CN113549641A - 一种核酶介导的多顺反子载体及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种核酶介导的多顺反子载体及其构建方法。本发明的多顺反子表达载体，包括基本骨架和目的基因表达元件，所述目的基因表达元件中包括核酶序列。当目的基因转录成mRNA后，所述核酶序列通过自发折叠形成活性结构并切割其自身，将含有多个阅读框的长链mRNA拆解成若干个单阅读框的短mRNA。本发明为多基因的表达提供一种全新的思路和技术方案。

Description

一种核酶介导的多顺反子载体及其构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种核酶介导的多顺反子载体及其构建方法。
背景技术
在许多生命活动中，多蛋白复合物通常作为关键调节因子发挥作用。如果单独表达复合物的各个亚基，可能会形成异常的多聚物或者包涵体，需要与分子伴侣或其他亚基共同表达才能正确折叠和溶解。因此，为了获得多蛋白复合物，对其生物学功能和结构进行研究，多基因共表达系统是最好的选择。
目前，多基因共表达的实现主要有三种途径：多载体系统、多顺反子载体和多表达框载体，但它们都有各自的缺点。多载体系统需要多个质粒具备可兼容的复制起始位点来避免胞内竞争，使得质粒的选择极为困难；此外，不同质粒的维持需要多个抗生素抗性标记以便于筛选，但是同时添加多种抗生素会抑制细胞的生长，降低共转化的效率，使得共表达基因的数目受到限制。多顺反子载体导致转录生成一条长的多顺反子mRNA，其长度受到RNA聚合酶功能和mRNA固有稳定性的限制；并且核糖体和核糖体结合位点(RBS)结合的效率取决于基因序列的位置和mRNA的结构，通常下游编码的蛋白质表达量会降低，从而影响多蛋白质复合物的化学计量。多表达框载体上每个基因都有单独的启动子，可以转录生成多个mRNA，但是内部启动子会占据载体上有限的克隆空间，并且启动子间相互干扰，造成不同基因的表达水平不一致。
因此，迫切需要一个全新的多基因共表达系统。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种全新的多基因表达系统。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明的第一方面提供了一种多顺反子表达载体，包括基本骨架和目的基因表达元件，所述目的基因表达元件中包括核酶序列。
一种实施方式中，当目的基因转录成mRNA后，所述核酶序列切割其自身，将含有多个阅读框的长链mRNA拆解成若干个单阅读框的短链mRNA。
一种实施方式中，所述核酶序列通过自发折叠形成活性结构并切割其自身。其自身是指核酶序列。
一种实施方式中，所述目的基因表达元件包括5’-3’方向排列的启动子、多克隆位点和终止子。所述核酶序列位于启动子和多克隆位点之间。即，所述核酶序列位于克隆位点的5’方向。
一种实施方式中，所述核酸序列来自Twister家族、hammerhead家族、HDV家族、twister sister家族、hammerhead variant家族、hatchet家族或pistol家族等。
一种实施方式中，所述目的基因表达元件中还包括二级保护结构序列Stem loop。
所述二级保护结构序列Stem loop保护所述mRNA不被降解。
所述二级保护结构序列Stem loop通常指一种分子内两个区域的核苷酸排列具有回文现象，让两端序列因为碱基配对而形成一状似棒棒糖的双螺旋结构，使得DNA或RNA产生核酸二级结构。
一种实施方式中，所述启动子选自T7 promoter、Rham promoter、Ara promoter、T5promoter、Trc promoter、Tac promoter或Trp promoter。
一种实施方式中，所述终止子选自L3S2P21 terminator、UUCG T7Te terminator、rrnB T1 terminator、rrnB T2 terminator或T3Te terminator。
一种实施方式中，所述目的基因表达元件中还包括蛋白表达识别标签序列，所述蛋白表达识别标签序列可转录表达成蛋白表达识别标签，用于目的蛋白的标记和纯化。
所述蛋白表达识别标签选自His-tag、Flag-tag、Strep-tag、GST-tag或MBP-tag。
一种实施方式中，所述目的基因表达元件中还包括标签去除序列。
所述标签去除序列能够被对应的蛋白酶专一性识别与酶切，从而去除蛋白表达识别标签。
所述标签去除序列位于蛋白表达识别标签序列与多克隆位点之间。
所述标签去除序列选自Thrombin、Factor Xa、Enterokinase、TEV protease、PreScission或Sumo protease。
一种实施方式中，所述目的基因表达元件中还包括酶切位点。
一种实施方式中，所述基本骨架包括复制起点和抗性筛选基因。
一种实施方式中，所述复制子选自pBR322 origin、ColE1 origin、pUC origin、ColA origin、pSC101 origin或p15A origin。
一种实施方式中，所述抗性筛选基因选自Kan、Amp、Chl、Car、Str、Tet或Gen。
本发明的第二方面，提供一种多顺反子表达系统，包括上述多顺反子表达载体。
进一步地，所述多顺反子表达系统还包括宿主细胞。
本发明的第三方面，提供前述多顺反子表达载体和/或系统在多基因表达、多蛋白质复合物组装中的用途。
本发明的第四方面，提供一种适用于多基因表达、多蛋白质复合物组装的方法，包括步骤：将目的基因插入到前述多顺反子表达载体的多克隆位点。
如上所述，本发明的技术方案，具有以下有益效果：
(1)基于核酶介导的多顺反子表达载体适用于多达十几个蛋白质大复合物的组装和表达，并且能够获得产量可观、可重复性高、均质可控的样品。
(2)核酶介导的将含有多个阅读框的长链mRNA拆解成若干个单阅读框的短链mRNA，保证了每个靶基因具有相对均一的核糖体亲和力，基因的顺序不会影响多蛋白复合物的化学计量学，使得每个基因都能获得相当的表达水平。
(3)本载体的组装构建方法将稀有切割限制性内切酶位点和SLIC联系在一起，操作十分简便，不仅避免了载体主链的重复，原则上还可以接受无限数量共表达基因的加载。
附图说明
图1：多顺反子表达载体pRAP-Kan和pRAP-Amp质粒图谱示意图。
图2：多顺反子表达载体pRAP中Stem loop、Twister、His-tag、PreScisseion、SapI、SwaI、PmeI及MCS序列示意图。
图3:包含两个不同cDNA插入片段的pRAP载体的构建和转录过程。
图4：SwaI和PmeI酶切位点的消化以及SLIC分子克隆的示意图，线：通过限制性内切酶消化和T4 DNA聚合酶处理后产生的突出端。
图5：人源翻译延伸因子eEF1B一系列共表达质粒的SwaI酶切线性化结果。
图6：人源翻译延伸因子eEF1B在HI-control(DE3)表达细胞株中的共表达情况，W：诱导表达后破碎的菌液；S：诱导表达后破碎菌液的上清；N：镍鳌合珠洗脱下来的目的蛋白。
图7：人源翻译起始因子eIF3一系列共表达质粒的SwaI酶切线性化结果。
图8：人源翻译起始因子eIF3共表达质粒在HI-control(DE3)表达细胞株中的共表达情况。P：诱导表达后破碎菌液的沉淀；S：诱导表达后破碎菌液的上清。
图9A：为His-PreScission-eIF3c+h+f+a+e+m+d镍柱亲和层析梯度洗脱图谱。
图9B：为图9A吸收峰处样品的SDS-PAGE鉴定结果。W:诱导表达后破碎的菌液；P：诱导表达后破碎菌液的沉淀；S：诱导表达后破碎菌液的上清；FT：上清结合镍柱之后的流穿。
图10A：为His-PreScission-eIF3c+h+f+a+e+m+d的凝胶层析图谱。
图10B：为图10A吸收峰处样品的SDS-PAGE鉴定结果。
图11：以人源翻译延伸因子eEF1B共表达质粒为模板，利用T7 RNA聚合酶体外转录的RNA。16S：原核核糖体小亚基RNA，1540个核苷酸；23S：原核核糖体大亚基RNA，2900个核苷酸。
图12：以人源翻译延伸因子eEF1B共表达质粒为模板，利用T7 RNA聚合酶体外转录的RNA；以及从转化了人源翻译延伸因子eEF1B共表达质粒的HI-control(DE3)表达细胞株中提取的体内全部RNA。左图：RNA被加载在1.2％琼脂糖-甲醛变性凝胶上；右图：用识别Twister序列的biotin探针检测从1.2％琼脂糖-甲醛变性凝胶转移至尼龙膜上的RNA的Northern印迹。Control:未诱导表达菌体的全部RNA；16S：原核核糖体小亚基RNA，1540个核苷酸；23S：原核核糖体大亚基RNA，2900个核苷酸。
图13：以人源翻译起始因子eIF3共表达质粒为模板，利用T7 RNA聚合酶体外转录的RNA。16S：原核核糖体小亚基RNA，1540个核苷酸；23S：原核核糖体大亚基RNA，2900个核苷酸。
图14：以人源翻译起始因子eIF3共表达质粒为模板，利用T7 RNA聚合酶体外转录的RNA；以及从转化了人源翻译起始因子eIF3共表达质粒的HI-control(DE3)表达细胞株中提取的体内全部RNA。左图：RNA被加载在1.2％琼脂糖-甲醛变性凝胶上；右图：用识别Twister序列的biotin探针检测从1.2％琼脂糖-甲醛变性凝胶转移至尼龙膜上的RNA的Northern印迹。Control:未诱导表达菌体的全部RNA；16S：原核核糖体小亚基RNA，1540个核苷酸；23S：原核核糖体大亚基RNA，2900个核苷酸。
具体实施方式
本发明的多顺反子表达载体，包括基本骨架和目的基因表达元件，所述目的基因表达元件中包括核酶序列。当目的基因转录成mRNA后，所述核酶序列通过自发折叠形成活性结构并切割其自身，将含有多个阅读框的长链mRNA拆解成若干个单阅读框的短链mRNA。
一般地，目的基因的表达涉及转录的启动子和终止子、核糖体结合位点、翻译起始密码子和终止密码子。因此，所述目的基因表达元件包括5’-3’方向排列的启动子、多克隆位点和终止子。所述核酶序列位于启动子和多克隆位点之间。即，所述核酶序列位于克隆位点的5’方向。
所述核酶序列可以来自Twister家族，能够自发折叠形成活性结构并切割其自身。如切割其自身的5’末端。其中一种Twister包括如SEQ ID NO.47所示序列。SEQ ID NO.47所示序列如下：AATGCAGCCGAGGGCGGTTACAAGCCCGCAAAAATAGCAGAGTA。
所述核酶序列还可以包括但不限于：
hammerhead家族
(例如,TAGTCTGATGAGAGCGAAAGCTCGAAACTGGAAAGCCAGTC,SEQ ID NO.48)；HDV家族
(例如,GGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATGCTTCGGCATGGCGAATGGGAC,SEQ ID NO.49)；
twister sister家族
(例如,CUUAGCAAGGCCCAGUCCCGUGCAAGCCGGGACCGCACAUGAGGAUCACCCAUGUGCGCGGCGCUC,SEQ ID NO.50)；
hammerhead variant家族
(例如,AGACAACCAGGAGTCTATAAAATAATCACTGAAGAGACTGGACGAAACCAATAGGTC,SEQID NO.51)；
hatchet家族
(例如,AATCGTTCTTACTGATATCAGTGACAAACATGTGGGGCTTATATCTAATCTTCGGATTAGTATTAGTGCAGACGTTAAAACCATGT,SEQ ID NO.52)；
或pistol家族
(例如,ACTCGACTAAGCGAGTATAAACATTACATAGGCTTAGAGCGTCCGTTCGCGGGG,SEQ IDNO.53)等。
需要说明的是，不同的核酶家族，自发折叠成活性结构并切割其自身的位置不同，可以是5’末端或3’末端，也可以是中间位置。
此外，由于核酶序列具有许多可变区，它的序列并不是统一固定的，只有一部分序列是保守的。同理Twister的序列也是如此，基于不可变的保守序列情况下，本发明示例性地采用了其中一种形式的序列。
所述目的基因表达元件还包括二级保护结构序列Stem loop。所述二级保护结构序列Stem loop保护所述mRNA不被降解。
所述二级保护结构序列Stem loop通常指一种分子内两个区域的核苷酸排列具有回文现象，让两端序列因为碱基配对而形成一状似棒棒糖的双螺旋结构，使得DNA或RNA产生核酸二级结构。
所述二级保护结构序列Stem loop的具体序列如SEQ ID NO.54所示，具体为：CCCGACGCTTCGGCGTCGGG。
本文中的术语“顺反子”是指编码单个蛋白或多肽的核苷酸序列，包含5’起始密码子和3’终止密码子。“多顺反子”包括多个“顺反子”，每个“顺反子”存在一个核糖体结合位点，每个“顺反子”各自拥有终止密码子和起始密码子，各“顺反子”彼此之间被终止密码子和起始密码子分离。
转录是由RNA聚合酶在启动子部位启动RNA转录的过程。启动子位于要表达的目的基因的上游，用于启动目的基因的转录。
术语“启动子”是指能够结合RNA聚合酶并且启动与其可操作连接的一个或多个核酸编码序列(例如目的基因)的转录的核酸序列。启动子通常位于同一链上的基因的转录起始位点附近和核苷酸编码序列的上游(反义链中的5')。启动子可以单独发挥功能以调节转录或可以通过一个或多个调节序列(例如增强子或沉默子)进一步调节。
本发明的多顺反子表达载体中，启动子可以包括但不限于T7 promoter,Rhampromoter,Ara promoter,T5 promoter,Trc promoter,Tac promoter,和Trp promoter。优选的启动子可以是T7 promoter,Rham promoter，T5 promoter,Ara promoter和Trppromoter。示例性，如图1所示，pRAP(plasmid for Ribozyme Assisted Polycistronic)表达载体中，使用T7启动子，但并非限于此。
终止子位于要表达的目的基因的下游，用于终止目的基因的表达。
术语“终止子”，即转录终止子，又称“转录终止序列”，包括转录单元末端的控制序列，其表示转录的3'加工和终止。
本发明的多顺反子表达载体中，终止子可以包括但不限于L3S2P21 terminator,UUCG T7Te terminator,rrnB T1 terminator,rrnB T2 terminator,T3Te terminator。优选的转录终止子可以是UUCG_T7Te terminator,rrnB_T1 terminator和L3S2P21terminator。示例性，如图1所示，pRAP(plasmid for Ribozyme AssistedPolycistronic)，使用UUCG T7Te term，但并非限于此。
多克隆位点，即MCS，在此位点插入目的基因。
转录出来的mRNA可在宿主细胞的翻译机器作用下翻译出目标蛋白。宿主细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效的核糖体结合位点(ribosomal binding site，RBS)以及Shine-Dalgarno(SD序列)，从而启动临近其下游的翻译起始密码子的蛋白质翻译工作。核糖体结合位点可由要表达的目的基因自己带入，也可利用载体上预先装载的RBS位点。如果是后者，要求目的基因装载到载体以后，ATG与RBS位点之间的距离符合翻译起点的要求，一般间隔3-11bp。
本发明的多顺反子表达载体的表达元件中，还可以包括蛋白表达识别标签序列，所述蛋白表达识别标签序列可转录表达成蛋白表达识别标签，用于目的蛋白的标记和纯化。例如，所述蛋白表达识别标签可以包括但不限于His-tag、Flag-tag,Strep-tag,GST-tag,MBP-tag。优选的蛋白表达标签是His-tag,Flag-tag和Strep-tag。示例性，如图1所示，pRAP(plasmid for Ribozyme Assisted Polycistronic)，使用His-tag，但并非限于此。
相应地，本发明的多顺反子表达载体的表达元件中，还可以包括标签去除序列。所述标签去除序列位于蛋白表达识别标签序列与多克隆位点之间。所述标签去除序列能够被对应的蛋白酶专一性识别与酶切，从而去除蛋白表达识别标签。所述标签去除序列可以包括但不限于Thrombin,Factor Xa,Enterokinase,TEV protease,PreScission,Sumoprotease。优选的标签去除序列是PreScission,TEV protease和Sumo protease。示例性，如图1所示，pRAP(plasmid for Ribozyme Assisted Polycistronic)，使用PreScission，但并非限于此。PreScission能够被PreScission Proteas人鼻病毒14型的3C蛋白酶特异性识别。PreScission Proteas人鼻病毒14型的3C蛋白酶，是一种大肠杆菌中重组表达的带GST标签的人鼻病毒14型的3C蛋白酶(human rhinovirus(HRV)type 14 3C protease)，也称HRV 3C Protease或HRV3C Protease，能在低温条件下(4℃)特异性地识别八肽序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro或核心五肽序列Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly氨基酸残基之间进行酶切，常用于去除融合蛋白的Glutathione S-transferase(GST)、His或者其它标签的蛋白酶。一般地，GST或His等标签设计在融合蛋白的N端，在GST或His等标签与目的蛋白之间设计加入PreScission Protease专一性识别与酶切的上述八肽序列，这样在GST或His标签被酶切后，在目的蛋白的N端仅有两个额外的Gly-Pro氨基酸残基，从而最大限度地减少了对其结构和功能的影响。
本发明的多顺反子表达载体的表达元件中，还包括酶切位点。例如：PmeI、SwaI和SapI等限制性内切酶位点。
本发明的多顺反子表达载体中，基本骨架包括复制起点和抗性筛选基因。所述复制起点亦可称为复制子。不同来源的表达载体的复制子和抗性筛选基因的可能有所不同，但是功能是一致的。所述复制子用于表达载体在宿主细胞中的复制。所述复制子可以包括但不限于pBR322 origin,ColE1 origin,pUC origin,ColA origin,pSC101 origin,p15Aorigin。优选的复制子可以是pBR322 origin和ColE1 origin。本发明的图1中，例举了所述复制子可以是pBR322 ori，但并不局限于此。
所述抗性筛选基因用于筛选目的表达载体。所述抗性筛选基因可以包括但不限于Kan(卡那霉素),Amp(氨苄西林),Chl(氯霉素)，Car(羧苄西林)，Str(链霉素)，Tet(四环素)和Gen(庆大霉素)。优选的抗性筛选基因是Kan，Amp和Chl。本发明的图1中，例举了所述抗性筛选基因可以是Kan/Amp，即卡那霉素抗性基因/氨苄西林抗性基因，但并不局限于此。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
示例性地，实施例1-3使用如图1所示的多顺反子表达载体pRAP-Amp(plasmid forRibozyme Assisted Polycistronic,Amp)。Stem loop:二级保护结构；Twister：核酶；His-tag：组氨酸标签；PreScission：人鼻病毒14型的3C蛋白酶，MCS：多克隆位点。PmeI、SwaI和SapI：限制性内切酶位点。图2是多顺反子表达载体pRAP中Stem loop、Twister、His-tag、PreScisseion、SapI、SwaI、PmeI及MCS序列示意图。图3是包含两个不同cDNA插入片段的pRAP载体的构建和转录过程。图4是SwaI和PmeI酶切位点的消化以及SLIC分子克隆的示意图。线：通过限制性内切酶消化和T4 DNA聚合酶处理后产生的突出端。
实施例1人源翻译延伸因子eEF1Bαγδ表达载体的构建和共表达纯化
1.1、pRAP-Amp-eEF1Bα、pRAP-Amp-eEF1Bγ和pRAP-Amp-eEF1Bδ表达载体的构建
首先，通过PCR(聚合酶链式反应)制备编码人源翻译延伸因子eEF1Bα、eEF1Bγ和eEF1Bδ的基因片段。PCR反应体系如表1所示：
表1 PCR反应体系
成分 体积
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix(NEB) 25μL
正向引物(10μM) 2.5μL
反向引物(10μM) 2.5μL
DNA模板(5ng/μL) 1μL
ddH<sub>2</sub>O 19μL
通过PCR制备eEF1Bα基因片段时，所采用DNA模板记为eEF1Bα的DNA模板，所述eEF1Bα的DNA模板来自于pET28-eEF1Bα，所述eEF1Bα的DNA模板含有SEQ ID NO.1所示序列。所采用的正向引物eEF1Bα-F的序列如SEQ ID NO.2所示；反向引物eEF1Bα-R的序列如SEQID NO.3所示。
pET28-eEF1Bα:
ATGGGTTTCGGAGACCTGAAAAGCCCTGCCGGCCTCCAGGTGCTCAACGATTACCTGGCGGACAAGAGCTACATCGAGGGGTATGTGCCATCACAAGCAGATGTGGCAGTATTTGAAGCCGTGTCCAGCCCACCGCCTGCCGACTTGTGTCATGCCCTACGTTGGTATAATCACATCAAGTCTTACGAAAAGGAAAAGGCCAGCCTGCCAGGAGTGAAGAAAGCTTTGGGCAAATATGGTCCTGCCGATGTGGAAGACACTACAGGAAGTGGAGCTACAGATAGTAAAGATGATGATGACATTGACCTCTTTGGATCTGATGATGAGGAGGAAAGTGAAGAAGCAAAGAGGCTAAGGGAAGAACGTCTTGCACAATATGAATCAAAGAAAGCCAAAAAACCTGCACTTGTTGCCAAGTCTTCCATCTTACTAGATGTGAAACCTTGGGATGATGAGACAGATATGGCGAAATTAGAGGAGTGCGTCAGAAGCATTCAAGCAGACGGCTTAGTCTGGGGCTCATCTAAACTAGTTCCAGTGGGATACGGAATTAAGAAACTTCAAATACAGTGTGTAGTTGAAGATGATAAAGTTGGAACAGATATGCTGGAGGAGCAGATCACTGCTTTTGAGGACTATGTGCAGTCGATGGATGTGGCTGCTTTCAACAAGATCcatcatCACCATCACCACCACCACTAA(SEQ ID NO.1)。
eEF1Bα-F:AAGTTCTGTTCCAGGGGCCGGGTTTCGGAGACCTGAAAAG(SEQ ID NO.2)；
eEF1Bα-R:TtgtggtgggtgtttCaTTAGATCTTGTTGAAAGCAGCC(SEQ ID NO.3)。
通过PCR制备eEF1Bγ基因片段时，所采用DNA模板记为eEF1Bγ的DNA模板，所述eEF1Bγ的DNA模板来自于pET28-eEF1Bγ，所述pET28-eEF1Bγ的DNA模板含有SEQ ID NO.4所示序列。所采用的正向引物eEF1Bγ-F的序列如SEQ ID NO.5所示；反向引物eEF1Bγ的序列如SEQ ID NO.6所示。
pET28-eEF1Bγ:
ATGGCGGCTGGGACCCTGTACACGTATCCTGAAAACTGGAGGGCCTTCAAGGCTCTCATCGCTGCTCAGTACAGCGGGGCTCAGGTCCGCGTGCTCTCCGCACCACCCCACTTCCATTTTGGCCAAACCAACCGCACCCCTGAATTTCTCCGCAAATTTCCTGCCGGCAAGGTCCCAGCATTTGAGGGTGATGATGGATTCTGTGTGTTTGAGAGCAACGCCATTGCCTACTATGTGAGCAATGAGGAGCTGCGGGGAAGTACTCCAGAGGCAGCAGCCCAGGTGGTGCAGTGGGTGAGCTTTGCTGATTCCGATATAGTGCCCCCAGCCAGTACCTGGGTGTTCCCCACCTTGGGCATCATGCACCACAACAAACAGGCCACTGAGAATGCAAAGGAGGAAGTGAGGCGAATTCTGGGGCTGCTGGATGCTTACTTGAAGACGAGGACTTTTCTGGTGGGCGAACGAGTGACATTGGCTGACATCACAGTTGTCTGCACCCTGTTGTGGCTCTATAAGCAGGTTCTAGAGCCTTCTTTCCGCCAGGCCTTTCCCAATACCAACCGCTGGTTCCTCACCTGCATTAACCAGCCCCAGTTCCGGGCTGTCTTGGGGGAAGTGAAACTGTGTGAGAAGATGGCCCAGTTTGATGCTAAAAAGTTTGCAGAGACCCAACCTAAAAAGGACACACCACGGAAAGAGAAGGGTTCACGGGAAGAGAAGCAGAAGCCCCAGGCTGAGCGGAAGGAGGAGAAAAAGGCGGCTGCCCCTGCTCCTGAGGAGGAGATGGATGAATGTGAGCAGGCGCTGGCTGCTGAGCCCAAGGCCAAGGACCCCTTCGCTCACCTGCCCAAGAGTACCTTTGTGTTGGATGAATTTAAGCGCAAGTACTCCAATGAGGACACACTCTCTGTGGCACTGCCATATTTCTGGGAGCACTTTGATAAGGACGGCTGGTCCCTGTGGTACTCAGAGTATCGCTTCCCTGAAGAACTCACTCAGACCTTCATGAGCTGCAATCTCATCACTGGAATGTTCCAGCGACTGGACAAGCTGAGGAAGAATGCCTTCGCCAGTGTCATCCTTTTTGGAACCAACAATAGCAGCTCCATTTCTGGAGTCTGGGTCTTCCGAGGCCAGGAGCTTGCCTTTCCGCTGAGTCCAGATTGGCAGGTGGACTACGAGTCATACACATGGCGGAAACTGGATCCTGGCAGCGAGGAGACCCAGACGCTGGTTCGAGAGTACTTTTCCTGGGAGGGGGCCTTCCAGCATGTGGGCAAAGCCTTCAATCAGGGCAAGATCTTCAAGcatcatCACCATCACCACCACCACTAA(SEQ ID NO.4)。
eEF1Bγ-F:AAGTTCTGTTCCAGGGGCCGGCGGCTGGGACCCT(SEQ ID NO.5)；
eEF1Bγ-R:TtgtggtgggtgtttCaTTACTTGAAGATCTTGCCCTGA(SEQ ID NO.6)。
通过PCR制备eEF1Bδ基因片段时，所采用DNA模板记为eEF1Bδ的DNA模板，所述eEF1Bδ的DNA模板来自于pET28-eEF1Bδ，所述pET28-eEF1Bδ的DNA模板含有SEQ ID NO.7所示序列。所采用的正向引物eEF1Bδ-F的序列如SEQ ID NO.8所示；反向引物eEF1Bδ的序列如SEQ ID NO.9所示。
pET28-eEF1Bδ:
ATGGCTACAAACTTCCTAGCACATGAGAAGATCTGGTTCGACAAGTTCAAATATGACGACGCAGAAAGGAGATTCTACGAGCAGATGAACGGGCCTGTGGCAGGTGCCTCCCGCCAGGAGAACGGCGCCAGCGTGATCCTCCGTGACATTGCGAGAGCCAGAGAGAACATCCAGAAATCCCTGGCTGGAAGCTCAGGCCCCGGGGCCTCCAGCGGCACCAGCGGAGACCACGGTGAGCTCGTCGTCCGGATTGCCAGTCTGGAAGTGGAGAACCAGAGTCTGCGTGGCGTGGTACAGGAGCTGCAGCAGGCCATCTCCAAGCTGGAGGCCCGGCTGAACGTGCTGGAGAAGAGCTCGCCTGGCCACCGGGCCACGGCCCCACAGACCCAGCACGTATCTCCCATGCGCCAAGTGGAGCCCCCAGCCAAGAAGCCAGCCACACCAGCAGAGGATGACGAGGATGATGACATTGACCTGTTTGGCAGTGACAATGAGGAGGAGGACAAGGAGGCGGCACAGCTGCGGGAGGAGCGGCTACGGCAGTACGCGGAGAAGAAGGCCAAGAAGCCTGCACTGGTGGCCAAGTCCTCCATCCTGCTGGATGTCAAGCCTTGGGATGATGAGACGGACATGGCTCAGCTGGAGGCCTGTGTGCGCTCTATCCAGCTGGACGGGCTGGTCTGGGGGGCTTCCAAGCTGGTGCCCGTGGGCTACGGTATCCGGAAGCTACAGATTCAGTGTGTGGTGGAGGACGACAAGGTGGGGACAGACTTGCTGGAGGAGGAGATCACCAAGTTTGAGGAGCACGTGCAGAGTGTCGATATCGCAGCTTTCAACAAGATCcatcatCACCATCACCACCACCACTAA(SEQ ID NO.7)。
eEF1Bδ-F:AAGTTCTGTTCCAGGGGCCGGCTACAAACTTCCTAGCACA(SEQ ID NO.8)；
eEF1Bδ-R:TtgtggtgggtgtttCaTTAGATCTTGTTGAAAGCTGCG(SEQ ID NO.9)。
PCR反应条件如表2所示：
表2 PCR反应条件
Figure BDA0003137689720000121
用琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，再用NucleoSpin凝胶和PCR产物提取试剂盒(Macherey-Nagel)将扩增产物回收纯化。分别获得eEF1Bα、eEF1Bγ和eEF1Bδ基因片段。eEF1Bα基因片段的序列如SEQ ID NO.10所示。eEF1Bγ基因片段的序列如SEQ ID NO.11所示。eEF1Bδ基因片段的序列如SEQ ID NO.12所示。
eEF1Bα:
GGTTTCGGAGACCTGAAAAGCCCTGCCGGCCTCCAGGTGCTCAACGATTACCTGGCGGACAAGAGCTACATCGAGGGGTATGTGCCATCACAAGCAGATGTGGCAGTATTTGAAGCCGTGTCCAGCCCACCGCCTGCCGACTTGTGTCATGCCCTACGTTGGTATAATCACATCAAGTCTTACGAAAAGGAAAAGGCCAGCCTGCCAGGAGTGAAGAAAGCTTTGGGCAAATATGGTCCTGCCGATGTGGAAGACACTACAGGAAGTGGAGCTACAGATAGTAAAGATGATGATGACATTGACCTCTTTGGATCTGATGATGAGGAGGAAAGTGAAGAAGCAAAGAGGCTAAGGGAAGAACGTCTTGCACAATATGAATCAAAGAAAGCCAAAAAACCTGCACTTGTTGCCAAGTCTTCCATCTTACTAGATGTGAAACCTTGGGATGATGAGACAGATATGGCGAAATTAGAGGAGTGCGTCAGAAGCATTCAAGCAGACGGCTTAGTCTGGGGCTCATCTAAACTAGTTCCAGTGGGATACGGAATTAAGAAACTTCAAATACAGTGTGTAGTTGAAGATGATAAAGTTGGAACAGATATGCTGGAGGAGCAGATCACTGCTTTTGAGGACTATGTGCAGTCGATGGATGTGGCTGCTTTCAACAAGATC(SEQID NO.10)。
eEF1Bγ:
GCGGCTGGGACCCTGTACACGTATCCTGAAAACTGGAGGGCCTTCAAGGCTCTCATCGCTGCTCAGTACAGCGGGGCTCAGGTCCGCGTGCTCTCCGCACCACCCCACTTCCATTTTGGCCAAACCAACCGCACCCCTGAATTTCTCCGCAAATTTCCTGCCGGCAAGGTCCCAGCATTTGAGGGTGATGATGGATTCTGTGTGTTTGAGAGCAACGCCATTGCCTACTATGTGAGCAATGAGGAGCTGCGGGGAAGTACTCCAGAGGCAGCAGCCCAGGTGGTGCAGTGGGTGAGCTTTGCTGATTCCGATATAGTGCCCCCAGCCAGTACCTGGGTGTTCCCCACCTTGGGCATCATGCACCACAACAAACAGGCCACTGAGAATGCAAAGGAGGAAGTGAGGCGAATTCTGGGGCTGCTGGATGCTTACTTGAAGACGAGGACTTTTCTGGTGGGCGAACGAGTGACATTGGCTGACATCACAGTTGTCTGCACCCTGTTGTGGCTCTATAAGCAGGTTCTAGAGCCTTCTTTCCGCCAGGCCTTTCCCAATACCAACCGCTGGTTCCTCACCTGCATTAACCAGCCCCAGTTCCGGGCTGTCTTGGGGGAAGTGAAACTGTGTGAGAAGATGGCCCAGTTTGATGCTAAAAAGTTTGCAGAGACCCAACCTAAAAAGGACACACCACGGAAAGAGAAGGGTTCACGGGAAGAGAAGCAGAAGCCCCAGGCTGAGCGGAAGGAGGAGAAAAAGGCGGCTGCCCCTGCTCCTGAGGAGGAGATGGATGAATGTGAGCAGGCGCTGGCTGCTGAGCCCAAGGCCAAGGACCCCTTCGCTCACCTGCCCAAGAGTACCTTTGTGTTGGATGAATTTAAGCGCAAGTACTCCAATGAGGACACACTCTCTGTGGCACTGCCATATTTCTGGGAGCACTTTGATAAGGACGGCTGGTCCCTGTGGTACTCAGAGTATCGCTTCCCTGAAGAACTCACTCAGACCTTCATGAGCTGCAATCTCATCACTGGAATGTTCCAGCGACTGGACAAGCTGAGGAAGAATGCCTTCGCCAGTGTCATCCTTTTTGGAACCAACAATAGCAGCTCCATTTCTGGAGTCTGGGTCTTCCGAGGCCAGGAGCTTGCCTTTCCGCTGAGTCCAGATTGGCAGGTGGACTACGAGTCATACACATGGCGGAAACTGGATCCTGGCAGCGAGGAGACCCAGACGCTGGTTCGAGAGTACTTTTCCTGGGAGGGGGCCTTCCAGCATGTGGGCAAAGCCTTCAATCAGGGCAAGATCTTCAAG(SEQ ID NO.11)。
eEF1Bδ:
GCTACAAACTTCCTAGCACATGAGAAGATCTGGTTCGACAAGTTCAAATATGACGACGCAGAAAGGAGATTCTACGAGCAGATGAACGGGCCTGTGGCAGGTGCCTCCCGCCAGGAGAACGGCGCCAGCGTGATCCTCCGTGACATTGCGAGAGCCAGAGAGAACATCCAGAAATCCCTGGCTGGAAGCTCAGGCCCCGGGGCCTCCAGCGGCACCAGCGGAGACCACGGTGAGCTCGTCGTCCGGATTGCCAGTCTGGAAGTGGAGAACCAGAGTCTGCGTGGCGTGGTACAGGAGCTGCAGCAGGCCATCTCCAAGCTGGAGGCCCGGCTGAACGTGCTGGAGAAGAGCTCGCCTGGCCACCGGGCCACGGCCCCACAGACCCAGCACGTATCTCCCATGCGCCAAGTGGAGCCCCCAGCCAAGAAGCCAGCCACACCAGCAGAGGATGACGAGGATGATGACATTGACCTGTTTGGCAGTGACAATGAGGAGGAGGACAAGGAGGCGGCACAGCTGCGGGAGGAGCGGCTACGGCAGTACGCGGAGAAGAAGGCCAAGAAGCCTGCACTGGTGGCCAAGTCCTCCATCCTGCTGGATGTCAAGCCTTGGGATGATGAGACGGACATGGCTCAGCTGGAGGCCTGTGTGCGCTCTATCCAGCTGGACGGGCTGGTCTGGGGGGCTTCCAAGCTGGTGCCCGTGGGCTACGGTATCCGGAAGCTACAGATTCAGTGTGTGGTGGAGGACGACAAGGTGGGGACAGACTTGCTGGAGGAGGAGATCACCAAGTTTGAGGAGCACGTGCAGAGTGTCGATATCGCAGCTTTCAACAAGATC(SEQ ID NO.12)。
接着用限制性内切酶SapI将pRAP-Amp载体线性化，在1％琼脂糖凝胶上电泳并从凝胶中分离纯化目的片段，用SLIC(不依赖基因序列和连接反应的高效分子克隆方法)将线性化载体分别与eEF1Bα、eEF1Bγ和eEF1Bδ基因片段按照摩尔比1:2混合重组，室温反应3min后置于冰上，然后采取“热激法”将重组子转化到大肠杆菌感受态中，最后通过DNA测序确定目的基因的正确插入(图5)。
1.2、pRAP-Amp-eEF1Bα+γ、pRAP-Amp-eEF1Bγ+α、pRAP-Amp-eEF1Bα+γ+δ和pRAP-Amp-eEF1Bγ+α+δ共表达载体的构建
从两个pRAP质粒中产生一个共表达质粒，以pRAP-Amp-eEF1Bα+γ为例：首先用稀有限制性内切酶SwaI将pRAP-Amp-eEF1Bα载体线性化，同时，从pRAP-Amp-eEF1Bγ载体中经稀有限制性内切酶PmeI酶切，或者用正向引物(5‘-AAACACCCACCACAATTTCC-3’,SEQ IDNO.13)和反向引物(5’-AAACCTACCTACACATTTAAATTG-3’,SEQ ID NO.14)PCR扩增获得eEF1Bγ基因片段，再通过SLIC将eEF1Bγ基因连接到pRAP-Amp-eEF1Bα线性化的载体中，形成含有eEF1Bα-eEF1Bγ基因的共表达载体pRAP-Amp-eEF1Bα+γ，最后通过DNA测序确定目的基因的正确插入，其他共表达载体都用同样的方法按照顺序依次组装(图5)。
1.3、人源翻译延伸因子eEF1Bαγδ在HI-control(DE3)表达细胞株中的表达情况和镍鳌合珠下拉实验
将pRAP-Amp-eEF1Bα、pRAP-Amp-eEF1Bγ、pRAP-Amp-eEF1Bδ、pRAP-Amp-eEF1Bα+γ、pRAP-Amp-eEF1Bγ+α、pRAP-Amp-eEF1Bα+γ+δ和pRAP-Amp-eEF1Bγ+α+δ分别单独转化到HI-control(DE3)表达细胞(Lucigen，USA)中，HI-control(DE3)表达细胞携带有庆大霉素抗性，挑取5个左右的克隆至分别标记好的5mL含有氨苄西林和庆大霉素两种抗生素的LB培养基中，于37℃-220rpm恒温振荡培养12hr。再按照1:100的比例接种到50mL含有抗生素的LB培养基中，于37℃-220rpm恒温振荡培养大约3hr，直到OD600达到0.6～0.8，用0.2mMIPTG在18℃-220rpm条件下诱导蛋白表达12hr。
在这期间，从未诱导的菌液中取出1OD，从诱导表达后的菌液中取出10OD，室温离心12000rpm-5min，全部弃掉上清。向未诱导的菌体中加入50μL细胞裂解液吹打混匀室温静置5min，再向里面加入50μL 2x SDS-PAGE上样缓冲液。向诱导表达后的菌体中加入1mL的His buffer A(20mM Hepes-KOH pH 7.5,300mM KCl,20mM Imidazole,5mMβ-Me,5％Glycerol)重悬，用超声破碎仪进行破碎，取出50μL破碎的菌液标记为全菌(W)，再取出50μL破碎的菌液，4℃离心12000rpm-10min后,取出上清(S)，剩下的沉淀(P)也用50μL Hisbuffer A重悬，最后全菌、上清和沉淀里各自加入50μL 2x SDS-PAGE上样缓冲液。95℃煮样10min，室温离心12000rpm-10min。将剩下的破碎菌液4℃离心12000rpm-10min，取出上清与镍鳌合珠4℃孵育10min,用His buffer A洗涤3次，然后用His buffer B(20mM Hepes-KOHpH 7.5,300mM KCl,500mM Imidazole,5mMβ-Me,5％Glycerol)将目的蛋白洗脱下来(N)，最后通过SDS-PAGE蛋白电泳鉴定目的蛋白的表达情况(图6)。
如图7所示，共表达的目标蛋白基本都在破碎菌液的上清中，可以被镍鳌合珠有效的纯化；从“eEF1Bα+γ”和“eEF1Bγ+α”，以及“eEF1Bα+γ+δ”和“eEF1Bγ+α+δ”的共表达情况来看，eEF1B各个亚基可溶且比例均一。因此，在核酶介导的多顺反子载体中，核糖体结合位点的效率一致，基因序列的位置不会影响多蛋白复合物的化学计量。
实施例2人源翻译起始因子eIF3表达载体的构建、共表达纯化及其活性鉴定
2.1 pRAP-Kan-eIF3c、pRAP-Kan-eIF3h、pRAP-Kan-eIF3f、pRAP-Kan-eIF3a、pRAP-Amp-eIF3e、pRAP-Amp-eIF3m和pRAP-Amp-eIF3d表达载体的构建
首先，通过PCR制备编码人源翻译起始因子eIF3c、eIF3h、eIF3f、eIF3a、eIF3e、eIF3m和eIF3d的基因片段。PCR反应体系如表3所示：
表3 PCR反应体系
成分 体积
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix(NEB) 25μL
正向引物(10μM) 2.5μL
反向引物(10μM) 2.5μL
DNA模板(5ng/μL) 1μL
ddH<sub>2</sub>O 19μL
通过PCR制备eIF3c基因片段时，所采用DNA模板记为eIF3c的DNA模板，所述eIF3c的DNA模板来自于Puc57-eIF3c，所述eIF3c的DNA模板含有SEQ ID NO.15所示序列。所采用的正向引物eIF3c-F的序列如SEQ ID NO.16所示；反向引物eIF3c-R的序列如SEQ ID NO.17所示。
Puc57-eIF3c:
ATGAGCCGTTTCTTCACCACCGGCTCCGACAGCGAGTCTGAATCCTCTCTGTCCGGTGAAGAACTGGTTACCAAACCAGTTGGCGGCAACTACGGTAAACAACCGCTGCTGCTGTCTGAAGATGAAGAGGACACCAAGCGCGTAGTGCGTTCTGCGAAAGACAAACGTTTTGAAGAGCTGACCAACCTGATTCGTACCATCCGTAACGCAATGAAAATCCGCGATGTGACCAAATGCCTGGAAGAATTTGAATTGCTGGGCAAAGCCTATGGTAAAGCTAAATCCATCGTTGATAAAGAAGGTGTACCGCGCTTCTACATCCGTATTCTGGCAGACCTGGAAGATTACCTGAACGAACTGTGGGAAGACAAAGAGGGCAAGAAAAAAATGAACAAAAACAACGCCAAAGCGCTTTCAACGCTGCGTCAGAAAATTCGCAAATACAACCGTGACTTCGAAAGCCACATCACTTCTTACAAACAGAACCCGGAACAGTCTGCTGACGAAGACGCAGAGAAAAATGAAGAGGATTCAGAAGGCAGCTCTGACGAAGATGAAGACGAAGATGGCGTTTCTGCAGCGACCTTCCTGAAAAAAAAATCTGAAGCCCCGTCTGGCGAATCTCGTAAATTCCTGAAAAAAATGGATGACGAAGATGAGGATTCCGAAGACTCCGAGGATGATGAGGACTGGGATACCGGTTCTACCAGCAGCGACTCTGATAGCGAAGAAGAGGAAGGTAAGCAGACTGCGCTGGCTTCTCGCTTTCTGAAGAAGGCGCCGACCACTGACGAGGACAAGAAAGCAGCTGAAAAGAAACGCGAAGATAAAGCGAAAAAGAAACATGACCGTAAGAGCAAACGTCTGGATGAAGAAGAAGAAGATAACGAAGGCGGTGAGTGGGAACGTGTTCGTGGTGGTGTTCCGCTGGTGAAAGAAAAACCGAAAATGTTTGCCAAAGGTACTGAAATCACTCACGCGGTTGTTATTAAAAAGCTGAACGAAATCCTCCAGGCACGCGGTAAAAAAGGAACCGATCGTGCAGCTCAGATTGAATTATTGCAGCTGCTTGTGCAGATCGCTGCTGAAAACAACCTCGGCGAAGGCGTGATTGTTAAAATCAAATTCAACATCATTGCTTCGCTGTACGACTACAACCCTAACCTGGCAACTTATATGAAACCTGAAATGTGGGGCAAATGCCTGGACTGTATCAATGAGCTGATGGACATCCTGTTTGCTAACCCGAACATCTTCGTTGGCGAGAACATCCTGGAAGAAAGCGAAAACCTGCATAACGCTGATCAGCCGCTGCGTGTTCGCGGCTGCATTCTGACTCTGGTCGAACGTATGGATGAAGAATTTACAAAAATTATGCAGAACACCGACCCGCATAGTCAGGAATACGTAGAACACCTGAAAGATGAAGCCCAGGTTTGCGCAATCATCGAACGTGTACAGCGTTATCTCGAAGAAAAAGGCACCACCGAAGAAGTGTGCCGTATTTATCTGCTGCGTATCCTGCACACCTACTACAAATTTGACTATAAAGCACACCAGCGCCAGCTTACACCACCGGAAGGCAGCTCCAAATCAGAACAGGATCAAGCCGAAAACGAAGGCGAAGACAGTGCCGTTCTGATGGAACGACTCTGCAAATATATCTACGCAAAAGACCGCACGGATCGCATTCGCACCTGCGCCATTCTGTGCCACATCTATCACCACGCTCTGCACTCTCGCTGGTACCAGGCTCGTGATCTGATGTTGATGTCTCATCTGCAGGACAACATTCAGCACGCCGATCCGCCGGTACAAATTCTGTATAACCGTACGATGGTTCAGCTGGGTATCTGTGCGTTCCGCCAAGGTCTGACCAAAGACGCACATAATGCCCTGCTCGATATCCAGTCGTCAGGTCGTGCTAAAGAGCTCCTTGGTCAGGGTTTGCTGTTACGTTCCCTGCAGGAGCGTAACCAGGAACAAGAGAAAGTTGAGCGCCGCCGTCAGGTACCGTTCCACTTGCATATCAACCTTGAACTGCTGGAATGTGTTTATCTAGTCTCCGCTATGCTGCTGGAGATCCCGTACATGGCGGCGCATGAATCGGATGCGCGTCGTCGCATGATCAGTAAGCAGTTCCATCATCAGTTGAGAGTTGGTGAGCGTCAGCCACTGCTGGGTCCGCCAGAATCTATGCGCGAACATGTGGTGGCAGCGAGCAAAGCGATGAAAATGGGCGACTGGAAAACCTGTCACAGCTTTATTATCAACGAAAAAATGAACGGTAAAGTCTGGGATCTTTTCCCGGAAGCTGACAAAGTACGTACCATGCTGGTACGCAAAATCCAAGAAGAGTCCCTGCGTACTTACCTGTTCACCTACAGCAGTGTCTATGACAGCATCAGCATGGAAACCCTGAGCGATATGTTCGAACTGGATCTGCCGACTGTTCACTCTATCATCTCCAAGATGATTATTAACGAAGAGTTAATGGCTTCTCTGGATCAGCCTACGCAAACCGTTGTGATGCACCGTACTGAGCCGACCGCGCAGCAGAATCTGGCACTGCAACTGGCTGAAAAACTGGGCTCACTGGTTGAAAATAACGAACGGGTGTTCGACCACAAACAGGGCACATATGGCGGTTACTTCCGTGACCAGAAGGACGGTTATCGTAAAAATGAAGGTTACATGCGTCGTGGCGGCTACCGTCAACAGCAATCTCAGACCGCTTAC(SEQ ID NO.15)。
eIF3c-F:AAGTTCTGTTCCAGGGGCCGGGTACTGAAATCACTCACG(SEQ ID NO.16)；
eIF3c-R:TtgtggtgggtgtttCaTTAGTAAGCGGTCTGAGATTG(SEQ ID NO.17)。
通过PCR制备eIF3h基因片段时，所采用DNA模板记为eIF3h的DNA模板，所述eIF3h的DNA模板来自于Puc57-eIF3h，所述eIF3h的DNA模板含有SEQ ID NO.18所示序列。所采用的正向引物eIF3h-F的序列如SEQ ID NO.19所示；反向引物eIF3h-R的序列如SEQ ID NO.20所示。
Puc57-eIF3h:
ATGGCGAGCCGTAAAGAAGGTACTGGTTCCACCGCCACTTCCTCTTCCAGTACGGCGGGCGCAGCAGGCAAGGGTAAAGGTAAAGGCGGCAGCGGCGACTCCGCGGTGAAACAAGTACAGATCGATGGTCTGGTTGTTCTTAAAATCATCAAGCACTACCAGGAAGAGGGTCAGGGCACCGAGGTGGTGCAGGGCGTTCTGCTGGGCCTGGTGGTTGAAGACCGCCTGGAAATCACCAACTGCTTCCCGTTCCCGCAGCATACCGAAGATGACGCCGACTTCGACGAAGTTCAGTACCAGATGGAGATGATGCGCAGCCTGCGTCACGTTAACATCGACCACCTGCACGTAGGCTGGTACCAGAGCACCTACTACGGTTCTTTTGTTACCCGTGCTCTGCTGGATTCTCAGTTCTCTTATCAGCACGCTATCGAAGAGTCTGTAGTATTGATTTATGATCCGATTAAAACCGCGCAGGGTAGTCTCTCGCTGAAAGCTTACCGTCTGACTCCGAAACTGATGGAAGTCTGTAAAGAGAAAGATTTTTCGCCTGAAGCGCTGAAAAAAGCGAACATTACCTTCGAGTACATGTTCGAAGAAGTGCCGATCGTTATCAAAAACAGCCATCTGATCAACGTGCTGATGTGGGAACTTGAGAAGAAATCCGCAGTTGCTGACAAACATGAACTGCTGTCTCTGGCTTCCAGCAACCACCTCGGCAAAAATCTGCAACTGTTAATGGATCGCGTTGATGAAATGAGCCAGGACATTGTTAAATACAATACCTATATGCGTAACACCAGCAAACAGCAGCAGCAGAAACACCAGTATCAACAACGTCGCCAGCAAGAAAACATGCAGCGTCAGTCTCGTGGTGAACCGCCGCTGCCGGAAGAAGATCTGAGCAAGCTGTTTAAACCACCGCAACCGCCAGCGCGTATGGACAGCTTGCTGATTGCTGGCCAGATTAACACTTACTGCCAGAACATCAAAGAATTTACTGCGCAAAACCTGGGTAAACTGTTCATGGCACAGGCACTGCAGGAATACAACAAC(SEQ ID NO.18)。
eIF3h-F:AAGTTCTGTTCCAGGGGCCGTCCGCGGTGAAACAAG(SEQ ID NO.19)；
eIF3h-R:TtgtggtgggtgtttCaTTAGTTGTTGTATTCCTGCAG(SEQ ID NO.20)。
通过PCR制备eIF3f基因片段时，所采用DNA模板记为eIF3f的DNA模板，所述eIF3f的DNA模板来自于Puc57-eIF3f，所述eIF3f的DNA模板含有SEQ ID NO.21所示序列。所采用的正向引物eIF3f-F的序列如SEQ ID NO.22所示；反向引物eIF3f-R的序列如SEQ ID NO.23所示。
Puc57-eIF3f:
ATGGCGACACCTGCGGTGCCGGTGAGTGCGCCGCCGGCTACTCCGACCCCTGTTCCTGCAGCTGCACCTGCCAGCGTGCCAGCGCCGACTCCGGCACCGGCAGCGGCACCGGTTCCGGCAGCCGCTCCGGCGTCATCATCTGATCCGGCGGCTGCTGCCGCAGCAACCGCCGCCCCGGGTCAGACTCCAGCCTCCGCGCAGGCGCCCGCTCAGACCCCAGCACCAGCCCTGCCTGGGCCAGCTCTGCCGGGTCCGTTCCCGGGCGGCCGTGTTGTTCGTCTGCACCCGGTAATCCTGGCGTCCATTGTTGACTCCTATGAACGTCGTAACGAAGGCGCGGCACGCGTTATCGGTACTCTGCTGGGTACGGTAGACAAACACTCTGTTGAAGTTACCAACTGTTTCTCCGTACCGCACAACGAGTCTGAAGATGAAGTGGCGGTAGATATGGAATTTGCTAAAAACATGTACGAACTGCATAAAAAAGTGAGCCCGAATGAGCTGATTCTGGGCTGGTACGCAACTGGCCATGACATCACCGAACACAGCGTCTTGATTCATGAATACTACAGCCGTGAAGCGCCAAACCCGATCCACCTGACTGTTGATACCAGCTTGCAGAACGGCCGCATGAGCATCAAAGCTTACGTTTCTACGCTGATGGGCGTACCAGGTCGTACTATGGGTGTGATGTTCACCCCGCTGACCGTGAAATATGCCTATTACGACACCGAGCGCATTGGCGTTGACCTGATCATGAAAACCTGCTTCTCTCCGAACCGCGTGATTGGTCTGTCCAGCGATCTGCAGCAGGTTGGCGGTGCTTCTGCACGTATTCAGGATGCGCTGTCGACAGTGCTGCAATACGCTGAAGACGTTCTGTCTGGTAAAGTTTCCGCTGATAACACCGTTGGTCGTTTCCTGATGTCTCTGGTTAACCAGGTACCGAAAATCGTTCCGGATGACTTTGAAACCATGCTGAACAGCAACATCAACGACCTCTTGATGGTGACCTATCTGGCTAACCTGACGCAATCGCAGATCGCACTGAATGAAAAACTGGTAAATCTG(SEQ ID NO.21)。
eIF3f-F:AAGTTCTGTTCCAGGGGCCGGGTCCGTTCCCGG(SEQ ID NO.22)；
eIF3f-R:TtgtggtgggtgtttCaTTACAGATTTACCAGTTTTTCATTCAG(SEQ ID NO.23)。
通过PCR制备eIF3a基因片段时，所采用DNA模板记为eIF3a的DNA模板，所述eIF3a的DNA模板来自于Puc57-eIF3a，所述eIF3a的DNA模板含有SEQ ID NO.24所示序列。所采用的正向引物eIF3a-F的序列如SEQ ID NO.25所示；反向引物eIF3a-R的序列如SEQ ID NO.26所示。
Puc57-eIF3a:
ATGCCAGCCTACTTCCAGCGTCCTGAAAACGCTCTGAAACGTGCGAACGAATTTCTGGAAGTCGGTAAAAAACAGCCGGCGCTGGATGTGCTGTACGATGTTATGAAATCCAAAAAACACCGTACCTGGCAGAAAATCCATGAACCAATCATGCTGAAATATCTGGAGCTGTGTGTGGACCTGCGTAAGTCTCATCTGGCTAAAGAAGGCCTGTATCAGTACAAAAATATTTGCCAGCAAGTTAACATCAAATCGCTGGAAGACGTAGTACGTGCTTATCTTAAAATGGCAGAGGAGAAAACCGAAGCAGCAAAAGAAGAGTCTCAGCAGATGGTGCTTGACATTGAGGACCTGGACAATATCCAGACCCCAGAATCGGTACTGCTGTCTGCGGTTTCCGGCGAAGACACCCAGGACCGCACCGATCGCCTTCTGCTGACTCCGTGGGTGAAATTCCTGTGGGAAAGCTACCGTCAGTGCCTGGATCTGCTGCGCAACAACAGCCGCGTGGAACGCCTCTATCACGACATCGCGCAGCAGGCGTTTAAATTTTGCCTGCAGTATACCCGTAAAGCTGAGTTCCGCAAACTGTGCGACAACCTGCGTATGCACCTGAGCCAGATTCAGCGCCATCATAATCAGTCTACAGCCATCAATCTGAACAATCCGGAATCTCAATCTATGCATCTGGAAACCCGTCTGGTTCAGCTTGATTCTGCAATCAGCATGGAACTATGGCAGGAAGCCTTCAAAGCGGTAGAAGACATCCACGGCTTGTTCAGCCTCTCCAAGAAGCCGCCGAAACCGCAGCTGATGGCTAACTATTACAACAAAGTTTCTACCGTGTTCTGGAAATCTGGTAATGCGCTGTTCCACGCTTCTACTCTGCACCGCCTGTACCATCTTTCTCGTGAGATGCGTAAAAACCTGACTCAGGATGAAATGCAACGCATGTCTACGCGTGTATTGCTGGCAACCCTGTCCATTCCGATCACCCCGGAACGTACTGATATTGCACGTCTGCTCGACATGGACGGTATCATCGTTGAAAAACAACGCCGTCTGGCAACGCTGCTGGGCCTGCAGGCACCGCCAACTCGTATCGGTCTGATCAACGATATGGTTCGTTTTAACGTTCTGCAATACGTTGTTCCGGAAGTTAAAGACCTTTATAACTGGCTGGAAGTAGAATTCAACCCGCTGAAATTGTGTGAACGTGTGACTAAAGTGCTCAACTGGGTTCGCGAGCAACCGGAGAAAGAACCGGAACTGCAACAGTACGTACCGCAACTGCAGAACAACACTATCCTGCGTCTGTTGCAACAGGTTTCGCAGATTTATCAGTCGATTGAATTTTCTCGCCTGACCTCTCTGGTGCCGTTCGTTGATGCCTTTCAGCTGGAACGTGCTATCGTCGACGCAGCGCGTCACTGTGATCTGCAGGTGCGTATCGACCACACCAGCCGTACGTTATCCTTCGGTTCTGACTTAAACTACGCGACCCGCGAAGATGCTCCGATTGGCCCGCACTTGCAGTCCATGCCGTCTGAACAGATCCGTAATCAACTGACGGCGATGAGCAGCGTCCTGGCCAAAGCCCTGGAAGTGATTAAACCAGCACACATCCTGCAAGAAAAGGAAGAGCAGCACCAGCTGGCTGTTACCGCTTACCTGAAAAACTCCCGTAAGGAGCATCAGCGCATTCTGGCGCGTCGTCAAACCATCGAAGAGCGTAAGGAACGCCTGGAAAGTCTGAACATCCAACGTGAAAAAGAAGAGCTGGAACAACGTGAGGCTGAACTGCAAAAAGTCCGTAAAGCTGAAGAAGAGCGTCTTCGTCAGGAAGCGAAGGAGCGCGAAAAAGAACGCATTCTCCAGGAACACGAACAGATCAAAAAGAAAACCGTTCGTGAACGTCTGGAGCAAATTAAGAAAACTGAACTCGGCGCTAAAGCGTTCAAGGATATCGATATCGAAGACTTGGAAGAACTGGACCCGGACTTCATTATGGCGAAACAGGTTGAACAACTTGAGAAAGAGAAAAAAGAACTTCAGGAGCGTCTCAAGAACCAGGAGAAGAAAATTGATTACTTTGAACGTGCGAAACGCCTGGAAGAAATTCCCTTGATCAAGAGCGCCTATGAAGAGCAGCGTATTAAAGATATGGATCTGTGGGAACAGCAGGAAGAAGAGCGTATTACTACCATGCAGCTCGAGCGTGAAAAAGCACTTGAACATAAAAACCGTATGTCCCGCATGCTCGAAGATCGAGACCTGTTTGTGATGCGCTTGAAAGCGGCACGCCAGAGCGTTTACGAAGAAAAGCTGAAGCAGTTCGAAGAACGTCTGGCGGAAGAGCGTCACAACCGCTTAGAAGAACGAAAGCGCCAGCGTAAAGAAGAGCGTCGCATCACTTACTACCGCGAAAAAGAAGAAGAAGAGCAGCGTCGCGCTGAAGAGCAGATGCTGAAAGAACGTGAAGAGCGTGAGCGCGCAGAACGTGCCAAACGTGAAGAAGAATTACGTGAATACCAGGAACGGGTCAAAAAACTGGAAGAAGTTGAGCGCAAGAAGCGTCAGCGTGAACTGGAAATCGAGGAACGTGAACGTCGCCGCGAAGAAGAACGTCGTCTGGGTGACAGTAGCCTGTCGCGTAAAGATAGCCGCTGGGGCGACCGCGATTCAGAAGGCACCTGGCGCAAAGGCCCTGAAGCTGACTCCGAATGGCGTCGTGGACCTCCGGAAAAAGAGTGGCGTCGCGGTGAAGGTCGTGACGAAGACCGTTCTCACCGTCGCGACGAGGAGCGCCCTCGCCGCTTAGGCGATGACGAAGACCGCGAGCCGTCCCTGCGCCCGGATGACGACCGTGTTCCTCGCCGTGGCATGGATGATGACCGCGGTCCGCGTCGTGGTCCAGAAGAAGATCGCTTCTCTCGGCGTGGTGCTGATGATGATCGTCCAAGCTGGCGTAACACCGACGACGATCGCCCACCGCGTCGTATCGCTGATGAAGATCGTGGTAACTGGCGCCACGCGGATGACGATCGCCCGCCACGTCGTGGCCTCGATGAAGACCGTGGCAGCTGGCGTACTGCCGACGAAGATCGTGGGCCACGCCGTGGCATGGACGATGACCGTGGTCCGCGCCGGGGTGGCGCAGATGATGAGCGTTCATCATGGCGCAATGCTGACGACGATCGTGGCCCGCGCCGTGGTCTGGATGATGATCGCGGCCCGCGCCGTGGGATGGATGATGATCGCGGTCCGCGTCGTGGTATGGATGATGACCGTGGCCCGCGCCGTGGTATGGATGACGACCGAGGTCCTCGTCGTGGTCTGGACGATGACCGCGGACCGTGGCGCAACGCCGATGACGACCGTATCCCGCGTCGCGGTGCGGAAGATGACCGTGGTCCGTGGCGTAACATGGACGATGACCGTCTGTCACGCCGCGCGGACGACGATCGTTTCCCGCGTCGCGGCGACGACAGCCGTCCGGGTCCCTGGCGTCCGCTGGTAAAGCCAGGCGGCTGGAGAGAAAAAGAGAAGGCTCGTGAAGAATCCTGGGGCCCCCCTCGTGAGTCCCGTCCGAGCGAAGAACGTGAGTGGGATCGCGAAAAAGAGCGCGATCGCGATAACCAGGACCGTGAAGAGAACGACAAAGATCCTGAGCGTGAACGTGACCGGGAACGCGACGTTGACCGCGAAGATCGTTTCCGTCGTCCGCGTGATGAGGGTGGTTGGCGTCGCGGCCCTGCCGAAGAAAGCAGTTCCTGGCGCGATTCCAGCCGTCGTGACGATCGTGATCGGGATGATCGTCGTCGGGAACGTGACGACCGTCGTGATCTGCGCGAACGCCGCGACCTGCGTGATGATCGTGACCGCCGCGGGCCGCCGCTGCGTTCCGAGCGCGAAGAAGTGTCTTCCTGGCGTCGTGCAGACGACCGTAAAGACGATCGCGTTGAAGAACGCGATCCGCCGCGTCGCGTACCACCGCCGGCACTGAGTCGTGATCGCGAGCGTGACCGCGACCGTGAACGTGAAGGTGAGAAAGAGAAAGCATCCTGGCGTGCAGAAAAAGACCGTGAATCACTGCGTCGTACCAAAAATGAAACTGACGAAGATGGCTGGACCACCGTACGCCGG(SEQ ID NO.24)。
eIF3a-F:AAGTTCTGTTCCAGGGGCCGCCAGCCTACTTCCAGCGTC(SEQ ID NO.25)；
eIF3a-R:TtgtggtgggtgtttCaTTATTTACGGACTTTTTGCAGTTCAG(SEQ ID NO.26)。
通过PCR制备eIF3e基因片段时，所采用DNA模板记为eIF3e的DNA模板，所述eIF3e的DNA模板来自于Puc57-eIF3e，所述eIF3e的DNA模板含有SEQ ID NO.27所示序列。所采用的正向引物eIF3e-F的序列如SEQ ID NO.28所示；反向引物eIF3e-R的序列如SEQ ID NO.29所示。
Puc57-eIF3e:
ATGGCTGAATACGACTTAACGACTCGCATTGCTCACTTCCTGGACCGTCACCTGGTGTTCCCGCTGCTGGAATTCCTGAGCGTGAAAGAGATCTACAACGAAAAAGAACTGCTGCAGGGCAAGCTTGATCTGTTGTCTGATACCAATATGGTTGACTTTGCCATGGATGTTTATAAAAACCTGTATTCTGACGATATCCCGCATGCACTGCGTGAAAAGCGTACTACCGTTGTTGCTCAGCTGAAACAGCTTCAGGCTGAGACCGAACCGATTGTTAAAATGTTCGAAGACCCAGAAACTACTCGTCAGATGCAATCTACCCGCGATGGTCGTATGCTCTTCGACTATTTGGCTGACAAACACGGTTTCCGTCAGGAGTACCTGGATACGCTGTACCGTTACGCAAAATTCCAGTACGAATGCGGTAACTACAGCGGTGCAGCGGAATATCTCTACTTCTTTCGCGTTCTGGTTCCGGCAACCGATCGCAACGCGCTGTCTTCGCTGTGGGGCAAACTGGCAAGCGAAATTCTGATGCAGAACTGGGATGCAGCAATGGAAGATCTGACTCGCCTGAAAGAAACCATCGACAACAACAGCGTCAGCAGTCCTTTGCAGTCTCTGCAACAGCGTACCTGGCTGATCCACTGGAGCCTGTTCGTATTTTTCAACCACCCGAAAGGCCGTGATAACATTATTGACCTGTTCCTCTACCAGCCGCAGTATCTGAATGCGATTCAGACCATGTGTCCGCACATCCTGCGTTATCTGACCACTGCTGTTATCACCAACAAAGACGTTCGTAAACGTCGCCAGGTGCTGAAGGACCTGGTAAAAGTGATCCAGCAGGAAAGCTACACCTACAAAGATCCGATCACTGAATTTGTTGAATGCCTGTACGTTAACTTCGATTTTGACGGTGCGCAGAAAAAACTGCGCGAATGTGAATCCGTACTGGTAAACGATTTCTTCCTGGTCGCCTGCCTTGAGGACTTCATCGAAAACGCACGTCTGTTTATTTTTGAAACCTTCTGCCGTATCCATCAGTGTATCTCCATCAACATGCTGGCTGATAAACTGAACATGACTCCGGAAGAAGCCGAGCGCTGGATCGTTAATCTGATTCGTAACGCTCGTCTGGATGCGAAAATCGATTCCAAGCTGGGTCACGTGGTGATGGGCAACAATGCCGTGTCGCCGTATCAGCAGGTTATTGAAAAAACCAAATCTCTCTCCTTCCGCTCACAAATGCTGGCGATGAACATCGAGAAGAAACTGAACCAGAATTCCCGTTCTGAAGCGCCGAACTGGGCGACCCAGGACTCCGGCTTCTAC(SEQ ID NO.27)。
eIF3e-F:AAGTTCTGTTCCAGGGGCCGGCTGAATACGACTTAACGACTC(SEQ ID NO.28)；
eIF3e-R:TtgtggtgggtgtttCaTTAGTAGAAGCCGGAGTCC(SEQ ID NO.29)。
通过PCR制备eIF3m基因片段时，所采用DNA模板记为eIF3m的DNA模板，所述eIF3m的DNA模板来自于Puc57-eIF3m，所述eIF3m的DNA模板含有SEQ ID NO.30所示序列。所采用的正向引物eIF3m-F的序列如SEQ ID NO.31所示；反向引物eIF3m-R的序列如SEQ ID NO.32所示。
Puc57-eIF3m:
ATGTCTGTTCCGGCGTTTATCGACATCTCTGAAGAGGACCAGGCGGCAGAACTGCGTGCTTACCTGAAATCCAAAGGCGCTGAAATCTCCGAAGAAAACTCCGAGGGCGGTCTGCACGTTGATCTGGCTCAGATCATCGAAGCTTGCGACGTTTGCCTGAAAGAGGATGACAAAGATGTGGAATCCGTGATGAACAGCGTGGTATCCCTGTTGTTGATTCTGGAGCCGGACAAGCAGGAAGCGCTGATTGAAAGCCTGTGTGAAAAACTGGTAAAGTTCCGTGAAGGCGAACGTCCTTCACTGCGTCTGCAACTGCTGTCTAACCTGTTCCACGGTATGGATAAAAACACCCCAGTACGTTACACCGTTTACTGCTCGCTGATCAAAGTGGCTGCTTCCTGCGGTGCGATTCAGTACATCCCGACCGAGCTGGATCAGGTTCGTAAATGGATTTCTGACTGGAACCTGACTACTGAAAAGAAACACACCCTCCTGCGCCTGCTGTACGAAGCACTGGTTGACTGCAAAAAATCTGACGCTGCCAGTAAGGTAATGGTGGAGTTGCTGGGTTCTTATACCGAAGATAACGCCAGCCAGGCACGCGTGGATGCTCACCGTTGCATCGTTCGCGCTCTGAAAGATCCGAACGCATTCCTGTTTGACCACCTGCTGACGCTGAAGCCGGTAAAATTCCTGGAAGGTGAACTGATCCACGACCTGCTGACCATCTTCGTTTCCGCGAAGCTGGCAAGCTATGTGAAATTCTACCAGAACAACAAAGACTTCATCGACAGCCTGGGCCTGCTGCATGAACAAAACATGGCGAAAATGCGTCTGCTGACCTTCATGGGCATGGCAGTTGAAAATAAAGAAATTTCGTTTGATACCATGCAGCAAGAACTGCAGATTGGCGCGGATGATGTAGAAGCCTTTGTTATCGATGCGGTTCGTACCAAAATGGTTTATTGTAAAATTGATCAGACTCAGCGCAAAGTCGTTGTTTCTCACAGCACGCATCGTACTTTCGGTAAACAGCAGTGGCAGCAGCTGTATGACACCCTGAATGCATGGAAACAAAATCTGAACAAAGTTAAAAATAGTCTGCTTTCTCTGAGCGACACT(SEQ IDNO.30)。
eIF3m-F:AAGTTCTGTTCCAGGGGCCGTCTGTTCCGGCGTTTATC(SEQ ID NO.31)；eIF3m-R:TtgtggtgggtgtttCaTTAAGTGTCGCTCAGAGAAAG(SEQ ID NO.32)。
通过PCR制备eIF3d基因片段时，所采用DNA模板记为eIF3d的DNA模板，所述eIF3d的DNA模板来自于Puc57-eIF3d，所述eIF3d的DNA模板含有SEQ ID NO.33所示序列。所采用的正向引物eIF3d-F的序列如SEQ ID NO.34所示；反向引物eIF3d-R的序列如SEQ ID NO.35所示。
Puc57-eIF3d:
ATGGCTAAGTTCATGACCCCGGTAATTCAGGATAACCCGTCTGGCTGGGGCCCGTGCGCAGTTCCGGAACAGTTCCGCGATATGCCGTATCAGCCGTTTAGCAAAGGCGACCGTCTGGGTAAAGTTGCTGACTGGACGGGAGCAACTTACCAGGACAAGCGTTACACCAACAAATATTCCTCGCAGTTCGGTGGTGGCTCCCAGTACGCTTACTTCCATGAAGAAGATGAGTCTTCCTTCCAGCTGGTTGACACCGCACGCACGCAAAAAACGGCATACCAGCGTAACCGCATGCGCTTCGCACAGCGTAATCTCCGTCGTGATAAAGATCGTCGCAACATGCTGCAATTTAACCTGCAGATTCTTCCGAAATCCGCGAAACAAAAAGAGCGTGAACGTATCCGCCTGCAAAAGAAATTCCAGAAGCAGTTTGGCGTTCGCCAGAAATGGGATCAGAAATCTCAGAAGCCGCGTGACAGCTCTGTCGAAGTACGTTCCGACTGGGAAGTGAAAGAAGAAATGGATTTCCCGCAGTTGATGAAAATGCGTTATCTGGAAGTTTCTGAGCCGCAAGACATCGAATGCTGCGGTGCTCTGGAATACTACGATAAAGCGTTTGATCGCATCACCACTCGTTCAGAAAAACCGCTGCGTAGCATTAAACGTATTTTCCACACCGTTACTACCACCGATGATCCGGTTATTCGTAAACTGGCTAAAACTCAGGGTAACGTGTTTGCAACGGATGCGATTCTCGCGACTCTGATGAGCTGTACCCGTTCTGTTTACTCCTGGGATATCGTGGTTCAGCGCGTTGGTTCTAAACTGTTCTTCGACAAACGCGACAACTCTGATTTTGACTTGCTGACCGTATCTGAAACTGCGAACGAACCGCCACAGGACGAAGGCAACTCGTTCAACTCCCCGCGCAATCTGGCAATGGAAGCGACCTACATCAATCACAACTTTAGTCAGCAGTGCCTGCGTATGGGCAAAGAACGTTACAACTTCCCTAATCCGAACCCGTTCGTTGAAGACGACATGGACAAAAATGAAATCGCCTCTGTAGCCTATCGTTATCGCCGCTGGAAACTTGGTGATGACATCGACCTGATCGTTCGTTGTGAACACGACGGCGTGATGACTGGCGCTAACGGTGAAGTCAGCTTCATCAACATCAAAACCCTGAACGAGTGGGACTCCCGTCATTGTAACGGCGTAGATTGGCGTCAGAAGCTGGATTCACAACGTGGTGCGGTGATCGCTACCGAACTGAAAAACAACAGCTACAAACTGGCGCGTTGGACCTGCTGCGCGCTGCTGGCCGGTAGCGAATATCTCAAGTTAGGTTATGTGAGTCGCTACCATGTCAAAGATTCCAGCCGTCACGTTATCCTGGGCACTCAACAGTTCAAACCAAACGAATTTGCTAGCCAGATCAACCTGAGCGTAGAAAACGCCTGGGGCATTCTGCGCTGCGTGATTGATATCTGTATGAAGCTTGAGGAAGGTAAATACCTGATTCTGAAAGACCCGAATAAACAGGTTATCCGTGTTTATTCTCTGCCGGACGGTACCTTCTCTTCTGACGAAGATGAAGAAGAAGAGGAGGAGGAGGAAGAAGAAGAGGAAGAGGAGGAAACC(SEQ ID NO.33)。
eIF3d-F:AAGTTCTGTTCCAGGGGCCGGCTAAGTTCATGACCCCG(SEQ ID NO.34)；
eIF3d-R:TtgtggtgggtgtttCaTTACGTGCGTGCGGTGTC(SEQ ID NO.35)。
PCR反应条件如表4所示：
表4PCR反应条件
Figure BDA0003137689720000241
用琼脂糖凝胶电泳检测条带大小后，将扩增产物回收纯化。分别获得eIF3c、eIF3h、eIF3f、eIF3a、eIF3e、eIF3m和eIF3d基因片段。eIF3c基因片段的序列如SEQ IDNO.36所示。eIF3h基因片段的序列如SEQ ID NO.37所示。eIF3f基因片段的序列如SEQ IDNO.38所示。eIF3a基因片段的序列如SEQ ID NO.39所示。eIF3e基因片段的序列如SEQ IDNO.40所示。eIF3m基因片段的序列如SEQ ID NO.41所示。eIF3d基因片段的序列如SEQ IDNO.42所示。
eIF3c:
GGTACTGAAATCACTCACGCGGTTGTTATTAAAAAGCTGAACGAAATCCTCCAGGCACGCGGTAAAAAAGGAACCGATCGTGCAGCTCAGATTGAATTATTGCAGCTGCTTGTGCAGATCGCTGCTGAAAACAACCTCGGCGAAGGCGTGATTGTTAAAATCAAATTCAACATCATTGCTTCGCTGTACGACTACAACCCTAACCTGGCAACTTATATGAAACCTGAAATGTGGGGCAAATGCCTGGACTGTATCAATGAGCTGATGGACATCCTGTTTGCTAACCCGAACATCTTCGTTGGCGAGAACATCCTGGAAGAAAGCGAAAACCTGCATAACGCTGATCAGCCGCTGCGTGTTCGCGGCTGCATTCTGACTCTGGTCGAACGTATGGATGAAGAATTTACAAAAATTATGCAGAACACCGACCCGCATAGTCAGGAATACGTAGAACACCTGAAAGATGAAGCCCAGGTTTGCGCAATCATCGAACGTGTACAGCGTTATCTCGAAGAAAAAGGCACCACCGAAGAAGTGTGCCGTATTTATCTGCTGCGTATCCTGCACACCTACTACAAATTTGACTATAAAGCACACCAGCGCCAGCTTACACCACCGGAAGGCAGCTCCAAATCAGAACAGGATCAAGCCGAAAACGAAGGCGAAGACAGTGCCGTTCTGATGGAACGACTCTGCAAATATATCTACGCAAAAGACCGCACGGATCGCATTCGCACCTGCGCCATTCTGTGCCACATCTATCACCACGCTCTGCACTCTCGCTGGTACCAGGCTCGTGATCTGATGTTGATGTCTCATCTGCAGGACAACATTCAGCACGCCGATCCGCCGGTACAAATTCTGTATAACCGTACGATGGTTCAGCTGGGTATCTGTGCGTTCCGCCAAGGTCTGACCAAAGACGCACATAATGCCCTGCTCGATATCCAGTCGTCAGGTCGTGCTAAAGAGCTCCTTGGTCAGGGTTTGCTGTTACGTTCCCTGCAGGAGCGTAACCAGGAACAAGAGAAAGTTGAGCGCCGCCGTCAGGTACCGTTCCACTTGCATATCAACCTTGAACTGCTGGAATGTGTTTATCTAGTCTCCGCTATGCTGCTGGAGATCCCGTACATGGCGGCGCATGAATCGGATGCGCGTCGTCGCATGATCAGTAAGCAGTTCCATCATCAGTTGAGAGTTGGTGAGCGTCAGCCACTGCTGGGTCCGCCAGAATCTATGCGCGAACATGTGGTGGCAGCGAGCAAAGCGATGAAAATGGGCGACTGGAAAACCTGTCACAGCTTTATTATCAACGAAAAAATGAACGGTAAAGTCTGGGATCTTTTCCCGGAAGCTGACAAAGTACGTACCATGCTGGTACGCAAAATCCAAGAAGAGTCCCTGCGTACTTACCTGTTCACCTACAGCAGTGTCTATGACAGCATCAGCATGGAAACCCTGAGCGATATGTTCGAACTGGATCTGCCGACTGTTCACTCTATCATCTCCAAGATGATTATTAACGAAGAGTTAATGGCTTCTCTGGATCAGCCTACGCAAACCGTTGTGATGCACCGTACTGAGCCGACCGCGCAGCAGAATCTGGCACTGCAACTGGCTGAAAAACTGGGCTCACTGGTTGAAAATAACGAACGGGTGTTCGACCACAAACAGGGCACATATGGCGGTTACTTCCGTGACCAGAAGGACGGTTATCGTAAAAATGAAGGTTACATGCGTCGTGGCGGCTACCGTCAACAGCAATCTCAGACCGCTTAC(SEQ ID NO.36)。
eIF3h:
TCCGCGGTGAAACAAGTACAGATCGATGGTCTGGTTGTTCTTAAAATCATCAAGCACTACCAGGAAGAGGGTCAGGGCACCGAGGTGGTGCAGGGCGTTCTGCTGGGCCTGGTGGTTGAAGACCGCCTGGAAATCACCAACTGCTTCCCGTTCCCGCAGCATACCGAAGATGACGCCGACTTCGACGAAGTTCAGTACCAGATGGAGATGATGCGCAGCCTGCGTCACGTTAACATCGACCACCTGCACGTAGGCTGGTACCAGAGCACCTACTACGGTTCTTTTGTTACCCGTGCTCTGCTGGATTCTCAGTTCTCTTATCAGCACGCTATCGAAGAGTCTGTAGTATTGATTTATGATCCGATTAAAACCGCGCAGGGTAGTCTCTCGCTGAAAGCTTACCGTCTGACTCCGAAACTGATGGAAGTCTGTAAAGAGAAAGATTTTTCGCCTGAAGCGCTGAAAAAAGCGAACATTACCTTCGAGTACATGTTCGAAGAAGTGCCGATCGTTATCAAAAACAGCCATCTGATCAACGTGCTGATGTGGGAACTTGAGAAGAAATCCGCAGTTGCTGACAAACATGAACTGCTGTCTCTGGCTTCCAGCAACCACCTCGGCAAAAATCTGCAACTGTTAATGGATCGCGTTGATGAAATGAGCCAGGACATTGTTAAATACAATACCTATATGCGTAACACCAGCAAACAGCAGCAGCAGAAACACCAGTATCAACAACGTCGCCAGCAAGAAAACATGCAGCGTCAGTCTCGTGGTGAACCGCCGCTGCCGGAAGAAGATCTGAGCAAGCTGTTTAAACCACCGCAACCGCCAGCGCGTATGGACAGCTTGCTGATTGCTGGCCAGATTAACACTTACTGCCAGAACATCAAAGAATTTACTGCGCAAAACCTGGGTAAACTGTTCATGGCACAGGCACTGCAGGAATACAACAAC(SEQ ID NO.37)。
eIF3f:
GGTCCGTTCCCGGGCGGCCGTGTTGTTCGTCTGCACCCGGTAATCCTGGCGTCCATTGTTGACTCCTATGAACGTCGTAACGAAGGCGCGGCACGCGTTATCGGTACTCTGCTGGGTACGGTAGACAAACACTCTGTTGAAGTTACCAACTGTTTCTCCGTACCGCACAACGAGTCTGAAGATGAAGTGGCGGTAGATATGGAATTTGCTAAAAACATGTACGAACTGCATAAAAAAGTGAGCCCGAATGAGCTGATTCTGGGCTGGTACGCAACTGGCCATGACATCACCGAACACAGCGTCTTGATTCATGAATACTACAGCCGTGAAGCGCCAAACCCGATCCACCTGACTGTTGATACCAGCTTGCAGAACGGCCGCATGAGCATCAAAGCTTACGTTTCTACGCTGATGGGCGTACCAGGTCGTACTATGGGTGTGATGTTCACCCCGCTGACCGTGAAATATGCCTATTACGACACCGAGCGCATTGGCGTTGACCTGATCATGAAAACCTGCTTCTCTCCGAACCGCGTGATTGGTCTGTCCAGCGATCTGCAGCAGGTTGGCGGTGCTTCTGCACGTATTCAGGATGCGCTGTCGACAGTGCTGCAATACGCTGAAGACGTTCTGTCTGGTAAAGTTTCCGCTGATAACACCGTTGGTCGTTTCCTGATGTCTCTGGTTAACCAGGTACCGAAAATCGTTCCGGATGACTTTGAAACCATGCTGAACAGCAACATCAACGACCTCTTGATGGTGACCTATCTGGCTAACCTGACGCAATCGCAGATCGCACTGAATGAAAAACTGGTAAATCTG(SEQ IDNO.38)。
eIF3a:
CCAGCCTACTTCCAGCGTCCTGAAAACGCTCTGAAACGTGCGAACGAATTTCTGGAAGTCGGTAAAAAACAGCCGGCGCTGGATGTGCTGTACGATGTTATGAAATCCAAAAAACACCGTACCTGGCAGAAAATCCATGAACCAATCATGCTGAAATATCTGGAGCTGTGTGTGGACCTGCGTAAGTCTCATCTGGCTAAAGAAGGCCTGTATCAGTACAAAAATATTTGCCAGCAAGTTAACATCAAATCGCTGGAAGACGTAGTACGTGCTTATCTTAAAATGGCAGAGGAGAAAACCGAAGCAGCAAAAGAAGAGTCTCAGCAGATGGTGCTTGACATTGAGGACCTGGACAATATCCAGACCCCAGAATCGGTACTGCTGTCTGCGGTTTCCGGCGAAGACACCCAGGACCGCACCGATCGCCTTCTGCTGACTCCGTGGGTGAAATTCCTGTGGGAAAGCTACCGTCAGTGCCTGGATCTGCTGCGCAACAACAGCCGCGTGGAACGCCTCTATCACGACATCGCGCAGCAGGCGTTTAAATTTTGCCTGCAGTATACCCGTAAAGCTGAGTTCCGCAAACTGTGCGACAACCTGCGTATGCACCTGAGCCAGATTCAGCGCCATCATAATCAGTCTACAGCCATCAATCTGAACAATCCGGAATCTCAATCTATGCATCTGGAAACCCGTCTGGTTCAGCTTGATTCTGCAATCAGCATGGAACTATGGCAGGAAGCCTTCAAAGCGGTAGAAGACATCCACGGCTTGTTCAGCCTCTCCAAGAAGCCGCCGAAACCGCAGCTGATGGCTAACTATTACAACAAAGTTTCTACCGTGTTCTGGAAATCTGGTAATGCGCTGTTCCACGCTTCTACTCTGCACCGCCTGTACCATCTTTCTCGTGAGATGCGTAAAAACCTGACTCAGGATGAAATGCAACGCATGTCTACGCGTGTATTGCTGGCAACCCTGTCCATTCCGATCACCCCGGAACGTACTGATATTGCACGTCTGCTCGACATGGACGGTATCATCGTTGAAAAACAACGCCGTCTGGCAACGCTGCTGGGCCTGCAGGCACCGCCAACTCGTATCGGTCTGATCAACGATATGGTTCGTTTTAACGTTCTGCAATACGTTGTTCCGGAAGTTAAAGACCTTTATAACTGGCTGGAAGTAGAATTCAACCCGCTGAAATTGTGTGAACGTGTGACTAAAGTGCTCAACTGGGTTCGCGAGCAACCGGAGAAAGAACCGGAACTGCAACAGTACGTACCGCAACTGCAGAACAACACTATCCTGCGTCTGTTGCAACAGGTTTCGCAGATTTATCAGTCGATTGAATTTTCTCGCCTGACCTCTCTGGTGCCGTTCGTTGATGCCTTTCAGCTGGAACGTGCTATCGTCGACGCAGCGCGTCACTGTGATCTGCAGGTGCGTATCGACCACACCAGCCGTACGTTATCCTTCGGTTCTGACTTAAACTACGCGACCCGCGAAGATGCTCCGATTGGCCCGCACTTGCAGTCCATGCCGTCTGAACAGATCCGTAATCAACTGACGGCGATGAGCAGCGTCCTGGCCAAAGCCCTGGAAGTGATTAAACCAGCACACATCCTGCAAGAAAAGGAAGAGCAGCACCAGCTGGCTGTTACCGCTTACCTGAAAAACTCCCGTAAGGAGCATCAGCGCATTCTGGCGCGTCGTCAAACCATCGAAGAGCGTAAGGAACGCCTGGAAAGTCTGAACATCCAACGTGAAAAAGAAGAGCTGGAACAACGTGAGGCTGAACTGCAAAAAGTCCGTAAA(SEQ ID NO.39)。
eIF3e:
GCTGAATACGACTTAACGACTCGCATTGCTCACTTCCTGGACCGTCACCTGGTGTTCCCGCTGCTGGAATTCCTGAGCGTGAAAGAGATCTACAACGAAAAAGAACTGCTGCAGGGCAAGCTTGATCTGTTGTCTGATACCAATATGGTTGACTTTGCCATGGATGTTTATAAAAACCTGTATTCTGACGATATCCCGCATGCACTGCGTGAAAAGCGTACTACCGTTGTTGCTCAGCTGAAACAGCTTCAGGCTGAGACCGAACCGATTGTTAAAATGTTCGAAGACCCAGAAACTACTCGTCAGATGCAATCTACCCGCGATGGTCGTATGCTCTTCGACTATTTGGCTGACAAACACGGTTTCCGTCAGGAGTACCTGGATACGCTGTACCGTTACGCAAAATTCCAGTACGAATGCGGTAACTACAGCGGTGCAGCGGAATATCTCTACTTCTTTCGCGTTCTGGTTCCGGCAACCGATCGCAACGCGCTGTCTTCGCTGTGGGGCAAACTGGCAAGCGAAATTCTGATGCAGAACTGGGATGCAGCAATGGAAGATCTGACTCGCCTGAAAGAAACCATCGACAACAACAGCGTCAGCAGTCCTTTGCAGTCTCTGCAACAGCGTACCTGGCTGATCCACTGGAGCCTGTTCGTATTTTTCAACCACCCGAAAGGCCGTGATAACATTATTGACCTGTTCCTCTACCAGCCGCAGTATCTGAATGCGATTCAGACCATGTGTCCGCACATCCTGCGTTATCTGACCACTGCTGTTATCACCAACAAAGACGTTCGTAAACGTCGCCAGGTGCTGAAGGACCTGGTAAAAGTGATCCAGCAGGAAAGCTACACCTACAAAGATCCGATCACTGAATTTGTTGAATGCCTGTACGTTAACTTCGATTTTGACGGTGCGCAGAAAAAACTGCGCGAATGTGAATCCGTACTGGTAAACGATTTCTTCCTGGTCGCCTGCCTTGAGGACTTCATCGAAAACGCACGTCTGTTTATTTTTGAAACCTTCTGCCGTATCCATCAGTGTATCTCCATCAACATGCTGGCTGATAAACTGAACATGACTCCGGAAGAAGCCGAGCGCTGGATCGTTAATCTGATTCGTAACGCTCGTCTGGATGCGAAAATCGATTCCAAGCTGGGTCACGTGGTGATGGGCAACAATGCCGTGTCGCCGTATCAGCAGGTTATTGAAAAAACCAAATCTCTCTCCTTCCGCTCACAAATGCTGGCGATGAACATCGAGAAGAAACTGAACCAGAATTCCCGTTCTGAAGCGCCGAACTGGGCGACCCAGGACTCCGGCTTCTAC(SEQ ID NO.40)。
eIF3m:
TCTGTTCCGGCGTTTATCGACATCTCTGAAGAGGACCAGGCGGCAGAACTGCGTGCTTACCTGAAATCCAAAGGCGCTGAAATCTCCGAAGAAAACTCCGAGGGCGGTCTGCACGTTGATCTGGCTCAGATCATCGAAGCTTGCGACGTTTGCCTGAAAGAGGATGACAAAGATGTGGAATCCGTGATGAACAGCGTGGTATCCCTGTTGTTGATTCTGGAGCCGGACAAGCAGGAAGCGCTGATTGAAAGCCTGTGTGAAAAACTGGTAAAGTTCCGTGAAGGCGAACGTCCTTCACTGCGTCTGCAACTGCTGTCTAACCTGTTCCACGGTATGGATAAAAACACCCCAGTACGTTACACCGTTTACTGCTCGCTGATCAAAGTGGCTGCTTCCTGCGGTGCGATTCAGTACATCCCGACCGAGCTGGATCAGGTTCGTAAATGGATTTCTGACTGGAACCTGACTACTGAAAAGAAACACACCCTCCTGCGCCTGCTGTACGAAGCACTGGTTGACTGCAAAAAATCTGACGCTGCCAGTAAGGTAATGGTGGAGTTGCTGGGTTCTTATACCGAAGATAACGCCAGCCAGGCACGCGTGGATGCTCACCGTTGCATCGTTCGCGCTCTGAAAGATCCGAACGCATTCCTGTTTGACCACCTGCTGACGCTGAAGCCGGTAAAATTCCTGGAAGGTGAACTGATCCACGACCTGCTGACCATCTTCGTTTCCGCGAAGCTGGCAAGCTATGTGAAATTCTACCAGAACAACAAAGACTTCATCGACAGCCTGGGCCTGCTGCATGAACAAAACATGGCGAAAATGCGTCTGCTGACCTTCATGGGCATGGCAGTTGAAAATAAAGAAATTTCGTTTGATACCATGCAGCAAGAACTGCAGATTGGCGCGGATGATGTAGAAGCCTTTGTTATCGATGCGGTTCGTACCAAAATGGTTTATTGTAAAATTGATCAGACTCAGCGCAAAGTCGTTGTTTCTCACAGCACGCATCGTACTTTCGGTAAACAGCAGTGGCAGCAGCTGTATGACACCCTGAATGCATGGAAACAAAATCTGAACAAAGTTAAAAATAGTCTGCTTTCTCTGAGCGACACT(SEQ IDNO.41)。
eIF3d:
GCTAAGTTCATGACCCCGGTAATTCAGGATAACCCGTCTGGCTGGGGCCCGTGCGCAGTTCCGGAACAGTTCCGCGATATGCCGTATCAGCCGTTTAGCAAAGGCGACCGTCTGGGTAAAGTTGCTGACTGGACGGGAGCAACTTACCAGGACAAGCGTTACACCAACAAATATTCCTCGCAGTTCGGTGGTGGCTCCCAGTACGCTTACTTCCATGAAGAAGATGAGTCTTCCTTCCAGCTGGTTGACACCGCACGCACG(SEQ ID NO.42)。
接着用限制性内切酶SapI将pRAP-Kan和pRAP-Amp载体线性化，在1％琼脂糖凝胶上电泳并从凝胶中分离纯化目的片段，用SLIC(不依赖基因序列和连接反应的高效分子克隆方法)将线性化载体分别与eIF3c、eIF3h、eIF3f、eIF3a、eIF3e、eIF3m和eIF3d基因片段按照摩尔比1:2混合重组，室温反应3min后置于冰上，然后采取“热激法”将重组子转化到大肠杆菌感受态中，最后通过DNA测序确定目的基因的正确插入(图7)。
(2)pRAP-Kan-eIF3c+h+f+a和pRAP-Amp-eIF3e+m+d共表达载体的构建
从两个pRAP质粒中产生一个共表达质粒，以pRAP-Kan-eIF3c+h为例：首先用稀有限制性内切酶SwaI将pRAP-Kan-eIF3c载体线性化，同时，从pRAP-Kan-eIF3h载体中经稀有限制性内切酶PmeI酶切，或者用正向引物(5‘-AAACACCCACCACAATTTCC-3’,SEQ ID NO.43)和反向引物(5’-AAACCTACCTACACATTTAAATTG-3’,SEQ ID NO.44)PCR扩增获得eIF3h基因片段，再通过SLIC将eIF3h基因连接到pRAP-Kan-eIF3c线性化的载体中，形成含有eIF3c-eIF3h基因的共表达载体pRAP-Kan-eIF3c+h，最后通过DNA测序确定目的基因的正确插入，其他共表达载体都用同样的方法按照顺序依次组装，或者两两组装(图7)。
(3)翻译起始因子eIF3在HI-control(DE3)表达细胞株中的表达情况
将pRAP-Kan-eIF3c、pRAP-Kan-eIF3h、pRAP-Kan-eIF3f、pRAP-Kan-eIF3a、pRAP-Amp-eIF3e、pRAP-Amp-eIF3m和pRAP-Amp-eIF3d分别单独转化到HI-control(DE3)表达细胞株中，用一种抗生素筛选；将pRAP-Kan-eIF3c+h+f+a和pRAP-Amp-eIF3e+m+d两个质粒共转化到HI-control(DE3)表达细胞株中，HI-control(DE3)表达细胞携带有庆大霉素抗性，用卡那霉素、氨苄西林和庆大霉素三种抗生素共同筛选。挑取5个左右的克隆至分别标记好的5mL含有抗生素的LB培养基中，于37℃-220rpm恒温振荡培养12hr。再按照1:100的比例接种到50mL含有抗生素的LB培养基中，于37℃-220rpm恒温振荡培养大约3hr，直到OD600达到0.6～0.8，用0.2mM IPTG在18℃-220rpm条件下诱导蛋白表达14hr。
在这期间，从未诱导的菌液中取出1OD，从诱导表达后的菌液中取出10OD，室温离心12000rpm-5min，全部弃掉上清。向未诱导的菌体中加入50μL细胞裂解液吹打混匀室温静置5min，再向里面加入50μL 2x SDS-PAGE上样缓冲液。向诱导表达后的菌体中加入1mL的His buffer A重悬，用超声破碎仪进行破碎，取出50μL破碎的菌液，4℃离心12000rpm-10min后,取出上清(S)，剩下的沉淀(P)也用50μL His buffer A重悬，最后全菌、上清和沉淀里各自加入50μL 2x SDS-PAGE上样缓冲液。95℃煮样10min，室温离心12000rpm-10min，最后通过SDS-PAGE蛋白电泳鉴定目的蛋白的表达情况(图8)。
如图8所示，eIF3复合物的各个亚基单独表达基本都在破碎菌液的沉淀中，只有将七个亚基共同表达的情况下，才能从破碎菌液的上清中，看到目标蛋白的可溶表达。
(4)翻译起始因子eIF3chfaemd的共表达纯化
将pRAP-Kan-eIF3c+h+f+a和pRAP-Amp-eIF3e+m+d两个质粒共转化到HI-control(DE3)表达细胞株中，用氨苄西林、卡那霉素和庆大霉素共同筛选。挑取5个左右的克隆至标记好含有两种抗生素的100mL LB培养基中，于37℃-220rpm恒温振荡培养12hr。再按照1:100的比例接种到6瓶含有两种抗生素的1L LB培养基中，于37℃-220rpm恒温振荡培养大约3h，直到OD600达到0.6～0.8，用0.2mM IPTG在18℃-220rpm条件下诱导蛋白表达14hr。然后用1L离心杯在6000rpm条件下离心15min，弃掉上清，收集菌体置于-80℃保存。
向菌体中加入大约5倍体积His buffer A重悬菌体，经高压细胞破碎仪(永联生物，UH-06)破碎后，置于高速离心机离心18000rpm-50min。取出上清样品上样至GEHealthcare 5mL HisTrap HP预装柱中，并由AKTA purifier通过不断提高咪唑浓度洗脱蛋白样品，将洗脱的样品用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定(图9A、图9B)。
根据蛋白的总分子量大小为330.2kDa，选择GE Healthcare HiLoad 26/60Superdex 200预装柱进行凝胶层析精细纯化目的蛋白。选取HisTrap纯化的2A2～2C2收集管，用50kDa Amicon超滤管(Merck)浓缩至上样体积10mL，然后上样至预先用GF buffer(20mM Hepes-KOH pH 7.5,100mM KCl,5mMβ-Me,5％Glycerol)平衡的凝胶层析柱中。经AKTA purifier洗脱，有三个尖峰，收集第一个和第二个峰中的1A2～1C3收集管，用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定(图10A、图10B)。最后将目的蛋白用50kDa Amicon超滤管浓缩至浓度为5mg/mL左右，置于-80℃保存。
如图10A、图10B所示，eIF3七元复合物利用pRAP共表达载体，只需要经过镍柱亲和层析和分子筛凝胶层析两个步骤，就可以得到均一可溶的多蛋白复合物。并且，从凝胶层析洗脱图谱来看，出峰体积约为148.5mL，该复合物应该是单体。
实施例3：多基因共表达的mRNA在体内和体外转录水平上检测
3.1 翻译延伸因子eEF1B共表达质粒在体外mRNA转录水平上的检测
以pRAP-Amp-eEF1Bα、pRAP-Amp-eEF1Bα+γ、pRAP-Amp-eEF1Bγ+α和pRAP-Amp-eEF1Bα+γ+δ为模板，引物分别为正向引物(5’-CACCACAATTCAGCAAATTG-3’，SEQ ID NO.45)和反向引物(5‘-GCGAGACCCCCG-3’,SEQ ID NO.46)，通过PCR制备体外转录体系需要的模板，PCR反应体系如表5所示。
表5 PCR反应体系
Figure BDA0003137689720000311
Figure BDA0003137689720000321
PCR反应条件如表6所示。
表6 PCR反应条件
Figure BDA0003137689720000322
并将扩增产物回收纯化。然后，利用T7 RNA聚合酶体外转录体系获得转录产物，用1.2％琼脂糖-甲醛变性凝胶检测(图11)。
3.2 翻译延伸因子eEF1B共表达质粒在体内mRNA转录水平上的检测
将pRAP-Amp-eEF1Bα、pRAP-Amp-eEF1Bα+γ、pRAP-Amp-eEF1Bγ+α和pRAP-Amp-eEF1Bα+γ+δ分别单独转化到HI-control(DE3)表达细胞株中，挑取5个左右的克隆至分别标记好的含有氨苄西林和庆大霉素抗生素的5mL LB培养基中，于37℃-220rpm恒温振荡培养12hr。再按照1:100的比例接种到含有抗生素的5mL LB培养基中，于37℃-220rpm恒温振荡培养2hr后，用0.2mM IPTG在37℃-220rpm条件下诱导蛋白表达1hr。最后，室温离心12000rpm-10min，全部弃掉上清，留下菌体置于-80℃保存。
用超快速RNA柱式提取试剂盒(Vazyme，RC112)将菌体里的全部RNA提取出来，1.2％琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳跑胶后，利用Northern印迹技术检测，需要经过虹吸转膜、紫外交联、烘干、DNA-biotin探针杂交、HRP-Streptavidin二抗杂交和化学显影过程(图12)。
3.3 翻译起始因子eIF3共表达质粒在体外mRNA转录水平上的检测
以pRAP-Amp-eIF3e、pRAP-Amp-eIF3e+m、pRAP-Amp-eIF3e+m+k和pRAP-Amp-eIF3e+m+k+l为模板，引物分别为正向引物(5’-CACCACAATTCAGCAAATTG-3’，SEQ ID NO.)和反向引物(5‘-GCGAGACCCCCG-3’,SEQ ID NO.)，通过PCR制备体外转录体系需要的模板，PCR反应体系如表7所示，
表7 PCR反应体系
Figure BDA0003137689720000323
Figure BDA0003137689720000331
PCR反应条件如表8所示，
表8 PCR反应条件
Figure BDA0003137689720000332
并将扩增产物回收纯化。然后，利用T7 RNA聚合酶体外转录体系获得转录产物，用1.2％琼脂糖-甲醛变性凝胶检测(图13)。
3.4 翻译起始因子eIF3共表达质粒在体内mRNA转录水平上的检测
将pRAP-Amp-eIF3e、pRAP-Amp-eIF3e+m、pRAP-Amp-eIF3e+m+k和pRAP-Amp-eIF3e+m+k+l分别单独转化到HI-control(DE3)表达细胞株中，挑取5个左右的克隆至分别标记好的含有氨苄西林和庆大霉素抗生素的5mL LB培养基中，于37℃-220rpm恒温振荡培养12hr。再按照1:100的比例接种到含有抗生素的5mL LB培养基中，于37℃-220rpm恒温振荡培养2hr后，用0.2mM IPTG在37℃-220rpm条件下诱导蛋白表达1hr。最后，室温离心12000rpm-10min，全部弃掉上清，留下菌体置于-80℃保存。
用超快速RNA柱式提取试剂盒(Vazyme，RC112)将菌体里的全部RNA提取出来，1.2％琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳跑胶后，利用Northern印迹技术检测，需要经过虹吸转膜、紫外交联、烘干、DNA-biotin探针杂交、HRP-Streptavidin二抗杂交和化学显影过程(图14)。如图11、图12、图13和图14所示，从共表达质粒在体外和体内mRNA转录的情况来看，Twister能够相对有效的切割转录出的含有多个阅读框的长链mRNA，Stem loop也发挥了保护mRNA 3’端不被降解的作用，实现mRNA各个目标基因转录出的RNA量基本一致。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 一种核酶介导的多顺反子载体及其构建方法
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgcagccg agggcggtta caagcccgca aaaatagcag agta 44
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagtctgatg agagcgaaag ctcgaaactg gaaagccagt c 41
<210> 3
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacatgctt cggcatggcg 60
aatgggac 68
<210> 5
<211> 66
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cuuagcaagg cccagucccg ugcaagccgg gaccgcacau gaggaucacc caugugcgcg 60
gcgcuc 66
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agacaaccag gagtctataa aataatcact gaagagactg gacgaaacca ataggtc 57
<210> 6
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aatcgttctt actgatatca gtgacaaaca tgtggggctt atatctaatc ttcggattag 60
tattagtgca gacgttaaaa ccatgt 86
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
actcgactaa gcgagtataa acattacata ggcttagagc gtccgttcgc gggg 54
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccgacgctt cggcgtcggg 20
<210> 9
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgggtttcg gagacctgaa aagccctgcc ggcctccagg tgctcaacga ttacctggcg 60
gacaagagct acatcgaggg gtatgtgcca tcacaagcag atgtggcagt atttgaagcc 120
gtgtccagcc caccgcctgc cgacttgtgt catgccctac gttggtataa tcacatcaag 180
tcttacgaaa aggaaaaggc cagcctgcca ggagtgaaga aagctttggg caaatatggt 240
cctgccgatg tggaagacac tacaggaagt ggagctacag atagtaaaga tgatgatgac 300
attgacctct ttggatctga tgatgaggag gaaagtgaag aagcaaagag gctaagggaa 360
gaacgtcttg cacaatatga atcaaagaaa gccaaaaaac ctgcacttgt tgccaagtct 420
tccatcttac tagatgtgaa accttgggat gatgagacag atatggcgaa attagaggag 480
tgcgtcagaa gcattcaagc agacggctta gtctggggct catctaaact agttccagtg 540
ggatacggaa ttaagaaact tcaaatacag tgtgtagttg aagatgataa agttggaaca 600
gatatgctgg aggagcagat cactgctttt gaggactatg tgcagtcgat ggatgtggct 660
gctttcaaca agatccatca tcaccatcac caccaccact aa 702
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagttctgtt ccaggggccg ggtttcggag acctgaaaag 40
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgtggtggg tgtttcatta gatcttgttg aaagcagcc 39
<210> 12
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggcggctg ggaccctgta cacgtatcct gaaaactgga gggccttcaa ggctctcatc 60
gctgctcagt acagcggggc tcaggtccgc gtgctctccg caccacccca cttccatttt 120
ggccaaacca accgcacccc tgaatttctc cgcaaatttc ctgccggcaa ggtcccagca 180
tttgagggtg atgatggatt ctgtgtgttt gagagcaacg ccattgccta ctatgtgagc 240
aatgaggagc tgcggggaag tactccagag gcagcagccc aggtggtgca gtgggtgagc 300
tttgctgatt ccgatatagt gcccccagcc agtacctggg tgttccccac cttgggcatc 360
atgcaccaca acaaacaggc cactgagaat gcaaaggagg aagtgaggcg aattctgggg 420
ctgctggatg cttacttgaa gacgaggact tttctggtgg gcgaacgagt gacattggct 480
gacatcacag ttgtctgcac cctgttgtgg ctctataagc aggttctaga gccttctttc 540
cgccaggcct ttcccaatac caaccgctgg ttcctcacct gcattaacca gccccagttc 600
cgggctgtct tgggggaagt gaaactgtgt gagaagatgg cccagtttga tgctaaaaag 660
tttgcagaga cccaacctaa aaaggacaca ccacggaaag agaagggttc acgggaagag 720
aagcagaagc cccaggctga gcggaaggag gagaaaaagg cggctgcccc tgctcctgag 780
gaggagatgg atgaatgtga gcaggcgctg gctgctgagc ccaaggccaa ggaccccttc 840
gctcacctgc ccaagagtac ctttgtgttg gatgaattta agcgcaagta ctccaatgag 900
gacacactct ctgtggcact gccatatttc tgggagcact ttgataagga cggctggtcc 960
ctgtggtact cagagtatcg cttccctgaa gaactcactc agaccttcat gagctgcaat 1020
ctcatcactg gaatgttcca gcgactggac aagctgagga agaatgcctt cgccagtgtc 1080
atcctttttg gaaccaacaa tagcagctcc atttctggag tctgggtctt ccgaggccag 1140
gagcttgcct ttccgctgag tccagattgg caggtggact acgagtcata cacatggcgg 1200
aaactggatc ctggcagcga ggagacccag acgctggttc gagagtactt ttcctgggag 1260
ggggccttcc agcatgtggg caaagccttc aatcagggca agatcttcaa gcatcatcac 1320
catcaccacc accactaa 1338
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagttctgtt ccaggggccg gcggctggga ccct 34
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttgtggtggg tgtttcatta cttgaagatc ttgccctga 39
<210> 15
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atggctacaa acttcctagc acatgagaag atctggttcg acaagttcaa atatgacgac 60
gcagaaagga gattctacga gcagatgaac gggcctgtgg caggtgcctc ccgccaggag 120
aacggcgcca gcgtgatcct ccgtgacatt gcgagagcca gagagaacat ccagaaatcc 180
ctggctggaa gctcaggccc cggggcctcc agcggcacca gcggagacca cggtgagctc 240
gtcgtccgga ttgccagtct ggaagtggag aaccagagtc tgcgtggcgt ggtacaggag 300
ctgcagcagg ccatctccaa gctggaggcc cggctgaacg tgctggagaa gagctcgcct 360
ggccaccggg ccacggcccc acagacccag cacgtatctc ccatgcgcca agtggagccc 420
ccagccaaga agccagccac accagcagag gatgacgagg atgatgacat tgacctgttt 480
ggcagtgaca atgaggagga ggacaaggag gcggcacagc tgcgggagga gcggctacgg 540
cagtacgcgg agaagaaggc caagaagcct gcactggtgg ccaagtcctc catcctgctg 600
gatgtcaagc cttgggatga tgagacggac atggctcagc tggaggcctg tgtgcgctct 660
atccagctgg acgggctggt ctggggggct tccaagctgg tgcccgtggg ctacggtatc 720
cggaagctac agattcagtg tgtggtggag gacgacaagg tggggacaga cttgctggag 780
gaggagatca ccaagtttga ggagcacgtg cagagtgtcg atatcgcagc tttcaacaag 840
atccatcatc accatcacca ccaccactaa 870
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagttctgtt ccaggggccg gctacaaact tcctagcaca 40
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttgtggtggg tgtttcatta gatcttgttg aaagctgcg 39
<210> 18
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggtttcggag acctgaaaag ccctgccggc ctccaggtgc tcaacgatta cctggcggac 60
aagagctaca tcgaggggta tgtgccatca caagcagatg tggcagtatt tgaagccgtg 120
tccagcccac cgcctgccga cttgtgtcat gccctacgtt ggtataatca catcaagtct 180
tacgaaaagg aaaaggccag cctgccagga gtgaagaaag ctttgggcaa atatggtcct 240
gccgatgtgg aagacactac aggaagtgga gctacagata gtaaagatga tgatgacatt 300
gacctctttg gatctgatga tgaggaggaa agtgaagaag caaagaggct aagggaagaa 360
cgtcttgcac aatatgaatc aaagaaagcc aaaaaacctg cacttgttgc caagtcttcc 420
atcttactag atgtgaaacc ttgggatgat gagacagata tggcgaaatt agaggagtgc 480
gtcagaagca ttcaagcaga cggcttagtc tggggctcat ctaaactagt tccagtggga 540
tacggaatta agaaacttca aatacagtgt gtagttgaag atgataaagt tggaacagat 600
atgctggagg agcagatcac tgcttttgag gactatgtgc agtcgatgga tgtggctgct 660
ttcaacaaga tc 672
<210> 19
<211> 1308
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcggctggga ccctgtacac gtatcctgaa aactggaggg ccttcaaggc tctcatcgct 60
gctcagtaca gcggggctca ggtccgcgtg ctctccgcac caccccactt ccattttggc 120
caaaccaacc gcacccctga atttctccgc aaatttcctg ccggcaaggt cccagcattt 180
gagggtgatg atggattctg tgtgtttgag agcaacgcca ttgcctacta tgtgagcaat 240
gaggagctgc ggggaagtac tccagaggca gcagcccagg tggtgcagtg ggtgagcttt 300
gctgattccg atatagtgcc cccagccagt acctgggtgt tccccacctt gggcatcatg 360
caccacaaca aacaggccac tgagaatgca aaggaggaag tgaggcgaat tctggggctg 420
ctggatgctt acttgaagac gaggactttt ctggtgggcg aacgagtgac attggctgac 480
atcacagttg tctgcaccct gttgtggctc tataagcagg ttctagagcc ttctttccgc 540
caggcctttc ccaataccaa ccgctggttc ctcacctgca ttaaccagcc ccagttccgg 600
gctgtcttgg gggaagtgaa actgtgtgag aagatggccc agtttgatgc taaaaagttt 660
gcagagaccc aacctaaaaa ggacacacca cggaaagaga agggttcacg ggaagagaag 720
cagaagcccc aggctgagcg gaaggaggag aaaaaggcgg ctgcccctgc tcctgaggag 780
gagatggatg aatgtgagca ggcgctggct gctgagccca aggccaagga ccccttcgct 840
cacctgccca agagtacctt tgtgttggat gaatttaagc gcaagtactc caatgaggac 900
acactctctg tggcactgcc atatttctgg gagcactttg ataaggacgg ctggtccctg 960
tggtactcag agtatcgctt ccctgaagaa ctcactcaga ccttcatgag ctgcaatctc 1020
atcactggaa tgttccagcg actggacaag ctgaggaaga atgccttcgc cagtgtcatc 1080
ctttttggaa ccaacaatag cagctccatt tctggagtct gggtcttccg aggccaggag 1140
cttgcctttc cgctgagtcc agattggcag gtggactacg agtcatacac atggcggaaa 1200
ctggatcctg gcagcgagga gacccagacg ctggttcgag agtacttttc ctgggagggg 1260
gccttccagc atgtgggcaa agccttcaat cagggcaaga tcttcaag 1308
<210> 20
<211> 840
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gctacaaact tcctagcaca tgagaagatc tggttcgaca agttcaaata tgacgacgca 60
gaaaggagat tctacgagca gatgaacggg cctgtggcag gtgcctcccg ccaggagaac 120
ggcgccagcg tgatcctccg tgacattgcg agagccagag agaacatcca gaaatccctg 180
gctggaagct caggccccgg ggcctccagc ggcaccagcg gagaccacgg tgagctcgtc 240
gtccggattg ccagtctgga agtggagaac cagagtctgc gtggcgtggt acaggagctg 300
cagcaggcca tctccaagct ggaggcccgg ctgaacgtgc tggagaagag ctcgcctggc 360
caccgggcca cggccccaca gacccagcac gtatctccca tgcgccaagt ggagccccca 420
gccaagaagc cagccacacc agcagaggat gacgaggatg atgacattga cctgtttggc 480
agtgacaatg aggaggagga caaggaggcg gcacagctgc gggaggagcg gctacggcag 540
tacgcggaga agaaggccaa gaagcctgca ctggtggcca agtcctccat cctgctggat 600
gtcaagcctt gggatgatga gacggacatg gctcagctgg aggcctgtgt gcgctctatc 660
cagctggacg ggctggtctg gggggcttcc aagctggtgc ccgtgggcta cggtatccgg 720
aagctacaga ttcagtgtgt ggtggaggac gacaaggtgg ggacagactt gctggaggag 780
gagatcacca agtttgagga gcacgtgcag agtgtcgata tcgcagcttt caacaagatc 840
<210> 21
<211> 2739
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgagccgtt tcttcaccac cggctccgac agcgagtctg aatcctctct gtccggtgaa 60
gaactggtta ccaaaccagt tggcggcaac tacggtaaac aaccgctgct gctgtctgaa 120
gatgaagagg acaccaagcg cgtagtgcgt tctgcgaaag acaaacgttt tgaagagctg 180
accaacctga ttcgtaccat ccgtaacgca atgaaaatcc gcgatgtgac caaatgcctg 240
gaagaatttg aattgctggg caaagcctat ggtaaagcta aatccatcgt tgataaagaa 300
ggtgtaccgc gcttctacat ccgtattctg gcagacctgg aagattacct gaacgaactg 360
tgggaagaca aagagggcaa gaaaaaaatg aacaaaaaca acgccaaagc gctttcaacg 420
ctgcgtcaga aaattcgcaa atacaaccgt gacttcgaaa gccacatcac ttcttacaaa 480
cagaacccgg aacagtctgc tgacgaagac gcagagaaaa atgaagagga ttcagaaggc 540
agctctgacg aagatgaaga cgaagatggc gtttctgcag cgaccttcct gaaaaaaaaa 600
tctgaagccc cgtctggcga atctcgtaaa ttcctgaaaa aaatggatga cgaagatgag 660
gattccgaag actccgagga tgatgaggac tgggataccg gttctaccag cagcgactct 720
gatagcgaag aagaggaagg taagcagact gcgctggctt ctcgctttct gaagaaggcg 780
ccgaccactg acgaggacaa gaaagcagct gaaaagaaac gcgaagataa agcgaaaaag 840
aaacatgacc gtaagagcaa acgtctggat gaagaagaag aagataacga aggcggtgag 900
tgggaacgtg ttcgtggtgg tgttccgctg gtgaaagaaa aaccgaaaat gtttgccaaa 960
ggtactgaaa tcactcacgc ggttgttatt aaaaagctga acgaaatcct ccaggcacgc 1020
ggtaaaaaag gaaccgatcg tgcagctcag attgaattat tgcagctgct tgtgcagatc 1080
gctgctgaaa acaacctcgg cgaaggcgtg attgttaaaa tcaaattcaa catcattgct 1140
tcgctgtacg actacaaccc taacctggca acttatatga aacctgaaat gtggggcaaa 1200
tgcctggact gtatcaatga gctgatggac atcctgtttg ctaacccgaa catcttcgtt 1260
ggcgagaaca tcctggaaga aagcgaaaac ctgcataacg ctgatcagcc gctgcgtgtt 1320
cgcggctgca ttctgactct ggtcgaacgt atggatgaag aatttacaaa aattatgcag 1380
aacaccgacc cgcatagtca ggaatacgta gaacacctga aagatgaagc ccaggtttgc 1440
gcaatcatcg aacgtgtaca gcgttatctc gaagaaaaag gcaccaccga agaagtgtgc 1500
cgtatttatc tgctgcgtat cctgcacacc tactacaaat ttgactataa agcacaccag 1560
cgccagctta caccaccgga aggcagctcc aaatcagaac aggatcaagc cgaaaacgaa 1620
ggcgaagaca gtgccgttct gatggaacga ctctgcaaat atatctacgc aaaagaccgc 1680
acggatcgca ttcgcacctg cgccattctg tgccacatct atcaccacgc tctgcactct 1740
cgctggtacc aggctcgtga tctgatgttg atgtctcatc tgcaggacaa cattcagcac 1800
gccgatccgc cggtacaaat tctgtataac cgtacgatgg ttcagctggg tatctgtgcg 1860
ttccgccaag gtctgaccaa agacgcacat aatgccctgc tcgatatcca gtcgtcaggt 1920
cgtgctaaag agctccttgg tcagggtttg ctgttacgtt ccctgcagga gcgtaaccag 1980
gaacaagaga aagttgagcg ccgccgtcag gtaccgttcc acttgcatat caaccttgaa 2040
ctgctggaat gtgtttatct agtctccgct atgctgctgg agatcccgta catggcggcg 2100
catgaatcgg atgcgcgtcg tcgcatgatc agtaagcagt tccatcatca gttgagagtt 2160
ggtgagcgtc agccactgct gggtccgcca gaatctatgc gcgaacatgt ggtggcagcg 2220
agcaaagcga tgaaaatggg cgactggaaa acctgtcaca gctttattat caacgaaaaa 2280
atgaacggta aagtctggga tcttttcccg gaagctgaca aagtacgtac catgctggta 2340
cgcaaaatcc aagaagagtc cctgcgtact tacctgttca cctacagcag tgtctatgac 2400
agcatcagca tggaaaccct gagcgatatg ttcgaactgg atctgccgac tgttcactct 2460
atcatctcca agatgattat taacgaagag ttaatggctt ctctggatca gcctacgcaa 2520
accgttgtga tgcaccgtac tgagccgacc gcgcagcaga atctggcact gcaactggct 2580
gaaaaactgg gctcactggt tgaaaataac gaacgggtgt tcgaccacaa acagggcaca 2640
tatggcggtt acttccgtga ccagaaggac ggttatcgta aaaatgaagg ttacatgcgt 2700
cgtggcggct accgtcaaca gcaatctcag accgcttac 2739
<210> 22
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aagttctgtt ccaggggccg ggtactgaaa tcactcacg 39
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ttgtggtggg tgtttcatta gtaagcggtc tgagattg 38
<210> 24
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atggcgagcc gtaaagaagg tactggttcc accgccactt cctcttccag tacggcgggc 60
gcagcaggca agggtaaagg taaaggcggc agcggcgact ccgcggtgaa acaagtacag 120
atcgatggtc tggttgttct taaaatcatc aagcactacc aggaagaggg tcagggcacc 180
gaggtggtgc agggcgttct gctgggcctg gtggttgaag accgcctgga aatcaccaac 240
tgcttcccgt tcccgcagca taccgaagat gacgccgact tcgacgaagt tcagtaccag 300
atggagatga tgcgcagcct gcgtcacgtt aacatcgacc acctgcacgt aggctggtac 360
cagagcacct actacggttc ttttgttacc cgtgctctgc tggattctca gttctcttat 420
cagcacgcta tcgaagagtc tgtagtattg atttatgatc cgattaaaac cgcgcagggt 480
agtctctcgc tgaaagctta ccgtctgact ccgaaactga tggaagtctg taaagagaaa 540
gatttttcgc ctgaagcgct gaaaaaagcg aacattacct tcgagtacat gttcgaagaa 600
gtgccgatcg ttatcaaaaa cagccatctg atcaacgtgc tgatgtggga acttgagaag 660
aaatccgcag ttgctgacaa acatgaactg ctgtctctgg cttccagcaa ccacctcggc 720
aaaaatctgc aactgttaat ggatcgcgtt gatgaaatga gccaggacat tgttaaatac 780
aatacctata tgcgtaacac cagcaaacag cagcagcaga aacaccagta tcaacaacgt 840
cgccagcaag aaaacatgca gcgtcagtct cgtggtgaac cgccgctgcc ggaagaagat 900
ctgagcaagc tgtttaaacc accgcaaccg ccagcgcgta tggacagctt gctgattgct 960
ggccagatta acacttactg ccagaacatc aaagaattta ctgcgcaaaa cctgggtaaa 1020
ctgttcatgg cacaggcact gcaggaatac aacaac 1056
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aagttctgtt ccaggggccg tccgcggtga aacaag 36
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttgtggtggg tgtttcatta gttgttgtat tcctgcag 38
<210> 27
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atggcgacac ctgcggtgcc ggtgagtgcg ccgccggcta ctccgacccc tgttcctgca 60
gctgcacctg ccagcgtgcc agcgccgact ccggcaccgg cagcggcacc ggttccggca 120
gccgctccgg cgtcatcatc tgatccggcg gctgctgccg cagcaaccgc cgccccgggt 180
cagactccag cctccgcgca ggcgcccgct cagaccccag caccagccct gcctgggcca 240
gctctgccgg gtccgttccc gggcggccgt gttgttcgtc tgcacccggt aatcctggcg 300
tccattgttg actcctatga acgtcgtaac gaaggcgcgg cacgcgttat cggtactctg 360
ctgggtacgg tagacaaaca ctctgttgaa gttaccaact gtttctccgt accgcacaac 420
gagtctgaag atgaagtggc ggtagatatg gaatttgcta aaaacatgta cgaactgcat 480
aaaaaagtga gcccgaatga gctgattctg ggctggtacg caactggcca tgacatcacc 540
gaacacagcg tcttgattca tgaatactac agccgtgaag cgccaaaccc gatccacctg 600
actgttgata ccagcttgca gaacggccgc atgagcatca aagcttacgt ttctacgctg 660
atgggcgtac caggtcgtac tatgggtgtg atgttcaccc cgctgaccgt gaaatatgcc 720
tattacgaca ccgagcgcat tggcgttgac ctgatcatga aaacctgctt ctctccgaac 780
cgcgtgattg gtctgtccag cgatctgcag caggttggcg gtgcttctgc acgtattcag 840
gatgcgctgt cgacagtgct gcaatacgct gaagacgttc tgtctggtaa agtttccgct 900
gataacaccg ttggtcgttt cctgatgtct ctggttaacc aggtaccgaa aatcgttccg 960
gatgactttg aaaccatgct gaacagcaac atcaacgacc tcttgatggt gacctatctg 1020
gctaacctga cgcaatcgca gatcgcactg aatgaaaaac tggtaaatct g 1071
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aagttctgtt ccaggggccg ggtccgttcc cgg 33
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ttgtggtggg tgtttcatta cagatttacc agtttttcat tcag 44
<210> 30
<211> 4146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgccagcct acttccagcg tcctgaaaac gctctgaaac gtgcgaacga atttctggaa 60
gtcggtaaaa aacagccggc gctggatgtg ctgtacgatg ttatgaaatc caaaaaacac 120
cgtacctggc agaaaatcca tgaaccaatc atgctgaaat atctggagct gtgtgtggac 180
ctgcgtaagt ctcatctggc taaagaaggc ctgtatcagt acaaaaatat ttgccagcaa 240
gttaacatca aatcgctgga agacgtagta cgtgcttatc ttaaaatggc agaggagaaa 300
accgaagcag caaaagaaga gtctcagcag atggtgcttg acattgagga cctggacaat 360
atccagaccc cagaatcggt actgctgtct gcggtttccg gcgaagacac ccaggaccgc 420
accgatcgcc ttctgctgac tccgtgggtg aaattcctgt gggaaagcta ccgtcagtgc 480
ctggatctgc tgcgcaacaa cagccgcgtg gaacgcctct atcacgacat cgcgcagcag 540
gcgtttaaat tttgcctgca gtatacccgt aaagctgagt tccgcaaact gtgcgacaac 600
ctgcgtatgc acctgagcca gattcagcgc catcataatc agtctacagc catcaatctg 660
aacaatccgg aatctcaatc tatgcatctg gaaacccgtc tggttcagct tgattctgca 720
atcagcatgg aactatggca ggaagccttc aaagcggtag aagacatcca cggcttgttc 780
agcctctcca agaagccgcc gaaaccgcag ctgatggcta actattacaa caaagtttct 840
accgtgttct ggaaatctgg taatgcgctg ttccacgctt ctactctgca ccgcctgtac 900
catctttctc gtgagatgcg taaaaacctg actcaggatg aaatgcaacg catgtctacg 960
cgtgtattgc tggcaaccct gtccattccg atcaccccgg aacgtactga tattgcacgt 1020
ctgctcgaca tggacggtat catcgttgaa aaacaacgcc gtctggcaac gctgctgggc 1080
ctgcaggcac cgccaactcg tatcggtctg atcaacgata tggttcgttt taacgttctg 1140
caatacgttg ttccggaagt taaagacctt tataactggc tggaagtaga attcaacccg 1200
ctgaaattgt gtgaacgtgt gactaaagtg ctcaactggg ttcgcgagca accggagaaa 1260
gaaccggaac tgcaacagta cgtaccgcaa ctgcagaaca acactatcct gcgtctgttg 1320
caacaggttt cgcagattta tcagtcgatt gaattttctc gcctgacctc tctggtgccg 1380
ttcgttgatg cctttcagct ggaacgtgct atcgtcgacg cagcgcgtca ctgtgatctg 1440
caggtgcgta tcgaccacac cagccgtacg ttatccttcg gttctgactt aaactacgcg 1500
acccgcgaag atgctccgat tggcccgcac ttgcagtcca tgccgtctga acagatccgt 1560
aatcaactga cggcgatgag cagcgtcctg gccaaagccc tggaagtgat taaaccagca 1620
cacatcctgc aagaaaagga agagcagcac cagctggctg ttaccgctta cctgaaaaac 1680
tcccgtaagg agcatcagcg cattctggcg cgtcgtcaaa ccatcgaaga gcgtaaggaa 1740
cgcctggaaa gtctgaacat ccaacgtgaa aaagaagagc tggaacaacg tgaggctgaa 1800
ctgcaaaaag tccgtaaagc tgaagaagag cgtcttcgtc aggaagcgaa ggagcgcgaa 1860
aaagaacgca ttctccagga acacgaacag atcaaaaaga aaaccgttcg tgaacgtctg 1920
gagcaaatta agaaaactga actcggcgct aaagcgttca aggatatcga tatcgaagac 1980
ttggaagaac tggacccgga cttcattatg gcgaaacagg ttgaacaact tgagaaagag 2040
aaaaaagaac ttcaggagcg tctcaagaac caggagaaga aaattgatta ctttgaacgt 2100
gcgaaacgcc tggaagaaat tcccttgatc aagagcgcct atgaagagca gcgtattaaa 2160
gatatggatc tgtgggaaca gcaggaagaa gagcgtatta ctaccatgca gctcgagcgt 2220
gaaaaagcac ttgaacataa aaaccgtatg tcccgcatgc tcgaagatcg agacctgttt 2280
gtgatgcgct tgaaagcggc acgccagagc gtttacgaag aaaagctgaa gcagttcgaa 2340
gaacgtctgg cggaagagcg tcacaaccgc ttagaagaac gaaagcgcca gcgtaaagaa 2400
gagcgtcgca tcacttacta ccgcgaaaaa gaagaagaag agcagcgtcg cgctgaagag 2460
cagatgctga aagaacgtga agagcgtgag cgcgcagaac gtgccaaacg tgaagaagaa 2520
ttacgtgaat accaggaacg ggtcaaaaaa ctggaagaag ttgagcgcaa gaagcgtcag 2580
cgtgaactgg aaatcgagga acgtgaacgt cgccgcgaag aagaacgtcg tctgggtgac 2640
agtagcctgt cgcgtaaaga tagccgctgg ggcgaccgcg attcagaagg cacctggcgc 2700
aaaggccctg aagctgactc cgaatggcgt cgtggacctc cggaaaaaga gtggcgtcgc 2760
ggtgaaggtc gtgacgaaga ccgttctcac cgtcgcgacg aggagcgccc tcgccgctta 2820
ggcgatgacg aagaccgcga gccgtccctg cgcccggatg acgaccgtgt tcctcgccgt 2880
ggcatggatg atgaccgcgg tccgcgtcgt ggtccagaag aagatcgctt ctctcggcgt 2940
ggtgctgatg atgatcgtcc aagctggcgt aacaccgacg acgatcgccc accgcgtcgt 3000
atcgctgatg aagatcgtgg taactggcgc cacgcggatg acgatcgccc gccacgtcgt 3060
ggcctcgatg aagaccgtgg cagctggcgt actgccgacg aagatcgtgg gccacgccgt 3120
ggcatggacg atgaccgtgg tccgcgccgg ggtggcgcag atgatgagcg ttcatcatgg 3180
cgcaatgctg acgacgatcg tggcccgcgc cgtggtctgg atgatgatcg cggcccgcgc 3240
cgtgggatgg atgatgatcg cggtccgcgt cgtggtatgg atgatgaccg tggcccgcgc 3300
cgtggtatgg atgacgaccg aggtcctcgt cgtggtctgg acgatgaccg cggaccgtgg 3360
cgcaacgccg atgacgaccg tatcccgcgt cgcggtgcgg aagatgaccg tggtccgtgg 3420
cgtaacatgg acgatgaccg tctgtcacgc cgcgcggacg acgatcgttt cccgcgtcgc 3480
ggcgacgaca gccgtccggg tccctggcgt ccgctggtaa agccaggcgg ctggagagaa 3540
aaagagaagg ctcgtgaaga atcctggggc ccccctcgtg agtcccgtcc gagcgaagaa 3600
cgtgagtggg atcgcgaaaa agagcgcgat cgcgataacc aggaccgtga agagaacgac 3660
aaagatcctg agcgtgaacg tgaccgggaa cgcgacgttg accgcgaaga tcgtttccgt 3720
cgtccgcgtg atgagggtgg ttggcgtcgc ggccctgccg aagaaagcag ttcctggcgc 3780
gattccagcc gtcgtgacga tcgtgatcgg gatgatcgtc gtcgggaacg tgacgaccgt 3840
cgtgatctgc gcgaacgccg cgacctgcgt gatgatcgtg accgccgcgg gccgccgctg 3900
cgttccgagc gcgaagaagt gtcttcctgg cgtcgtgcag acgaccgtaa agacgatcgc 3960
gttgaagaac gcgatccgcc gcgtcgcgta ccaccgccgg cactgagtcg tgatcgcgag 4020
cgtgaccgcg accgtgaacg tgaaggtgag aaagagaaag catcctggcg tgcagaaaaa 4080
gaccgtgaat cactgcgtcg taccaaaaat gaaactgacg aagatggctg gaccaccgta 4140
cgccgg 4146
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aagttctgtt ccaggggccg ccagcctact tccagcgtc 39
<210> 32
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttgtggtggg tgtttcatta tttacggact ttttgcagtt cag 43
<210> 33
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atggctgaat acgacttaac gactcgcatt gctcacttcc tggaccgtca cctggtgttc 60
ccgctgctgg aattcctgag cgtgaaagag atctacaacg aaaaagaact gctgcagggc 120
aagcttgatc tgttgtctga taccaatatg gttgactttg ccatggatgt ttataaaaac 180
ctgtattctg acgatatccc gcatgcactg cgtgaaaagc gtactaccgt tgttgctcag 240
ctgaaacagc ttcaggctga gaccgaaccg attgttaaaa tgttcgaaga cccagaaact 300
actcgtcaga tgcaatctac ccgcgatggt cgtatgctct tcgactattt ggctgacaaa 360
cacggtttcc gtcaggagta cctggatacg ctgtaccgtt acgcaaaatt ccagtacgaa 420
tgcggtaact acagcggtgc agcggaatat ctctacttct ttcgcgttct ggttccggca 480
accgatcgca acgcgctgtc ttcgctgtgg ggcaaactgg caagcgaaat tctgatgcag 540
aactgggatg cagcaatgga agatctgact cgcctgaaag aaaccatcga caacaacagc 600
gtcagcagtc ctttgcagtc tctgcaacag cgtacctggc tgatccactg gagcctgttc 660
gtatttttca accacccgaa aggccgtgat aacattattg acctgttcct ctaccagccg 720
cagtatctga atgcgattca gaccatgtgt ccgcacatcc tgcgttatct gaccactgct 780
gttatcacca acaaagacgt tcgtaaacgt cgccaggtgc tgaaggacct ggtaaaagtg 840
atccagcagg aaagctacac ctacaaagat ccgatcactg aatttgttga atgcctgtac 900
gttaacttcg attttgacgg tgcgcagaaa aaactgcgcg aatgtgaatc cgtactggta 960
aacgatttct tcctggtcgc ctgccttgag gacttcatcg aaaacgcacg tctgtttatt 1020
tttgaaacct tctgccgtat ccatcagtgt atctccatca acatgctggc tgataaactg 1080
aacatgactc cggaagaagc cgagcgctgg atcgttaatc tgattcgtaa cgctcgtctg 1140
gatgcgaaaa tcgattccaa gctgggtcac gtggtgatgg gcaacaatgc cgtgtcgccg 1200
tatcagcagg ttattgaaaa aaccaaatct ctctccttcc gctcacaaat gctggcgatg 1260
aacatcgaga agaaactgaa ccagaattcc cgttctgaag cgccgaactg ggcgacccag 1320
gactccggct tctac 1335
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aagttctgtt ccaggggccg gctgaatacg acttaacgac tc 42
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ttgtggtggg tgtttcatta gtagaagccg gagtcc 36
<210> 36
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
atgtctgttc cggcgtttat cgacatctct gaagaggacc aggcggcaga actgcgtgct 60
tacctgaaat ccaaaggcgc tgaaatctcc gaagaaaact ccgagggcgg tctgcacgtt 120
gatctggctc agatcatcga agcttgcgac gtttgcctga aagaggatga caaagatgtg 180
gaatccgtga tgaacagcgt ggtatccctg ttgttgattc tggagccgga caagcaggaa 240
gcgctgattg aaagcctgtg tgaaaaactg gtaaagttcc gtgaaggcga acgtccttca 300
ctgcgtctgc aactgctgtc taacctgttc cacggtatgg ataaaaacac cccagtacgt 360
tacaccgttt actgctcgct gatcaaagtg gctgcttcct gcggtgcgat tcagtacatc 420
ccgaccgagc tggatcaggt tcgtaaatgg atttctgact ggaacctgac tactgaaaag 480
aaacacaccc tcctgcgcct gctgtacgaa gcactggttg actgcaaaaa atctgacgct 540
gccagtaagg taatggtgga gttgctgggt tcttataccg aagataacgc cagccaggca 600
cgcgtggatg ctcaccgttg catcgttcgc gctctgaaag atccgaacgc attcctgttt 660
gaccacctgc tgacgctgaa gccggtaaaa ttcctggaag gtgaactgat ccacgacctg 720
ctgaccatct tcgtttccgc gaagctggca agctatgtga aattctacca gaacaacaaa 780
gacttcatcg acagcctggg cctgctgcat gaacaaaaca tggcgaaaat gcgtctgctg 840
accttcatgg gcatggcagt tgaaaataaa gaaatttcgt ttgataccat gcagcaagaa 900
ctgcagattg gcgcggatga tgtagaagcc tttgttatcg atgcggttcg taccaaaatg 960
gtttattgta aaattgatca gactcagcgc aaagtcgttg tttctcacag cacgcatcgt 1020
actttcggta aacagcagtg gcagcagctg tatgacaccc tgaatgcatg gaaacaaaat 1080
ctgaacaaag ttaaaaatag tctgctttct ctgagcgaca ct 1122
<210> 37
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aagttctgtt ccaggggccg tctgttccgg cgtttatc 38
<210> 38
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ttgtggtggg tgtttcatta agtgtcgctc agagaaag 38
<210> 39
<211> 1644
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atggctaagt tcatgacccc ggtaattcag gataacccgt ctggctgggg cccgtgcgca 60
gttccggaac agttccgcga tatgccgtat cagccgttta gcaaaggcga ccgtctgggt 120
aaagttgctg actggacggg agcaacttac caggacaagc gttacaccaa caaatattcc 180
tcgcagttcg gtggtggctc ccagtacgct tacttccatg aagaagatga gtcttccttc 240
cagctggttg acaccgcacg cacgcaaaaa acggcatacc agcgtaaccg catgcgcttc 300
gcacagcgta atctccgtcg tgataaagat cgtcgcaaca tgctgcaatt taacctgcag 360
attcttccga aatccgcgaa acaaaaagag cgtgaacgta tccgcctgca aaagaaattc 420
cagaagcagt ttggcgttcg ccagaaatgg gatcagaaat ctcagaagcc gcgtgacagc 480
tctgtcgaag tacgttccga ctgggaagtg aaagaagaaa tggatttccc gcagttgatg 540
aaaatgcgtt atctggaagt ttctgagccg caagacatcg aatgctgcgg tgctctggaa 600
tactacgata aagcgtttga tcgcatcacc actcgttcag aaaaaccgct gcgtagcatt 660
aaacgtattt tccacaccgt tactaccacc gatgatccgg ttattcgtaa actggctaaa 720
actcagggta acgtgtttgc aacggatgcg attctcgcga ctctgatgag ctgtacccgt 780
tctgtttact cctgggatat cgtggttcag cgcgttggtt ctaaactgtt cttcgacaaa 840
cgcgacaact ctgattttga cttgctgacc gtatctgaaa ctgcgaacga accgccacag 900
gacgaaggca actcgttcaa ctccccgcgc aatctggcaa tggaagcgac ctacatcaat 960
cacaacttta gtcagcagtg cctgcgtatg ggcaaagaac gttacaactt ccctaatccg 1020
aacccgttcg ttgaagacga catggacaaa aatgaaatcg cctctgtagc ctatcgttat 1080
cgccgctgga aacttggtga tgacatcgac ctgatcgttc gttgtgaaca cgacggcgtg 1140
atgactggcg ctaacggtga agtcagcttc atcaacatca aaaccctgaa cgagtgggac 1200
tcccgtcatt gtaacggcgt agattggcgt cagaagctgg attcacaacg tggtgcggtg 1260
atcgctaccg aactgaaaaa caacagctac aaactggcgc gttggacctg ctgcgcgctg 1320
ctggccggta gcgaatatct caagttaggt tatgtgagtc gctaccatgt caaagattcc 1380
agccgtcacg ttatcctggg cactcaacag ttcaaaccaa acgaatttgc tagccagatc 1440
aacctgagcg tagaaaacgc ctggggcatt ctgcgctgcg tgattgatat ctgtatgaag 1500
cttgaggaag gtaaatacct gattctgaaa gacccgaata aacaggttat ccgtgtttat 1560
tctctgccgg acggtacctt ctcttctgac gaagatgaag aagaagagga ggaggaggaa 1620
gaagaagagg aagaggagga aacc 1644
<210> 40
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aagttctgtt ccaggggccg gctaagttca tgaccccg 38
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ttgtggtggg tgtttcatta cgtgcgtgcg gtgtc 35
<210> 42
<211> 1779
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ggtactgaaa tcactcacgc ggttgttatt aaaaagctga acgaaatcct ccaggcacgc 60
ggtaaaaaag gaaccgatcg tgcagctcag attgaattat tgcagctgct tgtgcagatc 120
gctgctgaaa acaacctcgg cgaaggcgtg attgttaaaa tcaaattcaa catcattgct 180
tcgctgtacg actacaaccc taacctggca acttatatga aacctgaaat gtggggcaaa 240
tgcctggact gtatcaatga gctgatggac atcctgtttg ctaacccgaa catcttcgtt 300
ggcgagaaca tcctggaaga aagcgaaaac ctgcataacg ctgatcagcc gctgcgtgtt 360
cgcggctgca ttctgactct ggtcgaacgt atggatgaag aatttacaaa aattatgcag 420
aacaccgacc cgcatagtca ggaatacgta gaacacctga aagatgaagc ccaggtttgc 480
gcaatcatcg aacgtgtaca gcgttatctc gaagaaaaag gcaccaccga agaagtgtgc 540
cgtatttatc tgctgcgtat cctgcacacc tactacaaat ttgactataa agcacaccag 600
cgccagctta caccaccgga aggcagctcc aaatcagaac aggatcaagc cgaaaacgaa 660
ggcgaagaca gtgccgttct gatggaacga ctctgcaaat atatctacgc aaaagaccgc 720
acggatcgca ttcgcacctg cgccattctg tgccacatct atcaccacgc tctgcactct 780
cgctggtacc aggctcgtga tctgatgttg atgtctcatc tgcaggacaa cattcagcac 840
gccgatccgc cggtacaaat tctgtataac cgtacgatgg ttcagctggg tatctgtgcg 900
ttccgccaag gtctgaccaa agacgcacat aatgccctgc tcgatatcca gtcgtcaggt 960
cgtgctaaag agctccttgg tcagggtttg ctgttacgtt ccctgcagga gcgtaaccag 1020
gaacaagaga aagttgagcg ccgccgtcag gtaccgttcc acttgcatat caaccttgaa 1080
ctgctggaat gtgtttatct agtctccgct atgctgctgg agatcccgta catggcggcg 1140
catgaatcgg atgcgcgtcg tcgcatgatc agtaagcagt tccatcatca gttgagagtt 1200
ggtgagcgtc agccactgct gggtccgcca gaatctatgc gcgaacatgt ggtggcagcg 1260
agcaaagcga tgaaaatggg cgactggaaa acctgtcaca gctttattat caacgaaaaa 1320
atgaacggta aagtctggga tcttttcccg gaagctgaca aagtacgtac catgctggta 1380
cgcaaaatcc aagaagagtc cctgcgtact tacctgttca cctacagcag tgtctatgac 1440
agcatcagca tggaaaccct gagcgatatg ttcgaactgg atctgccgac tgttcactct 1500
atcatctcca agatgattat taacgaagag ttaatggctt ctctggatca gcctacgcaa 1560
accgttgtga tgcaccgtac tgagccgacc gcgcagcaga atctggcact gcaactggct 1620
gaaaaactgg gctcactggt tgaaaataac gaacgggtgt tcgaccacaa acagggcaca 1680
tatggcggtt acttccgtga ccagaaggac ggttatcgta aaaatgaagg ttacatgcgt 1740
cgtggcggct accgtcaaca gcaatctcag accgcttac 1779
<210> 43
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tccgcggtga aacaagtaca gatcgatggt ctggttgttc ttaaaatcat caagcactac 60
caggaagagg gtcagggcac cgaggtggtg cagggcgttc tgctgggcct ggtggttgaa 120
gaccgcctgg aaatcaccaa ctgcttcccg ttcccgcagc ataccgaaga tgacgccgac 180
ttcgacgaag ttcagtacca gatggagatg atgcgcagcc tgcgtcacgt taacatcgac 240
cacctgcacg taggctggta ccagagcacc tactacggtt cttttgttac ccgtgctctg 300
ctggattctc agttctctta tcagcacgct atcgaagagt ctgtagtatt gatttatgat 360
ccgattaaaa ccgcgcaggg tagtctctcg ctgaaagctt accgtctgac tccgaaactg 420
atggaagtct gtaaagagaa agatttttcg cctgaagcgc tgaaaaaagc gaacattacc 480
ttcgagtaca tgttcgaaga agtgccgatc gttatcaaaa acagccatct gatcaacgtg 540
ctgatgtggg aacttgagaa gaaatccgca gttgctgaca aacatgaact gctgtctctg 600
gcttccagca accacctcgg caaaaatctg caactgttaa tggatcgcgt tgatgaaatg 660
agccaggaca ttgttaaata caatacctat atgcgtaaca ccagcaaaca gcagcagcag 720
aaacaccagt atcaacaacg tcgccagcaa gaaaacatgc agcgtcagtc tcgtggtgaa 780
ccgccgctgc cggaagaaga tctgagcaag ctgtttaaac caccgcaacc gccagcgcgt 840
atggacagct tgctgattgc tggccagatt aacacttact gccagaacat caaagaattt 900
actgcgcaaa acctgggtaa actgttcatg gcacaggcac tgcaggaata caacaac 957
<210> 44
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ggtccgttcc cgggcggccg tgttgttcgt ctgcacccgg taatcctggc gtccattgtt 60
gactcctatg aacgtcgtaa cgaaggcgcg gcacgcgtta tcggtactct gctgggtacg 120
gtagacaaac actctgttga agttaccaac tgtttctccg taccgcacaa cgagtctgaa 180
gatgaagtgg cggtagatat ggaatttgct aaaaacatgt acgaactgca taaaaaagtg 240
agcccgaatg agctgattct gggctggtac gcaactggcc atgacatcac cgaacacagc 300
gtcttgattc atgaatacta cagccgtgaa gcgccaaacc cgatccacct gactgttgat 360
accagcttgc agaacggccg catgagcatc aaagcttacg tttctacgct gatgggcgta 420
ccaggtcgta ctatgggtgt gatgttcacc ccgctgaccg tgaaatatgc ctattacgac 480
accgagcgca ttggcgttga cctgatcatg aaaacctgct tctctccgaa ccgcgtgatt 540
ggtctgtcca gcgatctgca gcaggttggc ggtgcttctg cacgtattca ggatgcgctg 600
tcgacagtgc tgcaatacgc tgaagacgtt ctgtctggta aagtttccgc tgataacacc 660
gttggtcgtt tcctgatgtc tctggttaac caggtaccga aaatcgttcc ggatgacttt 720
gaaaccatgc tgaacagcaa catcaacgac ctcttgatgg tgacctatct ggctaacctg 780
acgcaatcgc agatcgcact gaatgaaaaa ctggtaaatc tg 822
<210> 45
<211> 1815
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccagcctact tccagcgtcc tgaaaacgct ctgaaacgtg cgaacgaatt tctggaagtc 60
ggtaaaaaac agccggcgct ggatgtgctg tacgatgtta tgaaatccaa aaaacaccgt 120
acctggcaga aaatccatga accaatcatg ctgaaatatc tggagctgtg tgtggacctg 180
cgtaagtctc atctggctaa agaaggcctg tatcagtaca aaaatatttg ccagcaagtt 240
aacatcaaat cgctggaaga cgtagtacgt gcttatctta aaatggcaga ggagaaaacc 300
gaagcagcaa aagaagagtc tcagcagatg gtgcttgaca ttgaggacct ggacaatatc 360
cagaccccag aatcggtact gctgtctgcg gtttccggcg aagacaccca ggaccgcacc 420
gatcgccttc tgctgactcc gtgggtgaaa ttcctgtggg aaagctaccg tcagtgcctg 480
gatctgctgc gcaacaacag ccgcgtggaa cgcctctatc acgacatcgc gcagcaggcg 540
tttaaatttt gcctgcagta tacccgtaaa gctgagttcc gcaaactgtg cgacaacctg 600
cgtatgcacc tgagccagat tcagcgccat cataatcagt ctacagccat caatctgaac 660
aatccggaat ctcaatctat gcatctggaa acccgtctgg ttcagcttga ttctgcaatc 720
agcatggaac tatggcagga agccttcaaa gcggtagaag acatccacgg cttgttcagc 780
ctctccaaga agccgccgaa accgcagctg atggctaact attacaacaa agtttctacc 840
gtgttctgga aatctggtaa tgcgctgttc cacgcttcta ctctgcaccg cctgtaccat 900
ctttctcgtg agatgcgtaa aaacctgact caggatgaaa tgcaacgcat gtctacgcgt 960
gtattgctgg caaccctgtc cattccgatc accccggaac gtactgatat tgcacgtctg 1020
ctcgacatgg acggtatcat cgttgaaaaa caacgccgtc tggcaacgct gctgggcctg 1080
caggcaccgc caactcgtat cggtctgatc aacgatatgg ttcgttttaa cgttctgcaa 1140
tacgttgttc cggaagttaa agacctttat aactggctgg aagtagaatt caacccgctg 1200
aaattgtgtg aacgtgtgac taaagtgctc aactgggttc gcgagcaacc ggagaaagaa 1260
ccggaactgc aacagtacgt accgcaactg cagaacaaca ctatcctgcg tctgttgcaa 1320
caggtttcgc agatttatca gtcgattgaa ttttctcgcc tgacctctct ggtgccgttc 1380
gttgatgcct ttcagctgga acgtgctatc gtcgacgcag cgcgtcactg tgatctgcag 1440
gtgcgtatcg accacaccag ccgtacgtta tccttcggtt ctgacttaaa ctacgcgacc 1500
cgcgaagatg ctccgattgg cccgcacttg cagtccatgc cgtctgaaca gatccgtaat 1560
caactgacgg cgatgagcag cgtcctggcc aaagccctgg aagtgattaa accagcacac 1620
atcctgcaag aaaaggaaga gcagcaccag ctggctgtta ccgcttacct gaaaaactcc 1680
cgtaaggagc atcagcgcat tctggcgcgt cgtcaaacca tcgaagagcg taaggaacgc 1740
ctggaaagtc tgaacatcca acgtgaaaaa gaagagctgg aacaacgtga ggctgaactg 1800
caaaaagtcc gtaaa 1815
<210> 46
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gctgaatacg acttaacgac tcgcattgct cacttcctgg accgtcacct ggtgttcccg 60
ctgctggaat tcctgagcgt gaaagagatc tacaacgaaa aagaactgct gcagggcaag 120
cttgatctgt tgtctgatac caatatggtt gactttgcca tggatgttta taaaaacctg 180
tattctgacg atatcccgca tgcactgcgt gaaaagcgta ctaccgttgt tgctcagctg 240
aaacagcttc aggctgagac cgaaccgatt gttaaaatgt tcgaagaccc agaaactact 300
cgtcagatgc aatctacccg cgatggtcgt atgctcttcg actatttggc tgacaaacac 360
ggtttccgtc aggagtacct ggatacgctg taccgttacg caaaattcca gtacgaatgc 420
ggtaactaca gcggtgcagc ggaatatctc tacttctttc gcgttctggt tccggcaacc 480
gatcgcaacg cgctgtcttc gctgtggggc aaactggcaa gcgaaattct gatgcagaac 540
tgggatgcag caatggaaga tctgactcgc ctgaaagaaa ccatcgacaa caacagcgtc 600
agcagtcctt tgcagtctct gcaacagcgt acctggctga tccactggag cctgttcgta 660
tttttcaacc acccgaaagg ccgtgataac attattgacc tgttcctcta ccagccgcag 720
tatctgaatg cgattcagac catgtgtccg cacatcctgc gttatctgac cactgctgtt 780
atcaccaaca aagacgttcg taaacgtcgc caggtgctga aggacctggt aaaagtgatc 840
cagcaggaaa gctacaccta caaagatccg atcactgaat ttgttgaatg cctgtacgtt 900
aacttcgatt ttgacggtgc gcagaaaaaa ctgcgcgaat gtgaatccgt actggtaaac 960
gatttcttcc tggtcgcctg ccttgaggac ttcatcgaaa acgcacgtct gtttattttt 1020
gaaaccttct gccgtatcca tcagtgtatc tccatcaaca tgctggctga taaactgaac 1080
atgactccgg aagaagccga gcgctggatc gttaatctga ttcgtaacgc tcgtctggat 1140
gcgaaaatcg attccaagct gggtcacgtg gtgatgggca acaatgccgt gtcgccgtat 1200
cagcaggtta ttgaaaaaac caaatctctc tccttccgct cacaaatgct ggcgatgaac 1260
atcgagaaga aactgaacca gaattcccgt tctgaagcgc cgaactgggc gacccaggac 1320
tccggcttct ac 1332
<210> 47
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tctgttccgg cgtttatcga catctctgaa gaggaccagg cggcagaact gcgtgcttac 60
ctgaaatcca aaggcgctga aatctccgaa gaaaactccg agggcggtct gcacgttgat 120
ctggctcaga tcatcgaagc ttgcgacgtt tgcctgaaag aggatgacaa agatgtggaa 180
tccgtgatga acagcgtggt atccctgttg ttgattctgg agccggacaa gcaggaagcg 240
ctgattgaaa gcctgtgtga aaaactggta aagttccgtg aaggcgaacg tccttcactg 300
cgtctgcaac tgctgtctaa cctgttccac ggtatggata aaaacacccc agtacgttac 360
accgtttact gctcgctgat caaagtggct gcttcctgcg gtgcgattca gtacatcccg 420
accgagctgg atcaggttcg taaatggatt tctgactgga acctgactac tgaaaagaaa 480
cacaccctcc tgcgcctgct gtacgaagca ctggttgact gcaaaaaatc tgacgctgcc 540
agtaaggtaa tggtggagtt gctgggttct tataccgaag ataacgccag ccaggcacgc 600
gtggatgctc accgttgcat cgttcgcgct ctgaaagatc cgaacgcatt cctgtttgac 660
cacctgctga cgctgaagcc ggtaaaattc ctggaaggtg aactgatcca cgacctgctg 720
accatcttcg tttccgcgaa gctggcaagc tatgtgaaat tctaccagaa caacaaagac 780
ttcatcgaca gcctgggcct gctgcatgaa caaaacatgg cgaaaatgcg tctgctgacc 840
ttcatgggca tggcagttga aaataaagaa atttcgtttg ataccatgca gcaagaactg 900
cagattggcg cggatgatgt agaagccttt gttatcgatg cggttcgtac caaaatggtt 960
tattgtaaaa ttgatcagac tcagcgcaaa gtcgttgttt ctcacagcac gcatcgtact 1020
ttcggtaaac agcagtggca gcagctgtat gacaccctga atgcatggaa acaaaatctg 1080
aacaaagtta aaaatagtct gctttctctg agcgacact 1119
<210> 48
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gctaagttca tgaccccggt aattcaggat aacccgtctg gctggggccc gtgcgcagtt 60
ccggaacagt tccgcgatat gccgtatcag ccgtttagca aaggcgaccg tctgggtaaa 120
gttgctgact ggacgggagc aacttaccag gacaagcgtt acaccaacaa atattcctcg 180
cagttcggtg gtggctccca gtacgcttac ttccatgaag aagatgagtc ttccttccag 240
ctggttgaca ccgcacgcac g 261

Claims (23)

1.一种多顺反子表达载体，包括基本骨架和目的基因表达元件，所述目的基因表达元件中包括核酶序列。
2.根据权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，当目的基因转录成mRNA后，所述核酶序列切割其自身，将含有多个阅读框的长链mRNA拆解成若干个单阅读框的短链mRNA。
3.根据权利要求2所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述核酶序列通过自发折叠形成活性结构并切割其自身。
4.根据权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述目的基因表达元件包括5’-3’方向排列的启动子、多克隆位点和终止子，所述核酶序列位于启动子和多克隆位点之间。
5.根据权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述核酸序列来自Twister家族、hammerhead家族、HDV家族、twister sister家族、hammerhead variant家族、hatchet家族或pistol家族。
6.根据权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述目的基因表达元件中还包括二级保护结构序列Stem loop。
7.根据权利要求6所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述二级保护结构序列Stemloop保护所述mRNA不被降解。
8.根据权利要求6所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述二级保护结构序列Stemloop指一种分子内两个区域的核苷酸排列具有回文现象，让两端序列因为碱基配对而形成一状似棒棒糖的双螺旋结构，使得DNA或RNA产生核酸二级结构。
9.根据权利要求4所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述启动子选自T7promoter、Rham promoter、Ara promoter、T5 promoter、Trc promoter、Tac promoter或Trp promoter。
10.根据权利要求4所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述终止子选自L3S2P21terminator、UUCG T7Te terminator、rrnB T1 terminator、rrnB T2 terminator或T3Teterminator。
11.根据权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述目的基因表达元件中还包括蛋白表达识别标签序列，所述蛋白表达识别标签序列可转录表达成蛋白表达识别标签，用于目的蛋白的标记和纯化。
12.根据权利要求11所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述蛋白表达识别标签选自His-tag、Flag-tag、Strep-tag、GST-tag或MBP-tag。
13.根据权利要求11所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述目的基因表达元件中还包括标签去除序列，所述标签去除序列能够被对应的蛋白酶专一性识别与酶切，从而去除蛋白表达识别标签。
14.根据权利要求13所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述标签去除序列位于蛋白表达识别标签序列与多克隆位点之间。
15.根据权利要求13所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述标签去除序列选自Thrombin、Factor Xa、Enterokinase、TEV protease、PreScission或Sumo protease。
16.根据权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述目的基因表达元件中还包括酶切位点。
17.根据权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述基本骨架包括复制起点和抗性筛选基因。
18.根据权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述复制子选自pBR322origin、ColE1 origin、pUC origin、ColA origin、pSC101 origin或p15A origin。
19.根据权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述抗性筛选基因选自Kan、Amp、Chl、Car、Str、Tet或Gen。
20.一种多顺反子表达系统，包括如权利要求1-19任一项所述多顺反子表达载体。
21.根据权利要求20所述多顺反子表达系统，其特征在于，还包括宿主细胞。
22.如权利要求1-19任一项所述多顺反子表达载体和/或如权利要求20-21任一项所述多顺反子表达系统在多基因表达、多蛋白质复合物组装中的用途。
23.一种适用于多基因表达、多蛋白质复合物组装的方法，包括步骤：将目的基因插入到如权利要求1-19任一项所述多顺反子表达载体的多克隆位点。
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