CN101357231A - 细胞膜仿生修饰的纳米基因载体组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞膜仿生修饰的纳米基因载体组合物及其制备方法。利用聚酰胺－胺树枝状聚合物外层的部分氨基与细胞膜仿生磷酸胆碱单体发生迈克尔加成反应，实现对聚酰胺－胺的表面仿生修饰，获得细胞膜仿生修饰的聚酰胺－胺，控制细胞膜仿生磷酸胆碱单体的接枝率，获得表面含有剩余氨基的仿生修饰的聚酰胺－胺，该仿生修饰的聚酰胺－胺表面含有正电荷，可以与基因进行复合，仿生修饰聚酰胺－胺和基因所形成的纳米基因载体组合物能实现基因的有效缔合、保护、传递与释放。本发明具有较高的基因缔合能力、良好的贮藏稳定性和较低的毒性以及较高的转染效率，在基因治疗中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及复合物及制备方法，尤其涉及一种细胞膜仿生修饰的纳米基因载体组合物及其制备方法。
背景技术
树枝状聚合物作为一种人工合成的新型纳米材料，以其独特的结构和性能在生物医学领域受到了日益广泛的关注，在药物释放、基因传递和医疗诊断等方面具有广阔的应用前景[高分子学报，2006，(4)：574-580]。树枝状聚合物作为一种新型纳米级基因载体，具有无免疫原性及遗传毒性的优点，成为该领域的研究热点之一[Adv.Drug Deliv.Rev，2005，57：2106～2129]。
目前，聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状聚合物是基因载体领域中受到广泛关注的树枝状聚合物之一。PAMAM-DNA复合物可保护DNA避免酶的降解，且PAMAM分子结构外表面具有大量的官能团，可以进行多重修饰。生物相容性和溶解性能是影响基因载体应用的因素之一。研究发现[国外医学儿科学分册，2004，31：96～98]，PAMAM表现出浓度及大小依赖的毒性，其分子代数和浓度越高，细胞毒性越强。G5代PAMAM在10μmol/L浓度时显示出细胞毒性，而G7代PAMAM在5μmol/L浓度下即可导致细胞死亡。随着研究的深入，人们开始关注树枝状聚合物的表面功能化修饰。Jevp Rasesphant等[Int J Pharm，2003，252：263～266]的研究结果表明，用月桂酰基或PEG链对PAMAM树枝状聚合物进行表面修饰，可以明显降低其细胞毒性，提高其生物相容性。
模拟生物膜结构的新型生物相容性材料的研究引起了极大的关注。研究表明，细胞膜外层具有双性电荷结构的磷酸胆碱极性头部可以与水分子形成非常牢固的水合层，减弱蛋白与其的相互作用，可以有效地改善材料的血液相容性。近年来，将细胞膜仿生的磷酸胆碱设计用于纳米材料的表面改性和设计，为解决纳米材料在生物医学应用中所面临的溶解性、稳定性和生物相容性等问题提供了良好的思路。与以聚氧乙烯为亲水段的聚合物胶束相比，以磷酸胆碱聚合物为亲水段的聚合物胶束显示出更为优异的生物相容性[J Contro Release，2005，107(3)：502～512]。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种细胞膜仿生修饰的纳米基因载体组合物及其制备方法。
细胞膜仿生修饰的纳米基因载体组合物由仿生修饰聚酰胺-胺树枝状聚合物与基因通过静电作用复合而成，仿生修饰聚酰胺-胺树枝状聚合物与基因的重量比为1∶10～10∶1，基因为含有编码遗传标记的DNA序列，遗传标记选自荧光蛋白基因。
所述的仿生修饰聚酰胺-胺树枝状聚合物是表面同时含有氨基和磷酸胆碱基团的聚酰胺-胺树枝状聚合物，氨基与磷酸胆碱基团的摩尔比为1∶10～100∶1。
细胞膜仿生修饰的纳米基因载体组合物的制备方法包括如下步骤：
1)1重量份末端含氨基的0～6代聚酰胺-胺树枝状聚合物和0.01～100重量份细胞膜仿生单体甲基丙烯酸磷酸胆碱酯或丙烯酸磷酸胆碱酯加入到10-10000重量份水中，加热到20～200℃，反应0.5～100小时，以透析袋透析1～100小时，冷冻真空干燥10～100小时后得到细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺；
2)细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺树枝状聚合物用5毫摩尔/升pH 5.5醋酸一醋酸钠缓冲溶液溶解，配成0.1～10毫克/毫升的溶液，用孔径0.22微米滤膜将溶液过滤；
3)荧光蛋白基因用4.3毫摩尔/升硫酸钠溶液溶解配制成50～250μg/ml的溶液；
4)将细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺树枝状聚合物和荧光蛋白基因溶液分别预热至55℃，然后按载体与荧光蛋白基因溶液体积比1∶1在涡旋混合仪上混合1分钟，室温静置0.5～1小时，细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺树枝状聚合物和荧光蛋白基因通过静电作用复合成纳米复合物溶液。
本发明与现有技术相比具有的有益效果：
1)经细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺表面含有的磷酸胆碱基团为细胞膜的组成部分，使得载体具有良好的生物相容性；
2)细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺表面含有丰富的正电荷性氨基，能与基因通过静电作用进行有效的复合；
3)聚酰胺-胺表面的磷酸胆碱基团为两性离子结构，使得纳米基因载体组合物在宽pH范围和盐浓度下都具有优异的分散性和稳定性。
具体实施方式
本发明利用聚酰胺-胺树枝状聚合物外层的部分氨基与细胞膜仿生磷酸胆碱单体发生迈克尔加成反应，实现对聚酰胺-胺的表面仿生修饰，获得细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺，控制细胞膜仿生磷酸胆碱单体的接枝率，获得表面含有剩余氨基的仿生修饰的聚酰胺-胺，该仿生修饰的聚酰胺-胺表面含有正电荷，可以与基因进行复合，仿生修饰聚酰胺-胺和基因所形成的纳米基因载体组合物能实现基因的有效缔合、保护、传递与释放。
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：
(1)磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成：
以外层为氨基的第5代聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)与细胞膜仿生单体丙烯酸磷酸胆碱酯(APC)作为原料，制备磷酸胆碱修饰的聚酰胺-胺树枝状聚合物，具体制备步骤如下：
在100mL三口烧瓶中加入APC(4g，0.014mol)的甲醇溶液(20mL)，通氮气保护，在0℃逐滴加入第五代PAMAM(G5，1g，4.85×10-5mol)的甲醇溶液(10mL)，滴加完毕后反应体系在0℃下继续搅拌30min，然后在室温下反应72h。反应完毕后经透析除去未反应单体，冻干得到粉末状固体产物。核磁和红外证实所获得的产物具有预期的结构，ζ电位的测定表明仿生修饰的聚酰胺-胺表面仍然带正电荷。
(2)基因超分子组装体的制备：
质粒DNA用4.3mmol/L硫酸钠溶液溶解配制成100μg/ml的溶液；细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺溶于5mmol/L pH 5.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，用孔径0.22微米滤膜将溶液过滤；将细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺和质粒DNA溶液分别预热至55℃，在N/P值为10的条件下，将细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺溶液加入到等体积的DNA溶液中，在涡旋混合仪上混合1分钟，室温静置0.5小时。
动态光散射和原子力显微镜结果表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺可以有效的与DNA复合。
(3)基因转染：
将HEK293细胞种植到24孔聚苯乙烯细胞培养板中，细胞种植密度为1×105细胞/孔。置于5％CO2，37℃培养箱中培养一段时间使细胞融合率达到70％左右。去除培养基，每孔加入100μL基因缔合体溶液(含10μg pEGFP质粒)与900μL新鲜培养基溶液(含10％胎牛血清)，继续培养，使pEGFP质粒在细胞内能表达绿色荧光蛋白。培养72h后，采用荧光显微镜观察转染细胞的形貌，定性研究绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺仍然具有较高的转染效率。
实施例2
(1)磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成：除了反应原料采用第4代聚酰胺-胺树枝状聚合物外，其他实验步骤同实施例1。核磁和红外证实所获得的产物具有预期的结构，ζ电位的测定表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺表面仍然带正电荷。
(2)基因超分子组装体的制备：同实施例1。动态光散射和原子力显微镜结果表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺可以有效的与DNA复合。
(3)基因转染：同实施例1。结果表明细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺仍然具有较高的转染效率。
实施例3
(1)磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成：除了反应原料采用甲基丙烯酸磷酸胆碱酯外，其他实验步骤同实施例1。核磁和红外证实所获得的产物具有预期的结构，ζ电位的测定表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺表面仍然带正电荷。
(2)基因超分子组装体的制备：同实施例1。动态光散射和原子力显微镜结果表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺可以有效的与DNA复合。
(3)基因转染：同实施例1。结果表明细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺仍然具有较高的转染效率。
实施例4
(1)磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成：同实施例1。核磁和红外证实所获得的产物具有预期的结构，ζ电位的测定表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺表面仍然带正电荷。
(2)基因超分子组装体的制备：除N/P调整为5外其他实验步骤同实施例1。动态光散射和原子力显微镜结果表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺可以有效的与DNA复合。
(3)基因转染：同实施例1。结果表明细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺仍然具有较高的转染效率。
实施例5
(1)磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成：同实施例1。核磁和红外证实所获得的产物具有预期的结构，ζ电位的测定表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺表面仍然带正电荷。
(2)基因超分子组装体的制备：除N/P调整为20外其他实验步骤同实施例1。动态光散射和原子力显微镜结果表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺可以有效的与DNA复合。
(3)基因转染：同实施例1。结果表明细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺仍然具有较高的转染效率。
实施例6
(1)磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成：同实施例2。核磁和红外证实所获得的产物具有预期的结构，ζ电位的测定表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺表面仍然带正电荷。
(2)基因超分子组装体的制备：同实施例4。动态光散射和原子力显微镜结果表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺可以有效的与DNA复合。
(3)基因转染：同实施例1。结果表明细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺仍然具有较高的转染效率。
实施例7
(1)磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成：同实施例3。核磁和红外证实所获得的产物具有预期的结构，ζ电位的测定表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺表面仍然带正电荷。
(2)基因超分子组装体的制备：同实施例4。动态光散射和原子力显微镜结果表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺可以有效的与DNA复合。
(3)基因转染：同实施例1。结果表明细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺仍然具有较高的转染效率。
实施例8
(1)磷酸胆碱仿生修饰聚酰胺-胺的合成：同实施例1。核磁和红外证实所获得的产物具有预期的结构，ζ电位的测定表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺表面仍然带正电荷。
(2)基因超分子组装体的制备：同实施例5。动态光散射和原子力显微镜结果表明细胞膜仿生修饰的聚酰胺-胺可以有效的与DNA复合。
(3)基因转染：同实施例1。结果表明细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺仍然具有较高的转染效率。
Claims (3)
1.一种细胞膜仿生修饰的纳米基因载体组合物，其特征在于它由仿生修饰聚酰胺-胺树枝状聚合物与基因通过静电作用复合而成，仿生修饰聚酰胺-胺树枝状聚合物与基因的重量比为1∶10～10∶1，基因为含有编码遗传标记的DNA序列，遗传标记选自荧光蛋白基因。
2.根据权利要求1所述的一种细胞膜仿生修饰的纳米基因载体组合物，其特征在于所述的仿生修饰聚酰胺-胺树枝状聚合物是表面同时含有氨基和磷酸胆碱基团的聚酰胺-胺树枝状聚合物，氨基与磷酸胆碱基团的摩尔比为1∶10～100∶1。
3.一种根据权利要求1所述细胞膜仿生修饰的纳米基因载体组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)1重量份末端含氨基的0～6代聚酰胺-胺树枝状聚合物和0.01～100重量份细胞膜仿生单体甲基丙烯酸磷酸胆碱酯或丙烯酸磷酸胆碱酯加入到10-10000重量份水中，加热到20～200℃，反应0.5～100小时，以透析袋透析1～100小时，冷冻真空干燥10～100小时后得到细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺；
2)细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺树枝状聚合物用5毫摩尔/升pH 5.5醋酸一醋酸钠缓冲溶液溶解，配成0.1～10毫克/毫升的溶液，用孔径0.22微米滤膜将溶液过滤；
3)荧光蛋白基因用4.3毫摩尔/升硫酸钠溶液溶解配制成50～250μg/ml的溶液；
4)将细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺树枝状聚合物和荧光蛋白基因溶液分别预热至55℃，然后按载体与荧光蛋白基因溶液体积比1∶1在涡旋混合仪上混合1分钟，室温静置0.5～1小时，细胞膜仿生修饰聚酰胺-胺树枝状聚合物和荧光蛋白基因通过静电作用复合成纳米复合物溶液。
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| CNA200810120681XA CN101357231A (zh) | 2008-09-02 | 2008-09-02 | 细胞膜仿生修饰的纳米基因载体组合物及其制备方法 |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106924755A (zh) * | 2015-12-31 | 2017-07-07 | 复旦大学 | 一种激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子及制备方法 |
| CN108642088A (zh) * | 2018-04-11 | 2018-10-12 | 天津大学 | 红细胞膜表面修饰基因递送系统及制备方法及应用 |
| CN112625268A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-09 | 暨南大学 | 一种细胞膜仿生聚酰胺-胺树枝状大分子水凝胶及其制备方法与应用 |
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2008
- 2008-09-02 CN CNA200810120681XA patent/CN101357231A/zh active Pending
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