CN101319251B - 一种精子染色质扩散实验检测精子dna碎片的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片的方法，其步骤如下：①精确配制精子裂解液；②将裂解液置入4℃保存2周，使用前1.5小时取出，置入22℃室温内；③将精液稀释至5-10×106/ml；④取稀释精液50微升放置在冰箱内5分钟，冰箱内温度为4℃；⑤冰箱内取出后将盖玻片移走，将载玻片水平浸入盐酸中变性7分钟取出；⑥步骤⑤中取走的载玻片再水平浸入步骤①中所述的精子裂解液中20分钟；⑦将步骤⑥中的载玻片用缓冲液冲洗5分钟；⑧用乙醇各2分钟脱水；⑨用瑞氏法或姬姆萨-瑞氏法或天蓝法染精子，在光学显微镜下观察分析精子DAN碎片。本发明方法实现了精子DNA检测简单、快速、准确、廉价、分辨率高的目的。

Description

一种精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片的方法
技术领域
本发明涉及医学临床上使用的试剂，是一种精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片的方法。
背景技术
目前，世界许多国家都在研究精子成熟过程中因受内外环境影响形成DNA碎片出现的DNA完整性异常，从而引起的精子形态和功能异常。由于在男性不育检测中DNA的完整性是精液的常规检测，也是评估男性不育的主要指标，因此，如何检测精子DNA完整性是生殖医学领域研究的重要课题之一。国外比较领先的检测方法为精子染色质扩散试验，其英文名为spermchromatin dispersion，简称SCD，其商品化的试验盒已推广使用。SCD检测方法具有较多优点，例如：简单、快速、准确、分辨率高等，但是，由于试剂盒包含知识产权，因此该试剂盒价格昂贵，受此限制，目前在我国尚未推广应用，并且，这种试剂盒中的精子核蛋白裂解液采用聚乙二醇辛基苯基醚，十二烷基碘酸钠等成份，这些成份均为化学试剂，其异味、刺激性及腐蚀性较大，并具有毒性成份，污染环境等。
发明内容
本发明的目的是，提供一种精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片的方法，使它具有造价低、无腐蚀，无毒，操作简便，易于推广的优点。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片的方法，其步骤如下：
①精确配制精子裂解液
精子裂解液为每100毫升蒸馏水中含三羟甲基氨基甲烷4.844克、氯化钠11.7克、二硫苏糖醇1.86克、皂角提取物8.12克及乙二胺四乙酸二钠盐12.32克，PH值为7.5；
②将裂解液置入4℃保存2周，使用前1.5小时取出，置入22℃室温内；
③将精液稀释至5-10×106/ml，在室温37℃下将0.3ml的精液稀释，加入0.7毫升的1％低熔点琼脂糖内，混匀；
④取稀释精液50微升置入用0.65％琼脂糖处理好的载玻片上，盖上22×22mm盖玻片，放置在冰箱内5分钟，冰箱内温度为4℃；
⑤冰箱内取出后将盖玻片移走，将载玻片水平浸入0.08摩尔盐酸HCl中变性7分钟取出；
⑥步骤⑤中取走的载玻片再水平浸入步骤①中所述的精子裂解液中20分钟；
⑦将步骤⑥中的载玻片用缓冲液冲洗5分钟，缓冲液中各物质及含量为：三羟甲基氨基甲烷10.78克/升，硼酸5.5克/升及乙二胺四乙酸二钠盐0.58克/升；
⑧用70％、90％、100％乙醇各2分钟脱水；
⑨用瑞氏法或姬姆萨-瑞氏法或天蓝法染精子，在光学显微镜下观察分析精子DAN碎片。
本发明的方法，为我国推广应用SCD方法检测精子DNA完整性提供了重要的基础。本发明所述方法中采用的裂解液用皂角或桔梗提取物替代了化学试剂，从而减少了化学试剂的应用，减少污染、无刺激性、无腐蚀、无毒，并使裂解液制造成本大幅降低，易于推广应用。本发明裂解液为精子染色质扩散实验试剂盒的裂解液，试验结果表明：采用本发明所述的裂解液用SCD方法检测精子DNA完整性的效果与国外同类试剂盒的检测效果完整性一致。SCD试验后经染色能够在光学显微镜下清晰的观察保留尾巴的单个精子DNA的完整性，根据晕环的大小，能够准确判定精子DNA是否有碎片，从而对男性生育力进行准确评估。
本发明所述方法可由附图1、2、3、4、5、6、7中清楚得出：正常精子没有DNA碎片，具有大大的晕环或中等晕环，如附图1、2所示，存在DNA碎片的精子没有晕环形成或有很小的晕环，或没有晕环且着色很淡，呈退化迹象，如附图3、4、5所示。上述试验进一步表明，本发明方法能够准确判定精子DNA是否具有完整性。上述试验结果还可具体描述为：计数500个精子，观察精子晕环大小，根据晕环与精子头部横径的比例，粗分为大、中、小和无晕环4个等级，大和中晕环表示精子DNA完整无碎片，小和无晕环表示精子DNA断裂为碎片。小晕环以≤精子头直径四分之一为判断标准，中晕环＞精子头直径四分之一而≤精子头直径三分之二，大晕环＞精子头直径三分之二。
本发明方法中的裂解液所含的皂角或桔梗提取物不使蛋白变性，丝毫不破坏精子尾部。本发明方法中所述的裂解液实现了精子DNA检测简单、快速、准确、廉价、分辨率高的目的。本发明的方法还具有操作简便、准确性好，分辨率高及成本低等优点。
本发明的方法以试剂盒商品推广应用，试剂盒包括：
1、DNA变性染液；
2、精子核蛋白裂解液；
DNA变性染液为公知技术。
附图1是呈现大晕环的正常精子；附图2是呈现中晕环的正常精子；附图3是呈现极小晕环的有DNA碎片的异常精子；附图4是没有晕环的有DNA碎片的异常精子；附图5是没有晕环且退化的精子；附图3、4、5所示均为有DNA碎片的异常精子；附图6是有三个正常精子和一个异常精子的图片；附图7是有两个正常精子和三个异常精子的图片。
上述图片均为采用本发明方法进行检验的结果。
本发明所述的一种精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片的方法，其步骤如下：
①精确配制精子裂解液
精子裂解液为每100毫升蒸馏水中含三羟甲基氨基甲烷4.844克、氯化钠11.7克、二硫苏糖醇1.86克、皂角或桔梗提取物8.12克及乙二胺四乙酸二钠盐12.32克，PH值为7.5；
②将裂解液置入4℃保存2周，使用前1.5小时取出，置入22℃室温内；
③将精液稀释至5-10×106/ml，在室温37℃下将0.3ml的精液稀释，加入0.7毫升的1％低熔点琼脂糖内，混匀；
④取稀释精液50微升置入用0.65％琼脂糖处理好的载玻片上，盖上22×22mm盖玻片，放置在冰箱内5分钟，冰箱内温度为4℃；
⑤冰箱内取出后将盖玻片移走，将载玻片水平浸入0.08摩尔盐酸HCl中变性7分钟取出；
⑥步骤⑤中取走的载玻片再水平浸入步骤①中所述的精子裂解液中20分钟；
⑦将步骤⑥中的载玻片用缓冲液冲洗5分钟，缓冲液中的各物质及含量为：三羟甲基氨基甲烷10.78克/升、硼酸5.5克/升及乙二胺四乙酸二钠盐0.58克/升；
⑧用70％、90％、100％乙醇各2分钟脱水；
⑨用瑞氏法或姬姆萨-瑞氏法或天蓝法染精子，在光学显微镜下观察分析精子DAN碎片。

Claims (1)

1.一种精子染色质扩散实验检测精子DNA碎片的方法，其特征在于：其步骤如下：
①精确配制精子裂解液
精子裂解液为每100毫升蒸馏水中含三羟甲基氨基甲烷4.844克、氯化钠11.7克、二硫苏糖醇1.86克、皂角提取物8.12克及乙二胺四乙酸二钠盐12.32克，PH值为7.5；
②将裂解液置入4℃保存2周，使用前1.5小时取出，置入22℃室温内；
③将精液稀释至5-10×106/ml，在室温37℃下将0.3ml的精液稀释，加入0.7毫升的1％低熔点琼脂糖内，混匀；
④取稀释精液50微升置入用0.65％琼脂糖处理好的载玻片上，盖上22×22mm盖玻片，放置在冰箱内5分钟，冰箱内温度为4℃；
⑤冰箱内取出后将盖玻片移走，将载玻片水平浸入0.08摩尔盐酸HCl中变性7分钟取出；
⑥步骤⑤中取走的载玻片再水平浸入步骤①中所述的精子裂解液中20分钟；
⑦将步骤⑥中的载玻片用缓冲液冲洗5分钟，缓冲液中各物质及含量为：三羟甲基氨基甲烷10.78克/升，硼酸5.5克/升及乙二胺四乙酸二钠盐0.58克/升；
⑧用70％、90％、100％乙醇各2分钟脱水；
⑨用瑞氏法或姬姆萨-瑞氏法染精子，在光学显微镜下观察分析精子DAN碎片。
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