催化位点；s.l.＝茎环)
对于靶向HBV RNA的核酶MAZI，5′gaggacu3′是第一个靶识别序列而5′ucguccc3′是第二个靶识别序列。在该靶序列中的切割位点是cuc*，加星号的c核苷酸是切割位点并且在核酶中没有配对物。MAZI核酶的序列(a)和(b)显示于附图的图1中。
对于靶向HBV RNA的核酶SGIII，5′ccucagcu3′是第一个靶识别序列而5′uguaucg3′是第二个靶识别序列。在该靶序列中的切割位点是cuc*，加星号的c核苷酸是切割位点并且在核酶中没有配对物。SGIII核酶的序列(a)和(b)显示于附图的图2中。
对于靶向HBV RNA的核酶DGII，5′gaggacu3′是第一个靶识别序列而5′uugga3′是第二个靶识别序列。在该靶序列中的切割位点仍是cuc*。用于本发明的核酶的优选亚属具有这些靶识别序列。DGII核酶的序列(a)和(b)显示于附图的图3中。
在下文的描述中，锤头结构核酶的结构以RNA形式被讨论，但是应当理解被它们用作模板转录的核酶DNA与之对应，其中胸腺嘧啶取代了尿嘧啶。本文显示的这些核酶构象也可理解为是那些明显来自碱基配对及其他能量考量的，然而本发明不局限于这些附图，即本发明包括同样分子的其他构象。
锤头结构核酶通过两个茎环来维持，第一个茎环(“茎I”)在第一个靶识别序列前，第二个茎环(“茎II”)位于第一个和第二个靶识别序列之间。这两个茎环可具有任何所需的形式，但通常包括3到5个形成的茎的互补碱基对和环中的4或5个碱基。
接着的第二个催化序列是第三个茎，其由第二个靶识别序列组成或包含第二个靶识别序列。在本发明的一个实施方案中，如果所述茎III不是天然存在，则在MAZI和SGIII的3′端茎III可以部分或全部地增加guc特异序列。其中，在这里，对于SGIII，g是天然末端，uc作为突出端添加，而对于MAZI guc作为突出端添加，因此其最后的几个碱基与第二个催化序列的碱基配对。对于DGII，c是作为突出端添加的。图4显示MAZI结合到它的靶位点，图5显示SGIII附着于它的靶区域以及图6显示DGII结合到它的靶位点。这些图表通过a-u和g-c碱基配对完成。
更优选，核酶包含3′自催化序列。这样的序列本身是已知的，尤其可来自PCT专利申请出版物N°WO 97/17433(Medical University of SouthCarolina)。3′自催化序列优选如下设计，接近靶向切割核酶的3′端序列与自催化序列的下游部分在或接近于其3’端碱基配对。这些优选的构建体在茎III中至少有4个碱基对。它们也可有多至10个这样的碱基对。通常，延伸于茎III外的非碱基配对的突出端仅仅是靶切割核酶序列3′端的1或2个和自催化序列3′端的0到5个。这样的构建体在图7的MAZI、在图8的SGIII及在图9的DGII举例说明。这里的3′自催化(＝自切割)序列是锤头结构核酶形式，其包含3′切割位点(对于MAZI和SGIII是guc，对于DGII是cuc)，第一个茎环(“scrz茎I”)，第二个茎环(＂scrz茎II＂)和第三个茎(＂scrz茎III＂)，第三个茎与靶向切割核酶的茎III碱基配对。切割发生在3′切割位点guc的c后。在scrz茎I和scas茎II之间的催化序列(cugauga)帮助稳定锤头结构并且也用于WO 97/17433。茎II和III之间提供gaa催化位点。
用于本发明的核酶可包含5′自催化序列，例如如WO 97/17433中描述的。WO 97/17433提供一种双重核酶，其包含位于中心的BglII克隆位点agatct，该克隆位点可插入任何需要的靶识别和催化序列。在WO 97/17433中，该插入片断为42个碱基。其包括第一个靶识别序列(8个碱基)，催化和结构稳定序列(23个碱基)和第二个靶识别序列(11个碱基，其最后两个是BglII位点的ag)。略作修改，相同的构建体可适合于本发明，例如用与图1中13-48位36个碱基等效的DNA取代WO 97/17433的23个碱基，在其3′端增加为克隆入BglII位点所需的核苷酸。在该构建体中，可除去茎I并由WO 97/17433中包含5′自催化位点的5′序列取代茎I。然而，WO97/17433中催化位点间的序列部分不是紧密的茎环形式因此呈现出较低的结构稳定性。
聚合酶载体的工程
关于图13，聚合酶载体pCS2P包含来自巨细胞病毒(CMV)的启动子和T7聚合酶基因。完整的T7聚合酶DNA序列可以从Genbank/EMBL获得，登录号为Accession No.M.38308。在该实例中，修饰的T7聚合酶DNA通过在质粒pT7AutoI[J.Dubendorff和F.Studier，J.Mol.Biol.219，61-68(1991)]上利用PCR获得并放大。用于PCR的引物在正向引物的5′端引入EcoRI和NcoI限制酶切位点；在反向引物的5′端引入BamHI。(BamHI以后用于自主聚合酶载体的克隆。)如下是引物序列，下划线表示重叠的T7聚合酶。
正向：
5’acgaattccatggacacgattaacatcg 3’
EcoRI位点＝gaattc；NcoI位点＝ccatgg
反向：
5’atataaggatccttacgcgaacgcgaac 3’
BamHI位点＝ggatcc
利用Vent聚合酶(该聚合酶在PCR产物中形成“平端”)实施该PCR。通过正向引物引入的NcoI位点是额外的克隆位点，其通过改变T7聚合酶的第二个密码子形成，将其DNA从天冬酰胺Asn(aac)改为天冬氨酸Asp(gac)。这没有改变T7聚合酶的活性。
将T7聚合酶的PCR产物克隆入pCS2-NLS质粒(R.A.W.Rupp等人，Genes and Development 8，1311-1323(1994)和D.L.Turner & H.Weintraub ibid.1434-1447)。在pCS2-NLS中的EcoRI位点和SnaB1(平端)位点引入T7聚合酶DNA，T7聚合酶DNA位于NLS顺时针方向稍后位置。pCS2中的NLS序列在此阶段对于现目的不是必需的，并且由于NLS序列位于两个NcoI位点之间其可通过限制性内切酶NcoI切割而除去。然后通过NcoI位点再连接该质粒。从而如图13所示的聚合酶质粒载体(pCS2P)完成了。它包含可开启产生T7聚合酶的CMV启动子(已存在于pCS2载体中)。核酶DNA载体和自身聚合酶载体都需要T7聚合酶，详见下文。
自身聚合酶(autopolymerase)载体的工程
该载体的用途是提供稳定并且充足的T7聚合酶供给。T7启动子用来开启T7聚合酶的产生。该聚合酶进行自主催化产生更多的T7启动子，T7启动子可产生更多T7聚合酶(图13)。
利用转染载体通过非哺乳动物启动子产生的mRNAs在哺乳动物细胞细胞质中通常不能被识别而不能通过细胞翻译成蛋白质。为了诱使细胞翻译由启动子转录的T7聚合酶mRNA，增加了脑心肌炎(EMC)病毒UTR(非翻译区)序列(Moss等人，Nature 348，91-92(1990))。该序列充当翻译增强子，为核糖体提供结合位点，该序列通过从pTM1载体PCR扩增EMC UTR而获得；参见B.Moss等人，Nature 348，91-92(1990)。所使用的引物在正相链中包含XbaI限制酶切位点。反向引物不引入限制酶切位点，因为从该载体中获得的EMC序列包含几个工程化的限制酶切位点，诸如BamHI和NcoI。如下是引物序列，下划线表示重叠的EMC序列：
正向：
5’gctctagaccacaacggtttccctctag 3’
XbaI位点＝tctaga，
反向：
5’cagcttcctttcgggctttgttagcagc 3’
然后利用XbaI和BamHI位点将EMC序列克隆入pET11a(NovagenLtd.)。图谱参见例如R & D Systems Ltd.的1996/97目录，Abingdon，Oxfordshire，England.第74页。EMC UTR序列其3′端在BamHI位点前天然包含NcoI限制酶切位点。因此，如上第6节所述的包含NcoI和BamHI位点的T7聚合酶序列容易克隆入质粒EMC UTR序列的下游，如X.Chen等人，Nucleic Acids Research 22，2114-2120(1994)描述的。参见例如图13的质粒pZEQ。
关于图13，该核酶载体包含编码MAZI、DGII和SGIII的核酶DNA。一直以来都希望可在HBV的侵染、增殖和复制周期的一个以上点攻击HBV。因此相同的载体可包含一个或多个其他种类的核酶DNA，这些核酶DNA将靶向对HBV增殖或复制重要的由HBV产生或者形成新HBV基因组所需的其他RNA。因此，图13说明包含MAZI、DGII和SGIII三种核酶DNA的载体。
为了“诱使起始”启动子，希望提供不同来源的聚合酶是可取的，为了该目的可以是酶本身，也可以是更优选的另外载体形式，也可以优选质粒。参见图13的质粒pCS2P。
关于图13，pCS2P包含驱动T7聚合酶基因转录的CMV启动子，第二个质粒pZEQ包含用于产生T7聚合酶的T7自身基因系统，和第三个质粒，其中由前两个质粒产生的聚合酶激活的T7启动子驱动被引入到核酶载体中的HBV核酶的转录，如图13中显示。可利用其他的翻译增强子代替图13中显示的那些。
在一些实施方案中，优选慢病毒载体。由HIV获得的慢病毒载体在体外和体内基因转移中是长期稳定的。这些载体因为可传递大的转基因(高达18kb)并且有能力稳定转导分裂细胞和非分裂细胞而有吸引力。这样的系统通常利用无肠HIV基因组以阻止复制，并且除去可导致侵染和毒性的病毒基因。为了进一步增加该系统的安全性并减少有复制能力的反转录病毒产生的可能性，通常通过在体外共转染3个质粒进入细胞系而装配慢病毒基因转移载体；包装构建体，包膜构建体和基因转移构建体。这样的载体也可自我失活。参见Zuffrey等人，J Virology 72，9873-9880(1998)。为了扩大该载体的向性并改善其生化性质，这样的载体往往来自水泡性口膜炎病毒(VSV-G)，且是具有包膜蛋白的假型。在当前的实施方案中，图14显示包装构建体，图15显示VSV-G包膜构建体，以及图16显示包含核酶MAZI、SGIII和DGII的基因转移构建体。
所使用的递送方法包括给药载体的胶囊化，特别是；经逆转录病毒(包括慢病毒)载体转导和与胆固醇接合的脂质体。
给药载体对系统和局部给药都是有效的。它们可设计成为缓释容器，或者直接递送其内容物到靶细胞。这样专门的给药载体的实例为脂质体、水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米微囊及生物粘附微球。
优选脂质体。它们是由类似细胞膜脂质方式排列的脂质组成的空心球形囊泡。它们具有截留水溶性成分的内部含水空间，其直径大小范围从0.05到几个微米。脂质体可递送DNA到细胞，因此该核酸保持生物学活性。
它们可通过混合DNA与脂质体形式的脂质诸如二烷基的或者甘油二酯或者磷脂酰胆碱而容易制备。如本领域已知的脂质体生成，参见J.J.Rossi等人，AIDS Research and Human Retroviruses 8，183-189(1992)。
对本发明有用的脂质体制剂包括：(a)包含聚阳离子脂质摩尔比率的lipofectamine试剂(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD USA)，(b)阳离子脂质，DDAB和DOPE，比率为2:1，R.Philip，Mol.Cell.Biol.14，2411-2418，(1994)；和(c)DMRIE，选择性地与DOPE结合，例如以1:1的摩尔比率(VICAL Corp.San Diego，CA，USA)。也可使用新型脂质体，例如血清抗性阳离子脂质GS 2888，J.G.Lewis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，3176(1996)及包含聚赖氨酸/DNA复合物的脂质体，S.Li和L.Huang，J.LiposomeResearch 7，63-75(1997)。
已经发展纳米颗粒和水凝胶传递体用于化疗剂和基于蛋白质的药物，并且必然可适合于本发明目的的核酶递送。
另一个递送方法是通过T细胞。适合的T细胞，优选患者自己的T细胞感染本发明核酶DNA，例如经电穿孔然后灌输这些细胞到患者。带有DNA的T淋巴细胞的电穿孔描述于PCT出版物WO 96/22638的实施例6中(GeneShears Pty Ltd.)并且该方法可应用到本发明。
药物用途的组合物通常包含镁盐，优选氯化镁缓冲液，这是核酶功能所需要的。它们也可包含含有助悬剂或者乳化剂的载体或者稀释剂。
本发明的载体系统，优选慢病毒载体系统，优选全身施用，例如经静脉注射、皮下注射、腹腔内、鼻内或者鞘内途径。由载体系统提供的核酶剂量取决于疾病指征和给药途径但是应该达到200mg/kg，并且通常每天最低以重量计为10mg/kg。剂量学将取决于临床试验的有效数据。
以下实例举例说明本发明。本文使用的所有DNA寡核苷酸可通过标准的合成法制备，例如利用磷酸三酯法的固相合成。
MAZI核酶DNA盒
构建具有核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的完整的核酶DNA盒：
aaggtaccta     atacgactca      ctatagggcg
aaagcccggg     acgactgatg      agcgcgaaag
cgcgaaagag     ccgtcgtgca      cgcgaaagcg
tgcacctgat     gaggccggaa      aggccgaaac
ggctctttgg     atcctctaga      tt  (143)
它由编码序列1到80位的正向寡聚物和143到58位的反向寡聚物利用寡核苷酸合成仪合成。该寡聚物3′端的26个碱基彼此完全互补并退火这两条链。在PCR仪上利用DNA聚合酶延伸它们使其成为完整的双链。利用分别针对5′端和3′端的KpnI和XbaI位点将长143的双链DNA盒克隆入pUC19。通过DNA测序确认序列。该盒包含T7启动子，市场上可买到的pUC19不包含该位点。
5’aaaggtacc   taatacgactcactata  gggcgaaagccc   gggacga
    KpnI       T7启动子           稳定环         MAZI茎I
ctgatga       gcgcgaaagcgc    gaa           agagcc gtc
催化结构域    茎II            Cat Dom       茎III突出端
gtgcacgcgaaagcgtgcac ctgatga       ggccggaaaggcc  gaa
用于Sc核酶的茎I      Sc.Cat.Dom    Sc茎II         Sc.Cat.Dom
acggctcttt ggatcc tctaga tt 3’
Sc茎III         XbaI
从5′端起始，最初的9个碱基组成KpnI限制酶切位点，其后有17个碱基形成随后的T7启动子序列，12个碱基折叠成维持稳定的茎环结构，后面是互补于1493-1486的7个碱基的靶特异区，形成茎I。催化结构域ctgatga……gaa居间茎II序列形成夹心形式。茎III结构由随后的反向互补于HBV序列1485-1480的5个碱基组成。最后的3个碱基提供3′顺式作用核酶的NUX位点并且是突出端。随后20个碱基形成顺式作用核酶的茎I，后面是茎II位于中间的催化结构域碱基。最后是茎III。最后的14个碱基组成BamHI和XbaI酶的两个限制酶切位点。图1显示反式作用MAZI核酶和图7显示顺式和反式作用MAZI核酶的结构。
通过在“Ribomax”溶液中加入T7聚合酶来生产核酶RNA，如Promega“Protocols and Applications Guide”手册中描述的。＂Ribomax”是一种包含核酶活性必需的镁离子的平衡盐溶液。T7聚合酶引发T7启动子从DNA转录RNA。通过利用无RNase的DNase，继之RNA的酸/苯酚分离，然后乙醇沉淀来分离转录物。按照上述引用的“Molecular Cloning-ALaboratory Manual”中的描述进行。
当在琼脂糖凝胶上电泳RNA时，切割前的核酶(103个碱基，图7)明显与切割后的核酶分离(50个碱基，图1)。
MAZI靶向切割
HBV基因组DNA克隆入pcDNA3，其被用于生产HBV的RNA转录物(上述引用的“Molecular Cloning-A Laboratory Manual”)。
从上述第2节描述的质粒转录的核酶与HBV RNA转录物以1摩尔核酶对1摩尔HBV RNA转录物的摩尔比率孵育。在37℃孵育4小时，使得HBV RNA靶的完全切割。在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上电泳RNA。图10显示紫外线照射下的凝胶照片。泳道1为分子量标准参照物，泳道2为与24mM MgCl2在37℃孵育4小时的HBV转录物，泳道3为和等摩尔MAZI核酶转录物与24mM MgCl2在37℃孵育4小时的HBV转录物。可以清楚地看到MAZI核酶切割了HBV RNA。关于图10，右侧的泳道显示产物孵育4小时后已完全切割靶RNA。图10中代表未切割的mRNA的条带已经消失并且在低分子量处已经被对应的已切割产物3′端的条带替代。包含HBV RNA5′端的片段在比图10中更低分子量处可见。未见含有MAZI核酶地条带。这是因为核酶分子尺寸小。
SGIII核酶DNA盒
构建具有核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的完整的核酶DNA盒：
aattcgagct      ctaatacgac        tcactatagg
gcgaaagccc      gatacactga        tgagcgcgaa
agcgcgaaag      ctgaggtcca        cgtagaaata
cgtgctgatg      aggacgaaag        tccgaaacct
cagctttgaa      ttcgataa          (137)
它由编码序列1到80位的正向寡聚物和137到58位的反向寡聚物利用寡核苷酸合成仪合成。该寡聚物3′端的22个碱基彼此完全互补并退火这两条链。在PCR仪上利用DNA聚合酶延伸它们使其成为完整的双链。利用分别针对5′端和3′端的SacI和EcoRI位点将长137的双链DNA盒克隆入pUC19。通过DNA测序确认该序列。该盒包含T7启动子，市场上可买到的pUC19不包含该位点。
5’aattcgagctc   taatacgactcactata     gggcgaaagccc     gataca
     SacI        T7启动子              稳定环           SGIII茎I
 ctgatga      gcgcgaaagcgc   gaa       agctgagg    tc
Cat.Dom       茎II           Cat.Dom   SGIII茎III  突出端
cacgtagaaatacgtg      ctgatga       ggacgaaagtcc    gaa
Sc茎I                 Sc Cat.Dom    Sc.茎II         Sc Cat.Dom
acctcagcttt     gaattcgataa 3’
Sc.茎III        EcoRI
从5′端起始，最初的9个碱基组成SacI限制酶切位点，其后17个碱基形成T7启动子序列，12个碱基折叠成维持稳定的茎环结构，后面是互补于2017-2012的5个碱基的靶特异区，形成茎I。催化结构域以夹层形式插入茎II序列。茎III结构由随后的反向互补于HBV序列2010-2002的8个碱基组成。最后的2个碱基形成3′顺式作用核酶的NUX位点并且是突出端。随后16个碱基形成顺式作用核酶的茎I，后面是茎II在中间地催化结构域碱基。最后是茎III。最后的11个碱基组成EcoRI酶的两个限制酶切位点。
通过在“Ribomax”溶液中增加T7聚合酶来生产核酶RNA，如Promega“Protocols and Applications Guide”手册中描述的。＂Ribomax”是一种包含核酶活性必需的镁离子的平衡盐溶液。T7聚合酶引发T7启动子从DNA转录RNA。通过利用无RNase的DNase，继之RNA的酸/苯酚分离，然后乙醇沉淀来分离转录物。如上述引用的“Molecular Cloning-ALaboratory Manual”中的描述进行。在琼脂糖凝胶上电泳RNA，切割前的核酶(102个碱基，图8)明显与切割后的核酶分离(51分碱基，图2)。通过含溴化乙锭的凝胶显示RNA(在紫外线灯下显像)。
SGIII靶向切割
HBV基因组DNA克隆入pcDNA3，其被用于生产HBV的RNA转录物(上述引用的“Molecular Cloning-A Laboratory Manual”)。
从上述第2节描述的质粒转录得到的核酶与HBV RNA转录物以1摩尔核酶对1摩尔HBV RNA转录物的摩尔比率孵育。在37℃孵育4小时，使得HBV RNA靶的完全切割。在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上电泳RNA。图11显示紫外线照射下的凝胶照片。泳道1为分子量标准参照物，泳道2为与等摩尔SGIII核酶转录物和24mM MgCl2在37℃孵育4小时后的HBV转录物，泳道3为与24mM MgCl2在37℃孵育4小时后的HBV转录物。清楚地看到SGIII核酶切割了HBV RNA。关于图11，右侧的泳道显示产物孵育4小时后已完全切割靶RNA。图11中代表未切割的mRNA的条带已经消失并且在低分子量处已经被对应于切割产物5′端的条带替代。包含HBV RNA 3′端的片段在比在图11更低分子量处可见。未见包含SGIII核酶的条带。这是因为核酶分子的尺寸小。
DGII核酶DNA盒
构建具有核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的完整的核酶DNA盒：
tatctagagg        tacctaatac      gactcactat
aaagcccggg        ccctccaact      gatgagcgcg
aaagcgcgaa        atcctctcca      atcctctcca
aggatcgaaa        gatccgaaa       gaggactgg
agctcgaatt        c               131
它由编码序列1到80位的正向寡聚物和131到51位的反向寡聚物利用寡核苷酸合成仪合成。该寡聚物3′端的19个碱基彼此完全互补并退火这两条链。在PCR仪上利用DNA聚合酶延伸它们使其成为完整的双链。利用分别针对5′端和3′端的KpnI和SacI位点将长131的双链DNA盒克隆入pUC19。通过DNA测序确认序列。该盒包含T7启动子，市场上可买到的pUC19不包含该位点。
5’TATACTAGAGGTACC  TAATACGACTCACTATA  GGGCGAAAGCCC
Kpn I               T7启动子           稳定环
UCCAA       CUGAUGA  GCGCGAAAGCGC  GAA       AGUCCUCU
Cat.Dom结合位点      茎II          CatDom    茎III
C         CACGUAGAAAUACGUG         CUGAUGA
突出端    Sc茎I                    Sc Cat Dom
GGAUCGAAAGAUCC   GAA           AGAGGACUG    GAGCTCGAATTC3’
Sc茎II           Sc Cat Dom    Sc茎III       Sac I EcoRI
从5′端起始，最初的15个碱基包含KpnI限制酶切位点，其后有17个碱基形成T7启动子序列，12个碱基折叠成维持稳定的茎环结构，接着是互补于1672-1667的5个碱基的靶特异区，形成茎I。催化结构域以夹层形式插入茎II序列。茎III结构由随后的反向互补于HBV序列1665-1658的8个碱基组成。最后的碱基形成3′顺式作用核酶的NUX位点并且是突出端。随后16个碱基形成顺式作用核酶的茎I，后面是茎II位于中间的催化结构域。随后是茎III并且最后是SacI和EcoRI的限制酶切位点。
通过在“Ribomax”溶液中增加T7聚合酶来生产核酶RNA，如Promega“Protocols and Applications Guide”手册中描述的。＂Ribomax”是一种包含核酶活性必需的镁离子的平衡盐溶液。T7聚合酶引发T7启动子从DNA转录RNA。通过利用无RNase的DNase，继之RNA的酸/苯酚分离，然后乙醇沉淀来分离转录物。如上述引用的“Molecular Cloning-ALaboratory Manual”中的描述进行。
在琼脂糖凝胶上电泳RNA，切割前的核酶(103个碱基)明显与切割后的核酶(48个碱基，图3)分离。通过含溴化乙锭的凝胶显示RNA(在紫外线灯下显像)。
DGII靶向切割
HBV基因组DNA克隆入pcDNA3，其被用于pcDNA3生产HBV的RNA转录物(上述引用的“Molecular Cloning-A Laboratory Manual”)。
从上述第2节描述的质粒转录得到的核酶与HBV RNA转录物以1摩尔核酶对1摩尔HBV RNA转录物的摩尔比率孵育。在37℃孵育4小时，使得HBV RNA靶完全切割。在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上电泳RNA。图12显示紫外线照射下的凝胶照片。泳道1为分子量标准参照物。泳道2为3.2kb的HBV转录物。泳道3为与等摩尔的DGII核酶孵育4小时后的HBV转录物。由于与DGII孵育，如泳道3所表明的3.2kb的HBV转录物已经被切割为2～1.6kb的切割产物，因此显然DGII核酶切割了HBV RNA。未见包含DGII核酶的条带。这是因为核酶分子的尺寸小。
MAZI、SGIII和DGII的慢病毒递送
根据标准方法，利用如图14、15和16所示的包装和包膜构建体装配核酶MAZI、SGIII和DGII的慢病毒递送系统。
为了提供用于证明慢病毒递送MAZI、SGIII和DGII核酶切割HBV基因组的模型，构建体外系统，在该体外系统中培养细胞表达RNA，该RNA来自表达部分HBV基因组的DNA质粒。为了切割HBV基因组，这些转染的细胞随后经表达MAZI、SGIII和DGII核酶的慢病毒转导。
图16显示分别表达HBV基因组1-1579和1500-3182序列的质粒pHBV1和pHBV2。利用pHBV1和HBV2载体转染H293T细胞(5.0E5)(Superfect，QIAGEN UK)，72小时后重复该转染。24小时后再转染，利用Lenti-HBVRZ病毒(MOI＝100)转导细胞(1.0x106)。转导48小时后，收集细胞用于RNA和DNA。
设计PCR引物使得PCR产物包含MAZI、SGIII和DGII切割位点。根据HBV序列HBVAYGEN登录号Accession No:Y07587设计这些引物，如下显示这些引物和由这些引物对在HBV模板上产生的PCR产物的长度。
MAZI引物
1                GGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGT
    1,414：GCGCG GGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGT CGGCG
2/Rev            GACCACGGGGCGCACCTCTCTTTA
    1,517：CGACC GACCACGGGGCGCACCTCTCTTTA CGCGG
PCR产物长度＝127
DGII引物
1                CACGTCGCATGGAGACCACCGT
    1,602：CTCTG CACGTCGCATGGAGACCACCGT GAACG
2/Rev            CTGCAATGTCAACGACCGACCTTG
    1,677：ACTCT CTGCAATGTCAACGACCGACCTTG AGGCA
PCR产物长度＝99
SGIII引物
1                ACGTGATCTTCTAGATACCGCCTC
    1,983：TCAGT ACGTGATCTTCTAGATACCGCCTC AGCTC
2/Rev            AGCTACCTGGGTGGGTGGTAATTT
    2,106：ACTCT AGCTACCTGGGTGGGTGGTAATTT GGAAG
PCR产物长度＝147
总之，引物对如下：
MAZI引物
1   GGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGT
2   TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC
DGII引物
1   CACGTCGCATGGAGACCACCGT
2   CAAGGTCGGTCGTTGACATTGCAG
SGIII引物
1   ACGTGATCTTCTAGATACCGCCTC
2   AAATTACCACCCACCCAGGTAGCT
利用上述引物分别通过PCR和RTPCR分析来自有和没有经Lenti-HBVRZ转导的表达HBV靶序列(来自pHBV1和pHBV2)的H293T细胞中的DNA和RNA。图17是显示这些PCR产物的琼脂糖凝胶照片。泳道1到4显示转染pHBV1的对照细胞，MAZI靶序列存在于DNA和RNA中(泳道1和2)。其中经Lenti-HBVRZ转导，DNA仍存在，但是因为已经被MAZI切割由该质粒翻译的RNA减少很多(泳道3和4)。泳道5到8显示转染pHBV2的对照细胞，DGII靶序列存在于DNA和RNA中(泳道5和6)。其中经Lenti-HBVRZ转导，DNA仍存在，但是因为已经被DGII切割由该质粒翻译的RNA已不存在(泳道7和8)。泳道9到12显示转染pHBV2的对照细胞，DGII靶序列存在于DNA和RNA中(泳道9和10)。其中经Lenti-HBVRZ转导，DNA仍存在，但是因为已经被DGII切割由该质粒翻译的RNA已不存在(泳道11和12)。
这些结果显而易见的证明当通过慢病毒载体递送时，细胞中的核酶MAZI、SGIII和DGII有切割靶HBV RNA的活性。
HBV序列(登记入册号Y07587.1 GI:1514493)
1  aactccacaa ccttccacca aactctgcaa gatcccagag tgagaggcct gtatttccct
61 gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgttccga ctactgtctc tcccatatcg
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
1321 acattctcgg gacggataac tctgttgttc tctcccgcaa atatacatcg tttccatggc
1381 tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg
                                                 切割位点
                                                     
Figure A200680049638D00271
1441 cgctgaatcc cacggacgac ccttctcggg gtcgcttgg ggctctctcgtcc ccttctcc
                                                  核酶MAZI
1501 gtctaccgtt tcgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc
1561 cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac
                                                 切割位点
                                                     
Figure A200680049638D00281
1621 cgtgaacgcc caccaattct tgcccaaggt cttacataa gaggactcttgga ctctctgc
                                                  核酶DGII
1681 aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgttcaaag actgggagga
1741 gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtattagga ggctgtaggc ataaattggt
1801 ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatcttttg ttcatgtcct
1861 actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gcatggacat tgatccttat
1921 aaagaatttg gagctactgt ggagttactc tcttttttgc cttctgactt ctttccttca
                                 切割位点
                                     
Figure A200680049638D00282
1981 gtacgtgatc ttctagatac cg cctcagctctgtatcgg gaagccttaga gtctcctgag
                                  核酶SGIII
2041 cattgttcac ctcaccatac tgctctcagg caagca attc tgtgctgggg ggaactaatg
2101 actctagcta cctgggtggg tggtaatttg gaagatccaa tatccaggga cctagtagtc
2161 agttatgtca acactaatat gggcctaaag ttccggcaac tattgtggtt tcacatttct
2221 tgtctcactt ttggaagaga aacagttata gaatatttgg tgtctttcgg agtgtggatt
2281 cgcactcctc cagcttatag accaccaaat gcccctatct tatcaacact tccggagact
2341 actgttgtta gacgacgagg caggtcccct agaagaagaa ctccctcgcc tcgcagacga
--------------------------------------------------------
3061 agggcattct acaaaccttg ccagcaaatc cgcctcctgc ctctaccaat cgccagtcag
3121 gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt
3181 gg
图表1
序列
ggcucucucguccc
SEQ ID NO：1
ccucagcucuguaucg
SEQ.ID NO：2
gaggacucuugga
SEQ ID NO：3
aaggtaccta atacgactca ctatagggcg aaagcccggg acgactgatg agcgcgaaag cgcgaaagag
ccgtcgtgca cgcgaaagcg tgcacctgat gaggccggaa aggccgaaac ggctctttgg atcctctaga tt
SEQ ID NO：4
aattcgagct ctaatacgac tcactatagg gcgaaagccc gatacactga
tgagcgcgaa agcgcgaaag ctgaggtcca cgtagaaata cgtgctgatg aggacgaaag tccgaaacct
cagctttgaa ttcgataa
SEQ ID NO：5
tatctagagg tacctaatac gactcactat aaagcccggg ccctccaact gatgagcgcg aaagcgcgaa
atcctctcca atcctctcca aggatcgaaa gatccgaaa gaggactgg agctcgaatt c
SEQ ID NO：6

Claims (33)

1.可转录为RNA的核酶DNA，其将在CUC位点切割HBV RNA。
2.根据权利要求1的核酶DNA，可转录为具有催化(切割)序列的RNA，所述催化(切割)序列的两部分中间夹有具有GCGCGAAAGCGC序列的居间稳定茎。
3.根据权利要求1或2的核酶DNA，具有如SEQ ID NO：4(MAZ1)所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1或2的核酶DNA，具有如SEQ ID NO：5(SGIII)所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1或2的核酶DNA，具有如SEQ ID NO：6(DGII)所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1或2的核酶DNA，其可转录为结合HBV识别位点的RNA，所述HBV识别位点具有核苷酸序列GGCUCUCUCGUCCC(MAZ1)。
7.根据权利要求1或2的核酶DNA，其可转录为结合HBV识别位点的RNA，所述HBV识别位点具有核苷酸序列CCUCAGCUCUGUAUCG(SGIII)。
8.根据权利要求1或2的核酶DNA，其可转录为结合HBV识别序列的RNA，所述HBV识别序列具有核苷酸序列GAGGACUCUUGGA(DGII)。
9.根据前述任一项权利要求的核酶DNA，其转录为锤头结构核酶。
10.核酶DNA，当其转录为RNA时，将对存在于HBV RNA中的靶RNA序列上的三个位点切割，所述位点包含如下的识别序列(5＇到3＇)
GGCTCTCTCGTCCC　　对于核酶MAZI
CCTCAGCTCTGTATCG　对于核酶SGIII
GAGGACTCTTGGA　对于核酶DGII。
11.载体系统，包含至少一个DNA载体，该载体包含在对人类细胞有效的启动子控制下的靶向切割的核酶DNA序列，所述靶向切割的核酶DNA序列一旦转录为RNA将在CUC位点处切割从HBV靶基因组转录的RNA。
12.根据权利要求11的载体系统，包含可切割从HBV靶基因组转录的mRNA的MAZI、DGII和SGIII核酶中的一个或多个的靶向切割核酶序列。
13.根据权利要求11或12的载体系统，包含至少两个DNA载体，其中第一个载体包含对人类细胞有效的第一启动子，第一启动子有效连接于可表达产生能作用于第二启动子的激活蛋白的基因，和第二个载体包含第二启动子，所述第二启动子有效连接于MAZI RNA、DGII RNA和SGIII RNA靶向切割核酶DNA序列和靶HBV RNA的靶向切割核酶DNA序列的一个或多个。
14.根据权利要求13的载体系统，包含至少三个DNA载体，其中第二个载体包含MAZI靶向切割核酶DNA和其中第三个载体包含切割转录自HBV靶RNA的mRNA的SGIII靶向切割核酶DNA。
15.根据权利要求14的载体系统，包含至少四个DNA载体，其中第二个载体包含MAZI靶向切割核酶DNA，第三个载体包含SGIII靶向切割核酶DNA和第四个载体包含用于切割由HBV靶RNA转录的mRNA的DGII靶向切割核酶DNA。
16.根据权利要求15的载体系统，包含至少五个DNA载体，其中第二个载体包含MAZI靶向切割核酶DNA和其中第三个载体包含SGIII靶向切割核酶DNA，第四个载体包含DGII靶向切割核酶DNA和第五个载体包含由HBV靶RNA转录的另一核酶切割mRNA的靶向切割核酶DNA。
17.根据权利要求13到16任一项的载体系统，其中第二启动子是T7聚合酶启动子，和激活蛋白是T7聚合酶。
18.根据权利要求17的载体系统，其中T7启动子中的一个或两个进一步包含提供内部核糖体进入位点(IRES)的DNA，用于帮助翻译人类细胞中T7聚合酶基因。
19.根据权利要求11到18任一项的载体系统，其中核酶序列是锤头型核酶。
20.根据权利要求11到19任一项的载体系统，其中核酶DNA序列进一步包含在靶向切割核酶序列下游的3＇自催化的锤头结构核酶DNA序列，因此当核酶DNA转录为RNA时，它表现为双锤头结构，其具有靶向HBVRNA的靶向切割核酶的第一个和第二个茎及3＇自催化核酶的第一个和第二个茎。
21.根据权利要求20的载体系统，其中第一个和第二个结构稳定茎环分别位于第一个识别序列的两侧。
22.根据权利要求21的载体系统，其中第二个识别序列位于第二个结构稳定茎环的下游。
23.根据权利要求22的载体系统，其中靶向切割核酶序列顺次(5＇到3＇)包含：
第一个结构稳定茎环；
第一个靶识别序列；
第一个催化序列；
第二个结构稳定茎环；
第二个催化序列；和
第二个靶识别序列。
24.根据权利要求11到23任一项的载体系统，其中靶向切割核酶DNA序列，当转录为RNA时，将切割存在于HBV RNA中的靶RNA序列，其包含识别序列(5＇到3＇)：
GGCTCTCTCGTCCC　　对于核酶MAZI
CCTCAGCTCTGTATCG　对于核酶SGIII
GAGGACTCTTGGA　对于核酶DGII。
25.包含根据权利要求11到24任一项载体系统的慢病毒。
26.药学上可接受的载体，其包含根据权利要求1到10任一项的核酶DNA，定义为权利要求11到24任一项的载体系统或根据权利要求25的慢病毒。
27.根据权利要求26的载体，其以脂质体形式存在。
28.药物组合物，其包含根据权利要求27的载体和稀释剂。
29.根据权利要求1到10任一项的核酶DNA，根据权利要求11到24任一项的载体系统或根据权利要求25的慢病毒，用于制备治疗与HBV感染相关的疾病的制剂。
30.根据权利要求1到10任一项的核酶DNA，根据权利要求11到24任一项的载体系统或根据权利要求25的慢病毒，用于制备治疗与HBV感染相关的疾病的药物。
31.根据权利要求1到10任一项核酶DNA、根据权利要求11到24任一项载体系统或根据权利要求25慢病毒的用途，用于生产治疗HBV感染相关疾病的药剂。
32.核酶DNA包含，(1)在对人类细胞有效的启动子控制下的靶向切割锤头型核酶DNA序列，并且其一旦转录为RNA将切割由HBV基因组编码的靶基因转录的mRNA，和其下游(2)3＇自催化的锤头型核酶DNA序列，因此当核酶DNA转录为RNA时，它表现为双锤头的形式，具有靶向HBV RNA的靶向切割核酶的第一和第二茎及3＇自催化核酶的第一和第二茎，及常规的连接这两个锤头的第三茎。
33.核酶DNA，当其转录为RNA时，将在存在于HBV RNA中的靶RNA序列上的三个位点切割，其包含如下的识别序列(5＇到3＇)
GGCTCTCTCGTCCC　　对于核酶MAZI
CCTCAGCTCTGTATCG　对于核酶SGIII
GAGGACTCTTGGA　　 对于核酶DGII
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