CN101351706A - 用于监测水解活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及测定水解试剂的活性的方法，包括：在存在一种荧光染料的条件下使一种生物分子与一种水解试剂接触，并处于可使所述水解试剂能够消化所述生物分子的条件下。随时间监测所述染料的荧光，荧光的变化指示所述水解试剂对所述生物分子的消化。所述生物分子优选是蛋白质、肽或蛋白质组，但也可以是碳水化合物、寡核苷酸或脂质。还涉及确定水解试剂消化生物分子的终点的方法，以及监测水解试剂消化生物分子的方法。可以实时地或通过取样进行对所述反应混合物的监测。本发明还涉及实现所述方法的试剂盒。

Description

用于监测水解活性的方法
技术领域
本发明涉及监测水解酶的活性的方法和监测生物大分子水解消化的方法。具体而言，本发明是关于使用荧光染料监测蛋白质和/或肽消化或者蛋白酶活性的方法。
背景技术
水解酶对许多生物过程是必需的，所述生物过程包括凋亡、细胞分化、骨再造、凝血、疾病状态、癌侵袭、细胞信号传导和多种病原性生物的感染周期等等。利用具有各种底物特异性的大量已知水解酶已经开发了许多测定法，由于这些测定法需要不同的特异性底物，因而不能简便地对它们进行相互的比较。
通常，例如对于蛋白酶类，这些测定法是基于蛋白酶底物的肽类似物，所述肽类似物通过水解键断裂后出现的分光光度变化(吸收或荧光)而被连续地监测(例如WO 2003/089663及其参考文献)。该方法可以被应用于探索一级序列的特异性、测量特定水解酶的活性以及应用于推定抑制剂的分析，但是不能应用于比较不同蛋白酶的活性，原因是底物的选择是有限的而且可用的底物仅适用于几种蛋白酶。另外，例如酪蛋白或BSA等常用底物蛋白质可以被荧光团强烈标记，并且猝灭的减少可被用作蛋白酶活性的量度(例如Jones，et al.Analytical Biochemistry(1997)251(2)，144-152)。然而，所述底物被不均匀标记并且形成的肽被不确定地标记，这使得无法进行后续的肽分析来探索序列特异性。蛋白的物理标记也会影响蛋白酶消化该蛋白的能力。
Spencer et al.(Anal.Biochem.(1975)64，556-566)已经报道了一种跟踪某些蛋白酶对含疏水口袋的完整蛋白质底物(例如BSA、α-酪蛋白、脲酶和过氧化氢酶)的水解活性的方法，这种跟踪方法通过从所述口袋中释放荧光团即1-苯胺基-8-萘磺酸盐来实现。然而，这种方法不具有普适性；仅仅适用于含有疏水口袋的蛋白质。
现有技术包含的方法需要形成染料标记的蛋白酶底物。然而，这些方法会影响所述底物，因为所述标记在性质上通常是非蛋白质的并且常常体积较大，所以它们作为所述蛋白酶天然底物的合理模型的有效性受到质疑。无染料的方法包括电泳、HPLC和质谱法。然而，这些方法很费力，不适合于实时测量，并且也难以提取动力学数据。
而且，用多种蛋白酶进行蛋白水解消化通常是蛋白组学中蛋白质鉴定技术的第一步，并且是重要的一步。
DNA的水解已经可以通过DNA结合染料的置换进行测定，所述染料例如PicoGreen(Tolun，et al.，Nucleic Acids Research(2003)31(18)，e111/1-e111/6)或溴化乙锭(例如Ferrari et al.，Nucleic Acids Research(2002)30(20)，e112/1-e112/9)。这些方法不是基于荧光标记的底物，而是基于DNA普遍的结构，该结构使得可以通过DNA小沟中或嵌入位点处的染料的置换实时监测核酸酶或螺旋酶的活性。如果能够为其他的水解酶(例如蛋白酶、酯酶、糖基化酶、磷酸酶等)开发这种类型的测定法将是有利的。
因此，亟需用于测定水解酶活性的快速并且简便的实时测试法，所述方法是定量的并且可进行例如不同蛋白酶(具有彼此独立的底物)的比较。蛋白组学上甚至有更大的需求，它需要测定水解酶活性以使得可对生成的片段进行质谱法或HPLC分析。因此，也需要新的和多用途的方法来监测蛋白质或肽的消化过程，其中产生的肽和其他片段能够被用于进一步的下游分析。
因此，本发明的目标是克服或改进现有技术的至少一个缺点，或者是提供另外的有效方案。
发明内容
根据第一方面，本发明提供一种测定水解试剂的活性的方法，包括：
步骤1：在存在一种荧光染料的条件下使一种生物分子与一种水解试剂接触，并处于使所述水解试剂能够消化所述生物分子的条件下；以及
步骤2：随时间监测所述染料的荧光，
其中荧光随时间的变化指示所述水解试剂对所述生物分子的消化。
所述生物分子可以是任何生物大分子。然而，所述生物大分子优选为蛋白质、肽或蛋白质组(proteome)。所述变化可以是荧光的增加或减少。
根据第二方面，本发明提供一种监测水解试剂对生物分子的消化的方法，包括：
步骤1：在存在一种荧光染料的条件下使一种生物分子与一种水解试剂接触，并处于使所述水解试剂能够消化所述生物分子的条件下；以及
步骤2：随时间监测所述染料的荧光，
其中荧光随时间的变化指示所述水解试剂对所述生物分子的消化。
根据第三方面，本发明提供一种确定水解试剂对生物分子消化的终点的方法，包括：
步骤1：在存在一种荧光染料的条件下使一种生物分子与一种水解试剂接触，并处于使所述水解试剂能够消化所述生物分子的条件下；和
步骤2：随时间监测所述染料的荧光变化，
其中荧光不再变化时即表示所述生物分子的消化终点。
根据第四方面，本发明提供一种监测水解试剂对生物分子的消化的方法，包括：
步骤1：使一种生物分子与一种水解试剂接触形成反应混合物，
步骤2：使所述反应混合物的第一样品与一种荧光染料接触并测定第一样品的荧光，
步骤3：使步骤1的反应混合物处于使所述水解试剂能够消化所述生物分子的条件下，并且
步骤4：在所述生物分子的消化过程的所需时间点，使所述反应混合物的第二样品与一种荧光染料接触；以及
步骤5：测定所述第二样品的荧光，
其中所述第二样品的荧光相对于所述第一样品的荧光的变化，指示所述水解试剂对所述生物分子的消化的程度。
上述方法的一个实施方案考虑了在消化过程中定期对所述反应混合物取样，并且在每个样品中加入荧光染料之后测定荧光随时间的变化，直至观察到的荧光不再减少。所述方法的变化方案可以被应用于确定生物大分子消化的终点。随时间测定荧光可以有利于提供表示反应速率常数的数据。在测量之前，该亚取样(sub-sampled)的反应混合物被适当地猝灭。
根据第五方面，本发明提供一种用于前述任一方面的方法中的荧光染料或其组合物。
根据第六方面，本发明提供一种用于前述权利要求任一项的方法中的试剂盒，包括：荧光染料、一种或多种水解试剂、以及任选地包括所述水解试剂的标准底物，以及关于如何使用所述试剂盒监测生物大分子的消化的说明书。
优选地，所述试剂盒包含一种标准的蛋白质或肽底物，或者任何其他的生物学标准物。
优选地，所述试剂盒包含适合于所述酶的标准缓冲剂。优选的缓冲剂包括Good缓冲剂(Good’s buffer)的一种，例如N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、BES等。
任何可水解的生物分子可以被应用于本发明中。
所述生物分子可以是任何大小/分子量的，但优选是大分子。所述大分子最优选是碳水化合物、脂质、肽/蛋白质、蛋白质组、磷蛋白、糖蛋白或寡核苷酸。
技术人员应知晓，在本发明的上下文中，术语“生物分子”包括天然存在的分子以及合成的分子，其中所述合成的分子可以包含与天然存在的分子相似的部分；或者它们的类似物、同源物、衍生物或修饰物(其中所述修饰物可以通过/用生物途径或者通过合成途径制备)。
本发明的生物分子一般是两个或多个氨基酸形成的氨基酸寡聚物/多聚物，即任意大小的肽、多肽或蛋白质；两个或多个核酸形成的寡聚物/多聚物，即DNA(包括cDNA、gDNA和任何非编码DNA)或RNA(包括mRNA、tRNA、RNAi、siRNA或任何非编码RNA等)；或者脂质或其部分中发现的寡聚物/多聚物。
技术人员应知晓，本发明还涉及生物分子的混合物。
可以使用任何的可水解的生物大分子。然而，所述生物大分子优选是碳水化合物、寡核苷酸、蛋白质、肽、脂质或者它们的混合物。所述生物分子可以存在于基因组、蛋白质组或细胞提取物中。
另外，优选的生物大分子是能够被水解试剂切割或消化的蛋白质、肽或蛋白质组。
优选地，所述底物具有提高的疏水性。任何提供这种提高的疏水性的方法都是合适的。然而，蛋白质变性剂(在优选的实施方案中为洗涤剂)以非变性的量使用以提高蛋白质疏水性，从而增加或改变所述荧光染料的结合。这些洗涤剂包括但不限于SDS、LDS、曲拉通X-100(triton X-100)、CHAPS、ALS、CTAB、DDAO、DOC等。
优选地，所述疏水试剂改变所述生物分子的疏水性。
在本说明书中，应认为所述术语一种或多种蛋白质还包括重组蛋白质。所述蛋白质或肽可以存在于一种复杂的蛋白质/肽混合物中，例如存在于整个蛋白质组中。
所述水解试剂优选是酶，并且更优选是蛋白水解的试剂，例如能够在至少一个位置切割生物分子的蛋白酶、酯酶、糖基化酶、磷酸酶或核酸酶。能够在本发明中使用的水解酶的非限制性实例有：羧酸酯水解酶、硫酯水解酶、磷酸单酯水解酶、磷酸二酯水解酶、三磷酸单酯水解酶、硫酸酯水解酶、二磷酸单酯水解酶、磷酸三酯水解酶、产生5’-磷酸单酯的脱氧核糖核酸外切酶(exodeoxyribonuclease)、产生5’-磷酸单酯的核糖核酸外切酶(exoribonuclease)、产生3’-磷酸单酯的核糖核酸外切酶、对核糖核酸或脱氧核糖核酸有活性的外切核酸酶、对核糖核酸或脱氧核糖核酸有活性的外切核酸酶、产生5’-磷酸单酯的脱氧核糖核酸内切酶(endodeoxyribonuclease)、产生非5’-磷酸单酯的脱氧核糖核酸内切酶、对改变的碱基具有特异性的位点特异性脱氧核糖核酸内切酶、产生5’-磷酸单酯的核糖核酸内切酶、产生非5’-磷酸单酯的核糖核酸内切酶、对核糖核酸或脱氧核糖核酸有活性的核糖核酸内切酶、对核糖核酸或脱氧核糖核酸有活性的核糖核酸内切酶、糖苷酶(即水解O-糖基和S-糖基的酶)、水解N-糖基化合物的酶、硫醚和三烷基锍水解酶(trialkylsulfonium hydrolase)、醚水解酶、氨肽酶、二肽酶、二肽基肽酶和三肽基肽酶、肽基二肽酶、丝氨酸型羧肽酶、金属羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、ω肽酶、丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸内肽酶、金属内肽酶、苏氨酸内肽酶。
优选的荧光染料应与蛋白质或肽疏水性地结合或相互作用。在一个实施方案中，所述荧光染料是SYTOX绿。在另一个实施方案中，所述荧光染料是Hoechst 33342。在另一个实施方案中，所述荧光染料是碘化丙啶(propidiumiodide)。在另一个实施方案中，所述荧光染料是ANS。在另一个实施方案中，所述荧光染料是epicocconone。在另一个实施方案中，所述荧光染料是尼罗红。在另一个实施方案中，所述荧光染料是BODIPY FL C5神经酰胺(BODIPY FLC5 ceramide)。在另一个实施方案中，所述荧光染料是5-十八酰基氨基荧光素。在另一个实施方案中，所述荧光染料是SYPRO橙。在另一个实施方案中，所述荧光染料是花青染料(cyanine dye)。在另一个实施方案中，所述荧光染料选自于laurdan/prodan家族染料。在另一个实施方案中，所述荧光染料是dapoxyl衍生物。在另一个实施方案中，所述荧光染料是芘染料(pyrenedye)。在另一个实施方案中，所述荧光染料是二苯己三烯衍生物。在另一个实施方案中，所述荧光染料是罗丹明衍生物。在另一个实施方案中，所述荧光染料是香豆素衍生物。但是，根据本文的教导，显然任何疏水活性染料(hydrophibicly active dye)在本发明的方法中都是有用的。有用染料的实例有花青染料、laurdan/prodan家族染料、dapoxyl衍生物、芘染料、二苯己三烯衍生物ANS及其类似物、苯乙烯染料(styryl dye)、尼罗红、两亲荧光素、罗丹明和香豆素，或者在对其环境亲脂性作出显著改变其荧光行为的反应(疏水活性)的任何其他荧光团。而且，根据本文的教导，可清楚地知晓衍生生物分子的酶，例如改变蛋白质疏水性的转移酶(例如甲基转移酶；羧甲基-、甲酰基-及相关的转移酶；羧基转移酶和氨甲酰基转移酶；脒基转移酶；转酮醇酶(transketolase)和转醛醇酶(transaldolase)；酰基转移酶；糖基转移酶、己糖基转移酶、戊糖基转移酶、转移其他糖基的酶；转移烷基或芳基的酶；转氨酶(氨基转移酶)；肟基转移酶(oximinotransferase)；例如蛋白激酶等转移含磷基团的酶；硫转移酶；磺基转移酶；CoA转移酶；和硒基转移酶(selenotransferase))，能够与所述的染料相互作用从而可以实时监测转移酶活性。
优选地，所述荧光染料对其环境的亲脂性的反应是其荧光行为显著改变。优选地，所述生物分子的水解基本上不受所述荧光染料的影响。
在本发明的上下文中，术语“epicocconone及相关染料”意欲包括epicocconone本身以及如WO 2004/085546中具体公开的相关荧光染料，该文献内容通过引用的方式全文纳入本文。
根据第七方面，本发明提供一种用于测定和/或检测水解消化反应的产物的方法，包括：
步骤1：对一种生物分子进行水解消化以获得蛋白质或肽片段，
步骤2：使所述蛋白质或肽片段与一种荧光染料接触，以及
步骤3：检测所述染料的荧光变化，
其中所述的染料荧光变化与所述蛋白质或肽片段的量成比例。
根据前述权利要求任一项的方法，其中所述生物分子是生物大分子。
优选在一种缓冲剂存在时进行所述水解，例如一种Good缓冲剂或一种N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲剂。
优选随时间测量荧光以提供表示反应速率系数的数据。优选在达到终点时终止所述消化，并且在消化终止以后进一步分析所述反应混合物。所述进一步的分析可以选自于肽质量指纹谱法(peptide mass finger printing)(PMF)、肽谱法和HPLC。
在其他的实施方案中，可以在所述荧光染料中加入碱。
在另外的实施方案中，所述生物分子来自于生物样品或食品样品。所述生物分子可以是蛋白质或蛋白质混合物。所述生物分子优选是碳水化合物或碳水化合物混合物。所述生物分子优选是糖蛋白或淀粉。所述生物分子优选是脂质。所述生物分子优选是植物油。所述生物分子优选是寡核苷酸。所述生物分子优选是DNA。
所述试剂盒也可以包含选自于以下的标准蛋白或肽底物：BSA、脱铁运铁蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、碳酸酐酶、胎球蛋白、鲑鱼精DNA、可溶淀粉和橄榄油。
附图说明
下文将仅通过示例的方式并参照附图描述本发明的优选实施方案：
图1.使用epicocconone(λex 540±10nm，λem630±10nm)作为报告染料，PNGase F对胎球蛋白去糖基化的实时监测的动力学(A)，以及通过SDS-PAGE验证所述消化(B)。对带荧光团的仅所述糖蛋白(空心方块)进行二相指数式缔合/解离模型(Y＝Y最大*exp(1-k1X)+跨距*exp(-k2X)+平台)拟合，并且确定的k1和k2值作为k1和k2的固定值被应用于酶PNGase F对胎球蛋白的酶水解(空心圆)的三相指数式缔合/解离方程(Y＝跨距1*exp(1-k1X)+跨距2*exp(-k2X)+跨距3*exp(1-k3X)+平台)中。插图显示水解的导出动力学常数和半衰期。B表示天然(2道)和去糖基化的胎球蛋白(3道)的SDS-PAGE验证：1道表示LMW标记物(97、66、45、30、20.1和14.4kDa)，4道只是酶PNGase F(48.4kDa)。
图2.DNA酶1对鲑鱼精双链DNA的水解的实时监测的动力学，使用Hoechst 33342(λex355nm，λem460nm)(A)、SYTOX-绿(λex485nm，λem520nm)(B)和碘化丙啶(λex540±10nm，λem630±10nm)(C)作为报告染料。对使用染料的DNA的荧光数据(空心方块)和使用DNA酶和染料的DNA的荧光数据(空心圆)进行进程曲线拟合。对于每种情况，对带荧光团的所述蛋白质进行单相指数式衰减(Y＝跨距*exp(-kX)+平台)拟合，并且k的值作为k1的固定值被应用于DNA加DNA酶的二相指数式衰减中(Y＝跨距1*exp(-k1X)+跨距2*exp(-k2X)+平台)。插图示出水解的准一级(pseudo-first order)动力学常数和半衰期。D表示对使用Hoechst 33342(2道和3道)、SYTOX-绿(4道和5道)和碘化丙啶(6道和7道)的DNA样品水解进行的基于DNA凝胶电泳的验证：1道和8道表示SPP1 DNA分子量标记物。
图3.使用epicocconone(λex540±10nm，λem630±10nm)作为报告染料，α-淀粉酶水解淀粉实时监测的动力学。A为淀粉酶与淀粉混合后epicocconone的荧光减少，B中加入了曲拉通X-100(0.02％)洗涤剂。对于每种情况，对所述带荧光团的蛋白质(空心方块)进行单相指数式衰减(Y＝跨距*exp(-kX)+平台)拟合，并且k的值作为k1的固定值被应用于淀粉加淀粉酶(空心圆)的二相指数式衰减中(Y＝跨距1*exp(-k1X)+跨距2*exp(-k2X)+平台)。插图示出水解的准一级动力学常数和半衰期。
图4.使用BODIPYC5神经酰胺(λex 485nm，λem520nm)作为报告染料，碱性磷酸酶对β-酪蛋白(β-CN)去磷酸化的实时监测动力学。对带荧光团的仅所述磷蛋白(空心方块)进行单相指数式递增(Y＝跨距*exp(1-kX)+平台)拟合，并且确定的k值作为k1的固定值被应用于磷酸酶对所述磷蛋白的酶水解(空心圆)的二相指数式递增(Y＝跨距1*exp(1-k1X)+跨距2*exp(1-k2X)+平台)中。插图示出碱性磷酸酶水解β-酪蛋白的导出动力学常数和半衰期。
图5.使用5-十八酰基氨基荧光素(λex 485nm，λem520nm)作为报告染料，脂肪酶(0.01μL，
Figure A20068004971200132
)对橄榄油水解的实时监测动力学。方块是不使用酶的橄榄油的实时数据，圆圈是加入脂肪酶的橄榄油。对带荧光团的仅橄榄油(空心方块)进行单相指数式衰减(Y＝跨距*exp(-kX)+平台)拟合，并且确定的k值作为k1的固定值被应用于脂肪酶对所述油酶水解(空心圆)的二相指数式衰减中(Y＝跨距1*exp(-k1X)+跨距2*exp(-k2X)+平台)。插图示出水解的导出动力学常数和半衰期。
图6.使用荧光团epicocconone(λex 540±10nm，λem630±10nm)作为报告染料跟踪非特异性蛋白酶(木瓜蛋白酶)消化四种不同蛋白质的实时监测实例。对于每种情况，对带荧光团的所述蛋白质(空心方块)进行单相指数式衰减(Y＝跨距*exp(-kX)+平台)拟合，并且k的值作为k1的固定值被应用于蛋白质加木瓜蛋白酶(空心圆)的二相指数式衰减(Y＝跨距1*exp(-k1X)+跨距2*exp(-k2X)+平台)中。BSA(A)、酪蛋白(B)、脱铁运铁蛋白(C)和碳酸酐酶(D)作为示例被示出。插图示出消化的准一级动力学常数和半衰期。E表示使用木瓜蛋白酶消化不同蛋白的SDS-PAGE验证：1道，LMW标记物(97、66、45、30、20.1和14.4kDa)；2道，BSA；3道，BSA/木瓜蛋白酶；4道，α-酪蛋白；5道，酪蛋白/木瓜蛋白酶；6道，脱铁运铁蛋白；7道，脱铁运铁蛋白/木瓜蛋白酶；8道，碳酸酐酶(牛)；9道，碳酸酐酶/木瓜蛋白酶；10道，仅未瓜蛋白酶。
图7.本实例显示使用多种荧光团监测蛋白酶对BSA的水解。使用SYPRO橙(A)、尼罗红(B)和epicocconone(C)实时监测胰蛋白酶的蛋白酶解，并且使用ANS实时监测木瓜蛋白酶的蛋白酶解(D)。对于每种情况，对带荧光团的仅所述蛋白质(空心方块)进行单相指数式衰减(Y＝跨距*exp(-kX)+平台)拟合，并且确定的k值作为k1的固定值被应用于蛋白质加蛋白酶(空心方块)的二相指数式衰减(Y＝跨距1*exp(-k1X)+跨距2*exp(-k2X)+平台)中。每幅图的插图示出水解的导出动力学常数和半衰期。E表示使用不同荧光团进行的胰蛋白酶(2-7道)和木瓜蛋白酶(8-9道)的BSA蛋白酶解的SDS-PAGE验证：2和3道，SYPRO橙；4和5道，尼罗红；6和7道，epicocconone；8和9道，ANS。1道代表LMW标记物(从上至下为97、66、45、30、20.1和14.4kDa)。
图8.在无报告染料的情况下进行牛血清白蛋白(BSA；空心圆)和碳酸酐酶(CA；倒三角)的胰蛋白酶消化。在标定时间点对每个反应亚取样，并且在加入报告染料(epicocconone)和读取荧光之前用亮肽素(leupeptin)(A)或大豆胰蛋白酶抑制剂(B)猝灭胰蛋白酶活性。插图示出消化的表观一级速率常数，该常数是通过将所述数据用单相指数式衰减拟合计算得出。
图9.使用荧光报告染料(epicocconone；λex 540±10nm，λem630±10nm)的、水解酶(胰蛋白酶)对复杂的蛋白质组(酵母)进行胰蛋白酶消化的实时监测动力学。对带荧光团的仅所述糖蛋白(空心方块)进行二相指数式缔合/解离模型(Y＝Y最大*exp(1-k1X)+跨距*exp(-k2X)+平台)拟合，并且确定的k1和k2值作为k1和k2的固定值被应用于酶即胰蛋白酶F对酵母蛋白质组进行酶水解(空心圆)的三相指数式缔合/解离方程(Y＝跨距1*exp(1-k1X)+跨距2*exp(-k2X)+跨距3*exp(1-k3X)+平台)中。插图示出水解的导出动力学常数和半衰期。通过残差显示蛋白质组加染料(空心方块)和蛋白质组加水解酶和染料(空心圆)的拟合优度。
图10.使用epicocconone作为报告染料，在存在和不存在非变性量的洗涤剂(SDS)时碳酸酐酶(CA)的胰蛋白酶消化的实时监测。CA加SDS但无胰蛋白酶(空心方块)显示出荧光的慢衰减，而存在胰蛋白酶(空心圆)时显示出荧光的指数式衰减。不存在SDS时信号很低(倒三角)，这是由于CA周围的疏水性减少。
图11.N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(蓝色)、胰蛋白酶(黄色)、牛血清白蛋白(红紫色)和胰蛋白酶消化的BSA(蓝绿色)的荧光变化的原始数据。
图12.来自0-128分钟的亚取样BSA胰蛋白酶消化液(含有epicocconone)的凝胶电泳(A)，电泳前用凝胶加样缓冲液在85℃下猝灭。包含除胰蛋白酶之外所有组分的对照凝胶(B)在128分钟内没有显示出变化。用Deep Purple总蛋白质染色剂(Deep Purple Total Protein Stain)对凝胶染色。首道显示LMW标记物，末道显示过夜孵育产物。
图13.从图12中显示的亚取样样品的选通区域(gated region)测定的总荧光强度。
图14.来自图11的原始数据的动力学分析。A是N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.4)中epicoccone反应的分析，显示染色的形成和随后的分解。示出了表观一级常数。分解的速率被应用于计算胰蛋白酶消化的一级速率常数(B)。对来自图13的蛋白质凝胶的数据分析得到类似的结果(C)。
图15.通过SDS-PAGE显示胰蛋白酶消化物。1道：标记物；2道：仅胰蛋白酶(T＝0)；3道：T＝0(无胰蛋白酶)；4道：T＝0(刚加入胰蛋白酶以后)；5道：T＝0.25h；6道：T＝0.5h；7道：T＝1h；8道：T＝6h；9道：T＝18h；10道：仅胰蛋白酶(T＝18)
图16.实时监测通过epicocconone跟踪的BSA消化的糜蛋白酶动力学。
图17.实时监测通过epicocconone跟踪的BSA消化的胰蛋白酶动力学。
图18.实时监测通过SYPRO橙跟踪的BSA消化的胰蛋白酶动力学。上图显示出SYPRO橙随时间对BSA的反应(r2＝0.9995)，下图显示除了加入胰蛋白酶外其他条件相同的反应。测得胰蛋白酶水解速率为0.1466分钟-1(r2＝0.9739)。
图19.FluroProfile测试。第1和第2行是在37℃下孵育18小时的未消化BSA样品(无胰蛋白酶)的两份平行样(duplicate samples)。第3和第4行是在37℃下孵育18小时的消化的BSA样品(胰蛋白酶)的两份平行样。所述样品被连续地进行4倍稀释以最终得到1/1024的稀释液(见图示标注)。第5和第6行分别是BSA标准样和抑肽酶标准样，从250μg mL-1连续稀释至61ngmL-1。第一列含有50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液作为对照。
图20.荧光相对于4倍连续稀释度作图。
图21.荧光相对于已知BSA浓度(根据表A2绘图)。
图22.A.BSA标准曲线。B.抑肽酶标准曲线。
图23.用尼罗红跟踪胰蛋白酶消化，尼罗红是另一种在疏水环境中荧光增加的染料。上图显示尼罗红随时间对BSA的反应(r2＝0.9969)，下图显示除了加入胰蛋白酶外其他条件相同的反应。测得胰蛋白酶水解速率为0.1302分钟-1(r2＝0.9894)。
具体实施方式
本发明是基于如下的发现，即荧光染料对于疏水环境的反应可以被用来以非破坏方式跟踪水解酶的活性。由于所述染料不是永久性地共价修饰底物，它们不会显著地影响酶的活性。不希望拘囿于理论，水解终产物亲水性的增加导致对环境敏感的荧光团产生的荧光同时减少。
更具体地，本发明是基于一项意外的发现，即当荧光染料epicocconone被应用于含有蛋白质和水解酶(例如木瓜蛋白酶等)的水解反应中的时候，它的荧光随所述蛋白消化的进行(直至消化完成)而降低。
Epicocconone、其衍生物和用途已记载于申请号为PCT/AU2004/000370的国际专利申请(PCT公布号WO 2004/085546)中，其内容通过引用的方式全文纳入本文。Epicocconone和相关染料已经被成功的应用于(特别用于)蛋白质和其他生物大分子的检测和定量中。这些方法是基于随蛋白质浓度的升高，例如epicocconone等染料的荧光会增强。就本文描述的研究而言，假定消化的蛋白样品的荧光强度随时间相对于蛋白消化产生的暴露赖氨酸残基的增加而成比例地增加。然而，意料之外的是，木瓜蛋白酶消化的BSA(牛血清白蛋白)中含有的epicocconone却显示出荧光的迅速减少，所述荧光可有效地跟踪所述消化过程并且在蛋白质消化完成时达到最低水平，这已经由SDS-PAGE证实。
不希望拘囿于理论或任何具体的作用机理，可形成蛋白质或肽的较小肽片段的水解消化似乎可改变蛋白质的电荷密度或疏水性，从而影响它与疏水活性荧光染料的相互作用，这转而又减少了所述染料的荧光。而且，加入非变性量的表面活性剂(例如SDS、曲拉通X-100或CTAB)显著地增加经水解的蛋白和未水解的蛋白的荧光之间的差异。这个原理可以被广泛地应用于可释放比起始物极性更大或极性更小的产物的所有水解酶或者其他水解试剂中，也可应用于针对其环境的疏水性而产生反应时其量会增加或减少的所有荧光团。
如上文所述，显然在蛋白酶的蛋白质消化过程中观察到的epicocconone等疏水活性染料荧光的减少也适用于其他疏水活性荧光染料。例如以下的染料家族：花青染料、laurdan/prodan家族染料、dapoxyl衍生物、芘染料、二苯己三烯衍生物、ANS及其类似物、苯乙烯染料、尼罗红、两亲荧光素、罗丹明和香豆素，或者对其环境亲脂性作出显著改变其荧光行为的反应的任何其他荧光团。具有类似性质的其他染料应是本领域技术人员已知的。
而且，上述的原理以及使用荧光染料观察到的效应可以被应用于任何有以下用途的方法中：蛋白质的切割或消化，或者将基团转移至蛋白质或生物分子(例如转移酶、激酶)。
基于上述原理，在一个实施方案中，本发明涉及测定例如蛋白酶等水解酶活性的方法，该方法是通过将所述水解酶与一种合适的底物(例如蛋白质或肽)和一种能够与所述底物相互作用的荧光染料混合，并且测定或观察荧光随时间的减少或增加(变化)，这样可指示所述水解酶的活性。在这些应用中可以使用标准的蛋白质底物，例如BSA等。
在另一个实施方案中，本发明涉及如下的方法，所述方法监测例如磷酸、硫酸或碳水化合物等极性基团被从蛋白质上去除时荧光随时间的增加。
在另一个实施方案中，本发明涉及这样一种方法，所述方法实时或者通过连续取样监测例如蛋白质等生物分子在类似于上述的反应中的水解消化，并且还检测或观察荧光随时间的减少或增加，以此指示水解消化过程。
本文描述的方法容易进行自动化技术或连续流式技术处理。
下文将通过参考非限制性的实施例对本发明进行更详细地描述。本文提供的蛋白酶的实例包括胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，荧光染料的实例包括epicocconone、ANS、尼罗红和SYPRO橙，它们仅作为方便的系统以证明本发明的原理和可行性。本文提供的水解酶的其他实例包括酯酶(磷酸酶、脂肪酶、DNA酶)和糖基化酶(淀粉酶、PNGase)，它们也只是为了方便证明本发明的可用性。提供的合适荧光团的其他实例包括SYTOX绿、Hoechst 33342、碘化丙啶、epicocconone、BODIPY FL C5神经酰胺或5-十八酰基氨基荧光素，它们也只是为了方便证明本发明广泛的应用。
初步实施例
实施例A：使用epicocconone实时监测胰蛋白酶的消化
该研究的目的是确定例如epicocconone等荧光染料是否能够被用于胰蛋白酶的蛋白质消化的实时监测。
A.1材料
·N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(50mM，pH 8.4，Sigma-Aldrich B3876)
·BSA(50mM的N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，10mg/mL，Sigma-AldrichA3059)
·胰蛋白酶(1mMHCl中20μg/20μL，Sigma-Aldrich T6567)
·碘乙酰胺(100mM的N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，1M，Sigma-AldrichI6125)
·DTT(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，200mM，Bio-rad 161-0611)
·透明底96孔板(Greiner bio-one，655096)
·Epicocconone(DMSO中，24mM，FLUOROtechnics)
·Deep Purple总蛋白质染色剂(GE Heal thcare)
·NuPAGE Novex 12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，NP0341)
·LMW标记物(Amersham Biosciences，17-0446-01)
A.2设备
·Typhoon 9200(Amersham Biosciences)
·FluoStar(BMG)
·电泳系统(XCell SureLock，Invitrogen)
A.3方法
A.3.1制备用于消化的BSA
1在N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH8.4)中进行胰蛋白酶消化。
2用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液制备10mg/mL的BSA。
3将100μL的BSA样品应用于胰蛋白酶消化。
A.3.2还原和烷基化
1在所述100μL的BSA样品中加入5μL的DTT储液，在80℃下维持10分钟使所述样品还原。
2在所述样品中加入4μL的碘乙酰胺储液，在室温下维持45分钟-1小时使所述样品烷基化。
3在所述样品中加入20μL的DTT，在室温下维持45分钟-1小时以中和样品中残余的碘乙酰胺。
A.3.3使用epicocconone(FluoStar测定法)实时监测胰蛋白酶消化
1把来自上文3.2的经还原且变性的BSA样品用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液稀释10倍(25μL+225μL N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液)。计算BSA的摩尔浓度为约4μM。
2取两份100μL的所述样品(步骤1)分别加到微量滴定板上。对照包括基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的消化缓冲液、仅胰蛋白酶样品和未消化的BSA样品(无胰蛋白酶)。
3将epicocconone储液用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸稀释100倍。在每个相应孔中加入100μL稀释的epicocconone溶液。终浓度是12μM。此时需要大约10分钟获得合适的FluoStar设置条件。
4以1∶40的比例加入用1mM HCl重新配制的胰蛋白酶(Sigma-AldrichT6567)。
5使用FluoStar(Ex/Em＝540/630±12)每2分钟实时监测荧光发生直至6小时。FluoStar设置如下：温度，37℃；10次闪光/循环，180个循环。
6利用Excel图表对所述数据作图(图11)。
A.3.4通过SDS-PAGE显示胰蛋白酶消化物
1将上文3.2得到的还原且变性的BSA样品用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液稀释10倍(25μL+225μL N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液)。计算BSA的摩尔浓度为约4μM。
2将100μL的所述样品(步骤1)加入1.5mL的微型管(microtube)中。对照包括基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的消化缓冲液和未消化的BSA样品(无胰蛋白酶)。
3将epicocconone储液用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸稀释100倍。在每个相应孔中加入100μL稀释的epicocconone溶液。终浓度是12μM。在此时(0时间点)，取出15μL样品，与15μL的蛋白凝胶加样缓冲液(2×)混合，于85℃下变性5分钟。
4以1∶40的比例加入用1mM HCl重新配制的胰蛋白酶。然后将所述样品管在37℃下孵育。
5在2、4、8、16、32、64、128分钟时和过夜后(18小时)进行亚取样。在每个取样点取出15μL样品，立即与15μL的蛋白凝胶加样缓冲液(2×)混合，于85℃下变性5分钟并保存于-80℃。
6对上述亚取样的样品进行SDS-PAGE(Nupage，12％BT凝胶)电泳，并且用Deep Purple对凝胶进行染色显示。
7用Typhoon扫描仪(Ex∶Em＝532∶560 LP；440PMT)对Deep Purple染色的凝胶成像。
8显示消化的(图12A)和未消化的(图12B)蛋白质样品的所有凝胶泳道被等同地选通，并且通过ImageQuant(v 5.2)软件测定荧光强度。
A.4数据分析和结果
这些研究的结果总结在图11至14中。
BSA和BSA+胰蛋白酶与epicocconone反应的原始数据按所述的测定获得，并且使用Prism(版本4.0.3，GraphPad Software，San Diego CA，USA)对其进行简单一级动力学模型拟合。
对于BSA与epicocconone在N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液中的反应，明显有至少两个反应，一个是epicocconone与BSA的时间依赖性缔合和接着的较慢的解离，和/或该荧光缀合物的光漂白。用一个简单的缔合/解离模型Y＝跨距1[1-exp(-k1X)]+跨距2×exp(-k2X)+底值(bottom)来模拟该过程，其中第一项是指信号的指数式增加，第二项是指数式减少。图11中的值减去背景荧光(N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸+胰蛋白酶)并且根据实验的实际起始时间(估计为首次读数后10分钟)进行校正。从该模型获得0.9992的r2值(图14)。
由于信号随时间的衰减是epicocconone与蛋白质(以及推定的肽)的相互作用特征，所以k2的值被应用于胰蛋白酶动力学的分析。使用了一个二相指数式衰减(Y＝跨距1[exp(-k1X)]+跨距2[exp (-k2X)]+平台)，其中k2被设定为只使用BSA时获得的值。因此，在所述实验条件下估计的胰蛋白酶的表观一级速率常数是0.109min-1(r2＝0.9871)。实际的动力学明显更复杂，但是这是一个很好的近似值，对于在许多情况下的水解活性的监测都将是非常有用的。
对亚取样的反应的结果进行类似的分析，但是不包括信号随时间衰减相关的项，因为对于凝胶而言该项并非相关项。因此，观察到的表观一级速率常数是0.3136分钟-1(r2＝0.9757)。然而，观察到很少的点具有大的95％的置信区间(0.1976至0.4296分钟-1)。结合相对不严密的测定模式(例如在亚取样过程中继续胰蛋白酶消化造成较高的表观速率常数)，表明了使用epicocconone的胰蛋白酶消化的原位监测与亚取样的繁琐方法相当，并且所述染料的存在不会显著地影响酶动力学。
还利用碳酸盐缓冲液(NH4HCO3，100mM或50mM，pH8.2)进行上述实验，并且将其结果与用N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液时获得的结果相比较。所述比较的结果在图15中示出。
Sigma-Aldrich蛋白质组学级胰蛋白酶(T 6567)在两种消化缓冲液中效果都很好。所述消化似乎在0.5-1小时内到达终点。
示出的数据表明，经还原且烷基化的BSA被胰蛋白酶快速地消化，并且该过程可以用对环境敏感的荧光染料进行原位跟踪。
实施例B-使用epicocconone监测糜蛋白酶对BSA消化的动力学
B.1材料
·N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(50mM，pH7.4，B3876)
·BSA(50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中10mg/mL，A3059)
·糜蛋白酶(C4129，1mM HCl中，1mg/mL)
·CaCl2(RO水中，1M)
·碘乙酰胺(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，1M，I6125)
·DTT(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，200mM，Bio-rad_161-0611)
·Epicocconone(DMSO中，24mM，Fluorotechnics)
·FluoStar(BMG)
·透明底96孔板(Greiner bio-one，655096)
B.2方法
B.2.1制备用于消化的BSA
1.在N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液中进行糜蛋白酶的消化。
2.用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液制备10mg/mL的BSA。
3.将100μL的BSA样品应用于糜蛋白酶的消化。
B.2.2还原、烷基化和中和
1.在所述BSA样品(100μL)中加入5μL的DTT储液，加热(80℃)10分钟使所述样品还原。
2.在所述样品中加入碘乙酰胺(4μL)储液，在室温下维持45分钟-1小时使所述样品烷基化。
3.在所述样品中加入DTT(20μL)，并在室温下孵育45分钟-1小时以中和残余的碘乙酰胺。
B.2.3使用epicocconone(FluoStar测定法)实时监测糜蛋白酶消化
1将来自2.2的还原且变性的BSA样品用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液稀释10倍(25μL+225μL N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液)。计算BSA的摩尔浓度为约6μM。
2取两份100μL的所述样品(步骤1)分别加到微量滴定板上。对照包括基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的消化缓冲液、仅糜蛋白酶样品和未消化的BSA样品(无糜蛋白酶)。
3将epicocconone储液用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸稀释100倍，并且在每个孔中加入100μL。终浓度是12μM。此时需要大约10分钟获得合适的FluoStar设置条件。
4加入2μL CaCl2
5以1∶30的比例加入用1mM HCl重新配制的糜蛋白酶(C4129)。
6使用FluoStar(Ex/Em＝540/630-12)每2分钟实时监测荧光发生直至6小时。FluoStar设置如下：温度，30℃；10次闪光/循环，180个循环。
7利用Excel图表对所述数据作图(图11)。
B.3.结果和讨论
图16显示了对糜蛋白酶消化BSA的动力学的实时监测。它还示出了类似于胰蛋白酶的动力学模式(图17)，即在未消化的BSA中荧光呈指数增加而在消化的BSA中呈指数衰减。在这些情况下获得的糜蛋白酶的表观一级速率常数是0.0447min-1。
实施例C-通过加入SYPRO橙跟踪BSA的胰蛋白酶消化
C.1材料
·按照上文的实施例2。
·SYPRO橙(在DMSO中，24mM，Molecular Probes)，用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸稀释100倍。
C.2方法
按照实施例2，不同之处是Fluorostar读板仪(plate reader)设置为480nm激发和600(±10nm)带通的发射滤光片。
C.3结果
结果表明，另一种在疏水环境中荧光增加的染料SYPRO橙在蛋白质消化的实时分析中的表现与epicocconone类似(图18)。具体地，通过跟踪荧光随时间的下降可以提取胰蛋白酶消化的表观一级速率常数。使用该染料获得了一个相近似的值(k＝0.1466分钟-1)。Epicocconone和SYPRO橙之间明显的不同是，用epicocconone时观察到的荧光的累积在用SYPRO橙时不明显，并且用SYPRO橙时荧光的光漂白/衰减比用epicocconone时快。
实施例D-使用FiuoroProfile对胰蛋白酶消化后(18小时)产生的肽定量
D.1材料和仪器
·N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(50mM，pH 8.4，B3876)
·BSA(50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，10mg/mL，A3059)
·胰蛋白酶(1mM HCl中20μg/20μL，T6567)
·碘乙酰胺(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，1M，I6125)
·DTT(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，200mM，Bio-rad_161-0611)
·透明底96孔板(Greiner bio-one，655096)
·BSA标准物(Sigma-Aldrich，A3059)
·抑肽酶标准物(Sigma-Aldrich，A1153)
·FluoroProfile(Sigam-Aldrich)
·9200 Typhoon扫描仪(Amersham Biosciences)
D.2方法
1.如前所述，将BSA变性、还原、烷基化并中和以用于胰蛋白酶消化，简要概括如下。
·100μL BSA样品(10mg/mL)
·5μL用N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸制备的200mM的DTT：70℃10分钟
·4μL用N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸制备的1M的IDA：室温下45分钟
·20μL用N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸制备的200mM的DTT：室温下45分钟
2.在还原、烷基化和中和以后，将上文的BSA样品用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液稀释10倍(50μL的所述样品+450μL的50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液)，得到用于胰蛋白酶消化的样品，即对未消化BSA分别在T＝0小时和T＝ON(过夜)亚取样的两份平行样，和消化的BSA(加入2.5μL的1mM HCl)的两份平行样，以及对消化的BSA分别在T＝0小时和T＝ON亚取样(加入2.5μL(含2.5μg)胰蛋白酶)的两份平行样。
3.在胰蛋白酶消化的终点，加入1μL的10％TFA并保存在-80℃。计算用于消化的BSA的量为749μg/mL。
D.2.1样品制备
对未消化的BSA(两份平行样)和消化的BSA(两份平行样)，用50mM的N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸连续地4倍稀释所述样品以最终得到1/1024的稀释液。
用N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液新鲜配制BSA并且连续稀释得到从61ng mL-1至1mg mL-1范围的系列稀释液。用N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液新鲜配制抑肽酶并且连续稀释得到从61ng mL-1至1mg mL-1范围的系列稀释液。
D.2.2 FluoroProfile测定
一种FluoroProfile试剂盒工作混合液由8份50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、1份A部分和1份B部分制得。
将样品(50μL)加入96孔板中，并且在每个孔中加入FluoroProfile工作溶液(50μL)。
在室温下孵育样品30分钟。使用Typhoon扫描仪在532/610(Ex/Em)读取荧光。
D.3结果
D.3.1未消化的和消化的BSA的荧光水平的FluoroProfile分析
图19示出了进行样品FluoroProfile测定的样品平板的typhoon扫描图像。如表A1和图20中所示，消化的BSA样品的荧光显著高于未消化样品。
表A1.连续稀释的未消化(第3列)的和消化的BSA样品(第7列)的荧光。通过FluoroProfile测试所述样品并且用Typhoon扫描仪读取荧光。
BSA(18h) 平均值 净值   BSA+胰蛋白酶(18h) 平均值 净值
  CTL(N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸) 493601.6 0 标准差   CTL(N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸) 471418.1 0 标准差
  1   47775445   47281843   532028.6   1   63459501   62988083   12751.78
  1/4   22790727   22297125   2346631   1/4   36243408   35771990   1408240
  1/16   7727012   7233410   941509.2   1/16   12828068   12356650   808548.6
  1/64   2750820   2257219   268100.9   1/64   3657093   3185675   218392.9
  1/256   1235006   741404.5   109485.5   1/256   1248152   776734.2   37772.8
  1/1024   707728   214126.4   9340.499   1/1024   696683.4   225265.3   23787.69
将所述未消化的和消化的样品(被连续稀释)的荧光相对于用于胰蛋白酶消化的BSA浓度作图(表A2和图21)。计算所述用于胰蛋白酶消化的BSA(变性的)浓度为749μg/mL(见表2)。
表A2.用于胰蛋白酶消化的BSA稀释液(749μg/mL)以及未消化的和消化的BSA的相应的荧光
  稀释F   μg/mL   BSA   BSA+胰蛋白酶
  1024   0.7   214126.42   225265.335
  256   2.9   741404.525   776734.24
  64   11.7   2257218.915   3185675.11
  16   47.8   7233410.155   12356649.59
  4   187   22297124.95   35771990.32
  1   749   47281843.18   62988083.24
D.3.2用FluoroProfile对消化的BSA定量
通过在原始BSA标准物曲线(图22A)中插值，测得所述未消化的BSA(变性的，孵育18小时)的浓度为704μg/mL(表A3)。所述消化的BSA被估计为1057μg/mL。
表A3.用原始BSA标准物对消化的BSA(BSA+胰蛋白酶)定量。
Figure A20068004971200251
Figure A20068004971200252
通过在抑肽酶标准物曲线(图22B)中插值，测得所述未消化的BSA(变性的，孵育18小时)的浓度为560μg/mL(表A4)。所述消化的BSA被估计为938μg/mL。
表A4.用抑肽酶标准物对消化的BSA(BSA+胰蛋白酶)定量。
Figure A20068004971200261
Figure A20068004971200262
在FluoroProfile测试中观察到消化的BSA中荧光增加，其中A部分和B部分都被用作胰蛋白酶消化18小时后取的亚样品。使用原始BSA标准物(图22A)和抑肽酶标准物(图22B)，观察到所述消化的BSA的荧光增加比未消化的BSA高约50％和67％(表A3和表A4)。
实施例E-通过加入尼罗红跟踪BSA的胰蛋白酶消化
E.1材料
·按照上文的实施例2。
·尼罗红(乙醇中，20mM，Sigma-Aldrich，73189)，用50mM的N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸稀释100倍。
E.2方法
按照实施例2，不同之处是Fluorostar读板仪设置为520nm激发和630(±10nm)带通的发射滤光片。
E.3结果
结果表明，尼罗红在蛋白质消化的实时分析中的表现也与epicocconone和SYPRO橙类似(图23)。具体地，通过跟踪荧光随时间的下降可以提取胰蛋白酶消化的表观一级速率常数。使用该染料获得了一个相似的值(k＝0.1302分钟-1)。Epicocconone与尼罗红之间明显的不同是，用epicocconone时观察到的荧光的累积在用尼罗红时不明显，并且用尼罗红时荧光的光漂白/衰减比用epicocconone时和用SYPRO橙时都快。
在实施例1-3和5中应注意到所示所有样品的BSA胰蛋白酶消化的表观一级动力学常数是相同的(在误差范围内)。
实施例
实施例1：使用荧光团实时监测糖基化酶的活性
1.1材料
●N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(100mM，pH8，Sigma-Aldrich B3876)
●胎球蛋白(RO水中，20mg/mL，Sigma-Aldrich F3004)
●肽-N-糖苷酶F(PNase F)(Sigma-Aldrich P7367)
●Epicocconone(DMSO中，24mM，FLUOROtechnics)
●SDS(BDH 442444H)
●2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich M7154)
●黑色96孔板(Greiner bio-one，655209)
●Deep Purple总蛋白质凝胶染色剂(GE Healthcare)
●NuPAGE Novex 12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，NP0341)
●NuPAGE LDS样品缓冲液(4×，Invitrogen，NP0007)
●LMW标记物(Amersham Biosciences，17-0446-01)
1.2设备
●Typhoon 9200(Amersham Biosciences)
●FluoStar(BMG)
●电泳系统(XCell SureLock，Invitrogen)
1.3方法
1.3.1存在洗涤剂时使用epicocconone实施监测去糖基化
1.将胎球蛋白用N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液以1∶20稀释。
2.将所述蛋白(90μg/90μL)用10μL的洗涤剂(含100mM 2-巯基乙醇的0.2％SDS)在100℃变性10分钟。
3.将100μL的所述样品(步骤2)加到微量滴定板的孔中。对照包括基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的消化缓冲液、仅PNGase F样品和未糖基化的胎球蛋白样品(无PNGase F)。
4.将Epicocconone储液用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸稀释100倍。在每个孔中加入100μL稀释的epicocconone溶液。
5.使所述样品在37℃下平衡(预孵育)20分钟。FluoStar需要约1分钟以达到合适的增益设置(gain setting)。
6.将用反渗透(RO)水重新配制的1个单位的PNGase F加入每个胎球蛋白样品和对照(如N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液+PNGase F)中。
7.使用FluoStar(Ex/Em＝540±10/630±10)每3分钟实时监测荧光发生直至69分钟。FluoStar设置如下：温度，37℃；10次闪光/循环。
8.进程曲线在Microsoft Excel中进行减去对照的处理。从仅包含胎球蛋白/染料的样品中减去缓冲液/染料，并且从胎球蛋白/PNGase/染料样品中减去PNGase+缓冲液/染料。
9.用Prism(GraphPad v.4)对标准化的数据作图并拟合-见图1。对所述胎球蛋白样品进行二相缔合/解离指数式(Y＝Y最大*(1-exp(-k1*X))+跨距*(exp(-k2*X))-底值)拟合，其中Y是荧光数据，X是时间(以分钟表示)。k1和k2的值被应用于三相缔合/解离指数式(Y＝跨距1*(1-exp(-k1*X))+跨距2*(exp(-k2*X))+跨距3*(1-exp(-k3*X))-底值)拟合，其中k3是胎球蛋白被PNGase去糖基化的准一级速率常数。
1.3.2通过SDS-PAGE显示去糖基化的样品
1.在测定的终点收集亚样品。取两种消化液中的亚样品(6.5μL)，与3.5μL加样缓冲液(2.5μL的NuPAGE样品缓冲液和1μL的500mM DTT)混合并且在80℃孵育10分钟。
2.然后将每个样品上样至12％的聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE Bis-Tris，Invitrogen)上，并且电泳(恒压200V)50分钟，直至蓝色的上样缓冲液染料刚刚跑出凝胶。
3.对Deep Purple染色的凝胶通过Typhoon扫描仪(Ex∶Em＝532∶560 LP；440PMT)成像。
1.4数据分析和结果
因为糖是相对极性的，所以蛋白质的去糖基化会导致疏水性的增加。存在低浓度的洗涤剂(如SDS)的时候，当糖被去除时应该有更多的洗涤剂与所述蛋白质结合。因此，对环境敏感的荧光分子将对疏水性变化作出反应，以利于酶活性(在该非限制性实例中：胎球蛋白的去糖基化)的无痕、实时测定。
胎球蛋白(48.4kDa)由74％多肽、8.3％己糖、5.5％氨基己糖和8.7％唾液酸构成，并且是常见的糖蛋白标准物。
测定胎球蛋白在存在荧光团epicocconone时与PNGase F反应而获得的标准化的(上文步骤8)实时荧光数据，并且使用Prism(版本4.0.3，GraphPadSoftware，San Diego，USA)进行三元(three-component)指数式缔合-解离动力学模型拟合。天然胎球蛋白样品的荧光轻微地增加，然后由于光漂白/分解而减少，这可以使用单相指数式缔合和随后的慢指数式离解进行拟。相反，含有酶的样品的荧光增加，并且用三相指数式拟合以得到去糖基化的准一级速率常数。分析结果显示于图1中。
图1A证明，所述样品(胎球蛋白+PNGase F)的荧光的增加是由于在37℃下1小时的去糖基化过程中疏水性的增加。对所述实时数据的拟合使得可以分析针对真实底物的酶活性，并测定水解的动力学常数和半衰期。可以使用10倍于半衰期的时间作为完全水解的度量(该示例中为59分钟)。图1B是对所述实时测试的独立的SDS-PAGE验证，显示出糖基化后天然的(2道)和PNGase F处理的(3道)胎球蛋白之间的分子位移(molecular shift)。
实施例2：使用三种不同荧光团实时监测寡核苷酸的水解
2.1材料和设备
●按照上一个实施例并有以下补充和/或替换。
●N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(500mM，pH7.5，Sigma-Aldrich B3876)
●MgCl2(1M，Sigma-Aldrich M-8266)
●CaCl2(1M，BDH 010070-0500)
●DNA酶1缓冲液(x 20)，其中含有0.1M N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸，0.4M MgCl2和0.02M CaCl2。
●鲑鱼精DNA(1 RO水中，1.25mg/mL，Sigma-Aldrich F3004)
●DNA酶1(0.15M NaCl中，5mg/mL，Sigma-Aldrich DN25)
●Hoechst 33342(DMSO中，10mM，Invitrogen H1399)
●碘化丙啶(RO水中，1.5mM，Sigma-Aldrich P4170)
●SYTOX-绿(DMSO中，5mM，Invitrogen S7020)
●SPP1/EcoRI DNA分子量标记物(Breastec Ltd.DMW-S1)
●DNA级琼脂糖(1.5％w/v，Progen 200-0011)
●核酸样品加样缓冲液(5×，Bio-rad 161-0767)
●Tris-硼酸盐-EDTA DNA电泳缓冲液(10×Fermentas B52)
●溴化乙锭(RO水，10mg/mL，Sigma-Aldrich E7637)
●Mini-Cell GT(Bio-rad)
●ChemiImagerTM 4400(Alpha Innotech)
2.2方法
2.2.1使用Hoechst 33342、SYTOX绿和碘化丙啶实时监测DNA酶水解双链DNA
1.将DNA样品用1×DNA酶1缓冲液稀释5倍至250μg/mL。
2.将100μL的所述样品(步骤1)加到微量滴定板上。对照包括1×DNA酶1缓冲液、仅DNA酶1样品和未消化的DNA样品(无DNA酶1)。
3.将每种荧光团储液用1×DNA酶1缓冲液稀释100倍。在每个孔中加入100μL稀释的荧光团溶液。所述样品在37℃平衡50分钟。FluoStar需要约1分钟获得合适的增益设置。
4.将用0.15M NaCl重新配制的1个单位的DNA酶1加入到每个待消化的DNA样品和一份对照(如1×DNA酶1缓冲液+DNA酶1)中。
5.使用FluoStar(Hoechst 33342为Ex/Em＝355/460nm，碘化丙啶为Ex/Em＝540±10/630±10；SYTOX-绿为Ex/Em＝485/520nm)每3分钟实时监测荧光发生直至120分钟。FluoStar设置如下：温度，37℃；10次闪光/循环。
6.进程曲线在Microsoft Excel中进行减去对照的处理。从仅含DNA的样品中减去DNA酶缓冲液，并且从DNA/DNA酶样品中减去DNA酶+缓冲液。
7.使用Prism(GraphPad v.4)对标准化的数据作图-见图2。首先将含有荧光团的DNA的进程曲线进行单相指数式衰减(Y＝跨距*exp(-kX)+平台)拟合，并且获得的k值作为固定k1值被应用于DNA加酶即DNA酶的二相指数式衰减中(Y＝跨距1*exp(-k1X)+跨距2*exp(-k2X)+平台)以导出k2。
2.2.2通过琼脂糖电泳显示外切核酸酶活性
1.在测试的终点收集亚样品。将从两种消化液取的亚样品(8μL)都与2μL的核酸加样缓冲液混合。
2.然后将每个样品加样至含有5μg溴化乙锭的2％的琼脂糖凝胶上，电泳(150V恒压)1小时直至蓝色的加样缓冲液染料刚刚跑出所述凝胶。
3.用ChemiImagerTM 4400对所述溴化乙锭染色的凝胶成像。
2.3数据分析和结果
进行该实验以证明对环境敏感的荧光团可以被应用于寡核苷酸样品水解的无痕跟踪，在本非限制性的实施例中用酶DNA酶1水解双链的鲑鱼精DNA。
图2显示了使用三种不同的荧光团实时监测DNA酶驱动的水解。加入DNA酶1后，在所有情况中均观察到了指数式衰减，并且通过非线性回归分析得到水解的准一级速率常数(K2)。在无酶的缓冲液中的寡核苷酸的进程曲线一般用单相指数式衰减拟合，从而与观察到的由于所述荧光团的光漂白和/或分解而出现的荧光随时间的缓慢减少相符。所述酶催化的水解用二相指数式衰减拟合，并将从所述仅有DNA的样品获取的一级速率常数作为其中一个速率常数。那么二级速率常数(图2中的K2)就是所述DNA水解的准一级速率常数的合理近似。使用三种不同染料所得的速率能很好地吻合，在0.11-0.15分钟-1内变化。对于每种情况，可以测定DNA水解的半衰期，并且10倍的该值时可能所述DNA完全水解(在该示例中为46-64分钟)。
图2D是该实时测试的基于DNA凝胶电泳的独立验证，显示出DNA样品被DNA酶1完全水解(道3、5和7)，而没有加入DNA酶的DNA样品由于存在复杂的DNA混合物而显示很强的染色(道2、4和6)。该实施例证明了用多种染料跟踪酶对复杂的寡核苷酸混合物(基因组)的水解活性的可行性。
实施例3：在存在非变性量的洗涤剂和荧光团时实时监测多糖水解
3.1材料和设备
●按照前文的实施例并有以下补充和/或替换。
●N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(50mM，pH7，Sigma-Aldrich B3876)
●淀粉(N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液中1％，Sigma-Aldrich S2630)
●α-淀粉酶(1.8单位/mg固体，Sigma-Aldrich A2771)
●曲拉通X-100(BDH 30632)
3.2方法
3.2.1用epicocconone实时监测α-淀粉酶驱动的淀粉水解
1.用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH7)制备1％浓度的淀粉溶液，煮沸15分钟。
2.将曲拉通X-100加入到所述淀粉溶液中，终浓度为0.02％。
3.将100μL的所述样品(步骤1)加到微量滴定板上。对照包括基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的消化缓冲液、仅α-淀粉酶样品和天然淀粉样品(无淀粉酶)。
4.将epicocconone储液用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸稀释100倍。在每个孔中加入100μL稀释的epicocconone溶液。所述样品在37℃下孵育50分钟。FluoStar需要约1分钟以获得合适的增益设置。
5.将用N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液重新配制的2μL(0.036单位)α-淀粉酶加入到一份淀粉样品和一份对照(如N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液+α-淀粉酶)中。
6.使用FluoStar(Ex/Em＝540±10/630±10nm)每3分钟实时监测荧光发生直至约200分钟。FluoStar设置如下：温度，37℃；10次闪光/循环。
7.进程曲线在Microsoft Excel中进行减去对照的处理。从仅含淀粉的样品中减去缓冲液，并且从淀粉/淀粉酶样品中减去淀粉酶+缓冲液。
8.用Prism(GraphPad v.4)对标准化的数据作图-见图3。
3.3数据分析和结果
进行该实验以证明对环境敏感的荧光团(例如epicocconone)可以被应用于监测碳水化合物样品的水解，例如在该非限制性的实施例中，通过测定底物周围局部的水解性监测淀粉酶水解马铃薯淀粉。
图3显示出使用epicocconone实时监测淀粉酶驱动的水解。存在洗涤剂曲拉通X-100时，水解开始的时候荧光信号比没有洗涤剂时高约20％，表明洗涤剂结合淀粉形成淀粉周围更加疏水的环境，水解对淀粉的破坏导致荧光呈指数减少。这种意料之外的现象可以被应用于无痕地跟踪酶反应的过程。淀粉酶水解淀粉的准一级速率常数是通过以下方式获得，即对淀粉/缓冲液/epicocconone对照进行单相指数式衰减拟合，然后使用该值(k1)对所述淀粉/缓冲液/epicocconone样品进行二相指数式衰减拟合，其中第一指数被固定为从所述对照确定的k1值。这样k2值就是α-淀粉酶水解淀粉的准一级速率常数。在该示例中，存在曲拉通X-100时该值是0.55分钟-1和0.65分钟-1。完全消化可以被确定在10倍的半衰期，在该示例中分别为127和107分钟。
实施例4：使用疏水性活性的荧光团实时监测蛋白质去磷酸化
4.1材料和设备
●按照前文的实施例并有以下补充和/或替换。
●β-酪蛋白(Sigma-Aldrich C6905)
●碱性磷酸酶(10-30DEA单位/mg固体，Sigma-Aldrich P7640)，以2mg/mL的浓度溶解于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液中。
●BODIPY FL C5-神经酰胺(在DMSO中10mM，Invitrogen D3521)
4.2方法
4.2.1使用BODIPY FL C5-神经酰胺实时监测磷酸酶活性
1.用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH7.5)制备浓度为1mg/mL的β-酪蛋白(β-CN)。
2.将100μL的所述样品(步骤1)加到微量滴定板上。对照包括基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的消化缓冲液、仅碱性磷酸酶的样品和天然β-CN样品(无磷酸酶)。
3.将BODIPY FL C5-神经酰胺储液用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸稀释100倍。在每个孔中加入100μL稀释的荧光团溶液。所述样品在30℃下孵育50分钟。FluoStar需要约1分钟以达到合适的增益设置。
4.将用N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液中重新配制的2μL磷酸酶加入到一份β-CN样品和一份对照(如N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液+磷酸酶)中。
5.使用FluoStar(Ex/Em＝485/520nm)每3分钟实时监测荧光发生直至约30分钟。FluoStar设置如下：温度，30℃；10次闪光/循环。
6.进程曲线在Microsoft Excel中进行减去对照的处理。从仅含β-CN/染料的样品中减去缓冲液/染料，并且从β-CN/磷酸酶/染料样品中减去磷酸酶+缓冲液/染料。
7.用Prism(GraphPad v.4)对数据作图-见图4。
4.3数据分析和结果
在该非限制性实施例中，我们给出了如何使用BODIPY FL C5-神经酰胺监测碱性磷酸酶驱动的β-酪蛋白(β-CN)水解。图4显示出通过疏水性的增加实时地监测磷蛋白的去磷酸化，所述疏水性与去除极性的磷酸基有关。测定从BODIPY FL C5-神经酰胺与酪蛋白结合而获取的标准化的数据被，并且使用Prism(4.0.3版，GraphPad Software，San Diego，USA)用简单一级指数式关联模型(simple first order exponential association model)拟合。得到的速率常数(k1)被用作碱性磷酸酶水解酪蛋白的二相指数式增加中的常数以获得所述去磷酸化反应的准一级速率常数。荧光的增加是由于随磷酸基被去除疏水性增加的结果(图4)。在该示例中，可以计算完全水解的时间为42分钟(10×t1/2)。
实施例5：用荧光团实时监测酯酶活性
5.1材料和设备
●按照前文的实施例并有以下补充或替换。
●橄榄油(无品牌名，Woolworths，Australia)
●脂肪酶(50KLU/g，Novozymes
Figure A20068004971200341
脂肪酶)
●5-十八酰基氨基荧光素(DMSO中，10mM，Sigma-Aldrich 74735)
5.2方法
5.2.1脂肪酶催化橄榄油水解的实时监测
1.用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液制备浓度为5％的橄榄油。用Branson电子超声波仪(Branson digital Sonifier)乳化所述水/油悬浮液(以60％的功率2×15秒)。
2.将100μL的所述样品(步骤1)加到微量滴定板上。对照包括基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的消化缓冲液、仅脂肪酶样品和天然橄榄油样品(无脂肪酶)。
3.将5-十八酰基氨基荧光素储液用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸稀释100倍。在每个孔中加入100μL稀释的荧光团溶液。
4.所述样品在室温下孵育50分钟。FluoStar需要约30秒钟以达到合适的增益设置。
5.将0.01、0.1、1和10μL的多种测试量的(脂肪酶)加入所述油样品中。
6.使用FluoStar(Ex/Em＝485/520nm)每3分钟实时监测荧光发生直至约200分钟。FluoStar设置如下：温度，37℃；10次闪光/循环。
7.进程曲线在Microsoft Excel中进行减去对照的处理。从仅包含橄榄油/染料的样品中减去缓冲液/染料，并且从橄榄油/Greasex/染料样品中减去Greasex+缓冲液/染料
8.用Prism(GraphPad v.4)对标准化的数据作图-见图5。
5.3数据分析和结果
在该非限制性实施例中，我们给出如何使用环境敏感的荧光团(例如5-十八酰基氨基荧光素)无痕地跟踪例如脂质等酯的实时水解。在该示例中，虽然我们给出的是一种市售的脂肪酶对橄榄油的水解，但是本领域技术人员应该知晓，相同的或相似的测试可以被应用于跟踪其他酯酶对其他酯的水解。
图5显示，使用5-十八酰基氨基荧光素作为报告物，实时监测每孔0.01μL的脂肪酶
Figure A20068004971200351
对橄榄油的水解。程序Prism能够对进程曲线进行单相(橄榄油+缓冲液+染料)或二相(橄榄油+缓冲液+脂肪酶+染料)指数式衰减的拟合，并确定水解的准一级速率常数(图5，插图)。
观察到的荧光的指数式减少可以通过以下原因进行解释，即橄榄油样品水解成的脂肪酸和乙醇的极性比原来酯的极性大，因而水解后疏水性减小。在该实施例中，完全水解可以被估计在10×半衰期(32分钟)，这证明了本发明在食品工业的可用性。
实施例6.存在非变性量的洗涤剂时用epicocconone实时监测蛋白酶解
该实验的进行是为了研究使用epicocconone实时监测非特异性蛋白酶的蛋白质消化。
6.1材料和设备
·按照前文的实施例并有以下补充和/或替换。
·蛋白质样品：BSA(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，10mg/mL，Sigma-Aldrich A3059)，脱铁运铁蛋白(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，10mg/mL，Sigma-Aldrich T2036)、α-酪蛋白(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，10mg/mL，Sigma-Aldrich C6780)和碳酸酐酶(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，10mg/mL，Sigma-Aldrich C7025)。
·SDS(BDH 442444H)
·木瓜蛋白酶(RO水中，2mg/mL，Sigma-Aldrich P4762)
·碘乙酰胺(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，1M，Sigma-AldrichI6125)
·DTT(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，200mM，BioRad 161-0611)
6.2方法
6.2.1使用epicocconone监测木瓜蛋白酶对不同蛋白质的水解
6.2.1.1制备用于消化的BSA
1.木瓜蛋白酶消化在N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH7.0)中进行。
2.用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液制备10mg/mL的蛋白质样品。
3.将100μL所述蛋白质样品应用于木瓜蛋白酶的消化。
6.2.1.2还原和烷基化
1.在100μL的蛋白质样品中加入1μL的10％SDS和5μL的DTT储液，在80℃下维持10分钟使所述样品被还原。
2.在所述样品中加入4μL碘乙酰胺储液，在室温下维持45分钟至1小时使所述样品烷基化。
3.在所述样品中加入20μL的DTT，在室温下维持45分钟至1小时以中和所述样品中残余的碘乙酰胺。
6.2.2存在洗涤剂时使用荧光团实时监测木瓜蛋白酶的消化
1.将所述还原且变性的蛋白质样品用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液稀释10倍(25μL+225μL N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液)。
2.将100μL的BSA样品(步骤1)加入96孔微量滴定板的孔中。对照包括基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的消化缓冲液、仅木瓜蛋白酶样品和未消化的样品(无木瓜蛋白酶)。所述测试由4孔样品组组成，用于使用epicocconone的BSA蛋白酶解。对于其余的蛋白质样品(如脱铁运铁蛋白、α-酪蛋白和碳酸酐酶)以相同的方式制备三组样品。
3.将epicocconone用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(pH7.0)稀释100倍。
4.在每个相应孔中加入100μL的工作荧光团溶液。需要约90秒获得合适的FluoStar增益设置。
5.所述样品然后在37℃下预孵育50分钟。
6.在所述测试中用4μL木瓜蛋白酶(＝0.248单位/μL)消化蛋白质样品。
7.使用FluoStar(Ex/Em＝540±10/630±10)每2分钟实时监测荧光发生直至400分钟。
8.进程曲线在Microsoft Excel中进行减去对照的处理。从仅含蛋白质/染料的样品中减去缓冲液/染料，并且从蛋白质/木瓜蛋白酶/染料样品中减去木瓜蛋白酶+缓冲液/染料。
9.用Prism(GraphPad v.4)对标准化的数据作图并拟合-见图6。
6.3数据分析和结果
在该非限制性实施例中，我们证明了epicocconone可以被应用测定非特异性蛋白酶-木瓜蛋白酶-的蛋白酶解。虽然木瓜蛋白酶是一种半胱氨酸蛋白酶，但是该方法也适用于丝氨酸蛋白酶、羧基蛋白酶(carboxy protease)和金属蛋白酶(metaloprotease)。木瓜蛋白酶具有广泛的特异性(不同于胰蛋白酶和糜蛋白酶)，它完全消化大部分的蛋白质样品。本文示出BSA、酪蛋白、脱铁运铁蛋白和碳酸酐酶的水解，它们作为具有不同性质的蛋白质的实例，可以通过本发明跟踪它们的水解。图6E显示出用木瓜蛋白酶处理的蛋白质样品在120分钟后被完全消化，而没有用木瓜蛋白酶处理的蛋白质显示出对应于各蛋白质分子量的带。在某些情况下，在消化后还剩下某些不能被进一步水解的较大的肽片段。
图6A-D显示了相据本发明通过以下方式形成的进程曲线，即使用荧光团epicocconone无痕地和实时地跟踪蛋白质的水解。在每种情况下，对带荧光团的蛋白质(方块)进行单相指数式衰减(Y＝跨距*exp(-kX)+平台)拟合，并且k值作为固定k1值被应用于蛋白质加木瓜蛋白酶(三角)的二相指数式衰减(Y＝跨距1*exp(-k1X)+跨距2*exp(-k2X)+平台)中。根据这些动力学数据，可以预测各种蛋白质完全消化需要的时间，如10×半衰期(见插图中每种蛋白质的半衰期)。观察到的荧光的指数式减少可以通过以下原因进行解释，即蛋白质样品水解成的肽段的疏水性比原蛋白质小很多，因而水解后失去疏水性。
实施例7.存在非变性量的洗涤剂时用不同的荧光团实时监测蛋白酶解
7.1材料和设备
●按照前文的实施例并有以下补充和/或替换。
●BSA(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，10mg/mL，Sigma-AldrichA3059)
●胰蛋白酶(1mM HCl中，20μg/20μL，Sigma-Aldrich T6567)
●木瓜蛋白酶(RO水中，2mg/mL，Sigma-Aldrich P4762)
●SDS(BDH 442444H)
●碘乙酰胺(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，1M，Sigma-AldrichI6125)
●DTT(100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸中，200mM，BioRad 161-0611)
●透明底96孔板(Greiner bio-one，655096)
●SYPRO橙(×5000浓缩，Invitrogen S-6650)
●尼罗红(乙醇中，1mg/mL，Sigma-Aldrich N-3013)
●ANS(DMSO中，10mM，Sigma-Aldrich A1028)
7.2方法
7.2.1使用epicocconone、SYPRO橙、尼罗红和苯胺基萘磺酸(ANS)监测胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对蛋白质的水解。
7.2.1.1制备用于消化的BSA
1.在pH8.4和pH7.0的N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液中分别进行胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的消化。
2.用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液制备10mg/mL的BSA。
3.将100μL的所述BSA样品应用于胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的消化。
7.2.1.2还原和烷基化
BSA样品被还原并被烷基化，如前述(6.2.1.2节)。
7.2.2存在洗涤剂时使用荧光团实时监测胰蛋白酶消化
1.将所述还原且变性的BSA样品用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液稀释10倍(25μL+225μL N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液)。
2.将100μL的所述样品(步骤1)加入96孔微量滴定板的孔中。对照包括基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的消化缓冲液、仅胰蛋白酶样品或木瓜蛋白酶以及未消化的BSA样品(无胰蛋白酶或者无木瓜蛋白酶)。对于一种荧光团(如SYPRO橙)，测试由4孔样品组组成。对于其余的荧光团(如尼罗红、epicocconone和SYPRO橙)以相同的方式制备三组样品。
3.将SYPRO橙储液用所述N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH8.4)稀释5000倍。将尼罗红和epicocconone储液用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(pH8.5)稀释100倍。将ANS用所述N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH7.0)稀释100倍。
4.在每个相应孔中加入100μL的工作荧光团溶液(如SYPRO橙、尼罗红、epicocconone和ANS)。尼罗红和epicocconone需要约30秒获得合适的FluoStar设置条件，SYPRO橙和ANS需要90秒。
5.所述样品接着在37℃下预孵育50分钟。
a)将用1mM HCl重新配制的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich T6567)以1∶40的比例加入到所述待消化的样品中。将相同量的酶加入仅包含缓冲液组分的对照中。
b)将4μL的木瓜蛋白酶(2mg/mL)加入到所述待消化的样品中。将相同量的酶加入仅包含缓冲液组分的对照中。
6.使用FluoStar(SYPRO橙的Ex/Em＝485/600±10；epicocconone和尼罗红的Ex/Em＝540±10/630±10；ANS的Ex/Em＝355/460)每2分钟实时监测荧光发生直至400分钟。FluoStar设置如下：温度，37℃；10次闪光/循环。
7.进程曲线在Microsoft Excel中进行减去对照的处理。从仅包含蛋白质/染料的样品中减去缓冲液/染料，并且从蛋白质/酶/染料样品中减去酶+缓冲液/染料。用Prism(GraphPad v.4)对标准化的数据作图并拟合-见图7
7.3数据分析和结果
图7显示了使用4种不同的荧光团实时监测蛋白酶解，如BSA/胰蛋白酶和BSA/木瓜蛋白酶。该实施例中的荧光团的如下能力被测试，即测定一种蛋白质疏水性的原始状态(水解之前)和所述蛋白质疏水性的后续状态(在水解时)的能力。
标准化的数据被应用于Prism分析获得速率常数。对于每种情况，对带荧光团的蛋白质(空心方块)进行单相指数式衰减(Y＝跨距*exp(-kX)+平台)拟合，并且k值作为固定k1值被应用于蛋白质加木瓜蛋白酶(空心圆)的二相指数式衰减(Y＝跨距1*exp(-k1X)+跨距2*exp(-k2X)+平台)中。通过该方法，可以测定水解的速率常数并预测完全消化的时间点。图7E是使用实际的实时样品的SDS-PAGE对消化的独立验证，显示出存在不同的荧光团时胰蛋白酶或木瓜蛋白酶对BSA的完全消化。从该图可以看出，在120分钟后所述蛋白质相关的条带消失，仅可以看到残余的木瓜蛋白酶或胰蛋白酶的微弱的条带。在某些情况下，在消化后还剩下某些不能被进一步水解的较大的肽片段。
虽然本发明是通过参考具体的实施例进行描述的，但是本领域技术人员应理解可以以许多其他的形式实施本发明。
实施例8.使用环境敏感的荧光团并通过亚取样监测水解活性的替代方法
8.1材料和设备
●按照前文的实施例并有以下补充和/或替换。
●Epicocconone(20％ACN/80％DMSO中，1mg/mL；Fluorotechnics)
●蛋白质样品，牛血清白蛋白(A-3059，Lot 083K1291)和碳酸酐酶(C-7025，Lot 093K9310)
●SDS(BDH 442444H)
●胰蛋白酶(1mM HCl中20μg/20μL；T6567，Sigma-Aldrich)
●亮肽素(L2884，Lot064K86283，Sigma-Aldrich)
●胰蛋白酶抑制剂(II-S型，T9128，Lot025K7014)
8.2方法
1.将胰蛋白酶抑制剂、亮肽素和胰蛋白酶抑制剂(大豆)分别制备成浓度为1mM的RO水溶液和0.48mM的RO水溶液。
2.蛋白样品的制备如上述的实施例6。所述还原且烷基化的蛋白样品以1∶10稀释于100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH8.4-5)中。
3.胰蛋白酶(4.62μg)以1∶50的比例加入每个蛋白质样品(231μg/300μL)中，所述样品在37℃下孵育。
4.收集亚样品，以用于亮肽素或胰蛋白酶抑制剂(大豆)对胰蛋白酶活性的抑制研究。
a.在0、10、20、30、60、60、90和120分钟亚取样45μL的胰蛋白酶消化液并立即加到含5μL的1mM亮肽素的1.5mL管中。所述亮肽素抑制剂处理的亚样品放置在室温下直至读取荧光。
b.在0、10、20、30、60、60、90和120分钟亚取样45μL的胰蛋白酶消化液并立即加到含5μL大豆胰蛋白酶抑制剂的1.5mL管中。所述大豆胰蛋白酶抑制剂处理的亚样品放置在室温下直至读取荧光。
5.亮肽素抑制剂的对照包括仅N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液和含有胰蛋白酶或含有胰蛋白酶+亮肽素的N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液。胰蛋白酶抑制剂(大豆)的对照也包括仅N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液和含有胰蛋白酶或含有胰蛋白酶+大豆胰蛋白酶抑制剂的N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液。
6.通过用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(pH8.4-8.5)以1∶100稀释制备epicocconone溶液。
7.将上文制备的亚样品(40μL)加到96孔板上，并且加入等体积的epicocconone溶液。将所述板插入FluoStar中，在37℃孵育50分钟。
8.亚样品的荧光在Ex/Em＝540-10/630-10nm下(10次闪光)读取。
9.所述荧光值通过从所述亚样品的原始荧光中减去相应对照的基础荧光进行标准化。
10.对所述标准化的数据进行作图，并显示于图8中。
8.3数据分析和结果
图8显示了在多个时间点亚取样的胰蛋白酶消化的BSA和CA的荧光衰减。在每个亚样品中，所述胰蛋白酶活性或者被亮肽素(A)或者被大豆胰蛋白酶抑制剂(B)抑制。该替代方法的以下的可用性被测试，即用于监测牛血清白蛋白(BSA)或碳酸酐酶(CA)胰蛋白酶的消化，并且该方法产生的荧光衰减的结果与实时测试(如实施例6)得到的结果类似。
本方法中BSA和CA的消化速率似乎都比实时测试中的速率略高。这可能是由于所述抑制剂需要时间以完全抑制胰蛋白酶，或者是由于不存在荧光团时所述胰蛋白酶的消化进行得略快。
本发明的另一个实施方案包括在不存在染料的条件下进行水解消化。在本实施例中，两种蛋白质的胰蛋白酶消化可以通过以下方式进行跟踪：进行亚取样并用蛋白酶抑制剂猝灭所述消化，然后加入所述染料并测定荧光。考虑到对胰蛋白酶的抑制是时间依赖性的并且可能不完全，对BSA消化测定的准一级速率常数(0.3分钟-1)与实施例7的方法得到的(0.1-0.2分钟-1)近似。
实施例9：使用荧光报告染料实时监测对复杂蛋白质组的水解活性
9.1材料和设备
●按照上文的实施例7。
●压榨面包酵母(Compressed baker’s yeast)(Microbiogen Pty Ltd，Australia)
●NaOH(1M，Sigma-Aldrich 480878)
●FluoroProfile(Sigma-Aldrich FP0010)
9.2方法
9.2.1酵母制备
1.将一小片压榨面包酵母(100mg)用胰蛋白酶消化。
2.将所述酵母片被悬浮于2mL的1M NaOH中。然后，以2100×g离心所述样品10分钟。
3.将一份所述上清液用RO水稀释5倍以使NaOH的浓度减小至200mM。
4.使用FluorProfile试剂盒测定蛋白质含量为1.3mg/mL。
5.将小份的所述蛋白质提取物(15μL)与85μL的N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(50mM，pH8.5)混合。
6.将100μL的终酵母样品应用于胰蛋白酶消化。
9.2.2 用epicocconone实时监测酵母蛋白质组的胰蛋白酶消化
1.将100μL所述终酵母样品加入微量滴定板孔中。对照包括基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的消化缓冲液、仅胰蛋白酶样品和未消化的酵母样品(无胰蛋白酶)。
3.将epicocconone储液用50mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸稀释100倍。在每个孔中加入100μL稀释的epicocconone溶液，进行4-孔测试。FluoStar需要约30秒获得合适的设置条件。
4.以1∶20的比例加入用1mM HCl重新配制的胰蛋白酶(Sigma-AldrichT6567)。
5.使用FluoStar(Ex/Em＝540±10/630±10)每2分钟实时监测荧光发生直至400分钟。FluoStar设置如下：温度，37℃；10次闪光/循环。
6.进程曲线在Microsoft Excel中进行减去对照的处理。从仅含蛋白质的样品中减去N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液，并且从蛋白质/胰蛋白酶样品中减去胰蛋白酶+缓冲液。
7.用Prism(GraphPad v.4)对标准化的数据作图-见图13。对用epicocconone消化所述酵母蛋白质组的进程曲线进行二相指数缔合/解离(Y＝Y最大*(1-exp(-k1*X))+跨距*(exp(-k2*X))-底值)拟合，以得出k1(缔合常数)和k2(解离常数)的值。这两个值被应用于对所述酵母蛋白组的胰蛋白酶消化进行的三相指数式(等式Y＝跨距1*(1-exp(-k1*X))+跨距2*(exp(-k2*X))+跨距3*(1-exp(-k3*X))-底值)拟合，其中保持上文得到的k1和k2不变，以导出k3的值。
9.3数据分析和结果
该实施例证明了用于监测针对复杂蛋白质混合物(如非限制性的实例：酵母蛋白质组)的水解活性的方法的可用性。图9显示了利用疏水活性染料epicocconone和洗涤剂SDS通过随所述蛋白质水解的荧光减少跟踪胰蛋白酶对酵母蛋白质组的消化，从而实时监测所述消化。相反，在使用epicocconone并且无胰蛋白酶时酵母蛋白质组样品形成初始的荧光增加，这是由于epicocconone和所述蛋白质的依赖于时间的缔合；然后是慢的指数式的减少，这是由于所述荧光团和/或荧光团-蛋白质加合物(adduct)的光漂白和/或分解。这可以用二相指数式缔合/解离模拟以得到这些过程的准一级速率常数。然后可将这些值应用于通过非线性回归确定所述复杂混合物水解的准一级速率常数。来自所述二相指数式缔合/解离(实心方块)非线性拟合的留数(residue)表明，报告染料和蛋白组之间缔合的实验数据和理论吻合得很好。与之类似，三相指数式的残差(residual)显示出同样好的吻合度(实心圆)，这表明测得的复杂蛋白质组水解准一级速率常数(k3)是被精确测定的。
实施例10.存在和不存在洗涤剂时用荧光团实时监测蛋白酶解
该实施例涉及在水解的实时监测中洗涤剂对疏水活性染料的荧光输出的影响。
10.1材料和设备
●如实施例6
10.2方法
10.2.1存在和不存在SDS时用epicocconone监测碳酸酐酶(CA)的水解
10.2.1.1制备用于消化的BSA
1.在N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH8.4)中进行胰蛋白酶消化
2.用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸酸缓冲液制备10mg/mL的蛋白质样品。
3.将100μL的所述蛋白质样品应用于胰蛋白酶消化。
10.2.1.2还原和烷基化
1.在100μL蛋白质样品中加入1μL的10％SDS和5μL的DTT储液，并在80℃下维持10分钟使所述样品还原。
2.另一份样品仅用5μL的DTT储液(无SDS)在80℃下维持10分钟还原
3.在所述样品中加入4μL碘乙酰胺储液，在室温下维持45分钟至1小时使所述样品烷基化。
4.在所述样品中加入20μL的DTT，在室温下维持45分钟至1小时以中和所述样品中残余的碘乙酰胺。
10.2.2存在或不存在洗涤剂时使用荧光团实时监测胰蛋白酶的消化
10.将所述还原且变性的蛋白质样品用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液稀释10倍(25μL+225μL N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液)。
11.将100μL的CA样品(步骤1)加入96孔微量滴定板的孔中。对照包括基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的消化缓冲液、仅木瓜蛋白酶样品和未消化的样品(无木瓜蛋白酶)。所述测试由4-孔样品组组成，用于使用epicocconone的CA蛋白酶水解。
12.将epicocconone用100mM N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(pH8.4)稀释100倍。
13.在每个相应孔中加入100μL的工作荧光团溶液。需要约90秒获得合适的FluoStar增益设置。
14.在测试中，所述蛋白质样品用4μL的胰蛋白酶溶液消化。
15.使用FluoStar(Ex/Em＝540±10/630±10)每2分钟实时监测荧光发生直至400分钟。
16.进程曲线在Microsoft Excel中进行减去对照的处理。从仅包含蛋白质/染料的样品中减去缓冲液/染料，并且从蛋白质/木瓜蛋白酶/染料样品中减去木瓜蛋白酶+缓冲液/染料。
17.用Prism(GraphPad v.4)对所述标准化的数据作图并拟合-见图6。
10.3数据分析和结果
进程曲线如实施例6进行拟合(图10)。当存在非变性量的洗涤剂(空心方块)时，碳酸酐酶(CA)变得更加疏水，并且在接触例如epicocconone等环境敏感的荧光团的时候荧光增加。在加入胰蛋白酶后，所述荧光迅速减少，如上文实施例6；而对于不含SDS的样品(倒三角)，荧光变化比存在SDS时(空心圆)减小超过50％。在两种情况中观察到的速率常数相近似(0.025分钟-1)，而无SDS的样品的95％置信区间则大得多，这是因为它的信号强度要低得多。该实施例证明了少量的洗涤剂在使用疏水活性的荧光团对水解活性的实时监测中的重要性。

Claims (47)

1.一种测定水解试剂的活性的方法，包括：
步骤1：在存在一种荧光染料的条件下使一种生物分子与一种水解试剂接触，并处于使所述水解试剂能够消化所述生物分子的条件下；以及
步骤2：随时间监测所述染料的荧光，
其中荧光随时间的变化指示所述水解试剂对所述生物分子的消化。
2.一种确定水解试剂对生物分子的消化的终点的方法，包括：
步骤1：在存在一种荧光染料的条件下使一种生物分子与一种水解试剂接触，并处于使所述水解试剂能够消化所述生物分子的条件下；以及
步骤2：随时间监测所述染料的荧光变化，
其中荧光不再出现进一步的变化时即表示对所述生物分子消化的终点。
3.一种监测水解试剂对生物分子的消化的方法，包括：
步骤1：使一种生物分子与一种水解试剂接触形成反应混合物，
步骤2：使所述反应混合物的第一样品与一种荧光染料接触并测定第一样品的荧光，
步骤3：使步骤1的所述反应混合物处于使所述水解试剂能够消化所述生物分子的条件下，并
步骤4：在所述生物分子的消化过程中的所需时间点，使所述反应混合物的第二样品与一种荧光染料接触；以及
步骤5：测定所述第二样品的荧光，
其中所述第二样品的荧光相对于所述第一样品的荧光的变化，指示所述水解试剂对所述生物分子消化的程度。
4.根据权利要求3的方法，根据需要还包括下述步骤：在消化过程中还定期对所述反应混合物取样，并且在每个附加的样品中加入一种荧光染料后测定所述附加的样品的荧光。
5.根据权利要求4的方法，包括对所述混合物重复取样，加入所述染料并测定所述荧光，直至观察到的荧光不再变化。
6.根据权利要求3-5的任一项的方法，其中所述样品被猝灭。
7.一种测定和/或检测水解消化反应产物的方法，包括：
步骤1：对一种生物分子进行水解消化以获得蛋白或肽片段，
步骤2：使所述蛋白或肽片段与一种荧光染料接触，以及
步骤3：检测所述染料的荧光变化。
其中所述的染料的荧光变化与所述蛋白或肽片段的量成比例。
8.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述生物分子是生物大分子。
9.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述生物分子是可水解的。
10.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述生物分子选自于：碳水化合物、寡核苷酸、蛋白质、肽、脂质，以及它们的混合物。
11.根据权利要求10的方法，其中所述生物分子存在于基因组、蛋白质组或细胞提取物中。
12.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述水解试剂改变了所述生物分子的疏水性。
13.根据前述权利要求任一项的方法，其中加入非变性量的洗涤剂。
14.根据权利要求13的方法，其中所述洗涤剂选自于：SDS、LDS、曲拉通X-100、CHAPS、ALS、CTAB、DDAO和DOC。
15.根据权利要求13或权利要求14的方法，其中所述洗涤剂的加入改变了所述生物分子的疏水性，从而影响所述荧光染料与所述生物分子的结合。
16.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述水解试剂是酶。
17.根据权利要求1-15任一项的方法，其中所述水解试剂是能够在至少一个位置切割所述生物分子的蛋白酶、酯酶、糖基化酶、磷酸酶或核酸酶。
18.根据权利要求17的方法，其中所述蛋白酶选自于：氨肽酶、二肽酶、二肽基肽酶和三肽基肽酶、肽基二肽酶、丝氨酸型羧肽酶、金属羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、ω肽酶、丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸内肽酶、金属内肽酶、苏氨酸内肽酶。
19.根据权利要求17的方法，其中所述酯酶选自于：羧酸酯水解酶、硫酯水解酶、磷酸单酯水解酶、磷酸二酯水解酶、三磷酸单酯水解酶、硫酸酯水解酶、二磷酸单酯水解酶、磷酸三酯水解酶、产生5’-磷酸单酯的脱氧核糖核酸外切酶、产生5’-磷酸单酯的核糖核酸外切酶、产生3’-磷酸单酯的核糖核酸外切酶、对核糖核酸或脱氧核糖核酸有活性的外切核酸酶、对核糖核酸或脱氧核糖核酸有活性的外切核酸酶、产生5’-磷酸单酯的脱氧核糖核酸内切酶、产生非5’-磷酸单酯的脱氧核糖核酸内切酶、对改变的碱基具有特异性的位点特异性脱氧核糖核酸内切酶、产生5’-磷酸单酯的核糖核酸内切酶、产生非5’-磷酸单酯的核糖核酸内切酶、对核糖核酸或脱氧核糖核酸有活性的核糖核酸内切酶、对核糖核酸或脱氧核糖核酸有活性的核糖核酸内切酶。
20.根据权利要求17的方法，其中所述糖基化酶选自于糖苷酶(水解N-糖基、O-糖基和S-糖基基团的酶)。
21.根据权利要求7-20任一项的方法，其中所述荧光染料与所述生物分子疏水地结合或相互作用。
22.根据权利要求21的方法，其中所述荧光染料对其环境的亲脂性的反应是其荧光行为的显著改变。
23.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述荧光染料选自于：epicocconone、花青染料、laurdan/prodan家族染料、dapoxyl衍生物、芘染料、二苯己三烯衍生物、ANS及其类似物、苯乙烯染料、两亲荧光素、罗丹明和香豆素。
24.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述荧光染料选自于：epicocconone、SYTOX绿、Hoechst 33342、碘化丙啶、BODIPY FL C5神经酰胺、5-十八酰基氨基荧光素、SYPRO橙和尼罗红。
25.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述水解在存在一种缓冲剂的条件下进行。
26.根据权利要求25的方法，其中所述缓冲剂是一种Good缓冲剂。
27.根据权利要求25的方法，其中所述缓冲剂是一种N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲剂。
28.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述生物分子的水解基本上不受所述荧光染料的影响。
29.根据前述权利要求任一项的方法，其中随时间测定荧光以提供表示反应速率系数的数据。
30.根据前述权利要求任一项的方法，其中在达到终点时终止消化。
31.根据权利要求30的方法，其中在终止消化以后进一步分析所述反应混合物。
32.根据权利要求31的方法，其中进一步分析选自于：肽质量指纹谱法(PMF)、肽谱法和HPLC。
33.根据前述权利要求任一项的方法，还包括在所述荧光染料中加入碱。
34.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述生物分子来自生物样品或食品样品。
35.根据权利要求34的方法，其中所述生物分子是蛋白质或蛋白质的混合物。
36.根据权利要求34的方法，其中所述生物分子是碳水化合物或碳水化合物的混合物。
37.根据权利要求34的方法，其中所述生物分子是糖蛋白或淀粉。
38.根据权利要求34的方法，其中所述生物分子是脂质。
39.根据权利要求34的方法，其中所述生物分子是植物油。
40.根据权利要求34的方法，其中所述生物分子是寡核苷酸。
41.根据权利要求34的方法，其中所述生物分子是DNA。
42.一种用于根据前述权利要求任一项的方法中的试剂盒，包括：
荧光染料，
一种或多种水解试剂，
任选地包括所述水解试剂的标准底物，和
如何使用所述试剂盒监测所述生物分子的消化的说明书。
43.根据权利要求42的试剂盒，还包括标准蛋白质或肽底物。
44.根据权利要求43的试剂盒，其中所述底物选自于：BSA、脱铁运铁蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、碳酸酐酶、胎球蛋白、鲑鱼精DNA、可溶淀粉和橄榄油。
45.根据权利要求42-44任一项的试剂盒，还包括缓冲剂。
46.根据权利要求45的试剂盒，其中所述缓冲剂是一种Good缓冲剂。
47.根据权利要求45的试剂盒，其中所述缓冲剂是一种N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲剂。
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