CN101340926A - 治疗重症肌无力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合补体蛋白C5的药剂在治疗与不适当的补体激活有关的疾病尤其是在治疗重症肌无力中的用途。

Description

治疗重症肌无力的方法
本发明涉及结合补体蛋白C5的药剂在治疗与不适当的补体激活有关的疾病尤其是在治疗重症肌无力中的用途。
在本文中提及的以及在说明书结尾所列的所有文献通过参考并入本文。
背景技术
补体系统是身体抵抗外来入侵的天然防御机制的基本组成部分，并且还参与炎症过程。在血清中和细胞表面有超过30种蛋白质参与补体系统功能和调节。最近，已经清楚，有～35种已知的补体系统成员可以与有益过程和病理过程相关联，补体系统本身与至少85种具有不同功能的生物学途径相互作用，比如血管发生、血小板活化、葡萄糖代谢和精子发生(Mastellos，D.，et al.，Clin Immunol，2005.115(3)p.225-35)。
外源抗原的存在激活补体系统。存在三种激活途径：(1)通过IgM和IgG复合物或者通过糖类识别激活的经典途径；(2)通过非自身表面(缺少特异性调节分子)和通过细菌内毒素活化的旁路途径；和(3)通过结合甘露聚糖的凝集素(manna-binding lectin，MBL)与病原表面上的甘露糖残基结合激活的凝集素途径。这三种途径包括并行级联事件，其通过在细胞表面上形成相似的C3和C5转化酶导致产生补体激活，从而导致急性炎症介质(C3a和C5a)释放和膜攻击复合物(MAC)的形成。在图1中显示涉及经典和旁路途径的并行级联。
在某些情形下补体可以被不适当地激活，导致不希望的局部组织破坏。已显示出不适当的补体激活在许多种疾病和病症中起作用，所述疾病和病症包括急性胰腺炎、阿耳茨海默氏病、变应性脑脊髓炎、异体移植、哮喘、成人型呼吸窘迫综合征、烧伤、克罗恩氏病、肾小球肾炎、溶血性贫血、血液透析、遗传性血管性水肿、缺血再灌注损伤、多系统器官衰竭、多发性硬化、重症肌无力、缺血性卒中、心肌梗塞、银屑病、类风湿性关节炎、感染性休克、系统性红斑狼疮、中风、血管渗漏综合征、移植排斥和心肺旁路术中不适当的免疫应答。因此，多年以来不适当激活的补体系统被作为治疗性介入的靶标，靶向补体级联反应不同部分的多种补体抑制剂正在开发用于治疗用途。
在缺血性卒中和心肌梗塞中，身体识别脑或心脏中的死组织作为外源物并且激活补体，从而引起进一步的局部损伤。相似地，在心肺转流术中，身体将仪器中的塑料表面识别为外源物，激活补体，可导致血管损伤。在自身免疫疾病中，身体可以错误地将自身识别为外源物，激活补体，并引起局部组织损伤(例如，在类风湿性关节炎中的关节破坏和在重症肌无力中的肌无力)。
重症肌无力是一种慢性自身免疫病，导致进行性疲劳(progressivefatigue)、肌肉张力丧失和麻痹增加。这些症状是由补体的不适当激活所引起的，其导致针对烟碱型乙酰胆碱受体(AchR)的免疫应答，其进而导致神经肌肉传导减少。重症肌无力的发生可与其它疾病相关联，比如胸腺肿瘤或甲状腺毒症，以及类风湿性关节炎和红斑狼疮。
目前对于重症肌无力还不能治愈。起初通常应用帮助改善神经肌肉传导和增加肌肉力量的抗胆碱酯酶剂比如溴新斯的明(Prostigmin)和溴吡斯的明(Mestinon)治疗该病。然而，应用抗胆碱酯酶剂的治疗与由乙酰胆碱累积引起的有害副作用相关，包括胃肠不适和支气管和口腔分泌物增加。此外，尽管抗胆碱酯酶剂通常提供症状上的改善，但是它们对该疾病的病程没有作用。对抗胆碱酯酶剂没有反应的患者还可以应用长期免疫抑制药物比如皮质类固醇泼尼松或者其它免疫抑制药物比如环孢霉素、硫唑嘌呤和环磷酰胺进行治疗。不过，这些免疫抑制药物与严重的副作用有关。皮质类固醇类的副作用包括体重增加、骨质疏松、高血压和青光眼。硫唑嘌呤和环孢霉素与肝功能障碍和恶性肿瘤风险增加相关。在一些情形中，推荐胸腺切除术作为药物的替代方案，但是其反应是不可预测的并且在术后所述疾病症状可持续数月或数年。
通过用纯化的AChR或抗AChR抗体免疫可以在动物模型中诱导实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)，这些模型可用于评价补体抑制剂对所述疾病进展的作用。补体抑制剂可溶性补体受体1(sCR1)已经显示出延迟体重减少和减轻EAMG的临床体征，这表明这种分子可用于治疗重症肌无力(Piddlesden et al.，J.Neuroimmunol.，1996，71：173-177)。然而，为达到这些效果必需每天注射sCR1，并且尽管sCR1降低了体重减轻，但是不能完全地阻止。因此sCR1不能完全地阻止重症肌无力的症状。
此外，sCR1通过结合补体级联反应的早期产物C3b和C4b发挥作用。补体系统在防御病原体中发挥重要的和有价值的作用，该级联反应的许多早期副产物在病原微生物的识别和调理作用中是重要的。因此，认为在经典和旁路途径的较早阶段进行治疗性介入具有增加微生物感染易感性的风险(Roos，A.，et al.，Immunobiology，2002，205(4-5)：p.595-609)。
因此，非常需要用于改善目前可用的重症肌无力治疗的药剂。
发明内容
因此，本发明提供了一种治疗或预防重症肌无力的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗或预防有效量的结合补体C5的药剂。
本发明还提供治疗或预防有效量的结合补体C5的药剂在制备用于治疗或预防重症肌无力的药物上的用途。
优选地，所述药剂具有阻止C5转化酶将补体C5切割成补体C5a和补体C5b-9的作用。
补体C5蛋白，在本文也被称为C5，由C5转化酶所切割，其本身是从C3a形成的，C3a是所述旁路途径的一种较早期产物(图1)。这种切割产物包括过敏毒素C5a和裂解复合物C5b-9，其也被称为膜攻击复合物(membrane attack complex，MAC)。C5a是一种高活性肽，其涉及许多病理炎症过程，包括嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞趋化性、嗜中性粒细胞活化、毛细血管通透性增加和嗜中性粒细胞凋亡抑制(Guo，R.F.and P.A.Ward，Annu Rev Immunol，2005，23：p.821-52)。
MAC与其它一些重要的病理过程相关，包括类风湿性关节炎(Neumann，E.，et al.，Arthritis Rheum，2002.46(4)：p.934-45；Williams，A.S.，et al.，Arthritis Rheum，2004，50(9)：p.3035-44)、增生性肾小球肾炎(Quigg，R.J.，Curr Dir Autoimmun，2004.7：p.165-80)、特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy)(Papagianni，A.A.，et al.，NephrolDial Transplant，2002，17(1)：p.57-63)、蛋白尿(proteinurea)(He，C，et al.，J Immunol，2005.174(9)：p.5750-7)、急性轴突损伤后的脱髓鞘病(Mead，R.J.，et al.，J Immunol，2002.168(1)：p.458-65)并且还引起异种移植后的急性移植物排斥(Nakashima，S.，et al.，J Immunol，2002.169(8)：p.4620-7)。
C5a已成为补体相关病症领域中特别关注的靶标(Mizuno，M.and D.S.Cole，Expert Opin Investig Drugs，2005.14(7)：p.807-21)。尽管C5a具有许多被充分认可的病理学相关性，但是在人体中去除C5a的影响似乎比较有限。已经开发出结合并抑制C5a或C5a受体的单克隆抗体和小分子来治疗多种自身免疫疾病。然而，这些分子不能阻止MAC的释放。
相对而言，根据本发明第一方面施用结合C5的药剂既抑制C5a肽又抑制MAC。意想不到的是，发现对C5a和MAC的抑制完全地减轻了与重症肌无力有关的临床症状。此外，因为C5是经典和旁路补体途径的晚期产物，所以对C5的抑制更少可能与并发感染的风险相关，而这种风险在靶向所述级联反应的较早期产物时是存在的(Allegretti，M.，et al.，CurrMed Chem，2005.12(2)：p.217-36)。
通过本领域已知的标准体外测定，例如在将凝胶上的蛋白质与已标记的C5一起孵育之后进行western印迹，可以确定药剂结合C5的能力。优选地，根据本发明的药剂以小于0.2mg/ml、优选小于0.1mg/ml、优选小于0.05mg/ml、优选小于0.04mg/ml、优选小于0.03mg/ml、优选0.02mg/ml、优选小于1μg/ml、优选小于100ng/ml、优选小于10ng/ml、更优选小于1ng/ml的IC50结合C5。
优选地，结合C5的所述药剂来自食血节肢动物。术语“食血节肢动物”包括所有从适合的宿主摄血为食的节肢动物，比如昆虫、蜱(ticks)、虱(lice)、跳蚤(fleas)和螨(mites)。优选地，所述药剂来自于蜱、优选源于毛白钝缘蜱(Ornithodoros moubata)。
根据本发明的一个实施方案，结合C5的所述药剂是一种包含图2中氨基酸序列第19至168位氨基酸的蛋白质，或者是此蛋白质的功能等价物。结合C5的所述药剂可以是由图2中氨基酸序列第19至168位氨基酸组成的蛋白质，或者是此蛋白质的功能等价物。
根据一个替代实施方案，根据本发明此实施方案使用的蛋白质可以包含图2中氨基酸序列第1至168位氨基酸或者由其组成，或者是其功能等价物。在图2中给出的蛋白质序列的前18个氨基酸形成对于C5结合活性并非必需的信号序列，因此，可以任选地将其舍弃，例如为了重组蛋白质生成的效率。
具有图2中给出的氨基酸序列的蛋白质，在本文中也被称为EV576蛋白，分离自毛白钝缘蜱的唾液腺。EV576是脂质运载蛋白(lipocalin)家族的较远成员(outlying member)，是第一个显示出抑制补体激活的脂质运载蛋白家族成员。通过结合C5并阻止C5转化酶将其切割成补体C5a和补体C5b-9，从而抑制C5a肽和MAC的作用，EV576蛋白抑制旁路、经典和凝集素补体途径。本文使用的术语“EV576蛋白”是指有或没有信号序列的图2中给出的序列。
在WO2004/106369中公开了EV576蛋白和这种蛋白质抑制补体激活的能力，其中EV576蛋白被称为“OmCI蛋白”。现已发现EV576蛋白在治疗和预防重症肌无力中出乎意料的有效。本文给出的数据证明，单注射EV576在至少7天中完全地减轻了EAMG小鼠的体重降低和肌无力。因此，EV576比sCR1在治疗和预防EAMG中更加有效，如上所述，sCR1在每天施用时只减轻重症肌无力的临床症状(Piddlesden et al，J.Neuroimmunol.，1996，71：173-177)。EV576在治疗重症肌无力中出乎意料的有效似乎是由于它通过结合C5因此抑制C5a和MAC的活性发挥作用。此外，本文给出的数据证明rEV576在早期轻度重症肌无力和晚期严重重症肌无力危象模型中是有效的。
根据本发明的另一实施方案，所述药剂可以是编码EV576蛋白或其功能等价物的核酸分子。例如，可以应用基因疗法实现在体内或者离体由对象的相关细胞内源性产生EV576蛋白。另一方法是施用“裸DNA”，其中治疗基因被直接注入血流或肌肉组织中。
优选地，这种核酸分子包含图2中核苷酸序列的第53至507位碱基，或者由其组成。该核苷酸序列编码没有信号序列的图2中的EV576蛋白。图2中核苷酸序列的前54个碱基编码对于补体抑制活性不是必需的信号序列。或者，所述核酸分子可以包含图2中核酸序列的第1至507位碱基，或者由其组成，所述核酸分子编码具有信号序列的所述蛋白质。
已证明EV576蛋白在大鼠、小鼠和人血清中结合C5并阻止C5转化酶对其的切割，其具有约0.02mg/ml的IC50。优选地，EV576蛋白的功能等价物保留有结合C5的能力，其IC50值小于0.2mg/ml、优选小于0.1mg/ml、优选小于0.05mg/ml、优选小于0.02mg/ml、优选小于1μg/ml、优选小于100ng/ml、优选小于10ng/ml、更优选小于1ng/ml。
已发现在大鼠中125I标记的EV576的血清β半衰期为30-38小时。优选地，EV576蛋白和其功能等价物保留大于20小时、优选大于25小时、优选大于30小时、优选大于40小时、优选大于50小时、优选大于100小时的半衰期。
在一个方面，本文使用术语“功能等价物”描述EV576蛋白的同源物和片段，其保留结合C5并阻止C5转化酶将补体C5切割成补体C5a和补体C5b-9的能力。术语“功能等价物”也表示在结构上相似于EV576蛋白的或者含有相似或相同三级结构(尤其是在结合C5的EV576蛋白的一个或多个活性位点环境中)的分子，比如合成的分子。
术语“同源物”意指包括由图2明确所示的EV576序列的旁系同源物(paralogues)和直系同源物(orthologues)，包括例如来自其它蜱物种的EV576蛋白序列，所述蜱物种包括具尾扇头蜱(Rhipicephalusappendiculatus)、血红扇头蜱(R.sanguineus)、囊状扇头蜱(R.bursa)、美洲钝眼蜱(A.americanum)、卡延钝眼蜱(A.cajennense)、希伯来钝眼蜱(A.hebraeum)、微小牛蜱(Boophilus microplus)、具环牛蜱(B.annulatus)、消色牛蜱(B.decoloratus)、网纹革蜱(Dermacentorreticulatus)、安德逊氏革蜱(D.andersoni)、边缘革蜱(D.marginatus)、变异革蜱(D.variabilis)、铁角血蜱(Haemaphysalis inermis)、Ha.leachii、Ha.punctata、小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)、骆驼璃眼蜱(Hy.dromedarii)、边缘璃眼蜱(Hy.marginatum marginatum)、蓖子硬蜱(Ixodes ricinus)、全沟硬蜱(I.persulcatus)、肩突硬蜱(I.scapularis)、六角形硬蜱(I.hexagonus)、波斯锐缘蜱(Argaspersicus)、鸽锐缘蜱(A.reflexus)、Ornithodoros erraticus、毛白钝缘蜱(O.moubata moubata)、O.m.porcinus、和O.savignyi。术语“同源物”意思包括来自蚊物种，所述蚊物种包括库蚊属(Culex)、按蚊属(Anopheles)和伊蚊属(Aedes)、尤其是致乏库蚊(Culex quinquefasciatus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)；跳蚤(flea)物种，比如猫蚤(Ctenocephalidesfelis)(猫跳蚤)；马蝇(horseflies)；白蛉(sandflies)；墨蚊(blackflies)；舌蝇(tsetse flies)；虱(lice)；螨(mites)；蛭(leeches)；和扁虫(flatworms)、的等价EV576蛋白序列。天然的EV576蛋白被认为以约18kDa的另外三种形式存在于毛白钝缘蜱(O.moubata)中，术语“同源物”意思还包括EV576的这些替代形式。
鉴定图2所示EV576序列的同源物的方法对于本领域技术人员是显而易见的。例如，可以通过对公共和私人序列数据库的同源搜索鉴定同源物。便利地是，可以应用公共数据库，但是私人或商用数据库同样是可用的，尤其是如果它们包含公用数据库所没有的数据时。一级数据库是保存一级核苷酸或氨基酸序列数据的网站并且可以是公用或商用的。公用的一级数据库的实例包括GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EMBL数据库(http://www.ebi.ac.uk/)、DDBJ数据库(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)、SWISS-PROT  蛋白质数据库(http://expasy.hcuge.ch/)、PIR(http://pir.georgetown.edu/)、TrEMBL(http://www.ebi.ac.uk/)、TIGR数据库(见http://www.tigr.org/tdb/index.html)、NRL-3D数据库(http://www.nbrfa.georgetown.edu)、the Protein Data Base(http://www.rcsb.org/pdb)、NRDB数据库(ftp://ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README)、OWL数据库(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/)以及二级数据库PROSITE(http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html)、PRINTS(http://iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html)、Profiles(http://ulrec3.unil.ch/software/PFSCAN_form.html)、Pfam(http://www.sanger.ac.uk/software/pfam)、Identify(http://dna.stanford.edu/identify/)和Blocks(http://www.blocks.fhcrc.org)数据库。商用数据库或私人数据库的实例包括PathoGenome(GenomeTherapeutics Inc.)和PathoSeq(Incyte Pharmaceuticals Inc.)。
典型地，两个多肽之间(优选特定区域比如活性位点)大于30％的一致性被认为标志着功能上等价，因此标志着两个蛋白质是同源物。优选地，同源蛋白质具有与图2中确定的EV576蛋白大于60％的序列一致性。更优选的同源物分别具有与图2中给出的EV576蛋白大于70％、80％、90％、95％、98％或99％的一致性。本文所指的一致性百分率是使用2.1.3版BLAST并采用NCBI(the National Center for Biotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数[Blosum 62矩阵；缺口罚分(gap open ρenalty)＝11和缺口延伸罚分(gap extension penalty)＝1]所确定的。
图2中给出的EV576蛋白序列的同源物包括含有对野生型序列的氨基酸替换、插入或缺失例如1个、2个、3个、4个、5个、7个、10个或更多个氨基酸的突变体，前提是这样的突变体保留结合C5的能力。因此突变体包括含有不以有害形式影响所述蛋白质功能或活性的保守氨基酸替换的蛋白质。该术语意思还包括天然生物学变体(例如，EV576蛋白来源物种中的等位基因变体或地理变异)。还可以通过在所述蛋白质序列中对特定残基进行系统性或定向突变来设计具有改善的结合C5能力的突变体。
只要EV576蛋白和EV576蛋白同源物的片段保留结合C5的能力，这样的片段也包含在术语“功能等价物”的范围内。片段可以包括例如源于EV576蛋白序列的多肽，其小于150个氨基酸、小于125个氨基酸、小于100个氨基酸、小于75个氨基酸、小于50个氨基酸、或甚至等于或小于25个氨基酸，只要这些片段保留结合补体C5的能力。所包括的这些片段不但可以是本文图2中明确给出的毛白钝缘蜱(O.moubata)EV576蛋白的片段，还可以是如上所述的此蛋白质同源物的片段。这样的同源物的片段通常与图2的EV576蛋白序列片段具有大于60％的一致性，更优选的同源物的片段分别与图2的EV576蛋白序列片段具有大于70％、80％、90％、95％、98％或99％的一致性。当然，可以通过对野生型序列的系统性突变或者片段化接着通过适当的活性测定来合理设计有改善的片段。片段对C5可以展示出与EV576相似的或更大的亲和性，并且对C5可以具有相等的或更大的IC50。
根据本发明使用的功能等价物可以是融合蛋白质，其可通过例如将编码EV576蛋白的多核苷酸框内(in frame)克隆至编码异源蛋白质序列的序列中获得。本文使用的术语“异源”意指不同于EV576蛋白或其功能等价物的任何多肽。可包含在可溶性融合蛋白质N-或C-端的异源序列的实例如下：膜结合蛋白质的细胞外结构域、免疫球蛋白恒定区(Fc区)、多聚化结构域、细胞外蛋白质结构域、信号序列、输出序列、或允许通过亲和色谱纯化的序列。许多这些异源序列可在表达质粒中商品化供应，因为这些序列通常包含在融合蛋白质中以提供其它特性而又不明显损害它们融合的蛋白质的特定生物活性(Terpe K，Appl Microbiol Biotechnol，60：523-33，2003)。这些其它特性的实例有在体液中持续更长的半衰期、细胞外定位、或者允许依靠标签(tag)(比如组氨酸或HA标签)进行较容易的纯化步骤。
可以通过在宿主细胞中表达，以重组形式制备EV576蛋白和其功能等价物。这样的表达方法对于本领域的技术人员是众所周知的，并且Sambrook et al(2000)和Fernandez&Hoeffler(1998)进行了详细的描述。EV576蛋白和其功能等价物的重组形式优选是未糖基化的。
还可以使用蛋白质化学的常规技术制备本发明的蛋白质和片段。例如，可以通过化学合成制备蛋白质片段。生产融合蛋白质的方法在本领域中是标准的，并且对于本领域技术人员是公知的。例如，在Sambrook et al.(2000)或Ausubel et al.(1991)中可以找到大多数常规的分子生物学、微生物学重组DNA技术和免疫技术。
按本发明的方法或用途施用结合C5的药剂的对象优选是哺乳动物，优选人。施用结合C5的药剂的对象还可以患有与重症肌无力相关的其它疾病比如胸腺肿瘤、甲状腺毒症、类风湿性关节炎和红斑狼疮。
以治疗或预防有效量施用所述药剂。术语“治疗有效量”意指治疗或改善目标疾病所需的药剂的量。本文使用的术语“预防有效量”意指预防目标疾病所需的药剂的量。
优选地，所述药剂的剂量足以结合对象中尽可能多的可利用C5、更优选所有可利用的C5。优选地，所提供药剂的剂量是结合对象中所有可利用C5所需摩尔剂量的至少两倍。所提供药剂的剂量可以是结合对象中所有可利用C5所需摩尔剂量的2.5倍、3倍或4倍。在一个实施方案中，所述剂量是从1mg/kg至15mg/kg。优选地，所述剂量是从1mg/kg(药物质量比患者质量)至10mg/kg、优选2mg/kg至8mg/kg。
需要施用药剂的频率将取决于所涉及药剂的半衰期。当所述药剂是EV576蛋白或其功能等价物时，施用剂量可以基于每天一次、每天两次、或每两天、三天、四天、五天、六天、七天、10天、15天或20天或更多天一次。
确切的剂量和施用频率还可取决于患者在施用时的状态。确定剂量时可以考虑的因素包括患者疾病状态的严重程度、患者的整体健康情况、年龄、体重、性别、饮食、施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和患者对治疗的耐受性或反应。通过常规试验可以确定准确的量，但是最终可取决于临床医生的判断。
通常所述药剂作为药学可接受载体的一部分来施用。本文使用的术语“药学可接受载体”包括基因、多肽、抗体、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸和无活性病毒颗粒，或者实际上任何其它药剂，只要所述载体本身不诱导毒性作用或致使产生对接受所述药物组合物的个体有害的抗体即可。药学可接受载体可另外含有液体比如水、盐水、甘油、乙醇或辅助物质比如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物等。因此，所用的药物载体将取决于施用途径而有所不同。载体能够使所述药物组合物配制成片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、膏剂(slurries)、混悬剂，以帮助患者的摄取。在Remington Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可以找到对药学可接受载体的详细论述。
可以通过任何已知的施用途径递送所述药剂。可以通过胃肠外途径(例如，通过皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射，或者递送至组织间隙)递送所述药剂。还可以将所述组合物施用至损伤中。其它施用模式包括口服和肺部施用、栓剂、和透皮或经皮施用、针和无针注射(hypospray)。
结合C5的药剂可以单独施用，或者作为治疗方案一部分施用，所述治疗方案还包括施用目前用于治疗重症肌无力患者的其它药物。例如，可以联合抗胆碱酯酶剂(比如新斯的明和吡斯的明)或免疫抑制药物(比如泼尼松、环孢霉素和硫唑嘌呤)施用所述药剂。联合药物治疗对治疗所述疾病可具有加和或协同作用。
因此，本发明提供(i)结合C5的药剂，优选EV576蛋白或其功能等价物，和(ii)抗胆碱酯酶剂和/或免疫抑制药物，用于治疗用途。
本发明还提供(i)结合C5的药剂，优选EV576蛋白或其功能等价物，和(ii)抗胆碱酯酶剂和/或免疫抑制药物在制备治疗重症肌无力药物中的用途。
可以与其它药物同时、依次或者分别地施用结合C5的药剂。例如，可以在施用其它药物之前或之后施用结合C5的药剂。
因此本发明提供了结合C5的药剂，优选EV576蛋白或其功能等价物，在制备用于治疗对象中重症肌无力的药物中的用途，其中所述对象之前已用抗胆碱酯酶剂和/或免疫抑制药物预先治疗过。本发明还提供了抗胆碱酯酶剂和/或免疫抑制药物在制备用于治疗对象中重症肌无力的药物中的用途，其中所述对象已用结合C5的药剂，优选EV576蛋白或其功能等价物预先治疗过。
结合C5的药剂还可以作为治疗方案的一部分施用，所述治疗方案还包括施用目前用于治疗与重症肌无力相关的其它疾病的其它药物，所述其它疾病比如胸腺肿瘤、甲状腺毒症、类风湿性关节炎和红斑狼疮。可以与所述其它药物同时、依次或分别地施用结合C5的药剂。例如，可以在施用所述其它药物之前或之后施用结合C5的药剂。
现将更详细地举例说明本发明的多个方面和实施方案。应当理解，对本发明细节的修改并不脱离本发明的范围。
附图说明
图1：补体激活的经典和旁路途径的示意图。暗灰色表示酶组分。过敏毒素被星状图所围绕。
图2：EV576的一级序列。下划线表示信号序列。粗体表示半胱氨酸残基。在右侧指示核苷酸和氨基酸数目。
图3：从蜱唾液腺提取物(SGE)纯化EV576。A)阴离子交换色谱。B)级分的常规溶血测定。C)还原SDS-PAGE。D)RP-HPLC。
图4：EV576的作用机制。A)对C3a生成没有作用。B)阻止C5a生成。C)直接结合C5。
图5：重组EV576。A)重组EV576(rEV576)与天然EV576同样有效地抑制补体。B)EV576的结构。
图6：rEV576在实验性重症肌无力模型中的作用。A)与对照动物相比，rEV576阻止体重减轻。B)与对照动物相比，用rEV576治疗的动物的临床评分。C)临床评分的原始数据。
图7：rEV576在慢性实验重症肌无力模型中的作用。A)与对照动物相比，在具有严重EAMG的动物中，rEV576阻止体重减轻和死亡。B)与对照动物相比，在具有严重EAMG的动物中，rEV576治疗对临床评分和握力(grip strength)有明显的改善。C)与对照动物相比，在具有轻度EAMG的动物中，rEV576阻止体重减轻。
图8：rEV576在慢性实验性重症肌无力模型中的作用。A)在经过治疗的、未经治疗的、轻度的EAMG或严重的EAMG组之间，AchR抗体未显示出差异。B)来自表现出严重和轻度EAMG大鼠的大鼠血清中总补体溶血活性。
图9：rEV576在慢性实验性重症肌无力模型中的作用。A)来自表现出严重EAMG大鼠的大鼠血清的细胞毒性。B)来自表现出轻度EAMG大鼠的大鼠血清的细胞毒性。
实施例
1.作用机制和抑制浓度
如WO2004/106369所公开的，通过对经常规溶血测定发现含有补体抑制活性的唾液腺提取物级分进行SDS-PAGE和RP-HPLC(图3)，从软蜱(soft tick)毛白钝缘蜱(Orthinodoros moubata)的唾液腺提取物中纯化EV576。
EV576抑制人和豚鼠的经典和旁路途径。它对C3a生成的速率没有影响(图4A)，但是阻止将C5切割成C5a(图4B)。
EV576抑制经典的和旁路补体途径的能力是由于该分子与补体C5结合所致，其中C5是C5a和C5b-9的前体。EV576直接结合C5(图4C)，IC50约为0.02mg/ml。确切的结合机制和血清因子所起的辅助作用(如果有的话)正在研究之中。
去除糖基化位点(否则在酵母表达系统中发生糖基化)的重组EV576(rEV576)与天然非糖基化蛋白质一样有活性(图5A)。
EV576的结构确认它是脂质运载蛋白家族的一种较远的成员(图5B)，与moubatin具有46％的一致性，后者是来自毛白钝缘蜱(O.moubata)的一种血小板凝集抑制因子。脂质运载蛋白是一大组的软蜱蛋白质，除了很少的几种之外它们的功能是未知的。
2.半衰期
发现在大鼠中125I标记的rEV576的血清β半衰期约为30-38小时。
3.EV576对实验性自身免疫性重症肌无力的作用
试验1
按照Piddlesden et al.(如上)的方法，在雌性Lewis大鼠中诱导实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)。
在第0天给Lewis大鼠腹膜内注射1mg/kg的抗-AchR mAb35，并连同注射：i)3.25mg rEV576(经计算为结合所有可用C5所需要的摩尔剂量的2.5倍)；或者ii)PBS。在7天中评价大鼠的体重和临床评分的变化。(图6)
与对照相比，注射3.25mg的rEV576完全地减轻了mAb35诱导的体重减轻和肌无力。
在诱导后72小时所有对照动物都变得濒临死亡并且不得不实施安乐死，而所有经rEV576治疗的动物都存活下来，体重增加并且在实验期间(183小时)没有表现出肌无力(图6)。
因此单次注射rEV576在至少7天中完全地减轻了EAMG的症状。
试验2
在慢性EAMG模型中进一步对rEV576进行分析。在该模型中，动物接受完全弗氏佐剂(CFA)中的乙酰胆碱受体蛋白并且在约30天的过程中产生它们自己的抗体。该模型模拟人的情形，其中症状的发生和发展相对缓慢。
通过皮下注射纯化的乙酰胆碱受体蛋白(2×100μl PBS中20μg乙酰胆碱受体蛋白，所述蛋白溶液在等体积的完全弗氏佐剂+灭活的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)-0.5mg中乳化)免疫18只Lewis大鼠。对照大鼠只注射PBS。
疾病发作(EAMG 临床评分1或2并且体重减轻＜15％)之后，给9只大鼠腹膜内(i.p.)注射3.25mg的rEV576，治疗持续10天，每12小时注射1mg。在这9只大鼠中，三只大鼠被评价为具有严重的肌无力(s-EAMG)和六只大鼠具有轻度的肌无力(M-EAMG)。
余下的9只大鼠未经处理。这9只大鼠中，四只大鼠被评估为具有严重的肌无力(S-EAMG)，五只大鼠具有轻度的肌无力(M-EAMG)。
在10天中，评价这两组大鼠的体重、握力和临床评分的变化。
在严重EAMG组中的大鼠，它们的体重减轻12％并且在用rEV576治疗开始时起的24小时内死亡。未经治疗的大鼠在24时内全部死亡。经rEV576治疗的大鼠显示出在体重减轻方面明显的减少。在第33天开始用rEV576治疗时，平均临床评分是2.0。10天的rEV576注射减轻了临床症状的严重性并且还阻止了体重的减轻(图7A)。这些大鼠还显示出在握力方面的明显改善(图7B)。
在显示出轻度早期EAMG的大鼠中，在第33天刚开始出现临床征象并且体重刚开始降低。rEV576治疗阻止大鼠体重的减轻并且大鼠体重平均增加3.43％。具有同样临床评分的未经治疗的动物体重减轻约4.59％(图7C)。与表现出轻度早期EAMG的未经治疗的大鼠相比，在经过治疗的大鼠中握力没有改善(数据未显示)。
从所述大鼠中收集血，用于检测AchR抗体和评价补体溶血活性。在各实验组之间，通过直接ELISA检测的AchR抗体没有差异(图8A)。来自经rEV576治疗的显示严重和轻度EAMG大鼠的大鼠血清完全抑制补体的活性(图8B)。
此外，在横纹肌肉瘤细胞系(ATCC，CCL-136)上应用ToxiLightBioassay Kit测定来自显示严重和轻度EAMG大鼠的大鼠血清的细胞毒性。如在图9A和9B中所能看到的，在具有严重EAMG的未经治疗的大鼠中检测到最高的细胞毒性。用rEV576治疗的动物显示出细胞毒活性明显降低。
该数据表明rEV576可以有效用于治疗早期轻度重症肌无力和严重晚期疾病(例如肌无力危象)。
序列表
<110>发展技术有限公司
<120>治疗重症肌无力的方法
<130>P041905WO
<150>0518443.7
<151>2005-09-09
<160>2
<170>SeqWin99，version 1.02
<210>1
<211>507
<212>DNA
<213>白毛钝缘蜱
<400>1
atgctggttt tggtgaccct gattttctcc ttttctgcga acatcgcata tgctgacagc    60
gaaagcgact gcactggaag cgaacctgtt gacgccttcc aagctttcag tgagggcaaa    120
gaggcatatg tcctggtgag gtccacggat cccaaagcga gggactgctt gaaaggagsa    180
ccagccggag aaaagcagga caacacgttg ccggtgatga tgacgtttaa gaatggcaca    240
gsctgggctt caaccgattg gacgtttact ttggacggcg caaaggtaac ggcaaccctt    300
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<210>2
<211>168
<212>PRT
<213>白毛钝缘蜱
<400>2
Met Leu Val Leu Val Thr Leu Ile Phe Ser Phe Ser Ala Asn Ile Ala
1               5                   10                  15
Tyr Ala Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala
            20                  25                  30
Phe Gln Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser
        35                  40                  45
Thr Asp Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Gly Glu Pro Ala Gly Glu
    50                  55                  60
Lys Gln Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr
65                  70                  75                  80
Asp Trp Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val
                85                  90                  95
Thr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Thr Gln Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp
            100                 105                 110
Ser Gln Ser His His Cys His Val Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro
        115                 120                 125
Asp Tyr Glu Met Trp Met Leu Asp Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val
    130                 135                 140
Glu Cys Cys Arg Gln Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gln
145                 150                 155                 160
Met Tyr Pro His Leu Lys Asp Cys
                165

Claims (20)

1.一种治疗或预防重症肌无力的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗或预防有效量的结合补体C5的药剂。
2.治疗或预防有效量的结合补体C5的药剂在制备治疗或预防重症肌无力的药物中的用途。
3.根据权利要求1的方法或根据权利要求2的用途，其中所述药剂用于阻止C5转化酶将补体C5切割成补体C5a和补体C5b-9。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法或用途，其中所述药剂以小于0.2mg/ml的IC50结合C5。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法或用途，其中所述药剂来源于食血节肢动物。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法或用途，其中所述结合C5的药剂是蛋白质，其包含图2中氨基酸序列的第19至168位氨基酸或者由其组成，或者是该蛋白质的功能等价物。
7.根据权利要求1至5中任一项的方法或用途，其中所述结合C5的药剂是蛋白质，其包含图2中氨基酸序列的第1至168位氨基酸或者由其组成，或者是该蛋白质的功能等价物。
8.根据权利要求1至5中任一项的方法或用途，其中所述药剂是编码如权利要求6或7所述蛋白质的核酸分子。
9.根据权利要求8的方法或用途，其中所述核酸分子包含图2中核苷酸序列的第53至507位碱基或者由其组成。
10.根据权利要求9的方法或用途，其中所述核酸分子包含图2中核苷酸序列的第1至507位碱基或者由其组成。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法或用途，其中所述对象是哺乳动物，优选人。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法或用途，其中以足以结合对象中尽可能多的可利用C5、更优选所有可利用C5的剂量施用所述药剂。
13.根据权利要求1至12中任一项的方法或用途，其中以足以减少体重减轻和/或肌无力的剂量施用所述药剂。
14.根据权利要求1至13中任一项的方法或用途，其中以1mg/kg至15mg/kg的剂量施用所述药剂。
15.根据权利要求1至14中任一项的方法或用途，其中以13mg/kg的单剂量腹膜内施用所述药剂。
16.根据权利要求1至13中任一项的方法或用途，其中以13mg/kg的剂量腹膜内施用所述药剂，接着每12小时以4mg/kg的剂量施用。
17.根据权利要求1至16中任一项的方法或用途，其中作为治疗方案的一部分施用所述结合C5的药剂，所述治疗方案还包括施用治疗重症肌无力的其它药物。
18.根据权利要求17的方法或用途，其中所述的其它药物是抗胆碱酯酶剂，比如新斯的明和吡斯的明，或者是免疫抑制药物，比如泼尼松、环孢霉素、和硫唑嘌呤。
19.根据权利要求17或18的方法或用途，其中与所述其它药物同时、依次或分别地施用所述结合C5的药剂。
20.根据权利要求1至19中任一项的方法或用途，其中所述重症肌无力是轻度重症肌无力或重度重症肌无力。
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