CN101355885A - 具有低亚硝胺含量的尼古丁 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有少于0.1μg的亚硝胺/mg尼古丁的尼古丁以及制备所述尼古丁的方法和含有所述尼古丁的产品。

Description

具有低亚硝胺含量的尼古丁

技术领域

本发明涉及含有少于0.1μg的亚硝胺/mg尼古丁的尼古丁，以及生产所述尼古丁的方法和含有所述尼古丁的产品。

背景技术

吸烟制品(如卷烟、雪茄、烟斗等)和无烟烟草产品(如嚼烟、干的和湿的鼻烟等)是由天然烟草、再生烟草和其混合物制得的。天然烟草可能含有致癌的亚硝胺，以及其它的有害成分，如Pb、Hg、Cd等。这些成分在烟草的烘烤(curing)过程中形成，如烟草特有的亚硝胺(TSNA)和非烟草特有的亚硝胺。同样地，由天然烟草的副产品形成的再生烟草也可能含有亚硝胺。当用于鼻烟、嚼烟或由烟草制成的其它产品的时候，该亚硝胺会从烟草产品中转移到人体中。另外，由含有亚硝胺的烟草产品生产的吸烟产品也会含有亚硝胺，它们从烟草中转移来或者是高温合成(pyro-synthesize)的。这些物质已经被证明是对人有害的，主要是由于它们的致癌性质。关于去除烟草产品中的亚硝胺和TSNA已经进行了广泛的研究。

尽管这样试图去除烟草中的TSNA，但是现在仍存在需要减少烟草中亚硝胺(如TSNA)含量的改良方法。

无烟烟草(SLT)和口癌症联系起来已经有数十年。提出使用SLT对人体危害的流行病学研究主要由1957开始的进行了40年以上的病例对照(case-control)研究组成。在长期的SLT使用者中，一些化合物可能会促进癌症的发展。

WO 02/28209公开了一种将亚硝胺的含量从0.84mg/g干烟草降到40mμg/g溶液中的烟草，即不干的烟草(见实施例3)，或者从4mg/g干烟草到0.8mg/g(见实施例1)的方法。活性炭或沸石被用来减少亚硝胺的含量。

WO 02/087365公开了一种适合于人们消费的无烟产品，其中所述产品含有含量为0.3μg/g烟草以下的亚硝胺。这种烟草是由低TSNA含量的烟草植物制备的，即各种弗吉尼亚烟叶(flue)(见第6页)。

因此，需要开发能够生产降低致癌成分含量的尼古丁的新的方法，从而能够生产出只有少量如亚硝胺和重金属的致癌成分的新尼古丁以及新的烟草产品。

发明内容

本发明涉及一种新的方法及尼古丁和通过所述方法生产的尼古丁产品和含有所述尼古丁的产品，其中所述尼古丁至少降低了亚硝胺的含量。尼古丁含有少于0.1μg亚硝胺/mg尼古丁，该亚硝胺对消费所述尼古丁的人是有害的或者给尼古丁产品提供了很差的味道如苦涩的味道。

本发明还涉及怎样获得尼古丁的方法，其中所述方法包括以下步骤：提供含有尼古丁和纤维的烟草原料，从所述烟草原料中分离所述纤维，从所述烟草原料中提取尼古丁，获得尼古丁，其中所述尼古丁含有少于0.1μg亚硝胺/mg尼古丁。

通过种植烟草植物、收获植物原料以及提纯过程的独特组合，第一次可能提供降低的亚硝胺含量的更纯的尼古丁，该尼古丁对人类有害并给尼古丁产品提供了苦涩的味道且当用作尼古丁或烟草产品如瑞典湿鼻烟(Swedishsnus)时降低了着色。

具体实施方式

定义

在本申请和发明的上下文中，应用了以下定义：

术语“烟草”是指烟草植物或者是源自相同种类或不同种类以及转基因(GMO)的烟草植物的混合物的任何部分。烟草植物属于茄科和烟草属。烟草植物的例子是源自柳叶烟草(Nicotiana tabacum)和黄花烟草(Nicotianarustica)的那些烟草植物。这些部分的例子为叶、茎、根等，这些部分可通过如新鲜的、冷冻、深度冷冻、冷冻干燥和烘烤中的任何方法来获得。

术语“尼古丁产品”是指用于将尼古丁输送到人体的任何应用中的如吸入剂、片剂、胶囊、锭剂、口香糖、粘膜贴或皮肤贴、滴鼻剂、鼻腔喷剂和/或口腔喷剂、皮肤凝胶/霜剂或任何其它局部给药、直肠应用等的任何产品。

术语“烟草产品”是指用于将尼古丁输送到人体内的任何应用中的由烟草制得的或者含有烟草的任何产品，如鼻烟、口用的湿鼻烟或干鼻烟、嚼烟、烟斗丝、雪茄烟草或卷烟烟草、片剂、胶囊、锭剂、口香糖、粘膜贴或皮肤贴等。这个词也指任何这些无尼古丁的产品。

术语“烟草特有的亚硝胺”(TSNA)指许多亚硝胺，如N′-亚硝基降烟碱(N′-nitrosonornicotine)(NNN)、N′-亚硝基新烟草碱(N′-nitrosoanatabine)(NAT)、N′-亚硝基假木贼碱(N′-nitrosoanabasine)(NAB)和4-(N-甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N′-亚硝基降烟碱。

术语“烟草纤维”意指含有纤维素、纤维素纤维和/或淀粉的烟草植物的任何部分。

尼古丁

本发明还涉及与其它尼古丁相比具有改善性质的尼古丁，例如低的亚硝胺含量如亚硝胺含量少于0.1μg亚硝胺/mg尼古丁，如少于0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01μg/mg尼古丁或甚至少于0.01μg亚硝胺/mg尼古丁。实例是0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001μg亚硝胺/mg尼古丁或甚至更低，即该尼古丁可以基本上不含有亚硝胺。该亚硝胺可以是N′-亚硝基降烟碱(NNN)、N′-亚硝基新烟草碱(NAT)、N′-亚硝基假木贼碱(NAB)和4-(N-甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)，和4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone)。

因为这些产品是致癌的或对身体有其它伤害或者给与尼古丁产品苦涩的味道，因此减少以上提到的化合物将产生更健康的尼古丁和尼古丁产品。尼古丁可以基本上没有烟草纤维，即不可溶的纤维。该尼古丁可以通过如与有机酸形成盐来稳定。该酸的例子为磺酸。

所述尼古丁可以用于生产尼古丁产品及烟草产品。该尼古丁产品含有以上定义的尼古丁以及可接受的稀释剂、缓冲剂、载体或赋形剂，如药学上可接受的产品。“可接受的”指稀释剂、缓冲剂、载体或赋形剂在应用的剂量和浓度范围内不会在患者体内产生任何有害作用。这种可接受的缓冲剂、载体或赋形剂在本领域中是众所周知的(例如参见Remington’s PharmaceuticalSciences，第18版，A.R Gennaro，ED.，Mack Publishing Company(1990)和handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，A.Kibbe，Ed.，PharmaceuticalPress(2000))。载体的例子包括选自由交联的聚丙烯酸的离子交换树脂、苯乙烯、苯乙烯/二乙烯基苯(DVB)、交联的聚甲基丙烯酸、波拉克磷树脂(polacrilex)、环糊精、糊精、糖醇、聚乙二醇、淀粉、微晶纤维素、纤维素和纤维素衍生物、口香糖系、凝胶、藻酸盐、聚乙烯基吡咯烷酮或其衍生物、天然纤维或改性纤维和纤维如烟草纤维组成的组中的载体。

尼古丁产品中的尼古丁可以与辅料混合，并制成片剂或形成胶囊用于常规的给药，该辅料如乳糖、蔗糖、糖醇、淀粉粉末、微晶纤维素、聚乙二醇、微晶纤维素、纤维素和链烷酸的纤维素衍生物纤维素酯、硬脂酸、滑石、环糊精、糊精、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯胶、凝胶、藻酸盐、聚乙烯基吡咯烷酮、和/或聚乙烯醇。

可选择地，尼古丁可溶解在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇、油、黄蓍胶和/或各种缓冲剂中。其它的辅料和给药方式是药学领域中众所周知的。所述的载体或稀释剂可以包括控制释放材料，如单独的或与蜡混合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯、或本领域中众所周知的其它材料。

尼古丁产品可以进行常规的制药上的操作如杀菌，和/或可以含有例如本文中其它地方公开的常规辅料，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂、填充剂等。

本发明的尼古丁产品可以局部或全身给药，如局部地、静脉注射、口服和甚至直肠使用都是可能的。

尼古丁产品的例子为片剂、胶囊、锭剂、口香糖、粘膜贴或皮肤贴、滴鼻液、鼻腔喷剂或口腔喷剂。其它的例子是吸烟制品如卷烟、雪茄、细切的吸烟制品和无烟制品如鼻烟、口用的湿鼻烟或干鼻烟和嚼烟。

另外，尼古丁可以用于生产烟草产品，如含有以上定义的烟草尼古丁的烟草产品。尼古丁产品或烟草产品还可以含有选自由天然的、等同于天然的、合成的和半合成的添加剂组成的组中的一种或多种添加剂，例如薄荷醇、香柠檬油(bergamot)、桉树(eucalyptus)和咖啡，橙子、桔子、阿萨伊莓(acaiberry)、柑橘或其它水果香料，甘草等。而且，尼古丁产品或烟草产品还可以含有单糖如葡萄糖、果糖、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、甘露糖醇或甜味剂如糖精、糖精钠、环己基氨基磺酸盐(cyclamate)、Acesulfan K天冬甜素(aspartam)。此外，尼古丁产品或烟草产品还可以含有多糖，例如蔗糖、麦芽糖糊精、天然纤维，纤维素、淀粉或其它适合的填料、微晶纤维素(Avicel)；微晶纤维素、滑石及天然和等同于天然的香味剂和香料。3mg湿鼻烟(snus)份的典型配方为，烟草10-24％、纤维10-20％、聚右旋糖5-15％、氯化钠8％、碳酸氢钠7％、聚乙烯基吡咯烷酮3％、滑石2％、微晶纤维5-15％，适量的香料量。

烟草产品可以具有作为核心的烟草纤维材料，和例如通过将尼古丁和/或盐喷射到烟草纤维材料上的烟草尼古丁和/或被吸附在烟草纤维材料上或被吸收在烟草纤维材料中的盐。此外，为本领域中的技术人员所公知的，来自烟草中的尼古丁和/或纤维可以装入非织造材料中形成胶囊。

尼古丁产品或烟草产品可以配制成一种或多种配制品，如香袋、烟袋、条状包装(stick-pack)、颊脂垫或片剂或者压入咀嚼片剂、锭剂、瑞索瑞波里特(resoriblette)、或片剂中用来吸吮。然后将得到的产品装到密封的包装中，以防止由于尼古丁氧化和/或蒸发而损失。

用以下的时间间隔，在35分钟内进行生物体外分析，所述尼古丁产品或烟草产品可以具有释放分布。

5分钟后释放的尼古丁是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg。

10分钟后释放的尼古丁是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、1 0mg。

15分钟后释放的尼古丁是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg。

20分钟后释放的尼古丁是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg。

25分钟后释放的尼古丁是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg。

30分钟后释放的尼古丁是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg。

35分钟后释放的尼古丁是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg。

该释放分布可以关于通过制剂而释放的尼古丁的速度和量以及有害物质来设计。从尼古丁产品和烟草产品中释放的尼古丁可以被设计成以足够量和/或足够速度释放以能够有理想的效果，另一方面可以被设计为保留如亚硝胺的通常产生副作用的物质，和/或以实质上很低的量和/或以实质上很慢的速度来释放该物质。

在本发明的另一个实施方式中，与商购的湿鼻烟相比可以延迟释放发明的尼古丁，以模仿尼古丁取代产品如贴片的效果。所述释放分布可以为0.1-10mg/h。

可以设计尼古丁产品，使得当进行欧洲药典最新版本(the Europeanpharmacopoeia latest ed)中描述的释放测试时，最多在60分钟内释放了尼古丁总含量中的至少约50重量％。

可以设计本发明的尼古丁产品，使得当进行释放测试时，最多在120分钟内释放尼古丁总含量中的约至少50重量％。

吸取释放(extracted release)

在生物体外试验通常的释放，吸取释放是在使用烟草产品如鼻烟、湿鼻烟或尼古丁产品的过程中释放的量。平均吸取量是通过用过产品的单个的值或者平均值相对于十个“未用产品”的平均含量的的减少来计算的。

基于天然烟草和/或转基因烟草和/或烟草代用品和/或本发明的尼古丁，来自精制的尼古丁产品或烟草产品的尼古丁的稳定状态或者单一血浆浓度，烟草和/或烟草代用品和/或药产品可以优选具有与典型的相同的在人体内的计算吸取量；吸取量(mg)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg。基于天然烟草和/或转基因烟草和/或烟草代用品和/或本发明的尼古丁，来自精制的烟草产品的尼古丁的稳定状态或者单一血浆浓度，烟草和/或烟草代用品和/或药产品可以优选具有与典型的相同的在人体内的生物学参数；

Cmax(ng/ml)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更高，达到50ng/ml。AUC(小时x ng/ml)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更高，达到50小时x ng/ml。

尼古丁的pH值是否来自本发明的尼古丁产品或者烟草产品，可以以pH参数作为代表性的；

pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.8、8.9、9.0、9.1到10。

尼古丁可以通过如实施例中描述的任何一种的方法来生产。

生产所述烟草产品的方法

本发明还涉及生产尼古丁和以上所述的烟草产品的方法。将烟草插条以及种子种植在田地里，其中土壤具有低含量的重金属以确保重金属将不会积累在烟草植物中和之后从烟草植物中提纯尼古丁后不会存在于尼古丁中。将尼古丁从烟草中提取，如从烟草烤烟(Tobacco tabacum)中提取。烟草植物可以是转基因的植物，如其中亚硝胺的含量减少的转基因植物。烟草植物材料可以是植物的任何部位，例如根、茎或如叶子的叶片的叶。在耕地上或者温室中，有或没有肥料或者添加其它促进生长的成分，烟草植物都可以生长。肥料的选择依赖于田地中土壤的质量，且这是该本领域中技术人员所公知的。肥料的例子为有机肥料、NPK或尿素。在特定的具体实施方式中，所述植物材料是叶片，将其收获并通过在液氮和/或干冰和/或深冷冻容器和/或任何其它的技术中冷冻直接转移到0℃以下的温度，例如冷冻，这停止了植物内部的所有正在进行的过程，且因此减少并消除了亚硝胺的量在植物材料内部提高的可能。可选择地，烟草植物材料是没有任何可见黄色部分的绿色材料。该收获的植物材料还可以用其它方法来处理，只要抑制亚硝胺的产生即可。通过确保该植物材料不受压，与植物在任何压力下相比，亚硝胺将保持在更低的水平。

然后可以将所述收获的植物材料碾碎、切割、碾磨或切片并与水溶液混合，该水溶液中加入了如氢氧化钠(NaOH)或碳酸钙(CaCO₃，石灰石)或氢氧化钙(熟石灰)等含量为10重量％的碱和25％的水分。然后可以将该植物混合物加入如渗滤器或反应器的容器中，水可以通过该渗滤器使尼古丁能够从植物材料中提取出来。接下来将纤维从尼古丁液体(nicotinizedbroth)中除去并进一步加工该尼古丁液体以提纯其中的尼古丁。

可以将该尼古丁液体加入到，例如Amberlite^TM，如Amberlite^TM IPR64、或Sepharose Fast Flow(两者都可以从Sigma-Aldrich获得的)或由IonExchange(India)Ltd.提供的Indion 464的阳离子交换树脂中通过柱，由此尼古丁将结合到柱中。接着，通过使用酸如使用醋酸或磷酸可以将尼古丁从柱中释放。通过这种方法后，尼古丁会从植物纤维中释放/提取。通过使用阳离子柱，通过所述柱后得到的该尼古丁比没有使用阳离子柱的更纯。

所述方法产生了从烟草植物材料中分离尼古丁和纤维材料并去除和/或最小化在尼古丁及纤维材料中的某些化合物如致癌及苦涩味道成分的量的机会。所述植物材料可以受到一系列洗涤步骤，如碱洗涤和酸洗涤步骤以去除材料上和内部的不合适成分。洗涤步骤的例子是用NaOH和水或纯净水洗涤。

洗涤步骤取决于原材料，可以进行一次或几次。每步洗涤步骤后都可取出样品以跟踪对有害成分的洗涤效果，通过该洗涤步骤减少和/或消除有害成分。洗涤步骤的次数取决于烟草植物材料，且洗涤步骤的次数随着时间而变化。但是，本领域中的技术人员通过使用在实施例中表示的不同的测试方法，将知道需要获得本发明的烟草产品的经过多少次洗涤步骤。

通过本发明的方法获得的尼古丁与以上定义的尼古丁有相同的性质。

以下实施例的目的是清楚地或含蓄地以任何方式、式样或形式说明但不限制本发明。

实施例

实施例1

用阳离子交换树脂从深度冷冻的烟草叶中提纯尼古丁

第I步：收获和深度冷冻

采集来自烟草植物(＝“绿色烟草”)的新鲜烟草叶，并深度冷冻(-20℃)少于3小时。

第II步：混合和渗滤

将深度冷冻的烟草叶和10重量％的碳酸钙(CaCO₃，石灰石)或氢氧化钙(熟石灰)在机件钢的混合机(带型)中混合，加入水得到混合物的水分达到25％的湿度。将微湿的未加工的烟草混合物加入机件钢渗滤器中，即圆柱形的提取器。纯净水流过混合物得到尼古丁液体。

第III步：提取

将尼古丁液体即含有含水母液的尼古丁转移到装填在机件钢或者不锈钢的长柱中的中等强度的酸性阳离子交换树脂中，即Amberlite^TM IPR64(Rohm和Haas/Ion Exchange Resins，Philadephia，PA，USA或者由IonExchange(India)Ltd Tiecicon House，Dr.E.Moses Road，Mahalaxmi，Mumbai-400 011，India提供的Indion 464)。用纯净水洗涤尼古丁-尼古丁阳离子交换树脂复合物以除去杂质。

第IV步：分离

用1M的硫酸将尼古丁从阳离子交换树脂柱中洗脱出来。将尼古丁盐出来沉淀并从容器的底部收集。

第V步：过滤和提纯

将尼古丁盐过滤并通过不锈钢超速离心机(在8000rpm下至少6分钟)提纯以除去痕量水。

第VI步：测试

在过滤和提纯尼古丁生物碱后，测试亚硝胺的含量(TSNA，即NNN、NNK、NAT和NAB)。将结果列在下表001T批中。测试的每克干烟草中亚硝胺的总含量至少低于0.1微克。

因此，如本文所示，可以选择性地降低烟草中的亚硝胺的总含量。

第VII步：包装

在如氮气的惰性气体下将提纯的尼古丁装入环氧树脂涂覆的圆筒中，然后保存在凉爽干燥的地方。

实施例2

用有机溶剂从新鲜的叶中提取和提纯尼古丁并随后使用阳离子交换树脂分离。

第I步：混合

在机件钢的混合机(带型)中将来自烟草植物(＝“绿色烟草”)的新鲜的烟草叶和10重量％的碳酸钙(CaCO₃，石灰石)或者氢氧化钙(熟石灰)混合。加入水得到混合物的水分为25％湿度。

第II步：渗滤

将微湿的未加工的烟草混合物装入进机件钢渗滤器即圆柱形提取器中。纯净水渗流过混合物得到尼古丁液体。

第III步：提取

用与水不混溶的非极性溶剂在用于液液提取的机件钢或者不锈钢的长柱中对尼古丁液体即含有含水母液的尼古丁进行液-液提取。使用的几种溶剂包括乙酸乙酯、己烷、环己烷和庚烷。从而将尼古丁转移到有机溶剂中。留在柱底的液体基本上不含有尼古丁生物碱。液-液提取不仅能快速地分开并分离生物碱，而且有助于提纯，因为一些杂质不溶于有机溶剂。

第IV步：分离

用滴定法测量尼古丁在与水不混溶的有机非极性溶剂中的浓度。将十(10)ml溶剂与10ml 10当量浓度的H₂SO₄在烧杯中混合，然后用10当量浓度的NaOH溶液滴定，用酚酞(phenolpthalin)作为指示剂。得数将确定溶剂中尼古丁的量。得数越大溶解在溶剂中的尼古丁的量越多，在搅拌下将计算量的稀释硫酸水溶液加入到机件钢或不锈钢的反应器中以形成40％的硫酸尼古丁。40％的硫酸尼古丁是不溶的且比与水不混溶的有机非极性溶剂重，从容器的底部收集40％的硫酸尼古丁。

随后将40％的硫酸尼古丁溶解于纯净水中并转移到装在由机件钢或者不锈钢的长柱中的中等强度的酸性阳离子交换树脂中，即Amberlite^TM IPR64(Rohm和Haas/Ion Exchange Resin，Philadephia，PA，USA)或者由IonExchange(India)Ltd提供的Indion 464。用纯净水洗涤尼古丁-尼古丁阳离子交换树脂复合物以除去杂质。用1M的硫酸将尼古丁从阳离子交换树脂柱中洗脱出来。尼古丁盐沉淀出来并从容器的底部收集。

第V步：过滤和提纯

将尼古丁盐过滤并通过不锈钢超速离心机(在8000rpm下至少6分钟)提纯以除去痕量水。

第VI步：包装

将提纯的尼古丁装入环氧树脂涂覆的圆筒中，然后保存在凉爽干燥的地方。

第VII步：碱化

将40％的硫酸尼古丁装入到不锈钢反应器中，然后在缓慢搅拌下加入氢氧化钠。在碱化结束后，95％的尼古丁分离到上层并滗析出来。

第VIII步：尼古丁生物碱的提纯

用强碱(NaOH)水溶液再次洗涤尼古丁生物碱后用超速离心机分离，获得98％的纯尼古丁生物碱。

第IX步：尼古丁生物碱的蒸馏

在蒸馏设备(优选玻璃蒸馏设备或装有玻璃管道的蒸馏设备)中获得纯度为97-99.9％的尼古丁生物碱。在高真空度下(接近760mm)，杂质(水)在约70摄氏度下开始蒸馏。在蒸馏速度下降后(获得约4％的量后)，倒空接收烧瓶(优选更换接收烧瓶)以收集尼古丁生物碱。保持高真空度，尼古丁在约140-160摄氏度下开始蒸馏。在惰性气氛中将蒸馏的生物碱保存在玻璃容器或者不锈钢容器中。

第X步：测试

在蒸馏尼古丁生物碱后，测试亚硝胺的含量(TSNA，即NNN、NNK、NAT和NAB)。将结果列在下表002T批中。测试的每克干烟草中亚硝胺的总含量至少低于0.1微克。

因此，如本文所示，可以选择性地降低烟草中的亚硝胺的总含量。

第XI步：包装

在如氮气的惰性气体下将提纯的尼古丁装入环氧树脂涂覆的圆筒中，然后保存在凉爽干燥的地方。

实施例3

使用有机溶剂、阳离子交换树脂分离并随后蒸馏从深度冷冻的叶中提取和提纯尼古丁。

第I步：混合

收集来自烟草植物(＝“绿色烟草”)的烟草叶，然后深度冷冻(-20℃)小于3小时。

第II步：混合和渗滤

在机件钢的混合机(带型)中将深度冷冻的烟草叶和10重量％碳酸钙(CaCO₃，石灰石)或者氢氧化钙(熟石灰)混合。加入水得到混合物的水分达到25％湿度。将微湿的未加工的烟草混合物装入机件钢渗滤器即圆柱形提取器中。将纯净水流过混合物以获得尼古丁液体。

第III步：提取

用与水不混溶的有机非极性溶剂即乙酸乙酯或另一种上述提到的溶剂，在用于液液提取的机件钢或者不锈钢的长柱中，对尼古丁液体即含有含水母液的尼古丁进行液-液提取。从而将尼古丁转移到有机溶剂中。留在柱底的母液基本上不含有尼古丁生物碱。液-液提取不仅快速分开并分离生物碱，而且有助于提纯，因为一些杂质不溶于有机溶剂中。

第IV步：分离

用滴定法测量尼古丁在有机溶剂中的浓度。在搅拌情况下将计算量的稀释硫酸水溶液加入到机件钢或不锈钢的反应器中以形成40％的硫酸尼古丁。40％的硫酸尼古丁是不溶的并且比有机溶剂重，从容器的底部收集40％的硫酸尼古丁。

随后将40％的硫酸尼古丁溶解于纯净水中并转移到装在机件钢或者不锈钢的长柱中的中等强度的酸性阳离子交换树脂中，即Amberlite^TM IPR64(Rohm和Haas/Ion Exchange Resins，Philadephia，PA，USA)。用纯净水洗涤尼古丁-尼古丁阳离子交换树脂复合物以除去杂质。用1M的硫酸将尼古丁从阳离子交换树脂柱中洗脱出来。尼古丁盐沉淀出来并从容器的底部收集。

第V步：过滤和提纯

将尼古丁盐过滤并通过不锈钢超速离心机(在8000rpm下至少6分钟)提纯以除去痕量水。

第VI步：包装

将提纯的硫酸尼古丁装入环氧树脂涂覆的圆筒中，然后保存在凉爽干燥的地方。

第VII步：碱化

将提纯的硫酸尼古丁加入到不锈钢反应器中，然后在缓慢搅拌下加入氢氧化钠。在碱化结束后，95％的尼古丁分离到上层并滗析出来。

第VIII步：尼古丁生物碱的提纯

用强碱(NaOH)水溶液再次洗涤尼古丁生物碱后用超速离心机分离，获得98％的纯尼古丁生物碱。

第IX步：尼古丁生物碱的蒸馏

在蒸馏设备(优选玻璃蒸馏设备或装有玻璃管道的蒸馏设备)中获得纯度为97-99.9％的尼古丁生物碱。在高真空度下(接近760mm)，杂质(水)在约70摄氏度下开始蒸馏。在蒸馏速度下降后(获得约4％的量后)，倒空接收烧瓶(优选更换接收烧瓶)以收集尼古丁生物碱。保持高真空度，尼古丁在约140-160摄氏度下开始蒸馏。在惰性气氛中将蒸馏的尼古丁保存在玻璃容器或者不锈钢容器中。

第X步：测试

在蒸馏尼古丁生物碱后，测试亚硝胺的含量(TSNA，即NNN、NNK、NAT和NAB)。将结果列在下表003T批中。检试的每克干烟草中亚硝胺的总含量至少低于0.1微克。

因此，如本文所示，可以选择性地降低烟草中的亚硝胺的总含量。

第XI步：包装

在惰性气体下将提纯的尼古丁装入环氧树脂涂覆的圆筒中，然后保存在凉爽干燥的地方。

实施例4

使用与水不混溶的有机非极性溶剂、阳离子交换树脂并随后蒸馏从烟草粉尘中提取和提纯尼古丁。

第I步：混合

在机件钢的混合设备(带型)中混合烟草粉尘(柄、顶叶、茎、碎片和粉尘均是烟草废弃物)和10重量％碳酸钙(CaCO₃，石灰石)或者氢氧化钙(熟石灰)。加入水得到混合物的水分达到25％湿度。

第II步：渗滤

将微湿的未加工的烟草混合物装入机件钢渗滤器即圆柱形提取器中。将水流过混合物以获得尼古丁液体。

第III步：提取

用与水不混溶的有机非极性溶剂乙酸乙酯，在用于液液提取的机件钢或者不锈钢的长柱中对尼古丁液体即含有含水母液的尼古丁进行液-液提取。从而将尼古丁转移到与水不混溶的有机非极性溶剂中。留在柱底的液体基本上不含有尼古丁生物碱。液-液提取不仅快速地分开并分离生物碱，而且有助于提纯，因为一些杂质不溶于有机溶剂中。

第IV步：分离

用滴定法测量尼古丁在与水不混溶的有机非极性溶剂中的浓度。将十(10)ml溶剂与10ml 10当量浓度的H₂SO₄在烧杯中混合，然后用10当量浓度的NaOH溶液滴定，用酚酞作为指示剂。得数确定溶剂中尼古丁的量。得数越大溶解在溶剂中的尼古丁的量越多，在搅拌情况下将计算量的稀释硫酸水溶液加入到机件钢或不锈钢的反应容器中以形成40％的硫酸尼古丁。40％的硫酸尼古丁是不溶的并且比有机溶剂重，从容器的底部收集40％的硫酸尼古丁。

随后将40％的硫酸尼古丁溶解于纯净水中并转移到装在机件钢或者不锈钢的长柱中的中等强度的酸性阳离子交换树脂中，即Amberlite^TM IPR64(Rohm和Haas/Ion Exchange Resins，Philadephia，PA，USA)或者由IonExchange(India)Ltd.提供的Indion 464。用纯净水洗涤尼古丁-尼古丁阳离子交换树脂复合物以除去杂质。用1M的硫酸将尼古丁从阳离子交换树脂柱中洗脱出来。沉淀出的尼古丁盐的纯度为95％并从容器的底部收集这些尼古丁盐。

第V步：过滤和提纯

将纯度为95％的尼古丁盐过滤并通过不锈钢超速离心机(在转速为8000rpm下离心至少6分钟)提纯以分离悬浮的颗粒并除去痕量的与水不混溶的有机非极性溶剂。

第VI步：包装

在惰性气体如氮气下将提纯的硫酸尼古丁装入环氧树脂涂覆的圆筒中，然后保存在凉爽干燥的地方。

第VII步：碱化

将提纯的硫酸尼古丁装入到不锈钢反应器中，然后在缓慢搅拌下加入氢氧化钠。在碱化结束后，95-97％的尼古丁分离到上层并被滗析出来。

第VIII步：尼古丁生物碱的提纯

用强碱(NaOH)水溶液再次洗涤尼古丁生物碱后用超速离心机分离，获得97-98％的纯尼古丁生物碱。

第IX步：尼古丁生物碱的蒸馏

在蒸馏设备(优选玻璃蒸馏设备或装有玻璃管道的蒸馏设备)中获得纯度为97-99.9％的尼古丁生物碱。在高真空度下(接近760mm)，杂质(水)在约70摄氏度下开始蒸馏。在蒸馏速度下降后(获得约4％的量后)，倒空接收烧瓶(优选更换接收烧瓶)以收集尼古丁生物碱。保持高真空度，尼古丁在约140-160摄氏度下开始蒸馏。在惰性气氛中将蒸馏的生物碱保存在玻璃容器或者不锈钢容器中。

第X步：测试

在蒸馏尼古丁生物碱后，测试亚硝胺的含量(TSNA，即NNN、NNK、NAT和NAB)。将结果列在下表004T批中。测试的每克干烟草中亚硝胺的总含量至少低于0.1μg。因此，如本文所示，可以选择性地降低烟草中的亚硝胺的总含量。

第XI步：包装

在惰性气体如氮气下将提纯的尼古丁装入环氧树脂涂覆的圆筒中，然后保存在凉爽干燥的地方。

实施例5

精制含有纯化尼古丁的烟草

第I步：洗涤不溶性部分

在按照上述实施例1-4提取烟草粉尘(柄、顶叶、茎、碎片和粉尘均是烟草废弃物)、新鲜的或者深度冷冻的烟草叶后，分别通过用纯净水(酸性的、碱性的和中性的)洗涤5次并最后用乙醇洗涤30分钟对不溶性部分进行精制。

第II步：离心并干燥不溶性部分

将不溶性部分在每分钟8000转下离心至少6分钟以除去大部分的水。

第III步：离心并干燥不溶性部分

在离心后，将精制的纤维通过流化床干燥进行干燥，直到少于1％的湿度。

第IV步：通过浸渍再生烟草

在离心和流化床干燥后，将精制的纤维(湿)浸渍在按照实施例1-4制备的高纯度的尼古丁溶液中以获得纯化的烟草成品，该烟草成品中尼古丁的含量为0.5-10重量％。

第V步：烟草的测试

在提纯和浸渍后，测试烟草中的亚硝胺的含量(TSNA，即NNN、NNK、NAT和NAB)。每克干烟草中的亚硝胺的总含量至少低于0.1μg。因此，如本文所示，烟草中的亚硝胺的总含量可以选择性地降低而不显著地降低烟草中的其它成分的含量，如烃、淀粉和纤维素。见表1。

第VI步：包装

烟草产品可以制成一种或多种制剂，如香囊、烟草袋、条状包装、颊垫或者贴片或压成咀嚼片、锭剂、瑞索瑞波里特或片剂用于吸吮。将得到的产品密封包装以防止由于尼古丁的氧化或者蒸发而损失尼古丁。在存储未决定包装成何种消费者包装形式时烟草产品时，在惰性气体如氮气下将提纯的烟草以及由这些提纯的烟草配制的产品装入环氧树脂涂覆的圆筒中，然后保存在凉爽干燥的地方。

表1：由上述实施例的不同的方法制备的不同批次的烟草产品和一些天然来源的烟草中的一些杂质的总含量。烟草1-5表示天然来源的烟草。

a/从不同的供应商购买的烟草。

b/从耕种的、收获的、处理的和/或加工的得到。

c/从耕种的、收获的和处理的得到。

018是在提纯(A)前和提纯后测试的。

实施例6

尼古丁口香糖产品

为了获得1000g口香糖，将22克实施例1-4中获得尼古丁与口香糖预混合料混合，其中，所述口香糖预混合料由600克Dreyco Gum Base(LA.Dreyfus company，3775 Park Avenue，Edison，New Jersey，USA)或者Nicol 8(Gum Base Co，Via Nerviano，25，20020 Lainate，Milan，Italy)、205g山梨糖醇、20g木糖醇、55g滑石、40g碳酸氢钠、20g碳酸钠、3g天冬甜素、1g的丁磺氨钾、5g的薄荷醇和风味油组成。将尼古丁、风味剂、黄油和预融的胶基质在胶捏合机中混合。

在进行以下步骤后就获得了尼古丁口香糖：挤出、冷却、辊压、刻痕(scoring)、硬化和包装。

获得以下强度和纯度值：

口香糖成品的测试

尼古丁分析

尼古丁分析(最初的)	2.00-2.20mg/片
		尼古丁分析(存储6个月后)	1.8-2.20mg/片

杂质/降解产品

注意：载体是波拉克磷树脂、环糊精、淀粉、纤维素和纤维素衍生物，口香糖基质、凝胶、藻酸盐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和烟草以及其它纤维。

然后测试所述口香糖中的亚硝胺的含量(TSNA，即NNN、NNK、NAT和NAB)。每克干烟草中的亚硝胺的总含量至少低于0.1μg。

实施例7

鼻烟(湿鼻烟)烟草产品

将实施例5的烟草制备成纺织材料或者非纺织材料的部分鼻烟(湿鼻烟)烟草袋(香囊)中。将鼻烟(湿鼻烟)制成不同的浓度，例如每个烟草袋含有1、3和6mg。在制剂中，烟草中的尼古丁的量是不同的并且根据烟草批次的分析而变化。通常，将烟草与作为填料的赋形剂(糊精，例如聚糊精(polydextrin)、麦芽糊精、天然纤维、纤维素、淀粉或者其它合适的填料)、甜味剂(木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、糖精、糖精钠、环己基氨基磺酸盐、Acesulfan K)和助剂以增加絮体(floe)特性(微晶纤维素、微晶体纤维素和滑石)和天然的和天然等同的香味和风味。对于一份3mg的湿鼻烟的典型的制剂，其含有10-24％的烟草、10-20％的纤维、5-15％的聚糊精、8％的氯化钠、7％的碳酸氢钠、3％的聚乙烯吡咯烷酮、2％的滑石、5-15％的微晶纤维素和适量的风味剂。

将如香囊、烟草袋和条状包装的烟草产品密封包装以防止由于尼古丁的氧化和/或蒸发导致的损失。

实施例8

烟草口香糖产品

通过混合含有15g的甘油和15g的磨碎的烟草(实施例5)的预混合料和实施例7中的口香糖预混合料制备烟草口香糖(1000g)，其中，所述口香糖预混合料由600g Dreyco Gum Base(L.A.Dreyfus company，3775 Park Avenue，Edison，New Jersey，USA)或者Nicol 8(Gum Base Co，Via Nerviano，25，20020Lainate，Milan，Italy)、205g山梨糖醇、20g木糖醇、55g滑石、50g碳酸氢钠、3g天冬甜素、1g的丁磺氨钾、5g的薄荷醇和风味油组成。

将烟草、风味剂、黄油和预融的树胶基质在胶捏合机中混合。

在进行以下制备步骤后就获得了烟草口香糖：挤出、冷却、辊压、刻痕、硬化和包装。

烟草口香糖：

尼古丁分析(最初的)         2.00-2.20mg/片

尼古丁分析(存储6个月后)    1.8-2.20mg/片

然后测试所述烟草口香糖中的亚硝胺的含量(TSNA，即NNN、NNK、NAT和NAB)。用气相色谱系统LC-MS-MS分析亚硝胺。每克干烟草中的亚硝胺的总含量至少低于0.1μg。

实施例9

分析亚硝胺

用公开在J Chromatogr A.2003年8月8日，1008(2)：135-43，Jansson等人Analysis of tobacco-specific N-nitrosamines in snuff by ethyl acetate extractionand liquid chromatography-tandem mass spectrometry中的方法分析亚硝胺。已经开发出一种快速、选择性和灵敏的方法进行常规分析鼻烟中的四种烟草特有的N-亚硝胺，即N’-亚硝基降烟碱、N’-亚硝基新烟草碱、N’-亚硝基假木贼碱和4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-l-丁酮。用乙酸乙酯提取来分离亚硝胺并LC-MS-MS分析。在提议的方法中，除了采用蒸发和过滤外，不需要其它的附加的洗涤步骤。在溶剂中的测试极限标准为0.0005-0.001mg/ml(0.005-0.01mg/g)。

实施例10

颜色指数的测试

将烟草分散并培育30分钟后过滤，测试上清液的颜色指数。按照改进的欧洲药典方法进行测试。

在测试尼古丁产品和/或烟草产品的颜色时，引进可见颜色指数-VCI(Visual Color Index-VCI)。

将含有精制烟草产品的烟草袋置于由透明的玻璃制备的测试管中的水中，其中，所述测试管装备有或没有装备搅拌器。可见颜色指数表示如下。

	VCI		VCI		VCI
						透明溶液	1	非乳白色的	1	无颗粒	1
稍亮褐色溶液	2	趋向于乳白色	2	一些颗粒	2
						亮褐色溶液	3	稍微乳白色	3	颗粒	3
褐色溶液	4	乳白色	4	导致趋向于沉淀物的颗粒	4
						暗褐色溶液	5	白乳白色	5	导致沉淀物的颗粒	5
深暗褐色溶液	6	白乳白色，不透明	6	导致清晰沉淀物的颗粒	6

测试精制的烟草和从任何普通商店购买的普通的瑞典湿鼻烟的可见颜色指数，测试得到以下VCI指数；

结果，总计每一时间点的数值。

分钟	本发明的烟草	VCI	普通的“湿鼻烟”品牌	VCI
					0	透明溶液、非乳白色、无颗粒	3	透明溶液、非乳白色、无颗粒	3
1	透明溶液、非乳白色、无颗粒	3	稍亮褐色溶液、非乳白色、一些颗粒	4
					2	透明溶液、非乳白色、无颗粒	3	亮褐色溶液、非乳白色、一些颗粒	5
5	透明溶液、趋于乳白色、无颗粒	3	褐色溶液、非乳白色、颗粒	8
					10	透明溶液、趋于乳白色、无颗粒	3	暗褐色溶液、非乳白色、导致沉淀物的颗粒	11
20	透明溶液、趋于乳白色、无颗粒	3	深暗褐色溶液、乳白色、导致沉淀物的颗粒	16

上述颜色指数表示产品不易于着色牙齿并且烟草的气味很小。

Claims (13)

1、一种尼古丁，该尼古丁含有少于0.1μg的亚硝胺/mg尼古丁。

2、根据权利要求1所述的尼古丁，其中，所述亚硝胺的含量少于0.05μg/mg尼古丁。

3、根据权利要求1所述的尼古丁，其中，所述亚硝胺的含量少于0.02μg/mg尼古丁。

4、根据前述权利要求中的任意一项所述的尼古丁，其中，所述亚硝胺的含量少于0.01μg/mg尼古丁。

5、根据前述权利要求中的任意一项所述的尼古丁，其中，所述亚硝胺至少为N’-亚硝基降烟碱、N’-亚硝基新烟草碱、N’-亚硝基假木贼碱、4-(N-甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮和4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮。

6、一种制备烟草产品的方法，该方法包括以下步骤：

a、提供含有尼古丁和纤维的烟草原料；

b、从所述烟草原料中分离所述纤维；

c、从所述烟草原料中提取尼古丁；和

d、获得尼古丁，其中，所述尼古丁含有少于0.1μg的亚硝胺/mg尼古丁。

7、根据权利要求6所述的方法，其中，步骤a)中的所述烟草原料为绿色的烟草植物原料。

8、根据权利要求7所述的方法，其中，所述烟草原料为叶原料。

9、根据权利要求6-7中的任意一项所述的方法，其中，步骤a)中所述烟草原料被保存在0℃以下的温度下。

10、根据权利要求8所述的方法，其中，所述烟草原料被冷冻在液氮中。

11、根据权利要求6-10中的任意一项所述的方法，其中，步骤c)中的所述提取是通过使用阳离子交换树脂进行的。

12、根据权利要求11所述的方法，其中，所述阳离子交换树脂是Amberlite^TM或Sepharose Fast Flow^TM或Indion 464^TM。

13、根据权利要求12所述的方法，其中，所述Amberlite^TM是Amberlite^TMIPR64。