CN101327209A - 二氢杨梅素注射剂,粉针剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含有二氢杨梅素注射剂和注射用冻干粉针剂的制备方法，含有2％至100％重量比的二氢杨梅素和药学可接受的附加剂、溶媒。具有治疗肝炎，保肝护肝，镇痛，降血脂，祛痰，抗菌消炎和提高免疫力的药物中的用途。

Description

二氢杨梅素注射剂，粉针剂及其制备方法

研究领域：

本方面属于治疗肝炎、保肝护肝，镇痛，降血脂，祛痰，抗菌消炎和提高免疫力的天然药物领域。

背景技术：

二氢杨梅素是一种已知的化合物(参见Walter Karrerr，BirkhauserVerlag，Bassel und stuttgart(1958)，P.652，NO：1640)。但该文献没有对二氢杨梅素的活性和用途进行研究。

本申请人令人惊奇地发现二氢杨梅素具有治疗肝炎、保肝护肝，镇痛，降血脂，祛痰，抗菌消炎和提高免疫力作用。二氢杨梅素可以从葡萄科植物中得到，也可以通过化学领域常规方法得到。

本发明目的之一是提供含有二氢杨梅素和药学可接受的附加剂、溶媒所制备的注射剂，可以是液体注射剂，也可以注射用粉针剂。

本发明目的之一是提供一种二氢杨梅素注射剂的制备方法。

本发明是这样实现的：通过各种溶剂(水和/或有机溶剂)煎煮葡萄科植物，煎煮一次或多次，煎煮液经过滤，浓缩冷却至浸膏，再用热水溶解，乘热过滤，滤液直接用色谱分离，得到二氢杨梅素溶液。洗脱液回收有机溶剂，调节适当的pH值，过滤，加入附加剂，过滤、罐装，灭菌；或在无菌条件下冷冻干燥，分装，即得。

本发明可以使用所有葡萄科植物，优选使用蛇葡萄属，更优选粤蛇葡萄，栋叶玉葡萄，大叶蛇葡萄，显齿蛇葡萄，白蔹，山葡萄和东北蛇葡萄等。

煎煮所用溶液优选水，醇类，酯类，酮类，醚类和强极性有机溶剂，更优选低级链烷醇，低级脂肪酸酯，具有3-12个碳原子的酮和醚和/或水，最优选甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇，仲丁醇，叔丁醇，乙酸乙酯，乙酸甲酯，甲酸乙酯，丙酮，甲基乙基酮，乙醚，甲基乙基醚，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，四氯甲烷，二甲亚砜，二甲基甲酰胺和/或水等。

色谱分离填料可以是聚酰胺，聚丙烯酰胺，大孔吸附树脂，阳离子交换树脂，阴离子交换树脂，优选聚酰胺，聚丙烯酰胺，大孔吸附树脂，更优选聚酰胺。

色谱分离所使用的洗脱液可以是低级醇水溶液，低级酮水溶液，低级醚水溶液，低级酯水溶液，其中有机溶剂优选甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，丙酮，乙酸乙酯，甲酸乙酯或丙酯，乙酸甲酯，更优选甲醇，乙醇，丙酮，乙酸乙酯。可以是梯度洗脱。洗脱速度大约10ml/min。

由于二氢杨梅素在水中的溶解度低，又极易被氧化，所以采用现有的注射剂制备方法很难保证制剂的稳定，制备的注射剂溶液颜色加深，有效成分结构发生改变。本发明人发现使用复合溶剂，即在注射用水中加入一定比例的非水溶剂，增加原料药的溶解度，同时可增加有效成分的稳定性。非水溶剂可以选择PEG200，PEG400，PEG600，丙二醇，丙三醇中的一种或几种。为了防止二氢杨梅素的氧化，可以在制剂中加入BHA，BHT，维生素C，维生素E中的一种或几种作为抗氧化剂。同时，本发明人发现，制剂的PH值对稳定性有很关键的影响，经过考察，pH值在3.50-4.00范围内，才能保证溶液的稳定。

本发明目的之一是提供一种二氢杨梅素注射用粉针剂的制备方法。

二氢杨梅素注射液的溶剂是采用复合溶剂保证制剂的稳定性，由于复合溶剂会降低溶液的共熔点，使溶液难以冻干，故注射液中的复合溶剂在冻干粉针剂中不适合，需选择增溶剂。本发明使用羟丙基β-环糊精(HPCD)包埋法增溶，即二氢杨梅素称和HPCD，用适量的乙醇制备包合物，再加适量的甘露醇，冻干，即得。

本发明的另一个目的是提供二氢杨梅素注射剂在治疗肝炎，保肝护肝，镇痛，降血脂，祛痰，抗菌消炎和提高免疫力的药物中的用途。

具体实施例：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：二氢杨梅素注射剂的制备

取粤蛇葡萄干燥嫩茎叶2kg，用95％乙醇回流提取两次，每次2小时，过滤，合并滤液，回收乙醇至干，加入1200毫升80℃热水，使浸膏充分溶解，滤去黑色不溶物，滤液用聚酰胺柱分离，先用水洗，再用乙酸乙酯洗脱，回收乙酸乙酯，即得二氢杨梅素。

称取二氢杨梅素1份，丙二醇4份、PEG4002份和注射用水适量，60℃加热使溶解，再加入维生素C 0.04份，待其溶解后，加0.02份的活性炭振摇30min，用0.45μm微孔滤膜过滤，控制其PH在3.50-4.00范围内，加注射用水稀释至处方量，通氮、灌封于棕色安瓿中、100℃灭菌15min，质检合格后印字包装即得。

实施例2：二氢杨梅素注射用冻干粉针剂的制备

取显齿蛇葡萄干燥嫩茎叶2kg，用水煎煮提取两次，每次2小时，过滤，合并滤液，蒸发至干，加入1200毫升80℃热水，使浸膏充分溶解，滤去黑色不溶物，滤液用大孔吸附树脂分离，先用水洗，再用乙醇洗脱，回收乙醇，即得二氢杨梅素。

称取5g二氢杨梅素1份，用10份无水乙醇溶解，另取5份HPCD，用20份水溶解，将含有二氢杨梅素的乙醇溶液缓慢加入到HPCD溶液中，边加边搅拌，继续搅拌2h，于旋转蒸发仪中除去乙醇至无醇味，取出置于50ml的容量瓶中，加5份甘露醇，溶解，用水稀释至刻度，用0.45μm微孔滤膜过滤，分装，冻干。

实施例3：对四氯化碳引起的小鼠试验性肝损伤的影响

将小鼠随机分为6组，每组10只：阳性对照组、模型对照组、二氢杨梅素3组，二氢杨梅素组是将二氢杨梅素注射剂或冻干粉针剂用水稀释至适当浓度待用。阳性对照组和模型对照组给予注射用水；阳性对照组为联苯双酯200mg/kg，po，联苯双酯为常用的肝炎治疗药，以联苯双酯治疗模型动物，观察疗效，作为对照；模型对照组为检验药效，动物必须先制成肝炎模型，使动物患肝炎；二氢杨梅素组是在上述模型基础上，再给二氢杨梅素，以观察疗效，三组为腹腔注射给药，每天分别给予：50、100、200mg/kg。各组动物分组给药，连续用药6天，末次给药后1小时腹腔注射1％四氯化碳油溶液0.2ml/只小鼠，随即空腹20小时后眼眶静脉采血，分离血清，测血清ALT、AST和T-BIL水平。结果见下表。

表1：二氢杨梅素对四氯化碳引起的小鼠肝损伤影响

*P＜0.05  **P＜0.01与模型组比较

从表1的数据可以看出，二氢杨梅素具有极好的治疗肝炎的作用，以及降低T-BIL含量，显示二氢杨梅素有明显的降酶退黄的保肝作用。

实施例4：二氢杨梅素在体外的抑菌、抗病毒实验

流感病毒的分离和鉴(滴)定：目前常用鸡胚进行分离流感病毒，接种途径为鸡胚的尿囊腔，3天后出现鸡胚死亡的病变特征和出现血凝素，对此，我们采用此法进行对二氢杨梅素的鉴定。我们采用一定浓度的提取液和4个血凝单位的流感病毒1∶1混合，让二者于室温作用20分钟后再注射鸡胚，注射量为每胚0.2ml。实验采用8至11日龄的鸡胚，进行尿囊腔接种，培养48小时后，于4℃放置过夜，然后无菌取其尿液，经1000rpm离心10分钟后取上清，分装，-20℃存放，以备检测之用，尿液的检测分血凝和血抑两种，使用的血细胞是来亨公鸡，方法为常规法。

抗病毒实验：用不同浓度的二氢杨梅素在鸡胚中进行抗病毒实验。

表2：流感病毒血凝抑制试验

备注：1、原液是将二氢杨梅素注射剂或冻干粉针剂用水稀释至4mg/ml

2、10^-5和10^-6指从二氢杨梅素原液进行药的稀释度

3、判断结果时按血凝强度分别以++++、+++、++、-表示；红细胞呈细沙粒样均匀铺于孔(管)底者为++++，即100％凝集；红细胞均匀铺于孔(管)底，但边缘不整而稍向孔(管)底集中者为+++，即75％凝集；红细胞于孔(管)底形成一个环状，四周有小凝集块者为++，即50％凝集；红细胞于孔(管)底形成圆团，但边缘不够光滑，四周稍有凝块者为+，即25％凝集；红细胞于孔(管)底形成圆团，边缘光滑整齐者为-，即无凝集。

实施例5：二氢杨梅素在体外抑菌效应试验：

采用平板打孔法测定二氢杨梅素的抗菌效应。试管法和平板法进行尝试后，确定了平板打孔法这一简便易行且耗时较短的方法。采用五种实验菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎球菌、溶血链菌、卡他球菌进行效应试验。

原液是将二氢杨梅素注射剂或冻干粉针剂用水稀释至4mg/ml

实施例6：二氢杨梅素对小鼠体液免疫(血清凝集素)的影响

1、阴性对照

2、阿斯匹林组

3、本发明二氢杨梅素剂量组(0.15g/kg，0.45g/kg，1.35g/kg)，二氢杨梅素组是将二氢杨梅素注射剂或冻干粉针剂用水稀释至适当浓度待用。

观察凝集程度，分五组(0-4)，计算抗体，结果进行统计学处理，按下式计算抗体积数(抗体积数∑＝S1+2S2+3S3+4S4……NSn)

	动物数	抗体积数	P值
				空白对照组	10	92.4±13.02
阿斯匹林	10	115.00±17.12	＜0.01
				二氢杨梅素0.15g/kg	10	103±11.02
二氢杨梅素0.45g/kg	10	114±19.02	＜0.01
				二氢杨梅素1.35g/kg	10	103±7.02	＜0.05

结果证实：中、高剂量组明显增加血清中抗羊红细胞凝集素值，有显著性差异，二氢杨梅素对机体网体内系统吞噬功能有增强作用。

实施例7：二氢杨梅素镇痛试验

1、动物：昆明小白鼠18-22g，雌雄各半。

2、分组与溶液配制：

将小白鼠每组10只，分为4组：a)注射用水组；b)高剂量组(1.2g/kg)；

C)中剂量组(0.6g/kg)；C)低剂量组(0.3g/kg)。

3、给药方式

连续3天腹腔注射，并在第三天给药后60min，腹腔给予醋酸(0.5％)溶液0.2ml/只，观察5-30min内动物扫体数。

4、结果统计

样品组	剂量	止痛率	P值
				注射用水		0
二氢杨梅素	1.2g/kg	93％	＜0.05
				二氢杨梅素	0.6g/kg	88％	＜0.05
二氢杨梅素	0.3g/kg	54％	＜0.05

结果证明：二氢杨梅素具有明显的止痛作用。

实施例8：二氢杨梅素对高血脂症小鼠血脂的降脂作用

组别	剂量mg/kg	TC mmol/L	TG mmol/L	HDL-C mmol/L
					正常对照组		3.91±0.77	1.41±0.36	1.85±0.27
模型对照组		11.24±5.77	2.11±0.40	1.35±0.50
					安妥明	310	5.12±1.15	1.76±0.13	1.72±0.62
二氢杨梅素	400	6.11±1.92	1.58±0.24	1.62±0.56

将动物随机分为4组，正常对照组，阳性对照组，模型对照组，二氢杨梅素组(将二氢杨梅素注射剂或冻干粉针剂用水稀释至适当浓度待用)。每组10只小鼠，一日一次，连续给药10天，正常对照组不给任何药。其他各组小鼠均给高脂乳剂0.5ml/只，形成实验性高血脂。于10天用药后禁食过夜。次日从小鼠眼眶取静脉血，检测血清中TC、TG、HDL-C值下降。结果表明，模型组TC，TG值明显升高，HDL-C值下降。与模型组比较，二氢杨梅素组能明显降低血清TC，TG值，还使HDL-C略有升高，说明二氢杨梅素能抑制高脂乳剂引起的小鼠血脂升高，具有降脂作用。

实施例9：二氢杨梅素对小鼠酚红祛痰试验

动物每日给药(将二氢杨梅素注射剂或冻干粉针剂用水稀释至适当浓度)一次，连续3天。阴性对照给予同样体积注射用水，末次给药前1天禁食，末次给药后0.5小时腹腔注射25％酚红溶液500mg/kg，再0.5小时后按颈处死动物分离气管，插入注射针，用2ml生理盐水冲洗，冲洗液加1M NaOH 0.1ml显色，用722型分光光度计于546nm波长比色，直接读出酚红含量。

从试验结果表示，二氢杨梅素样品，3天后增加小鼠呼吸道酚红分泌量，提示样品有祛痰作用。

*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01同生理盐水组比较。

Claims (4)

1.一种二氢杨梅素注射剂，特征在于含有2％至100％重量比的二氢杨梅素和药学可接受的附加剂、溶媒。

2.权利要求1的二氢杨梅素注射剂，特征在于可以是液体注射剂和/或注射用粉针剂。

3.一种如权利要求1-2所述的二氢杨梅素注射剂制备方法，特征在于用水和/或有机溶剂煎煮葡萄科植物，煎煮一次或多次，过滤，合并滤液，蒸出溶剂，再用热水溶解，乘热过滤，滤液直接用色谱分离。洗脱液回收溶剂，调节pH值2-5，过滤，加入附加剂，过滤、罐装，灭菌；或在无菌条件下冷冻干燥，分装，即得。

4.如权利要求1-3所述的二氢杨梅素注射剂，特征在于具有治疗肝炎，保肝护肝，镇痛，降血脂，祛痰，抗菌消炎和提高免疫力的药物中的用途。