CN101307109B - 鼠抗人t淋巴细胞cd3表面抗原单克隆抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体及其制备方法和用途。本发明利用杂交瘤细胞技术以胎儿胸腺细胞作为免疫原，利用Balb/c小鼠进行免疫，制备鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体。然后利用该抗体在Balb/c小鼠体内制备腹水，进一步制成鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体注射液(MMA₃)。该注射液在临床上主要用于治疗再生障碍性贫血，其疗效显著，副作用轻微，复发率低。

Description

鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体及其制备方法和用途，属于生物技术领域。

背景技术

再生障碍性贫血(简称再障，AA)是由多种原因引起的骨髓造血功能衰竭性疾病，临床上呈全血细胞减少。近年来研究表明，免疫功能紊乱与再障的发病密切相关。已知某些病毒、药物及射线等因素与再障发病有关。随着经济建设的发展，环境生活因素的影响，我国再障的发病率逐渐增高，尤多发生于青壮年、婴幼儿，严重影响国民生产力及国民体质健康。再障分急性型(AAA)和慢性型(CAA)两类，又根据临床表现分为严重型(SAA)和极重型(VSAA)。SAA与VSAA发病急，进展快，易出现严重出血、感染，死亡率高。CAA以贫血为主，经常出血，反复感染，长期迁延不愈，部分患者输血要求频繁，CAA也可突然病情加剧，演变成SAA加速死亡。目前对再障的治疗还没有特效药物，再障至今被视为难治之症。

发明内容

本发明目的是通过杂交瘤技术，利用Balb/c小鼠以胎儿胸腺细胞进行免疫，用其脾细胞与SP2/0细胞融合筛选出一特异性单抗，即鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体(简称抗CD₃单抗)。该抗体作为细胞免疫调节剂，在临床上可制成鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体注射液(MMA₃)，主要用于治疗再障及其他细胞免疫功能紊乱性疾病，其疗效显著，副作用轻微，复发率低。

本发明采用的技术方案是：首先利用杂交瘤细胞技术以胎儿胸腺细胞作为免疫原，利用Balb/c小鼠进行免疫，制备杂交瘤细胞，即保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏号为CCTCC NO：C200803的抗T淋巴细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株CD3。然后将该杂交瘤细胞注射入Balb/c小鼠体内，抽取腹水产生鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体。

本发明涉及到的杂交瘤细胞已于2008年3月14日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保存号为：C200803，名称为抗T淋巴细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株CD3。

本发明是通过以下过程实现的：

一、杂交瘤细胞CCTCC NO：C200803的产生

1、制备免疫原在超净台内无菌条件下取胎儿胸腺细胞作为免疫原。

2、免疫第一次免疫用2×10⁷胸腺细胞，腹腔注射，加强免疫二次，每次间隔3周，融合前3天做末次免疫。

3、融合与克隆化Balb/c小鼠经胎儿胸腺细胞腹腔注射免疫后，取脾细胞与Sp2/0细胞与50％PEG作用下融合后，置HAT选择培养基中培养，加Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞，5天后可见集落长成，10-12天后换HT培养液，待集落生长至孔面积1/4左右时，取上清以APAAP法进行细胞株筛选，得到抗体分泌阳性的杂交瘤细胞即抗T淋巴细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株CD3。

二、由上述杂交瘤细胞CCTCC NO：C200803分泌的鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体的制备通过以下步骤实现的：

(1)预注射液体石蜡

用酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，每只腹腔注射0.5ml石蜡；

(2)细胞扩培

将获得的杂交瘤细胞CCTCC NO：C200803接种到培养瓶中孵箱培养扩增，收集细胞；

(3)接种细胞

将上步收集到的细胞用生理盐水稀释调至1×10⁶-3×10⁶个/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml；

(4)采集腹水

挑出接种细胞后7-12天的小鼠抽腹水；腹水经澄清、分子筛柱层析纯化后即可获得鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体。

上述步骤获得的鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体可进一步制成鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体注射液(MMA₃)，临床上主要用于治疗再生障碍性贫血。

本发明临床前研究：

1.药效学研究表明，MMA₃对PBMNC无致丝裂作用，对无造血系统疾病者的骨髓CFU-GM及再生障碍性贫血患者骨髓CFU-CM的体外生长有明显激活作用，并呈双向作用。

2.药理学研究表明，在高于临床拟用剂量条件下，MMA₃对猫的精神神系统以及血压、呼吸、心电等均无影响。

3.药代动力学表明，IgG₁在体内存留8.3天，大部分时间分布于实验动物的组织中(占总停留时间的53％)，分布体积超过了血浆和间质液体积，给药后迅速分布于多数器官，肝、脾、肺的平衡时间分别＜2.6min，肠道分布较慢(＜20min)，肌肉分布最慢(260min)，血浆浓度分布比＞0.5％，在肌肉中该比值＞0.18，降解主要在肠道(72.8％)，其次是肝(20.5％)，脾(3.6％)。在抗体被降解或分泌之前至少在体液组织之间进行2.8次/g组织器官重量的循环。

4.急性毒性实验表明，小鼠分别经尾静脉、皮下给药未能测出LD₅₀；当以MMA₃最高浓度、最大给药体积给药后，实验动物未出现毒性反应症状，I.V.和S.C.给药的LD₅₀均大于90mg/kg，表明MMA₃急性毒性甚低。

5.亚急性毒性实验表明，小鼠给予临床拟用剂量的40-90倍的MMA₃后，未见对小鼠产生明显毒性作用。小鼠静脉连续大剂量给药的毒性很低。

6.慢性毒性实验表明，连续注射给大鼠MMA₃12天后，多数实验动物即可产生抗MMA₃抗体。在连续给药期及停药观察3个月期间，实验动物的一般行为、症状无明显改变；血液学与血生化指标，系统解剖与病理组织学以及骨髓象学检查项目均未见毒性反应症状，与溶媒对照组比较均无明显差异。结果表明MMA₃对大鼠无明显毒性作用。

7.全身过敏实验表明，MMA₃对豚鼠无致敏作用。

8.连续给药的局部刺激性实验表明，MMA₃连续给药对给局部无刺激性作用。

9.致突变实验表明，MMA₃对人二倍体细胞无致突变作用。

MMA₃I期临床研究表明，副作用轻微，安全性较好。

MMA₃根据《药品注册管理办法》规定属生物制品二类新药，经国家药品监督管理局批准进行临床研究[批件号为(1999)制申体字第34号]，目前已完成I期临床研究，进入II期临床研究，进一步观察其安全性和疗效。由郑州大学第一附属医院作为组长单位(原河南医科大学第一附属医院)，河北医科大学第二医院、兰州大学第一医院、济南军区总医院、兰州军区总医院等作为参加单位为本产品进行多中心、随机、双肓双模拟、平行对照的临床研究。

本发明创新点：

1.MMA₃为一新型抗CD₃单抗。本发明以胎儿胸腺细胞作为免疫原，通过鼠-鼠B淋巴细胞杂交瘤技术制备得到了MMA₃杂交瘤细胞株。获得的MMA₃杂交瘤细胞株经山东医科大学附属医院鉴定，结果证明其为识别T淋巴细胞分化抗原CD₃的单抗；抗CD₃单抗经中国药品生物制品检所检定证明MMA₃为鼠IgG₁；MMA₃半成品、成品经中国药品生物制品检定所检定合格。MMA₃为特异性明确的抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原的单克隆抗体，与已知的OKT₃及WuT₃单克隆抗体识别抗原的不同表位，对正常骨髓粒-巨噬祖细胞(CFU-GM)体系生长有明显激活作用，且呈双向调节作用特征。

2.MMA₃纯化方法独特，重复性好，收率高。MMA₃纯化方法选用了小鼠腹水离心、过滤澄清，100％饱和度(NH₄)₂SO₄沉淀离心，色谱层析。在色谱层析方法的选择上，发明人比较了离子交换、亲和层析、分子排阻、疏水层析等方法的优缺点。离子交换层析在样品上柱前需经透析等手段除掉高盐，增加了操作步骤，且分离效果不理想。亲和层析介质成本高且不够稳定。而用分子排阻介质Sephacryl S-300HR初步纯化，洗脱液直接接上Phenyl Sepharose6FF(high sub)进行疏水层析(HIC)纯化，可以在高盐条件下上样，在低盐条件下洗脱，得到的MMA₃纯度高且重复性好，其纯化效果见表1。

表1  MMA₃纯化结果汇总

3.对适应症再障碍性贫血的选择合理。发明人对MMA₃治疗AA的机理进行了一第系列的研究，结果表明，机体免疫调解机制紊乱在AA发病中起重要作用，特别是无明显诱因的患者。具体再现为：a.T淋巴细胞亚群分布异常，CD₈ ⁺细胞比例的增大，CD₄/CD₈比值下降；b.异常细胞克隆；c.负造血调控因子(干扰素γ、肿瘤坏死因子α等)表达增强；d.HLA-DR表达增强。

TCR/CD₃复合体是T细胞特异性的主要调节者，抗TCR-CD₃单克隆抗体能模拟其重量性配体并与之结合，然而这些抗体导致T细胞呈现两个相反效应-T细胞的活化和抑制。MMA₃用于治疗就是基于抗CD₃单克隆抗体的上述两个生物学效应。MMA₃对正常及AA患者骨髓CFU-GM体外生长作用研究表明，MMA₃对正常及AA患者骨髓CFU-GM有明显激活作用，且呈双向调节效应。本项目曾作为科研项目，研究结果表明MMA₃对AA的治疗总有效率为79.3％，且起效迅速、毒副作用较小。

MMA₃是国内唯一主要用于治疗再障的单抗制剂，美国OKT₃和国内WuT₃产品尽管在技术和质量指标上与MMA₃有相同之处，但它们作用的抗原决定簇位点与MMA₃不同(经竞争抑制试验表明位点不同)，来源均是鼠源性，前两者主要用于治疗器官移植中的抗排斥反应。

治疗典型病例：

例一：邢某，男，56岁，患慢性再障12年，经常规治疗多年无效，Hb41g/L，WBC2.5×10⁹，Plt6×10⁹需输血维持，一周输血200ml。经用MMA₃治疗两疗程好转，血常规基本恢复正常，无需输血，继用MMA₃巩固治疗一疗程，随访至今，情况良好。

例二：赵某，男，45岁，患慢性再障3年，经用司坦唑醇、达那唑、再障升血片治疗无好转。MMA₃治疗两疗程好转，随访至今，Hb 101g/L，WBC 4.5×10⁹，Plt 126×10⁹，随访至今病情稳定。

例三：李某，女，12岁，患急性再障一月，高热，Hb 32g/L，WBC 1.5×10⁹，Plt 11×10⁹，用MMA₃治疗三疗程好转，Hb 100g/L，WBC 4.7×10⁹，Plt 112×10⁹，至今情况良好。

附图说明

附图1为杂交瘤细胞制备基本程序框图。

附图2为MMA₃生产技术路线框图。

具体实施方式

一、杂交瘤细胞CCTCC NO：C200803的产生

1.材料

①亲本细胞  骨髓瘤细胞：Sp2/0，由澳大利亚引进；Balb/c种属，不合成免疫球蛋白，染色体数为72条。

②免疫亲代细胞  动物种系与来源：Balb/c小鼠，雄性，8-10周龄，山东医科大学实验动物中心提供。

③MMA₃细胞株免疫原——胎儿胸腺细胞  胎儿胸腺来源于济南市历下区人民医院妇产科，胎儿为女婴，孕龄为7个月，系手术引产。胎儿母亲李某，年龄28岁，系第二胎，计划生育引产；胎儿母亲身体健康，HBsAg阴性，肝功、血常规正常，问诊无家族遗传史。胎儿引产后尚有弱呼吸，无畸形，健康。

2.方法

2.1制备免疫原  在超净台内无菌条件下先取出胎儿胸腺，获取胎儿胸腺细胞为免疫原。

2.2免疫  第一次免疫用2×10⁷胸腺细胞，腹腔注射，加强免疫二次，每次间隔3周，融合前3天做末次免疫。

2.3融合与克隆化  Balb/c小鼠经2×10⁷胎儿胸腺细胞腹腔注射免疫3次，于末次免疫3天后，取脾细胞与Sp2/0细胞与50％PEG(分子量1540，Sigma)作用下融合后，置HAT选择培养基中培养，加Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞，5天后可见集落长成，10-12天后换HT培养液，待集落生长至孔面积1/4左右时，取上清以APAAP法进行细胞株筛选，对抗体分泌阳性的杂交瘤细胞以有限稀释法进行亚克隆3次，至所有亚克隆细胞均成阳性反应(阳性克隆率100％)。

2.4杂交瘤细胞检定  细胞核学特征：检查细胞分裂中期染色体，应符合杂交瘤细胞的核型。

①试剂：秋水仙素；0.075mol/L氯化钾低渗溶液；细胞固定液(甲醇3份，冰乙酸1份)；姬姆氏染色液；树脂

②器材：尖底离心管(10ml)，吸管，载玻片，盖玻片，离心机(水平式转头)，显微镜。

③方法：在细胞传代培养48小时后，加秋水仙素，最终浓度为0.1μg/ml，继续培养3小时。移入离心管，1000rpm离心10分钟，弃上清液；加入5ml预温至37℃的0.075mol/L氯化钾低渗液，用吸管吹打均匀，置37℃水浴20分钟；每管加入1ml新鲜配制的固定液混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清液。再加5ml固定液，静止30分钟后，1000r/min离心10分钟，弃上清；沉淀物中加5ml固定液，轻轻吹散细胞，吸取2-3滴细胞悬液，滴于预冷的洁净载玻片上，立即轻轻吹散，使细胞分布均匀，并在火焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥；用姬姆氏染液染色10分钟，经自来水洗去染色液，自然干燥，树脂封片后，用显微镜检测；每个标本计数100个完整的中期细胞核，记录染色体数，分析染色体数的分布。并作显微镜摄影。

二、由上述杂交瘤细胞CCTCC NO：C200803分泌的鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体的制备

1.材料

①细胞培养用小牛血清  支原体检测应为阴性，经小量试验适于杂交瘤细胞生长。

②培养液  采用RPMI-1640培养液，G1BCO生产。

③化学试剂  各种生产应用化学试剂应达到分析纯化上。

0.4M NaCl：干烤NaCl46.752g，加无热原水2000ml，用0.2M NaOH调pH至6.8-7.0；

0.2MNaOH：NaOH4g，加无热原水500ml；

100％饱和硫酸铵(ASA)：硫酸铵400g，放入大烧杯中，加无热原水500ml，用电炉子加热助溶，边加热边搅拌至硫酸铵完全溶解，稍冷却，过滤。

④动物种系与来源  Balb/c小鼠，8周龄以上，由北京军科院提供。制备腹水动物使用Balb/c小鼠，生产用鼠必需经过检查，应无鼠源病毒污染，并有合格证明。在腹水生产过程中如发现动物不健康、咬伤、感染者均应废弃。

2.方法

2.1预注射液体石蜡。进入实验室后，穿隔离服，戴好帽子、口罩、手套，将适量液体石蜡倒入干烤过的小瓶内，用酒精棉球消毒手套，用注射器吸取适量石蜡，用酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，腹腔注射0.5ml/只石蜡，(7天之后注射细胞)作好标记。

2.2接种细胞。

2.2.1物品高压蒸汽灭菌：小号培养瓶、弯头吸管、直头吸管、刻度吸管、尖底离心管，121℃，20min；

2.2.2无菌室紫外线消毒；

2.2.3打开水浴箱，设定39℃，水浴箱中放一盛开水的大烧杯，使其温度为39℃。

2.2.4复苏杂交瘤细胞(需无菌操作)

2.2.5向小号培养瓶中加入含15％小牛血清的1640培养液10ml。

2.2.6用刻度吸管取8ml 1640培养液，放入尖嘴离心管中。

2.2.7从液氮罐中取出要复苏的细胞，迅速放入盛有39℃温水的烧杯中，再将烧杯迅速放入39℃水浴箱中，用镊子夹住冻存管下部快速转动，使其迅速融化(以稍稍带一点冰核为好)。

2.2.8打开冻存管，用直头吸管将其内细胞液吸出，放入盛1640培养液的尖底离心管中，混匀，盖好盖，用封口膜封住离心管口，1000转/分，离心10min。

2.2.9离心后，在超净台内弃去上清，吸取培养瓶内的培养液将离心管底的细胞轻轻吹起，放入盛有培养液的培养瓶中，拧好瓶塞(不要太紧，以拧开时稍有阻力为好)，轻轻晃匀，作好标记(种类，日期)，放入37℃CO2孵箱培养。

2.2.10换液。4-6小时后，给刚复苏的细胞换一次液。轻轻摇晃两下培养瓶，倒去培养液(视细胞多少来决定倒去多少培养液)，补加含15％小牛血清的1640培养液至10ml，放入孵箱继续培养。

2.3细胞扩增。细胞经几次传代后，选出效价高的扩培制备腹水。

2.3.1物品高压蒸汽灭菌：大号培养瓶、弯头吸管、刻度吸管；

2.3.2无菌室紫外线消毒。

2.3.3细胞扩培(需无菌操作)。

2.3.4用弯头吸管轻轻吹打细胞，形成细胞悬液。

2.3.5向大号培养瓶中加入适量细胞悬液(具体依细胞数量而定)。

2.3.6用刻度吸管分别向每个大号培养液中加入35ml含10％小牛血清的1640培养液，轻轻摇匀，拧好瓶盖，作好标记(种类，日期)，放入孵箱培养。

2.3.7扩培的细胞培养2-3天，观察细胞生长情况，当细胞几乎覆盖整个瓶底时，开始收集。

2.3.8用弯头吸管轻轻吹打细胞，动作要轻，形成细胞悬液，倒入塑料离心管中，盖好盖，用封口膜封口。

2.3.9离心：1600转/分，10min。

2.3.10洗涤：在超净台内弃掉上清，用生理盐水吹打均匀，合并入1-2个离心管里，加生理盐水混匀，盖好盖，用封口膜封口，1600转/分离心10min。

2.3.11计数：在超净台内弃掉上清，离心管底部的细胞用生理盐水作适当定量稀释，显微镜下记数，然后用生理盐水调整细胞浓度为1×10⁶-3×10⁶个/ml，迅速送至动物室给小鼠注射。

2.4接种细胞：将培养的细胞调至1×10⁶个/ml，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml，注射细胞前要先摇匀，放射要迅速，细胞放置时间不宜过长，记录细胞种类、注射数量、日期等。

2.5采集腹水：挑出接种细胞后约7-12天，腹部胀大，变紫，四肢及尾部发白，行动迟缓，精神不振的小鼠待抽腹水。在超净台内，用酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，右手捏住针头中间，斜面向上刺入小鼠腹腔，变换针头同小鼠的相对位置，使腹水快速流入离心管，可多次采集。抽取腹水时注意不要触及针头两端，离心管口及内壁等，保证腹水不被热原污染。

2.6腹水处理：腹水内含有红细胞、细胞碎渣、纤维蛋白凝块及脂质等，需离心除去。4℃，3000转/分，15分钟，吸取上部澄清腹水放入无热原盐水瓶内，作好标记，-20℃冻存，沉渣弃去。

2.7腹水在处理前需提前12小时从-20℃拿出放4℃冰箱融化。

2.8腹水处理

2.8.1吸取石蜡：融化的腹水液面有一层石蜡，用无热原吸管吸出弃掉，尽量吸干净。留样检测效价。

2.8.2腹水处理，Xml腹水加入Xml0.4MNaCl溶液，再加入2Xml 100％饱和硫酸铵(少量多次加入，边加边摇匀)用氨水调pH至6.8-7.0，4℃放置4小时或过夜。

2.8.3在4℃，10000转/分离心20分钟，上清弃去(检测效价为阴性)，沉淀留下。

2.9分子筛柱层析

①柱型号：35×1000(mm)。

②胶型号：Sephacryl S-300HR(Pharmacia)750ml全部装入，按说明书装胶。

③流量；3ml/min。

④流动相：0.2mNaCl(MMA8)或0.4mNaCl(MMA3)pH7.0。

⑤上样量：1-5％柱床体积(7.5～37.5ml)，样品中总蛋白浓度＜40mg/ml。

⑥样品处理：样品沉淀用流动相溶液吹打均匀，总体积在20～30ml左右为宜。

⑦加样方式：用无热原移液管把样品液沿绕柱内壁小心的加入。不要冲击着胶表面，待样品刚刚进入胶面后，向柱内加约10cm高流动相，洗脱，收峰。

⑧胶在位清洗：(每上3次样约300ml腹水清洗一次)冲无热原水约300ml，流速3ml/min→冲0.2mNaOH 400ml，流速1ml/min→冲无热原水至pH为水的pH值，流速1ml/min→冲流动相。

2.10半成品检定

上步中纯化后得到的抗体进行效价检定、无菌试验、蛋白含量测定、热原试验、电泳等检测。

2.10.1效价

①细胞上清：1∶10；1∶20；1∶40；1∶80；1∶160

②腹水：1∶10；1∶100；1∶1000；1∶2000；1∶4000；1∶8000；1∶16000

③铵沉上清：1∶10；1∶100；1∶200；1∶400

④半成品、成品：1∶10；1∶100；1∶200；1∶400；1∶800；1∶1600

步骤：

①准备片子：将血膜片从-20℃冰箱中取出，室温下放置30min；打开包装，将正面对着风扇吹干，约30min；

②固定：将固定液从4℃冰箱中取出，放入血膜片(保证所用的圈完全浸入固定液中)固定30秒后立即用自来水冲洗(冲洗时要小心，防止将细胞冲掉)，吹干；

③镜检：在显微镜下观察各圈内的细胞，选出可使用的，用记号笔在小圈的周围画上网格线，作好标记；

④加一抗：把片子放在湿盒内，将稀释好的样品即一抗，按稀释倍数由大到小依次加入各圈内(注意不要使样品溢出圈外相混，也不能太少，以免样品干涸)，室温放置1小时；用pH7.2，0.01M PBS缓冲液冲洗片子，吹干；

⑤加二抗：向各圈中加二抗(羊抗鼠Ig抗血清)，在湿盒内放置30min；用pH7.2，0.01M PBS缓冲液冲洗片子，吹干；

⑥加三抗：向各圈中加三抗(鼠抗碱性磷酸酶)，在湿盒内放置30min；用pH7.2，0.01M PBS缓冲液冲洗片子，吹干；

⑦染色：临用时现配制显色液(底物缓冲液1ml加入坚固红1mg)，在混合器上充分混匀(以稍显橙黄色为宜)，立即滴加到每个小圈内，将装有片子的湿盒放入37℃水浴箱内作用30min；自来水冲洗片子，吹干；

⑧复染：向每个小圈中滴加复染液，作用30秒，立即用自来水冲洗干净，吹干；

⑨封片：将封片剂用热水溶解，滴在片子上，加盖玻片封片(防止产生气泡)；

⑩观察结果：在显微镜下观察细胞，阳性者细胞膜被染成玫瑰红色，细胞核被染成蓝色。依据细胞膜被染色的程度由深到浅，依次用#、+++、++、+、±、-来表示。

2.10.2无菌试验：每个青霉素小瓶加3～4ml培养基，加1ml药液，37℃培养48h。

2.10.3热原试验：兔热原检查法。在兔子耳朵静脉注射MMA₃量为2mg/kg。

①选择健康家兔：雌雄均可，雌应无孕，体重1.7-3.0kg，体重差异不超过700g。

②室温变化≤3℃，避免噪音干扰，室温18-28℃。

③家兔在测试前1小时开始停食并置于家兔固家盒中，至试验完毕。

④温度记录：用肛温计插入肛门6cm，时间≥1.5分钟，记录。

⑤实验用器皿应置烘箱中250℃加热30分钟或180℃加热2小时。

⑥正常体温测定与家兔分组：家兔固定至少1小时后，每隔30分钟测体温一次，一般测定两次，两次之差不超过0.2℃，以这两次体温平均值作为该兔的正常体温(38-39.6℃)，各兔体温之差不超过1℃

2.10.4蛋白质含量测定：

①4％碳酸钠溶液。取4g碳酸钠，加蒸馏水溶解成100ml

②0.2mol/L氢氧化钠溶液。取0.8g氢氧化钠加蒸馏水溶解成100ml

③0.04mol/L硫酸铜溶液。取0.5gCuSO₄·5H₂O加蒸馏水溶解成50ml

④2％酒石酸钾(或酒石酸钠)，加蒸馏水溶解成50ml

⑤碱性铜液。临用前取试剂①和②各25ml，试剂③和④各0.5ml混匀配制而成。

⑥酚试剂：称取100g钨酸钠，25g钼酸钠，置1500ml烧杯瓶中，加入700ml蒸馏水，50ml85％磷酸及100ml浓硫酸，上联回流管微沸回流10小时，取下回流管，加入150g硫酸锂，50ml蒸馏水，几滴溴液，煮沸约15分钟，驱除过量的溴。冷却，加蒸馏水稀释至1000ml，过滤，为酚试剂贮备液。酚试剂贮备液经标准氢氧化钠滴定，测定酸浓度，而后用蒸馏水稀释相当1mol/L盐酸浓度，即为酚试剂。

⑦标准蛋白质溶液。取牛血清白蛋白标准品，准确稀释至1mg/ml(含ml于0.02％NaN₃)，为标准蛋白质贮备液。精确量取标准蛋白质贮备液2.5ml于25ml容量瓶中，用含0.02％NaN₃的蒸馏水稀释至刻度，为标准蛋白溶液(100ug/ml)。

⑧样品。精确量取一定体积样品(含蛋白质50ug左右)于试管中，加5ml碱性铜溶液，混匀，于室温放置10分钟，快速加入0.5ml酚试剂，摇匀，于室温放置30分钟，用650nm波长滤光片比色(呈色后，如发现浑浊，经3000rpm离心15分钟后再比色)。

⑨标准曲线。精确量取标准蛋白质溶液(100ug/ml)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置于试管中，加蒸馏水补至1ml，其余操作同样品，可得一标准曲线。

2.10.5电泳：还原及非还原SDS-PAGE法

①浓缩胶浓度：5％，分离胶浓度：15％

②浓缩胶电流：15mA，分离胶电流：20mA

③电极缓冲液：50mol/L Tris-38m mol/L甘氨酸，PH8.3，0.1％SDS

④电泳时间：1h

⑤样品处理：样品与处理液3∶1混合，100℃，3min，进行还原和非还原处理，上样量每孔＞5.0μg

⑥染色方法：考马斯亮兰染色。

2.11过滤除菌

2.11.1过滤除菌前准备工作

①过滤前需干烤物品：磨口瓶(2500ml)2个；盐水瓶若干；量筒；吸管；刻度吸管；小烧杯；药匙；青霉素瓶；NaCl；漏斗；钢盘；饭盒；滤器；过滤用玻璃管及套管。

②过滤前需泡NaOH物品：盐水瓶塞；青霉素瓶塞；过滤管；密封垫。

③用干烤的钢盘、无热原水泡大滤膜。

④过滤前需高压灭菌物品：培养基；盐水瓶；吸管；整套滤器。

2.11.2加保护剂：检定合格的半成品用相应的流动相稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml，按0.1％(V/V)的量加入吐温-80，按2％(W/V)的量加入甘氨酸，摇匀。

2.11.3过滤除菌：在无菌条件下用0.22um微孔滤膜过滤除菌，先用无热原水预过滤，确保滤膜无破损后再过滤药液，作无菌试验。

2.12定量分装

2.12.1分装前的准备工作

①分装前需干烤物品：安瓿瓶；小漏斗(装在搪瓷缸内)；分装瓶；饭盒；磨口瓶(2500ml)2个；大平皿、小平皿。

②需泡双氧水物品：分装器；针头；针头套。

③分装前需高压灭菌物品：衣服；帽子；口罩；培养基；青霉素小瓶；吸管；分装用针头；安瓿瓶；漏斗；整套分装器。

2.12.2分装：在无菌条件下，5ml易折安瓿瓶定量分装，5.0ml/支，即为成品。过敏试验针为1ml/支，200ug，5支成品配1支。

2.13成品检定项目：效价；无菌试验；热原试验。

具体方法与半成品检定方法一样。

2.14包装，入库。

Claims (4)

1.鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体，其特征在于，该抗体是由保藏于中国典型培养物保藏中心保藏号为CCTCC NO：C200803的抗T淋巴细胞单克隆抗体杂交瘤细胞株CD3分泌的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体，其特征在于，制备方法步骤如下：

(1)预注射液体石蜡

用酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，每只腹腔注射0.5ml石蜡；

(2)细胞扩培

将获得的杂交瘤细胞CCTCC NO：C200803接种到培养瓶中孵箱培养扩增，收集细胞；

(3)接种细胞

将上步收集到的细胞用生理盐水稀释调至1×10⁶-3×10⁶个/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml；

(4)采集腹水

挑出接种细胞后7-12天的小鼠抽腹水；腹水经澄清、分子筛柱层析纯化后即可获得鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体。

3.根据权利要求1或2所述的鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体，其特征在于，所述抗体为IgG₁亚类。

4.根据权利要求1或2所述的鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体，其特征在于，进一步制成鼠抗人T淋巴细胞CD₃表面抗原单克隆抗体注射液(MMA₃)，临床上主要用于治疗再生障碍性贫血。

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