CN101316933A - 浓缩、纯化和除去朊病毒蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过在容许琼脂糖凝胶与朊病毒PrPSc蛋白质特异性的和高亲和性的结合的条件下使朊病毒PrPSc蛋白质与琼脂糖凝胶接触、并从所述琼脂糖凝胶中除去未结合的非朊病毒蛋白质来浓缩和/或纯化朊病毒PrPSc蛋白质的方法,以及涉及通过在容许琼脂糖凝胶与朊病毒PrPSc蛋白质特异性的和高亲和性的结合的条件下使体液与琼脂糖凝胶接触、并从所述琼脂糖凝胶中除去体液来从体液中除去朊病毒PrPSc蛋白质的方法。此外,本发明涉及通过在容许琼脂糖凝胶部分与朊病毒PrPSc蛋白质的特异性的和高亲和性的结合以及琼脂糖凝胶的配体部分与PrPC蛋白质结合的条件下使朊病毒PrPSc蛋白质和PrPC蛋白质与配体修饰的琼脂糖凝胶接触、在容许非朊病毒蛋白质和PrPC蛋白质从琼脂糖凝胶的配体部分中释放、而不容许朊病毒PrPSc蛋白质的释放的条件下向与琼脂糖凝胶结合的蛋白质中添加选择性释放试剂、以及从琼脂糖凝胶中除去非朊病毒蛋白质和PrPC蛋白质,来从PrPC蛋白质中分离和/或富集朊病毒PrPSc蛋白质的方法。本发明的另一个方面涉及上述方法用于浓缩、纯化和/或除去朊病毒PrPSc蛋白质的用途。
Description
本发明涉及通过在容许琼脂糖凝胶与朊病毒PrPSc蛋白质特异性的和高亲和性的结合的条件下使朊病毒PrPSc蛋白质与琼脂糖凝胶接触、并从所述琼脂糖凝胶中除去未结合的非朊病毒蛋白质来浓缩和/或纯化朊病毒PrPSc蛋白质的方法,以及涉及通过在容许琼脂糖凝胶与朊病毒PrPSc蛋白质特异性的和高亲和性的结合的条件下使体液与琼脂糖凝胶接触、并从所述琼脂糖凝胶中除去体液来从体液中除去朊病毒PrPSc蛋白质的方法。
此外,本发明涉及通过在容许琼脂糖凝胶部分与朊病毒PrPSc蛋白质的特异性和高亲和性结合以及琼脂糖凝胶的配体部分与PrPC蛋白质结合的条件下使朊病毒PrPSc蛋白质和PrPC蛋白质与配体修饰的琼脂糖凝胶接触、在容许非朊病毒蛋白质和PrPC蛋白质从琼脂糖凝胶的配体部分释放、而不容许朊病毒PrPSc蛋白质的释放的条件下向与琼脂糖凝胶结合的蛋白质中添加选择性释放试剂、以及从琼脂糖凝胶中除去非朊病毒蛋白质和PrPC蛋白质,来从PrPC蛋白质中分离和/或富集朊病毒PrPSc蛋白质的方法。
本发明的另一个方面涉及上述方法用于浓缩、纯化和/或除去朊病毒PrPSc蛋白质的用途。
发明背景
天然的朊病毒蛋白质,对于细胞朊病毒蛋白被称为“PrPC”,是在自然中广泛分布的,在哺乳动物中是特别好地保守性的。天然PrPC蛋白质向对于绵羊痒病朊病毒蛋白质被称为“PrPSc”或对于蛋白酶K抗性朊病毒蛋白质被称为“PrPres”的传染性蛋白质的转变被认为导致各种疾病的传播。朊病毒相关疾病的实例包括,例如,人类中的苦鲁病(kuru)和克雅病(CJD);绵羊中的绵羊痒病、牛中的牛海绵状脑病(BSE)、可传播的貂脑病以及在鹿和麋鹿中的消耗性疾病(wasting disease)。
BSE是疯牛病的一种形式,可传播给各种其他哺乳动物,包括人类。BSE的人类形式称为新变体克雅病或vCJD。在20世纪80年代中晚期在英国估计4千万人摄食了BSE污染的牛肉。由于口头传染的疾病的潜伏期可能是20-30年,该疾病的真实程度可能直到2010年后都不会显现。
除了感染的牛肉的摄食之外,存在着通过输血在人类中传播朊病毒相关疾病的可能性。由于现在有通过输血的朊病毒传播的(两个)直接征兆,对于血液制品的安全性有越来越高的关注。并且,已经显示了感染的朊病毒在淋巴细胞上存在,还有证据表明除了是与细胞相关的之外,朊病毒还存在于血浆中。此外,动物也可能通过在朊病毒污染的土壤上放牧或通过摄食含有朊病毒感染的干草螨的干草而被朊病毒相关疾病感染。
从样品中检测以及除去朊病毒蛋白质的能力在食品工业和医学部门有深刻的重要性。
对于检测朊病毒蛋白质,已经开发了许多基于朊病毒特异性抗体的分析。然而,由于朊病毒蛋白质在自然中和在哺乳动物中、特别是在人类血液、用于移植的人类或其他哺乳动物器官中以及在来自哺乳动物的肉类和加工食品中非常低的朊病毒浓度,这些分析需要在先的富集。
在过去十年已经开发了许多方法用于纯化朊病毒蛋白质和其衍生物。亲和层析作为适合的纯化技术起到了重要作用。特别是,琼脂糖凝胶本身已经被证明是携带亲和层析的配体的适合的支持材料。
Grathwohl等人(Arch.Virol.(1996)141:1863-1874)公开了通过采用二价铜离子琼脂糖凝胶作为支持材料的固定金属(Cu2+)亲和层析(IMAC)从感染后不久的绵羊痒病感染的小鼠的小鼠脾脏富集PrPSc。然而,他们发现,对于在感染的最早期阶段的诊断,通过用N-十二烷基肌氨酸钠和NaCl盐析提取PrPSc是更有效的。
WO 01/77687比较了使用附着于琼脂糖凝胶的特异性六肽配体从部分纯化的可溶制品中清除PrPC朊病毒蛋白和通过单独的相同琼脂糖凝胶材料作为参考材料实现的清除。单独的SP-琼脂糖凝胶和DEAE-琼脂糖凝胶展现了与PrPC的结合,它比用结合六肽配体的树脂所实现的低100倍。事实上,该文件声明:
“在pH 7.4时,DEAE琼脂糖凝胶看来也不结合PrPC。”
SP琼脂糖凝胶与PrPC的低结合相对于PrPC与硅土的结合、即与非特异性结合剂的结合甚至更降低20倍。根据DEAE琼脂糖凝胶根本不结合以及SP琼脂糖凝胶以非常低和非特异性亲和性结合PrPC的事实,明显的是,是SP琼脂糖凝胶的SP(磺丙基基团)部分对低结合亲和性负责。因此,WO01/77687实际教导了琼脂糖凝胶作为PrPC特异性配体的惰性固体支持物,SP琼脂糖凝胶的SP部分实际可以以低于非特异性结合剂硅土超过20倍的亲和性结合PrPC。
P.R.Foster(Transfusion Medicine,1999,9,3-14)的文件在1999年公开,此时朊病毒研究仍处于开始,科学界还没有关于朊病毒PrPSc蛋白质的物理化学组成的线索,可传播海绵状脑病(TSE)的原因“试剂”的检测仍然依靠具有很少的定量显著性的详细描述和易出错的动物研究。此外,该文件指出,PrPSc将由于它非常低的水可溶性在沉淀过程中倾向于沉淀在固相中。此外,它表明,PrPSc具有强亲水性和疏水性结构域,其将附着于各种表面,特别是,将与用于血浆产品的生产的层析和过滤介质相互作用。该文件告知,离子的、阳离子的、疏水性和多种未鉴别的树脂将结合PrPSc。甚至特别预先处理以防止吸附的过滤用醋酸纤维素膜将与PrPSc相互作用。然而,这个文件中的所有研究是基于TSE传染性的降低,而不是展现了PrPSc与任何吸附剂的实际结合。特别指出的是,在吸附剂结合之外,降低的PrPSc活性也可以由其他机制引起,例如(i)溶液中PrPSc的沉淀以及固体如过滤器和层析支持物材料的机械滞留,以及(ii)通过与固体接触或随时间的PrPSc钝化。在这点上,作者在他的层析材料讨论中注明所有被检查的吸附剂引起PrPSc的分离——
“...尽管使用了不同的配体、基质和吸附原理。”
该文件的表1还公开了当与其他吸附剂相比较时,对于阴离子、阳离子和疏水性连接的琼脂糖凝胶,在PrPSc传染性方面的微弱降低。然而,该文件没有公开任何材料或方法用于实践它与琼脂糖凝胶本身相关的教导,也没有指出对于与这些琼脂糖凝胶相关的实施方式的其他任何公众可获得的参考文献。因此,与基于琼脂糖凝胶的吸附剂相关的结果缺乏足够的公开。此外,表1的结果与该文件的说明书抵触,在其说明书中展现了所采用的SP琼脂糖凝胶具有高结合亲和性,而Q琼脂糖凝胶基本上与PrPSc没有结合亲和性(第28页的表格)。考虑到结果的精确度,作者自己注明:
“关于一般的TSE试剂(......)以及特别是nvCJD的物理化学性质仍有很多需要了解。在缺乏这些数据的情况下不可避免的是,对于完全除去可能存在的任何nvCJD试剂,在单独或组合的特定过程步骤的能力上存在着不确定性。”(增加了强调)
换句话说,在1999年作者P.R.Foster自己认为存在着与血浆分级步骤来有效除去PrPSc的可能性研究相关的许多固有的难题,并且这个文件的结果必需在所述环境中被看作是推测的和初步的。
对于纯化和/或检测人类或动物朊病毒蛋白质的特别精致、敏感和高度选择性的方法基于朊病毒蛋白质或其衍生物与一种或多种朊病毒重复结构的可逆的聚集和解离,所述朊病毒重复结构在6.2到7.8的pH值下与朊病毒蛋白质寡聚化,在4.5到5.5的pH值下再次解离。例如,附着于固相支持物的具有朊病毒重复结构的蛋白质可以与朊病毒蛋白质寡聚化从而检测和除去这些蛋白(PCT/EP2004003060)。
目前,本领域仍然需要进一步的鉴定方法,其以简单、低成本、高度选择性和有效的方式浓缩、纯化和/或除去朊病毒PrPSc蛋白质。
由于PrPSc和PrPC蛋白质的相同氨基酸序列,它们一般被同时浓缩和富集,然后在后期阶段通过蛋白酶K消化而分离,此时仅PrPC蛋白质被选择性地消化而PrPSc蛋白质保持了蛋白酶抗性。
因此,除了通过选择性酶消化之外,还存在着从PrPC蛋白质有效地分离PrPSc的需要。
因此,本发明的目的是提供简单、低成本、有效和高度选择性的方法来浓缩、纯化和/或除去PrPSc。
另一个目的是提供简单、低成本、有效和高度选择性的方法来从PrPC蛋白质中分离PrPSc。
本发明的目的是通过浓缩和/或纯化朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的方法而解决的,所述方法包括以下步骤:
a)在容许琼脂糖凝胶与朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的特异性和高亲和性结合的条件下使朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物与琼脂糖凝胶接触,
b)从所述琼脂糖凝胶中除去未结合的非朊病毒蛋白质,
其中所述琼脂糖凝胶优选地不是Cu2+螯合的琼脂糖凝胶。
令人惊讶地的是发现,琼脂糖凝胶本身(即,因而,裸露的、具有钝化的、除去的、屏蔽配体)具有对PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的特异性的和高结合的亲和性。因而,琼脂糖凝胶与PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的结合足以用于它们的浓缩和/或纯化。人们仅仅需要从所述琼脂糖凝胶中除去未结合的非朊病毒蛋白质。
在此使用的术语“琼脂糖凝胶与朊病毒PrPSc的特异性的和高亲和性的结合”是表明,琼脂糖凝胶本身(即,琼脂糖凝胶核心而不是任何其上的配体)特异性地结合PrPSc而不结合PrPC。优选地,在本发明的上下文中琼脂糖凝胶的特异性结合是指琼脂糖凝胶本身与PrPSc多聚体而不是与PrPC的结合。在这点上术语高亲和性的结合是指与10-6到10-12M或更低、优选地10-8到10-12M或更低的离解常数相关的结合亲和性。技术人员可以通过常规的和简单的结合分析容易地测定给定的琼脂糖凝胶与朊病毒PrPSc的特异性和高结合亲和性。例如,一种这样的分析将包括以下步骤:
a)提供要分析的琼脂糖凝胶并除去、钝化和/或屏蔽所述琼脂糖凝胶核心上的任何配体,如果存在,
b)将使用的PrPSc稀释到将避免非特异性消除,例如沉淀、非特异性结合等等的浓度,
c)在适合的缓冲液中在一定条件下孵育a)的琼脂糖凝胶和b)的PrPSc持续足以允许相互结合的时间,
d)一个或多个洗涤步骤,优选的2到10倍缓冲体积孵育缓冲液,用于从所述琼脂糖凝胶洗去任何未结合的蛋白质,
e)任选地用过量的、优选1000倍过量的非特异性结合蛋白质、优选的BSA(牛血清白蛋白)洗涤,以除去或阻断所述琼脂糖凝胶上的任何非特异性结合位点,
f)使用包含离液剂,优选地包含尿素和/或盐酸胍和/或SDS的缓冲液的洗脱步骤,以除去与琼脂糖凝胶结合的PrPSc,
g)检测洗脱缓冲液中的PrPSc,从而证实琼脂糖凝胶与PrPSc本身的高亲和性结合。
为了测定所分析的琼脂糖凝胶的特异性,重复上述分析,除了在步骤c)中孵育PrPC代替PrPSc,并且在洗涤溶液中检测PrPC,从而表明没有结合。备选地,可以在步骤c)中同时地孵育PrPSc和PrPC与琼脂糖凝胶,特异性和高亲和性琼脂糖凝胶将引起在洗涤溶液中检测到PrPC和仅在离液洗脱缓冲液中检测到PrPSc。
测定琼脂糖凝胶的特异性的和高亲和性的结合的更详细和优选的方法以下在实施例1中示出。
简而言之,术语“琼脂糖凝胶与PrPSc蛋白质的特异性的和高亲和性的结合”是意味着将使用该术语的琼脂糖凝胶和方法与仅非特异性地和以低亲和性地结合PrPSc,例如通过沉淀和/或低吸附的琼脂糖凝胶和所述方法相区别。
在此使用的术语“浓缩和/或纯化”意思是表明PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的浓度被提高、和/或非PrPSc蛋白质和/或非蛋白质材料被除去。
该方法也可以用于有效地从体液中除去朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物。在这种情况下,它包括以下步骤:
a)在容许琼脂糖凝胶与朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的特异性和高亲和性结合的条件下使包含朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的体液与琼脂糖凝胶接触,
b)从所述琼脂糖凝胶中除去所述体液。
优选地,所述体液选自由全血、血液级分或脑组织匀浆构成的组,优选选自血浆。然而,体液也可以包括哺乳动物组织的组织匀浆,特别是脑组织和脊髓组织的组织匀浆。
还发现的是,琼脂糖本身一般具有极好的与血液的相容性,当与血液接触时,本身对于血液凝固没有观察到或最多是可忽略的效果。大多数连接的、金属连接的和/或带负电的琼脂糖凝胶也被证明是血液相容性的。这通过以下的表1的结果展现了,其中测试了根据本发明使用的多种琼脂糖凝胶对常见的生理学蛋白质参数的影响。令人惊讶地发现,琼脂糖凝胶可以与血液或血液级分接触而不损害或实质上改变血液参数。此外,令人惊讶地发现,金属螯合的琼脂糖凝胶实际上对凝结因子VII的稳定性具有积极效果。
表1
*根据Quick的促凝血酶原激酶时间
**促凝血酶原激酶时间的国际标准化比率(INR)
***活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT))
树脂I=Ni-琼脂糖凝胶高效(Amersham/General Electrics 17-526802)
树脂II=加载了Zn的树脂I
树脂III=SP琼脂糖凝胶(Sigma S 6532)
树脂IV=琼脂糖凝胶4B(Sigma 4B-200)
因而,本发明的独立的方面涉及包含凝结因子VII的新的组合物,优选人类凝结因子VII,并进一步包含至少一种金属螯合的琼脂糖凝胶、优选的Ni-和/或Zn-琼脂糖凝胶,更优选的Zn-琼脂糖凝胶。另一个独立的方面涉及金属螯合的琼脂糖凝胶、优选的Ni-和/或Zn-琼脂糖凝胶、更优选的Zn-琼脂糖凝胶的用途,用于稳定包含凝胶因子VII的血液、血液级分以及固体或液体成分。
不希望受到理论的限制假想的是,金属螯合的琼脂糖凝胶对于凝结因子VII的有益效果是基于针对蛋白酶消化和/或折叠稳定性的稳定效果。
要注意的是,原则上,任何连接的或非连接的琼脂糖凝胶可以用于本发明的实践,只要所述琼脂糖凝胶不被屏蔽,在血液与活细胞体内或体外接触时,是无毒的。为了实践用于从血液消除朊病毒蛋白的本发明的方法,金属连接的琼脂糖凝胶是优选的,带负电的琼脂糖凝胶是更优选的,而非连接的琼脂糖凝胶和非带电的琼脂糖凝胶是最优选的。
令人惊讶地,用于本发明的方法的琼脂糖凝胶不限于任何特定类型的琼脂糖凝胶,只是琼脂糖凝胶核心对于朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的结合应当是充分可接近的。
优选的,用于实践本发明的方法的琼脂糖凝胶选自非连接的琼脂糖凝胶、更优选地选自由琼脂糖凝胶2B、4B、6B、琼脂糖凝胶CL-4B、琼脂糖凝胶-6B、Superdex75、聚丙烯酰胺葡聚糖100HR和交联葡聚糖凝胶G10构成的组。
对于实践本发明的方法还优选的是选自配体修饰的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶,优选地选自由金属螯合的琼脂糖凝胶、凝集素琼脂糖、亚氨基二乙酸琼脂糖凝胶、蛋白A琼脂糖、链霉抗生物素蛋白琼脂糖凝胶、磺丙基琼脂糖凝胶和羧甲基琼脂糖凝胶构成的组,更优选地选自金属螯合的琼脂糖凝胶,以及最优选地,用于实践所述方法、组合物或用途的琼脂糖凝胶是Zn-琼脂糖凝胶。
Zn琼脂糖凝胶是与生理性液体高度相容的。琼脂糖凝胶或Zn离子都将不会对体液例如全血、血液级分、优选血浆有任何不利影响。因此,Zn琼脂糖凝胶对于从体液和/或身体器官,例如要再导入动物、优选的人类中用于移植的器官中除去PrPSc蛋白质和/或功能衍生物是特别有用的。
如前所提及的,对于实践本发明的方法、组合物或用途必需的是,可选择的配体不屏蔽琼脂糖凝胶核心从而朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物具有自由的通路。在先有技术中采用的配体修饰的琼脂糖凝胶中这是个难题。技术人员通常可以通过简单地测试琼脂糖凝胶对PrPSc蛋白质的结合亲和性来选择对于PrPSc结合是足够可接近的配体修饰的琼脂糖凝胶,以及,如果希望,设计适合的配体修饰的琼脂糖凝胶,例如,通过采用使配体置于琼脂糖凝胶合适的距离处使得琼脂糖凝胶不被配体屏蔽的间隔区分子。
本发明的方法另一个预料之外的益处是,与朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物结合的琼脂糖凝胶对于朊病毒PrPC蛋白质和/或其功能衍生物是高度选择性的,朊病毒PrPC蛋白质和/或其功能衍生物本身与琼脂糖凝胶不具有任何显著的结合亲和性。
因而,本发明的方法不仅容许选择性地浓缩、纯化和/或除去朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物,还实际上也除去了高度类似的朊病毒PrPC蛋白质和/或其功能衍生物。
当使用配体修饰的琼脂糖凝胶时,其中配体部分结合朊病毒PrPC蛋白质和/或其功能衍生物,本发明的方法容许同时浓缩和/或纯化朊病毒PrPSc和PrPC蛋白质和/或其功能衍生物。然后,朊病毒PrPSc和PrPC蛋白质和/或其功能衍生物可以通过从琼脂糖凝胶选择性地除去PrPC蛋白质和/或其功能衍生物来分离。
在优选的实施方式中,本发明还涉及从PrPC蛋白质和/或其功能衍生物中分离和/或富集朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的方法,包括以下步骤:
a)在一定条件下使朊病毒PrPSc蛋白质和PrPC蛋白质和/或其功能衍生物与配体修饰的琼脂糖接触,所述条件容许
(i)所述琼脂糖凝胶部分与所述朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的特异性和高亲和性结合,以及
(ii)琼脂糖凝胶的所述配体部分与PrPC蛋白质和/或其功能衍生物的结合,
b)任选地从所述配体修饰的琼脂糖凝胶中除去未结合的材料,
c)任选的等待足够的时间,使紧密邻近朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物处的某些或大多数与配体结合的PrPC蛋白质和/或其功能衍生物转变成朊病毒PrPSc蛋白质和/或功能衍生物,
d)在一定条件下向来自步骤a)、b)或c)的与琼脂糖凝胶结合的蛋白质和/或其功能衍生物中添加选择性释放试剂,所述条件容许PrPC蛋白质和任选的非朊病毒蛋白质从所述琼脂糖凝胶的配体部分释放,但不容许朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物从所述琼脂糖凝胶部分的释放,以及
e)从所述琼脂糖凝胶中除去PrPC和任选的非朊病毒蛋白质。
当朊病毒PrPSc和PrPC蛋白质和/或其功能衍生物在配体修饰的琼脂糖凝胶上存在时,预料不到的发现是,在很多情况下PrPSc的数量在消耗PrPC的情况下提高。相信的是,PrPC和/或其功能衍生物在紧密接近PrPSc处通过自然的构象变化被转化,PrPSc看起来伴护(chaperone)了这种变化。这个发现与以下认识相符,PrPSc的存在是PrPSc从PrPC前体“产生”所需的。
在上述方法的更优选的实施方式中,所述方法进一步包括步骤:
f)从所述琼脂糖凝胶释放PrPSc朊病毒蛋白质和/或其衍生物。
对于从琼脂糖凝胶释放PrPSc朊病毒蛋白质和/或其衍生物,优选地添加离液剂和/或洗涤剂,优选地添加尿素和/或盐酸胍和/或SDS,更优选地添加尿素和/或SDS,最优选地添加包含8M尿素和5%SDS的凝胶加载缓冲液并施加电场。当然,也可以采用通常用于阻断酶对聚合物、优选的糖衍生的聚合物的亲和性的任何其他非破坏性方法。
对于实践根据本发明的方法,特别是从PrPC蛋白质分离和/或富集朊病毒PrPSc蛋白质的方法,优选的是采用配体修饰的琼脂糖凝胶,所述琼脂糖凝胶是包含二价固定化金属离子的金属螯合琼脂糖凝胶。
由于琼脂糖凝胶部分和任选地琼脂糖凝胶的带负电和/或金属配体部分与PrPSc的结合、以及琼脂糖凝胶的带负电和/或金属配体部分与PrPC的结合,金属螯合的琼脂糖凝胶以及带负电的琼脂糖凝胶例如磺丙基琼脂糖凝胶和羧甲基琼脂糖凝胶可以结合PrPSc以及PrPC蛋白质和/或其功能衍生物。
本发明的分离方法的机制在于PrPSc和PrPC对于琼脂糖凝胶固定的金属离子的不同结合性质。虽然PrPSc看起来具有对琼脂糖凝胶、二价金属离子和负电荷的内在亲和性,PrPC看来仅对二价金属离子和负电荷具有内在亲和性。因此,它们对琼脂糖凝胶的不同亲和性可以被用于分离它们。
优选地,金属螯合的琼脂糖凝胶的金属离子选自由Ni2+、Zn2+、Co2+、Mg2+、Ca2+和Mn2+构成的组。
Ca2+和Mn2+的结合是较弱的,两种离子都仅结合PrPSc和PrPC的单体。
其他所提及的金属离子Ni2+、Co2+、Zn2+和Mn2+更强地与PrPSc和PrPC的单体和寡聚体结合,因此是优选的。因为它极好的结合性质和由于它在体内生理条件下没有毒性,Zn2+对于实践本发明的方法、用途和组合物的金属螯合琼脂糖凝胶是最优选的。
附带地,如实施例1中展现的,Cu-琼脂糖凝胶将不能有效地保持PrPSc蛋白质。在实施例1中,用Cu2+重新装载Ni-高效琼脂糖凝胶引起了大量BSA的非特异性结合(还参见附图4,泳道1),因而,不适合于复杂的蛋白质溶液中朊病毒蛋白质的富集。因此,Grathwohl等人介绍的Cu-琼脂糖凝胶将不能提供PrPSc从PrPC中的定量分离所需的差异亲和力。因而对于本发明的所有方法一般优选的是,琼脂糖凝胶不是Cu2+金属螯合的琼脂糖凝胶。
当采用金属螯合的琼脂糖凝胶用于实践本发明的方法时,选择性释放试剂优选地是金属螯合剂,优选地是选自EDTA、咪唑和/或EGTA的试剂,更优选地是EDTA。
对于在本发明的方法中从金属螯合的琼脂糖中分离PrPSc和PrPC蛋白质和/或其功能衍生物,最优选的是,所述金属是Zn2+以及所述金属螯合剂是EDTA。
还优选的是,用于分离PrPSc和PrPC蛋白质的、容许PrPC和任选的非朊病毒蛋白质从琼脂糖凝胶固定的金属离子上释放的、本发明的方法的步骤d)中的条件包括,存在浓度5到50mM、更优选的10到25mM的金属螯合剂、最优选浓度10到25mM的EDTA。
还发现的是,向复杂的蛋白级分例如血液级分或脑组织匀浆中添加少量的螯合剂如EDTA、咪唑和/或EGTA可以帮助避免非特异性结合,并因而帮助从PrPSc和/或PrPC蛋白质中分离非特异性材料。例如,对于某些血浆级分,发现10到25mM EDTA有效地降低非特异性结合。当使用琼脂糖凝胶固定的金属离子工作时,人们必需小心,如果PrPC的释放也不是期望的,螯合剂的降低非特异结合和释放PrPC的效果不会重叠。此外,取决于非特异性结合蛋白质的存在和数量,将必需采用上述优选的浓度范围,即,被提高,来补偿非特异性蛋白质的存在,所述非特异性蛋白质消耗用于PrPC释放的螯合剂。这种优化处于本领域熟练技术人员的能力之内。
虽然如果本身不被屏蔽,但是琼脂糖凝胶本身足以结合显著数量的PrPSc,可能希望的是采用具有至少一种其他配体的琼脂糖凝胶用于特异性地结合朊病毒PrPSc和/或PrPC蛋白质,其中所述配体直接地或间接地,例如通过例如间隔区分子的方式,连接到琼脂糖凝胶。
在优选的实施方式中,其他配体选自由朊病毒蛋白质、朊病毒蛋白质的功能衍生物、带有His标签的朊病毒蛋白质、朊病毒蛋白质结合蛋白、朊病毒蛋白质结合抗体以及朊病毒蛋白质特异性配体构成的组。
更优选地,其他配体是朊病毒蛋白质,例如朊病毒片段,例如牛PrP(25-241),其直接或间接地,例如通过金属螯合剂,结合到琼脂糖凝胶。
如之前在导言小节提及的,朊病毒蛋白质或其衍生物与一种或多种朊病毒重复结构的可逆的聚集提供了用于结合、浓缩、纯化和/或除去朊病毒蛋白质和/或其功能衍生物的高度选择性和有效性的手段(PCT/EP2004003060),所述一种或多种朊病毒重复结构在6.2到7.8的pH值下与朊病毒蛋白质寡聚化,在4.5到5.5的pH值下可以再次解离。对于实践本发明,朊病毒重复结构可以作为其他配体附着于琼脂糖凝胶,以特异性地与朊病毒蛋白质寡聚化从而结合它们。
在更优选的实施方式中,其他的配体是朊病毒蛋白质和/或其功能衍生物。
用于实践本发明的方法的琼脂糖凝胶上的其他配体可以直接或间接地结合到琼脂糖凝胶,优选的是通过琼脂糖凝胶和配体本身之间的间隔区部分来结合。
虽然本发明的方法不限于任何特定的朊病毒蛋白质或其衍生物,朊病毒蛋白质和/或其功能衍生物选自由来自人类、牛、羊、小鼠、仓鼠、鹿或大鼠来源的朊病毒蛋白质和其衍生物构成的组。
此处在整个说明书和权利要求中使用的术语“朊病毒蛋白质的功能衍生物”是指朊病毒蛋白质的任何衍生物,特别是其片段,其包括至少一个或多个朊病毒重复结构,优选地2到4个、更优选地4个朊病毒重复结构。
在优选的实施方式中,朊病毒蛋白质的功能衍生物具有至少一个朊病毒重复结构,所述朊病毒重复结构是八肽、伪八肽、六肽、伪六肽,更优选的是具有选自由PHGGGWGQ(人类)、PHGGSWGQ(小鼠)和PHGGGWSQ(大鼠)构成的组的序列的八肽,或衍生自所述序列的伪八肽,优选地选自PHGGGGWSQ(各种物种)和PHGGGSNWGQ(有袋动物),或具有选自由PHNPGY(鸡)、PHNPSY、PHNPGY(乌龟)构成的组的序列的六肽,或是来自所述序列的伪六肽。
在更优选的实施方式中,至少一个、优选地每个所述朊病毒重复结构包含连接到C-末端β转角结构的N-末端环体构象。
最优选地,用于实践本发明的功能衍生物也能够可逆地聚集和/或解离,即,在水性液体环境中在6.2到7.8的pH值下寡聚化和/或在4.5到5.5的pH值下使寡聚体聚集物解离。
对于实践本发明的方法有用的朊病毒蛋白质的功能衍生物也可以是特征在于它们结合非屏蔽的琼脂糖凝胶达到显著的程度。显著的程度是指相对于衍生所述衍生物的天然发生的朊病毒蛋白质,优选地至少50、更优选地至少70、再更优选地至少80、以及最优选地至少90%的所述衍生物结合到未结合的琼脂糖凝胶。为了测定琼脂糖凝胶结合朊病毒蛋白质衍生物的程度,可以使用例如琼脂糖凝4B(Sigma,产品编码4B-200)评定琼脂糖凝胶结合。这种分析的参数可以由本领域技术人员常规地测定。
朊病毒蛋白质领域的普通技术人员将理解,在此提及的朊病毒蛋白质的功能衍生物可以是简要地和足够地特征在于它们包含至少一种上述朊病毒重复结构并能够结合未屏蔽的琼脂糖凝胶。对于牛朊病毒蛋白质或其衍生物,朊病毒蛋白质与琼脂糖凝胶的结合被认为受到结构域102-241的影响,其相应于人类PrP中氨基酸残基90到230。其他物种的朊病毒蛋白质和其衍生物中的类似区域具有类似的琼脂糖凝胶结合活性。
在优选的实施方式中,用于实践本发明的功能衍生物包括一个或多个氨基酸的删除、取代和/或插入、和/或一个或多个氨基酸的共价修饰来自朊病毒蛋白质。
在更优选的实施方式中,用于实践本发明的功能衍生物包括人类PrP的一个或多个八肽重复序列,优选地包括氨基酸51-90个,和/或C-末端结构域,优选地包括氨基酸121-230个。
如果采用配体修饰的琼脂糖凝胶,在允许所述琼脂糖凝胶与朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的结合以及任选的配体修饰的琼脂糖凝胶的配体部分与PrPC蛋白质的结合的条件下使朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物与琼脂糖凝胶接触的条件优选地是生理条件,更优选地是5到8的pH值和2到39℃,更优选地是约7的pH值和约20到25℃。
用于使琼脂糖结合到朊病毒蛋白质和其功能衍生物的进一步的条件是离子强度、缓冲物质等等。本领域的技术人员可以常规地确定适合的和优化的条件用于使琼脂糖凝胶结合到朊病毒蛋白质。
当术语“除去”用于消除未结合的非朊病毒蛋白质、体液和/或PrPC蛋白质和/或其衍生物的上下文中时是指用于分离蛋白质和琼脂糖凝胶材料的标准技术,如离心、过滤、超滤,等等。
如果天然地使用具有上述其他配体用于通过朊病毒蛋白聚集结合朊病毒蛋白质的琼脂糖凝胶,6.2到7.8的pH值是优选的。
在另一个优选的实施方式中,接触琼脂糖凝胶和朊病毒蛋白质的条件包括存在至少一种洗涤剂和/或细胞裂解缓冲液。这样,存在于感兴趣的样品中的细胞和/或膜级分可以通过根据本发明的方法直接地处理,而不需任何预先步骤用于解放朊病毒蛋白质或其功能衍生物并使它们可接近。
在进一步的方面中,本发明涉及琼脂糖凝胶、优选配体修饰的琼脂糖凝胶的用途,用于在根据本发明的方法中从其他的蛋白质中分离和/或除去朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物。
在优选的实施方式中,琼脂糖凝胶在上述方法之一中使用,用于从全血、血液级分或脑组织匀浆中、优选的从血浆中浓缩、纯化和/或除去朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物。
在进一步优选的实施方式中,所使用的琼脂糖凝胶是金属螯合的琼脂糖凝胶,优选包含二价金属离子,更优选地包含选自由Ni2+、Co2+、Zn2+和Mn2+构成的组的金属离子,最优选地包含Zn2+。
附图
图1说明了重组PrP-β和PrP-纯与Ni琼脂糖凝胶高效的特异性结合(实施例1和4)。
1:80mM EDTA,2:60mM EDTA,3:50mM EDTA,4:40mM EDTA,5:30mM EDTA,6:20mM EDTA,7:10mM EDTA,8:5mM EDTA,9:无EDTA,10:标准蛋白。(a)BSA(b)牛PrP(25-241)β形式和纯粹形式寡聚体(c)牛PrP(25-241)纯形式(d)牛PrP(25-241)β形式(e)小鼠PrP(89-231)β形式。
图2显示了PrP-β和PrP-纯与各种琼脂糖凝胶的结合(实施例1)。
1:蓝色琼脂糖凝胶CL-6B,2:亚氨二乙酸琼脂糖凝胶3:α-乳糖-琼脂糖,4:凝集素琼脂糖,5:蛋白A琼脂糖凝胶6:苯基-琼脂糖凝胶CL-6B,7:琼脂糖凝胶CL-4B,8:存在50mM EDTA的情况下的Ni琼脂糖凝胶高效,9:Ni琼脂糖凝胶高效,10:标准蛋白。(a)BSA(b)牛PrP(25-241)β形式和纯粹形式寡聚体(c)牛PrP(25-241)纯粹形式(d)牛PrP(25-241)β形式(e)小鼠PrP(89-231)β形式。
图3描绘了PrP-β和PrP-纯与各种琼脂糖凝胶的结合(实施例1)。
1:SP琼脂糖凝胶2:CM琼脂糖凝胶3:链霉抗生物素蛋白-氧化铁颗粒,4:EZviewTM红色链霉抗生物素蛋白亲和凝胶,5:反应性红色120-琼脂糖,6:亚氨二乙酸琼脂糖凝胶7:琼脂糖凝胶4B,8:在存在50mM EDTA的情况下的Ni琼脂糖凝胶高效,9:Ni琼脂糖凝胶高效。(a)BSA(b)牛PrP(25-241)β形式和纯形式寡聚体(c)牛PrP(25-241)纯形式(d)牛PrP(25-241)β形式(e)小鼠PrP(89-231)β形式。
图4展现了在重新加载了各种阳离子之后PrP-β和PrP-纯与Ni琼脂糖凝胶高效的结合(实施例1)。
1:Cu2+,2:空泳道,3:Ag+,4:Mn2+,5:Zn2+,6:Co2+,7:Ni2+,8:Ni2+和在存在0.5%Triton X-100的情况下的结合,9:Ni2+和在存在50mMEDTA的情况下的结合,10:未处理的基质。(a)BSA(b)牛PrP(25-241)β形式和纯形式寡聚体(c)牛PrP(25-241)纯形式(d)牛PrP(25-241)β形式(e)小鼠PrP(89-231)β形式。
图5说明了在重新加载了各种阳离子之后PrP-β和PrP-纯与Ni琼脂糖凝胶高效的结合(实施例1)。
1:未处理的基质,2:Ni2+和在存在50mM EDTA的情况下的结合,3:Ni2+,4:Mn2+,5:Mg2+,6:Ca2+,7:预加载BSA的Ni琼脂糖凝胶基质,8:预加载BSA的Ni琼脂糖凝胶基质。(a)BSA(b)牛PrP(25-241)β形式和纯形式寡聚体(c)牛PrP(25-241)纯形式(d)牛PrP(25-241)β形式(e)小鼠PrP(89-231)β形式。
图6显示了在牛血液的各种级分中天然PrPC的浓度。用牛PrP(25-241)纯形式预加载的Ni琼脂糖凝胶高效用于浓缩(实施例2)。
1和2:单核细胞和淋巴细胞,3和4:嗜中性细胞,5和6:血小板,7和8:血浆,9:标准蛋白。(a)天然PrPC(b)牛PrP(25-241)纯形式(c)具有朊病毒蛋白样特征的蛋白质。
图7描绘了在从牛血液的单核细胞和淋巴细胞中浓缩之后天然PrPC的蛋白酶K裂解。用牛PrP(25-241)纯形式预加载的Ni琼脂糖凝胶高效用于浓缩(实施例2)。
1和2:没有蛋白酶K,3:5μg/ml蛋白酶K,4:25μg/ml蛋白酶K,5:50μg/ml蛋白酶K。(a)牛PrP(25-241)纯形式寡聚体(b)天然PrPC(c)蛋白酶-截短的PrPC(d)牛PrP(25-241)纯形式。
图8展现了在从牛的血浆中浓缩之后天然PrPC的蛋白酶K裂解。用牛PrP(25-241)纯形式预加载的Ni琼脂糖凝胶高效用于浓缩(实施例2)。
1和2:没有蛋白酶K,3:0.5μg/ml蛋白酶K,4:5μg/ml蛋白酶K,5:50μg/ml蛋白酶K。(a)天然PrPC(b)蛋白酶-截短的PrPC(c)牛PrP(25-241)纯形式。
图9说明了在从用天然绵羊痒病脑组织匀浆掺入的缓冲溶液中浓缩之后天然PrPSc的蛋白酶K裂解。用牛PrP(25-241)纯形式预加载的Ni琼脂糖凝胶高效用于浓缩(实施例3)。
A:在50mM磷酸钠缓冲液中。B:在0.32M蔗糖、0.1%NP40、0.1%脱氧胆酸盐中。1:没有蛋白酶K,2:5μg/ml蛋白酶K 3:25μg/ml蛋白酶K。(a)天然PrPSc寡聚体(b)天然PrPSc单体形式。
图10显示了在从牛血液的血小板浓缩之后天然PrPC和PrPSc的蛋白酶K裂解。用牛PrP(25-241)纯形式预加载的Ni琼脂糖凝胶高效用于浓缩(实施例3)。
A:没有刮削脑组织匀浆的血小板溶胞产物。B:在用天然绵羊痒病脑组织匀浆的血小板溶胞产物掺入之后。1:没有蛋白酶K,2:50μg/ml蛋白酶K。(a)天然PrPSc寡聚体(b)天然PrPC和PrPSc单体形式。
图11描绘了天然PrPSc从重组PrP-纯的分离。用牛PrP(25-241)纯形式预加载的Ni琼脂糖凝胶高效用于浓缩(实施例4)。
1:没有EDTA,2:5mM EDTA,3:10mM EDTA,4:15mM EDTA,5:20mM EDTA,6:30mM EDTA。(a)天然PrPSc寡聚体(b)二-糖基化的PrPSc(c)单糖基化的PrPSc(d)未糖基化的PrPSc(e)牛PrP(25-241)纯形式。
图12展现了在从牛血液的血浆浓缩之后天然PrPC和PrPSc的蛋白酶K裂解。用牛PrP(25-241)纯形式预加载的Ni琼脂糖凝胶高效用于浓缩(实施例5)。
A:用BSE朊病毒实验性地感染的牛。B:没有BSE感染的牛。1:没有蛋白酶K,2:25μg/ml蛋白酶K,3:50μg/ml蛋白酶K。(a)天然PrPC和PrPSc形式(b)牛PrP(25-241)纯形式。四个箭头指明从用BSE朊病毒感染的牛一般地观察到的、而不是从健康对照动物观察到的PrPSc的蛋白酶K裂解产物。
图13说明了从牛的血浆中总PrP的消除。四个批次的用牛PrP(26-241)纯形式预加载的Ni琼脂糖凝胶高效用于分步地消除(实施例6)。从两个血液供体A和B获得血浆。
1:从血浆A的第一次消除,2:从血浆B的第一次消除,3:从血浆A的第二次消除,4:从血浆B的第二次消除,5:从血浆A的第三次消除,6:从血浆B的第三次消除,7:从血浆A的第四次消除,8:从血浆B的第四次消除,9:蛋白质标准。(a)牛PrP(25-241)纯形式寡聚体(b)天然PrPC(C)牛PrP(25-241)纯形式。
图14:显示了总PrP从人类血浆中的消除。四个批次的用人类PrP(23-230)纯形式预加载的Ni琼脂糖凝胶高效用于分步地消除(实施例6)。
1:第一次消除,2:第二次消除,3:第三次消除,4:第四次消除。(a)牛PrP(25-241)纯形式寡聚体(b)二糖基化的天然PrPC(c)天然PrPC的截短的形式(d)牛PrP(25-241)纯形式。
以下,将通过实施例的方式进一步说明本发明,实施例将涉及本发明的优选的实施方式,其不能被看作限制本发明的范围。
实施例
实施例1
不同的琼脂糖凝胶对PrP
Sc
的总体高亲和性结合
实验设计:
在存在1000倍过量的BSA的情况下用重组朊病毒蛋白质研究了朊病毒蛋白质对各种琼脂糖凝胶的结合亲和性和特异性。重组朊病毒蛋白质PrP-纯(alicon ag,产品编号P0001)和PrP-β(alicon ag,P 0019和P0027)分别用作PrPC和PrPSc的模型物质。由于它们的不同电泳运动性,牛PrP(25-241)和小鼠PrP(89-231)的β-形式和牛PrP(25-241)的纯形式可以由SDS-PAGE很好地分辨。
为了进行结合实验,将所研究的5μg朊病毒蛋白质和5mg BSA溶于含有50mM磷酸钠、pH 7的1ml结合缓冲液中。取决于实验设计,结合缓冲液含有添加剂如EDTA或洗涤剂。将琼脂糖凝胶基质和结合缓冲液的混合物在1.5ml小瓶中在4℃旋转1h。随后,在500g离心基质,用1ml结合缓冲液洗涤两次来除去未结合的蛋白质。琼脂糖凝胶结合的蛋白质在含有5%SDS和8M尿素的10μl标准凝胶加载缓冲液中变性,通过SDS-PAGE在12%聚丙烯酰胺凝胶上分析。
用所选的阳离子重新加载Ni琼脂糖凝胶高效(Amersham,产品代码17-526802)通过首先用含有50mM EDTA的结合缓冲液洗涤基质两次来除去结合的Ni2+来进行。将剥离的基质用结合缓冲液洗涤两次,通过在含有50mM金属离子的结合缓冲液中在4℃旋转10分钟来重新加载。在用结合缓冲液洗涤两次之后除去未结合的金属离子。
结果:
结果在以下的表1中概述:其中“-”代表琼脂糖凝胶对PrP没有亲和性,“+”代表对单体PrP形式的亲和性,“++”代表对单体PrP形式的高亲和性,“+++”代表对单体和寡聚体形式的PrP的高亲和性。术语“单体”和“寡聚体”PrP形式是指在SDS-PAGE中在非还原条件下观察到的二硫化物连接的寡聚体,而不是没有分子间二硫键的聚集的PrP形式。
未连接的琼脂糖凝胶以高亲和性结合牛PrP(25-241)的β形式和小鼠PrP(89-231),而不结合牛PrP(25-241)的纯形式。结合对单体形式而不对寡聚体形式发生(图2泳道7;图3泳道7)。虽然相对PrP有1000倍过量的BSA,但是与琼脂糖凝胶基质结合的白蛋白的相对数量是相对低的,表明PrP结合是高度特异性的。
带负电的琼脂糖凝胶以高亲和性结合牛PrP(25-241)的β形式和小鼠PrP(89-231)以及牛PrP(25-241)的纯形式。结合发生在单体和多聚体PrP形式上(图3泳道1和2)。
如对BSA的强结合所表明的,带正电的琼脂糖凝胶显示了非特异性蛋白质结合亲和性。由于在SDS-PAGE凝胶上加载的大量的总蛋白,不能够确定结合的PrP的数量。
测试的某些配体修饰的琼脂糖凝胶以高亲和性结合牛PrP(25-241)的β形式和小鼠PrP(89-231)以及牛PrP(25-241)的纯形式。结合发生在单体上而不发生在寡聚体的PrP形式上(图2泳道4和5;图3泳道3和6)。然而,一些其他配体修饰的琼脂糖凝胶显示了非特异性蛋白结合亲和性,如强的BSA结合所指示的(图2泳道1-2和6;图3泳道5)。
IMAC-琼脂糖凝胶以高亲性结合牛PrP(25-241)的β形式和小鼠PrP(89-231)以及牛PrP(25-241)的纯形式。对于某些IMAC-琼脂糖凝胶,例如Ni琼脂糖凝胶高效(Amersham),结合发生在单体上以及寡聚体的PrP形式上(图1泳道9;图2泳道9;图3泳道9;图4泳道10)。然而,许多琼脂糖凝胶专一性地结合单体的PrP。
IMAC琼脂糖凝胶与朊病毒蛋白质的结合受到螯合的金属离子的种类的调节。重新加载Ni2+、Zn2+或Co2+的Ni琼脂糖凝胶高效以高亲和性结合牛PrP(25-241)的β形式和小鼠PrP(89-231)以及牛PrP(25-241)的PrP-纯形式(图4泳道5、6、7和10)。寡聚体PrP形式与Ni琼脂糖凝胶高效的结合在用0.5%Triton X-100洗涤之后保持不变(图4泳道8),表明结合是特异性的。用BSA对Ni琼脂糖凝胶高效的预包被引起了寡聚体PrP形式的更有效的结合(图5泳道7-8)。用Cu2+对Ni琼脂糖凝胶高效的重新加载引起大量BSA的非特异性结合(图4泳道1),因而不适合于复杂的蛋白质溶液中朊病毒蛋白质的特异性富集。用Mn2+、Mg2+或Ca2+重新加载的Ni琼脂糖凝胶高效主要结合单体的PrP(图4泳道4;图5泳道4-6)。
解释:
PrP-β与琼脂糖凝胶的结合受以下调节:
-琼脂糖凝胶基质的可接近性
-琼脂糖凝胶固定化金属离子的存在
-琼脂糖凝胶上负电荷的存在
PrP-纯与琼脂糖凝胶的结合受以下的调节:
-琼脂糖凝胶固定化金属离子的存在
-琼脂糖凝胶上负电荷的存在
对β形式与琼脂糖凝胶的内在亲和性负责的氨基酸位于牛朊病毒蛋白序列的残基104到241之内。含有八肽重复的残基25到103因而不是琼脂糖凝胶结合所需的。然而,通过固定的金属离子和负电荷的结合,残基23到103的存在引起对IMAC琼脂糖凝胶或阳离子交换琼脂糖凝胶的提高的亲和性。
总结:
未连接的琼脂糖凝胶具有对PrP-β(相应于PrPSc)而不是对PrP-纯(相应于PrPC)的内在结合亲和性。因而未连接的琼脂糖凝胶可以用于浓缩、纯化和除去朊病毒而不影响PrPC的浓度。
当用固定的金属离子(例如Ni2+、Zn2+、Co2+)或负电荷(例如磺丙基或羧甲基)修饰基质时,PrP-β对琼脂糖凝胶的结合亲和性被提高,此时这些配体也结合PrP-纯。因而IMAC琼脂糖凝胶和带负电的琼脂糖凝胶可以用于浓缩、纯化和除去各种朊病毒蛋白形式。
实施例2
血液中天然朊病毒蛋白质的浓缩
实验设计:
健康人类和动物的血液中PrPC的数量仅仅是最低限的。没有任何浓缩步骤,使用常规的分析方法例如蛋白质印迹检测不到PrPC。然而,将用牛PrP(25-241)纯形式预加载的Ni琼脂糖凝胶高效应用于20ml血液,PrPC变得可见。
通过向用50mM磷酸盐缓冲液平衡的20ml琼脂糖凝胶中添加5ng重组朊病毒蛋白质来制备用牛PrP(25-241)预加载的Ni琼脂糖凝胶高效。将混合物涡旋,在4℃下旋转孵育1h。
使用标准方案从新鲜牛血液制备细胞溶胞产物和血浆。例如,在用柠檬酸钠1/10稀释到10mM的终浓度之后,从收集在EDTA试管中的20ml血液制备血浆级分。用Gey’s平衡盐溶液(Sigma,产品码G9779)1/1稀释柠檬酸血液,小心地混合。将溶液分配到50ml Falcon试管中,每个试管的最大体积为15ml,打开闸时在200g离心7分钟。向上清液中添加EDTA到终浓度10mM,打开闸时在560g离心10分钟。通过向每个血液级分中添加用牛PrP(25-241)预加载的60μl Ni琼脂糖凝胶高效来浓缩天然血液PrP。将蛋白溶液在4℃旋转孵育1h,在500g离心2分钟。丢弃上清液,将琼脂糖凝胶用含有100mM磷酸钠、10mMTris、20mM咪唑、pH 8的1mL缓冲液洗涤两次以除去未结合的蛋白质。对于连续的蛋白酶K消化,将每个血液级分分成三部分。将与琼脂糖凝胶结合的蛋白质与浓度0μg/ml到50μg/ml之间的蛋白酶K(Sigma,P2308)孵育,在37℃以1400rpm在Eppendorf热混合器中摇动1h。样品体积是在0.2mL PCR试管中的80μl,裂解缓冲液由50mM磷酸钠、pH 7和150mM NaCl组成。为了确保在蛋白酶K反应期间琼脂糖凝胶基质的均匀分布,向PCR试管中添加切成0.5cm长度的10μl尖头(Treff)。通过添加2μl 150mM PMSF贮备溶液终止反应。涡旋试管,在500g离心2分钟,丢弃上清液。使与琼脂糖凝胶结合的蛋白质在含有5%SDS和8M尿素的10μl凝胶加载缓冲液中变性,并加载到12%丙烯酰胺凝胶上。使用半干的不连续的三缓冲系统将蛋白质转移到PVDF上。转移是在1mA/cm2下持续1h。使用ECL高级蛋白质印迹检测试剂盒(Amersham)、PrP特异性单克隆抗体和过氧物酶联结的抗小鼠单克隆抗体的标准方案分析印迹。
结果:
在浓缩之后,在各种血液级分中测量到纳克数量的PrPC,包括单核细胞和淋巴细胞、血小板和血浆(图6)。血液细胞和血浆中的天然PrPC是二糖基化的,具有约35kDa的表观分子量。嗜中性细胞不表达显著数量的朊病毒蛋白质。
与琼脂糖凝胶结合的PrP对于蛋白酶K消化是可接近的。在用5μg/ml蛋白酶K处理来自细胞溶胞产物或血浆的固定的朊病毒蛋白质一小时之后,PrPC部分地降解,显示约30kDa的表观分子量(图7和8)。在10倍高的蛋白酶K浓度下,朊病毒蛋白质被完全地降解。
总结:
IMAC-琼脂糖凝胶构成了用于从体液浓缩总朊病毒蛋白质的极好的基质。琼脂糖凝胶固定的朊病毒蛋白质对于朊病毒诊断中采用的进一步的生化分析例如蛋白酶消化是可接近的。
实施例3
在用脑组织匀浆掺入之后浓缩血液中的PrP
Sc
实验设计:
血液中天然PrPSc的性质是未知的,然而看起来它具有与脑中发现的PrPSc相似的生物化学性质。我们使用来自脑组织匀浆(PrPSc浓度在1pg/ml和1ng/ml之间)的PrPSc作为模型底物来分析它与牛PrP(25-241)预加载的Ni琼脂糖凝胶高效的结合。
浓缩实验如实施例2中描述的进行,只是向样品中添加各种数量的绵羊痒病脑组织匀浆。
结果:
在向脑组织匀浆中掺入1mL磷酸钠缓冲液pH 8到1ng/ml PrPSc的终浓度和随后的200倍浓缩之后,二糖基化的、单糖基化的和未糖基化的PrPSc以及多聚体形式可以在蛋白质印迹中检测到(图9)。因而,独立于聚集和糖基化状态,PrPSc有效地结合琼脂糖凝胶。在存在5和25μg/ml蛋白酶K的情况下,约70个残基从固定的PrPSc的N-末端除去。高达5000倍浓缩的PrPSc、以及在含有0.5%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸盐和0.43%蔗糖的磷酸盐缓冲液中获得了类似的结果。甚至在N-末端截断之后,PrPSc与琼脂糖凝胶的结合不由于洗涤剂或碳水化物的存在而减少。
使用血小板溶胞产物和血浆获得了类似的结果。来自脑组织匀浆的天然血液PrPC和PrPSc通过琼脂糖凝胶基质被共同浓缩。在存在5μg/ml蛋白酶K的情况下,天然PrPC被完全降解(图10A),而浓缩的PrPSc显示了二糖基化、单糖基化和未糖基化形式的典型模式(图10B)。
总结:
IMAC-琼脂糖凝胶构成了用于从体液浓缩传染性朊病毒的极好的基质。琼脂糖凝胶固定的PrPSc质对于朊病毒诊断中采用的进一步的生化分析例如蛋白酶K消化是可接近的。
实施例4
浓缩的朊病毒蛋白质的构象特异性洗脱
实验设计:
如之前的实施例所提及的,Ni琼脂糖凝胶高效以高亲和性结合重组蛋白PrP-β和PrP-纯以及结合天然PrPC和PrPSc。
为了研究琼脂糖凝胶基质的洗脱性质,我们使用了与之前相同的实验设计,唯一例外是结合缓冲液含有各种浓度的EDTA。
结果:
在存在10mM EDTA的情况下,专门地,重组PrP的二聚形式被从琼脂糖凝胶基质上释放。在存在40mM EDTA的情况下,牛PrP(25-241)的纯形式被释放,而β形式甚至在80mM EDTA浓度下保持结合到琼脂糖凝胶(图1)。
当用Ni琼脂糖凝胶高效处理时,PrPSc的三种糖形式和重组牛PrP(25-241)被共同浓缩。在用提高浓度的EDTA洗涤琼脂糖凝胶基质之后,牛PrP(25-241)被逐渐地释放,而PrPSc保持结合(图11)。因而,代表天然PrPC的纯形式从琼脂糖凝胶上特异性地释放。掺入了来自绵羊痒病脑组织匀浆后的血液的天然PrPC获得了类似的结果。
解释:
向Ni琼脂糖凝胶高效添加EDTA引起独立的Ni2+从琼脂糖凝胶上的剥离。在琼脂糖凝胶固定的Ni+的数量低于某一值的EDTA浓度下,没有足够可用的结合位点,PrPC从琼脂糖凝胶上释放。相比之下,PrPSc保持结合,因为它的另外的琼脂糖凝胶结合活性。
总结:
IMAC-琼脂糖凝胶构成了用于从体液浓缩PrPC和PrPSc、随后在存在EDTA的情况下分离两种PrP构象体的极好的基质。
实施例5
来自BSE感染的牛的血液中天然PrP
Sc
的检测
实验设计:
在用BSE朊病毒感染的牛的血液中PrPSc的数量仅仅是最低限度的。没有任何浓缩步骤,使用常规的分析方法例如蛋白质印迹检测不到PrPSc。然而,将用牛PrP(25-241)纯形式预加载的Ni琼脂糖凝胶高效应用于用BSE实验地感染的牛的20ml血液,PrPSc变得可见。
对于这些实验,我们使用了与实施例2中相同的实验设置。
结果:
在用25μg/ml或50μg/ml蛋白酶K处理来自血浆的固定朊病毒蛋白质之后,存在着四种朊病毒蛋白质条带的积累,对于BSE感染的牛这是一般检测到的(图12A)。相对于没有蛋白酶K的情况下未降解的PrPC,微克数量的PrPSc移位了。对照牛没有观察到这样的条带。(图12B)。
总结:
IMAC-琼脂糖凝胶构成了用于检测来自BSE感染的牛的体液的天然PrPSc的极好的基质。
实施例6
通过过滤除去血液中的天然朊病毒蛋白质
实验设计:
根据早先的实施例,结果是所使用的少量的琼脂糖凝胶具有纳克范围内的结合能力。因而琼脂糖凝胶可以用于总朊病毒蛋白质从体液,例如人类和动物血浆中的完全消除。
对于血浆过滤实验,我们使用如实施例2中描述的相同的实验设置,只是连续地向相同的血浆中添加四批次的琼脂糖凝胶基质。将用于过量人类和牛血浆的Ni琼脂糖凝胶高效分别用人类PrP(23-230)、牛PrP(25-241)的纯形式预先加载。
结果:
在10ml来自牛血液的血浆中孵育1小时之后,用牛PrP(25-241)纯形式预加载的第一批次20μl Ni琼脂糖凝胶高效结合纳克数量的天然朊病毒蛋白质(图13)。第二批次的琼脂糖凝胶完全没有朊病毒蛋白质,达到1pg的检测极限。对于第三和第四批次的琼脂糖凝胶获得了相同的结果。因而,在与琼脂糖凝胶基质第一次孵育时间之后已经从血浆中除去了全部朊病毒蛋白质。
在10ml来自人的血浆中孵育1小时之后,用人PrP(23-230)纯形式预加载的第一批次20μl Ni琼脂糖凝胶高效也结合纳克数量的天然朊病毒蛋白质(图14)。当与之前的批次比较时,第二和第三批次的琼脂糖凝胶分别结合相对更少的朊病毒蛋白质。第四批次的琼脂糖凝胶完全没有朊病毒蛋白质,达到1pg的检测极限。因而,所有朊病毒蛋白质已经从人血浆中除去。
在人血浆中约4倍数量的PrPC解释了当与牛血浆相比时对于人血浆的过滤需要更大数量的琼脂糖凝胶。
总结:
IMAC-琼脂糖凝胶构成了用于从体液例如人类和牛血浆中除去天然朊病毒蛋白质的极好的基质。
表2
+++PrPSc单体和多聚体结合
++PrPSc单体结合
+PrPSc单体结合但有比++更低的亲和性
-没有PrPSc结合
序列表
<110>Alicon AG
<120>浓缩、纯化和除去朊病毒蛋白质的方法
<130>RP50013PCT II
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln
1 5
<210>2
<211>8
<212>PRT
<213>小鼠
<400>2
Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln
1 5
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>褐家鼠
<400>3
Pro His Gly Gly Gly Trp Ser Gln
1 5
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>脊椎动物物种
<400>4
Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Ser Gln
1 5
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>有袋动物
<400>5
Pro His Gly Gly Gly Ser Asn Trp Gly Gln
1 5 10
<210>6
<211>6
<212>PRT
<213>红原鸡
<400>6
Pro His Asn Pro Gly Tyr
1 5
<210>7
<211>6
<212>PRT
<213>未知的
<220>
<223>朊病毒蛋白的六肽衍生物
<400>7
Pro His Asn Pro Ser Tyr
1 5
<210>8
<211>6
<212>PRT
<213>乌龟
<400>8
Pro His Asn Pro Gly Tyr
1 5
Claims (28)
1.一种浓缩和/或纯化朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的方法,包括以下步骤:
a)在容许琼脂糖凝胶与朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的特异性的和高亲和性的结合的条件下使朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物与琼脂糖凝胶接触,
b)从所述琼脂糖凝胶中除去未结合的非朊病毒蛋白质,
其中所述琼脂糖凝胶不是Cu2+螯合的琼脂糖。
2.一种从体液中除去朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的方法,包括以下步骤:
a)在容许琼脂糖凝胶与朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的特异性的和高亲和性的结合的条件下使包含朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的体液与琼脂糖凝胶接触,
b)从所述琼脂糖凝胶中除去所述体液。
3.权利要求2的方法,其中所述体液选自全血、血液级分或脑组织匀浆,优选地选自血浆。
5.根据权利要求1到4中任一项的方法,其中所述琼脂糖凝胶选自配体修饰的琼脂糖凝胶,优选地选自由螯合金属的琼脂糖凝胶、凝集素琼脂糖、亚氨基二乙酸琼脂糖凝胶、蛋白A琼脂糖、链霉抗生物素蛋白琼脂糖凝胶、磺丙基琼脂糖凝胶和羧甲基琼脂糖凝胶构成的组,更优选地选自螯合金属的琼脂糖凝胶,以及最优选地,所述琼脂糖凝胶是Zn-琼脂糖凝胶。
6.一种从PrPC蛋白质和/或其功能衍生物中分离和/或富集朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的方法,包括以下步骤:
a)在一定条件下使朊病毒PrPSc蛋白质和PrPC蛋白质和/或其功能衍生物与配体修饰的琼脂糖凝胶接触,所述条件容许
(i)所述琼脂糖凝胶部分与所述朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的特异性的和高亲和性的结合,以及
(ii)琼脂糖凝胶的所述配体部分与PrPC蛋白质和/或其功能衍生物的结合,
b)任选地从所述配体修饰的琼脂糖中除去未结合的材料,
c)任选地等待足够的时间,以便在紧密邻近朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物处的某些或大多数与配体结合的PrPC蛋白质和/或其功能衍生物转变成朊病毒PrPSc蛋白质和/或功能衍生物,
d)在一定条件下向来自步骤a)、b)或c)的与琼脂糖凝胶结合的蛋白质和/或其功能衍生物中添加选择性释放试剂,所述条件容许PrPC蛋白质和任选的非朊病毒蛋白质从所述琼脂糖凝胶的配体部分释放,但不容许朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物从所述琼脂糖凝胶部分释放,以及
e)从所述琼脂糖凝胶中除去PrPC和任选的非朊病毒蛋白质。
7.权利要求6的方法,进一步包括步骤:
f)从所述琼脂糖凝胶释放PrPSc朊病毒蛋白质和/或其衍生物。
8.权利要求7的方法,其中通过添加离液剂和/或洗涤剂,优选地添加尿素和/或盐酸胍和/或SDS,更优选地添加尿素和/或SDS,最优选地添加包含8M尿素和5%SDS的凝胶加载的缓冲液并施加电场来完成PrPSc朊病毒蛋白质和/或其衍生物的释放。
9.权利要求5到8中任一项的方法,其中所述配体修饰的琼脂糖凝胶是包含二价的固定的金属离子的金属螯合的琼脂糖凝胶。
10.权利要求9的方法,其中所述金属离子选自由Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+和Mn2+构成的组。
11.权利要求10的方法,其中所述金属离子选自由Ni2+、Co2+、Zn2+和Mn2+构成的组。
12.权利要求11的方法,其中所述金属离子是Zn2+。
13.权利要求6到8中任一项的方法,其中所述配体修饰的琼脂糖凝胶是根据权利要求9到12中任一项的金属螯合的琼脂糖凝胶,所述选择性释放试剂是金属螯合剂,优选地是选自EDTA、咪唑和/或EGTA的试剂。
14.权利要求13的方法,其中所述金属螯合剂是EDTA。
15.根据权利要求14的方法,其中所述金属螯合的琼脂糖凝胶包含Zn2+,所述金属螯合剂是EDTA。
16.根据权利要求6到15中任一项的方法,其中容许非朊病毒蛋白质和PrPC从琼脂糖固定的金属离子上释放的权利要求6的步骤d)中的条件包括存在浓度5到50mM的金属螯合剂、更优选的10到25mM,最优选的浓度10到25mM的EDTA。
17.权利要求1到16中任一项的方法,其中用于结合朊病毒PrPSc和/或PrPC蛋白质的至少一种其他配体直接或间接地与所述琼脂糖凝胶结合。
18.权利要求17的方法,其中所述其他配体选自由朊病毒蛋白质、朊病毒蛋白质的功能衍生物、带有His标签的朊病毒蛋白质、朊病毒蛋白质结合蛋白、朊病毒蛋白质结合抗体以及朊病毒蛋白质特异性配体构成的组。
19.权利要求18的方法,其中所述其他配体是朊病毒蛋白质和/或其功能衍生物。
20.权利要求17到19中任一项的方法,其中所述其他配体直接地或间接地,优选地通过间隔区部分结合到琼脂糖凝胶。
21.根据权利要求1到20中任一项的方法,其中所述朊病毒蛋白质和/或其功能衍生物选自由来自人类、牛、羊、小鼠、仓鼠、鹿或大鼠来源的朊病毒蛋白质和其衍生物构成的组。
22.权利要求1到21中任一项的方法,其中所述功能衍生物通过一个或多个氨基酸删除、取代和/或插入,和/或一个或多个氨基酸的共价修饰从朊病毒蛋白质衍生得到。
23.权利要求1到22中任一项的方法,其中所述功能衍生物包含人类PrP的一个或多个八肽重复序列,优选包含氨基酸51-90个,和/或C-末端结构域,优选包含氨基酸121-230个。
24.权利要求1到23中任一项的方法,其中用于琼脂糖凝胶与朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物结合的条件是生理条件,优选5到8的pH值和2到39℃,更优选约7的pH值和约2到8℃。
25.权利要求24的方法,其中所述条件包括存在至少一种洗涤剂和/或细胞裂解缓冲液。
26.具有对PrPSc的特异性和高亲和性结合的琼脂糖凝胶在根据权利要求1到25中任一项的方法中用于从其他蛋白质中浓缩、纯化和/或除去朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物的用途。
27.根据权利要求26的琼脂糖凝胶的用途,用于从全血、血液级分或脑组织匀浆中、优选地从血浆中浓缩、纯化和/或除去朊病毒PrPSc蛋白质和/或其功能衍生物。
28.权利要求26或27的用途,其中所述琼脂糖凝胶是金属螯合的琼脂糖,优选地包含二价金属离子,更优选地包含选自由Ni2+、Co2+、Zn2+和Mn2+构成的组的金属离子,最优选地包含Zn2+。
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