CN101292162A - 鉴定治疗剂的方法 - Google Patents
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Abstract
如此处所述,胆固醇在动脉粥样硬化斑块中被氧化。该反应生成的能用作巨噬细胞趋化引诱剂的胆固醇氧化或臭氧化产物可促进单核细胞分化为巨噬细胞并能提高E-选择素和A类清道夫受体(SR-A)的表达。本发明涉及使用该种胆固醇臭氧分解产物鉴定可用于治疗动脉硬化症和其它炎性动脉疾病的药剂的方法。
Description
本申请主张于2005年8月15日提交的美国临时申请60/708,316的优先权,其内容在此全文引用作为参考。本申请还涉及2003年9月5日提交的美国临时申请60/500,845,2003年11月6日提交的美国临时申请60/517,940,2004年9月3日提交的美国申请10/934,319,以及2004年9月3日提交的美国申请10/934,795,其内容在此全文引用作为参考。
在此披露的此项发明在美国政府资助下产生,该资助由国家卫生研究院授予,资助号POCA 27489。美国政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本发明涉及对可通过抵消动脉粥样硬化病灶中产生的胆固醇臭氧化产物的作用而应用于治疗和预防动脉粥样硬化和/或心血管疾病的药剂的鉴定方法。根据本发明,胆固醇臭氧化产物是改变动脉粥样硬化症形成中关键细胞的分化,表达模式,和/或趋化性的细胞毒素。
背景技术
心血管疾病是许多国家主要的疾病和死亡因素。约三分之一的男性在60岁前患有主要的心血管疾病。而女性在最初显示出较低的风险(比例为1比10),但心血管疾病随年龄增长而变得普遍。例如,在65岁后,女性患心血管疾病的几率与男性相当。血管疾病(例如冠状动脉疾病,中风,再狭窄和外周血管疾病)仍是全世界主要的死亡和残废因素。
尽管医生鼓励改变饮食和生活方式以减少心血管疾病的形成,遗传易感性导致的脂代谢紊乱仍是血管疾病中中风和死亡的显著因素。因此有必要对疑难的动脉粥样硬化病灶的形成和治疗进行探讨。
发明内容
本发明人之前已显示抗体可生成如臭氧等活性氧。Wentworth等人,Science 298,2195(2002);Babior等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,3920(2003);P.Wentworth Jr.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,1490(2003)。本申请提供的证据显示了动脉粥样硬化病斑物质可生成臭氧等活性氧以及胆固醇臭氧化产物。
如本发明所述,胆固醇的臭氧化产物存在于动脉粥样硬化病斑并能加剧或加速疑难病斑的累积。例如,胆固醇的臭氧化产物可以促进巨噬细胞的脂质摄取并加速泡沫细胞形成的速率。胆固醇的臭氧化产物还可以不利地影响载脂蛋白B100和其中含有载脂蛋白B100的低密度脂蛋白(LDLs)的二级结构,此外,胆固醇的臭氧化产物还可以改变动脉粥样硬化形成中相关细胞的分化,表达模式,或趋化性。
因此,本发明一方面涉及可以抵消或抑制胆固醇臭氧化产物活性的药剂的鉴定。例如,在一个实施例中,本发明涉及一种在动脉粥样硬化组织中抑制泡沫细胞形成的药剂的鉴定方法。该方法包括将巨噬细胞与一种测试药剂接触并观察该巨噬细胞在暴露至胆固醇臭氧分解产物后A类清道夫受体(SR-A)的表达是否上升,在一些实施例中,该细胞在LDL存在下被暴露至胆固醇臭氧分解产物4a或5a。
本发明的另一方面为一种能抑制巨噬细胞向动脉粥样硬化组织募集的药剂的鉴定方法。该方法包括将巨噬细胞与一种测试药剂接触并观察该巨噬细胞是否向胆固醇臭氧分解产物源头迁移。在一些实施例中,胆固醇臭氧分解产物4a或5a被用作该胆固醇臭氧分解产物。
本发明的另一方面是一种能抑制动脉粥样硬化症的药剂的鉴定方法。本方法包括将内皮细胞与一种测试药剂接触并观察该内皮细胞暴露至胆固醇臭氧分解产物后其中E-选择素的表达是否上升。在一些实施例中,该内皮细胞在LDL存在的情况下被暴露至胆固醇臭氧分解产物4a或5a。本发明的另一方面是一种能抑制单核细胞分化成为巨噬细胞的药剂的鉴定方法。本方法包括将单核细胞与一种测试药剂接触并观察该单核细胞是否分化成为巨噬细胞,其中该单核细胞以胆固醇臭氧分解产物进行培养。在一些实施例中,该单核细胞以胆固醇臭氧分解产物4a或5a进行培养。
如本发明所提供,胆固醇臭氧化产物是动脉粥样硬化病灶的标记。不生成臭氧的抗体,以及其它与胆固醇臭氧化产物结合的结合剂可用于灭活或抑制胆固醇臭氧化产物的毒性并从而治疗和预防动脉粥样硬化。因此本发明提供了抗胆固醇臭氧化产物的抗体和结合实体。
本发明还涉及一种通过向哺乳动物给用一种与治疗剂连接的抗体或结合实体治疗或预防哺乳动物动脉粥样硬化的方法,其中该抗体或结合实体可以与动脉粥样硬化病斑中的一种分子或抗原(例如,胆固醇臭氧化产物)结合。该种治疗剂可以帮助减缓动脉粥样硬化病灶的生长或减小其尺寸等。
本申请还涉及胆固醇臭氧化的细胞毒产物,以及使用该种细胞毒胆固醇臭氧化产物治疗自体免疫疾病,癌症,肿瘤,细菌感染,病毒感染,真菌感染,溃疡和/或其它可受益于定位给用细胞毒素的疾病的方法。
本发明的一个方面是可对原核或真核细胞具有细胞毒的分离的胆固醇臭氧化产物。该种臭氧化产物可以导致巨噬细胞脂质摄取或泡沫细胞形成。本发明中该臭氧化物还能改变低密度脂蛋白中一种蛋白的二级结构。例如,本发明的臭氧化产物可以改变载脂蛋白B100的二级结构。
本发明的臭氧化产物包括具有式4a-15a,7c的任意一种或其组合的任意化合物。
本发明的另一方面是一种用于治疗或预防包含了具有式4a或式5a的胆固醇臭氧化产物的动脉粥样硬化病灶的标记。
本发明的另一个方面是包含了载体和可对原核或真核细胞具有细胞毒的分离胆固醇臭氧化产物的组合物。该胆固醇的臭氧化产物可以是此处所述的任意胆固醇臭氧化产物。
本发明的另一个方面是一种能与胆固醇臭氧化产物结合的分离结合实体。该结合实体可以结合的胆固醇臭氧化产物可以是,例如,具有式4a-15a,7c的任意一种或其组合的任意化合物。在一些实施例中,该臭氧化产物为4a或5a。该结合实体可以是抗体等。该结合实体可以是针对一种半抗原(例如,具有式13a,14a或15a的半抗原)所产生。抗体结合实体的范例包括由具有ATCC编号PTA-5427或PTA-5428的杂交瘤KA1-11C5或KA1-7A6衍生的抗体。其它抗体结合实体的范例包括具有ATCC编号PTA-5429或PTA-5430的杂交瘤KA2-8F6或KA2-1E9衍生的抗体。
在一些实施例中,本发明的结合实体与治疗剂连接。所采用的治疗剂可以减少动脉粥样硬化病灶或预防动脉的进一步堵塞等。可与本发明的结合剂一起使用的治疗剂的范例包括抗氧化剂,消炎剂,药物,小分子,肽,多肽或核酸。
本发明的另一方面是一种与胆固醇臭氧化产物连接的分离结合实体,其中该胆固醇臭氧化产物对原核或真核细胞具有细胞毒性。
本发明的另一方面是一种在患者体内治疗动脉粥样硬化的方法,其包括向患者给用一种可以结合胆固醇臭氧化产物的结合剂。与该结合剂相结合的胆固醇臭氧化产物可以是具有式4a-15a或7c中任意一种的化合物。优选地,该结合剂不生成活性氧。在一些实施例中,该结合实体与治疗剂相连接。该种治疗剂可以帮助减缓动脉粥样硬化病灶的生长或减小其尺寸。可采用治疗剂的范例包括抗氧化剂,消炎剂,药物,小分子,肽,多肽或核酸。
本发明的另一方面是一种通过向患者给用能结合目标细胞的结合剂杀死患者体内的目标细胞的方法,其中该结合剂连接至胆固醇臭氧化产物。该结合实体可以是抗体。在该实施例中,该结合实体或抗体可以生成活性氧。该抗体可连接至能生成单线态氧的化合物。能生成单线态氧的化合物的范例包括蒽-9,10-二丙酸内过氧化物等内过氧化物。其它能生成单线态氧的化合物的范例包括蝶呤,黄素,血卟啉,四(4-磺酸苯基)卟啉,联吡啶钌(II)复合物,孟加拉玫瑰红染料,醌,若丹明染料,苯二甲蓝染料,竹红菌素,rubrocyanin,频哪氰醇或别花青素等。
本发明的另一方面是一种通过采用能结合胆固醇臭氧化产物的结合实体或抗体从哺乳动物体液分离细胞毒性胆固醇臭氧化产物以从哺乳动物中去除细胞毒性胆固醇臭氧化产物的方法。该臭氧化产物可以从哺乳动物的循环血中去除。在另一个实施例中,该臭氧化产物从哺乳动物血液中通过体外处理再回输体内而去除。在一个更进一步的实施例中,该结合实体或抗体以定位方法施用至定位组织。
本发明的另一方面是一种通过向哺乳动物给用一种与细胞毒性胆固醇臭氧化物连接的抗体治疗或预防哺乳动物癌症的方法,其中该抗体可以结合癌细胞。
本发明的另一方面是一种通过向哺乳动物给用一种与细胞毒性胆固醇臭氧化物连接的抗体治疗或预防哺乳动物非正当免疫应答的方法,其中该抗体可以结合该非正当免疫应答涉及的免疫细胞。
本发明的另一方面是一种调节抗体活性氧生成的药剂的鉴定方法,其通过:(a)将抗体与候选药剂结合;(b)测定形成的活性氧的数量;以及(c)将形成的活性氧的数量与通过测定未与候选药剂结合的抗体形成的活性氧所得到的标准值进行比较。在一些实施例中,该活性氧为臭氧。
附图说明
图1A-D显示了靛蓝胭脂红1可通过4-β-佛波醇12-豆蔻酸酯13-醋酸酯(PMA)处理的人动脉粥样硬化病灶氧化形成靛红磺酸2。
图1A显示了靛蓝胭脂红1通过臭氧转变为靛红磺酸2时发生的化学变化。
图1B显示了由PMA-激活的动脉粥样硬化病灶对靛蓝胭脂红1的漂白。各玻璃瓶中均含有等量的分散在靛蓝胭脂红1溶液(200/M)中的动脉粥样硬化病斑(净重约50mg)以及在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS,10mM磷酸钠,150mM NaCl)中的牛过氧化氢酶(50μg)。该图片在向右侧瓶子添加溶有PMA的DMSO溶液(10μL,40μg/mL)后30分钟拍摄。在左侧瓶子添加同体积的无PMA的DMSO。反应混合物的总体积为1mL。
图1C显示了通过反相HPLC分析时在图1B的+PMA瓶子的上清液中出现的新HPLC峰。该新的峰对应靛红磺酸2,其保留时间(RT)约为9.71分钟。
图1D显示了如图1B所示的PMA-激活的人动脉粥样硬化病灶物质与靛蓝胭脂红1反应后离心得到的上清液的阴离子电喷雾质谱图谱。当使用靛蓝胭脂红1作为指示剂在H2 18O中以PMA激活悬浮病斑物质时,如靛红磺酸2分离裂解产物的质谱中[M-H]-230质量碎片峰的外观和相对强度所示,约40%的靛蓝胭脂红1的内酰胺羰基氧结合了18O。由靛蓝胭脂红1在普通水(H2 16O)的存在下形成的靛红磺酸2具有质量碎片峰[M-H]-228。
图2A显示了由胆固醇3臭氧分解得到可通过羟醛缩合转化为5a的5,6-secosterol 4a。通过2,4-二硝基苯肼(2mM溶于0.08%HCl)衍生分别得到腙衍生物4b和5b。由4a通过衍生化过程得到的5b的量约为20%。对5a和5b的构象分配参考K.Wang,E.W.A.Pryor,Steroids 58,225(1993)。
图2B显示了作为图3中18分钟[M-H]-579的洗脱峰的标准考察的氧化型胆固醇6a-9a和2,4-二硝基苯肼氢氯化衍生物6b-7b的结构。7a-7b的构象分配基于采用标准合成的7b物质的1H-1H ROESY试验。
图3A-E显示了采用液相色谱质谱连用(LCMS)对病斑物质和化学合成的标准样品腙4b,5b和6b的分析。条件:Adsorbosphere-HSRP-Cl柱,75%乙腈,20%水,5%甲醇,流速0.5mL/min,360nm检测,以2,4-二硝基苯肼氢氯化物(DNPH HCl)衍生的病斑萃取物的内嵌阴离子电喷雾质谱(MS)(Hitachi M8000机器)。
图3A显示了未经PMA活化但经过此处所述的2,4-二硝基苯肼的衍生化的病斑物质的LCMS分析。以PMA(40μg/mL)激活前的动脉粥样硬化病灶中检测到化合物4b(RT~14.1min),5b(RT~20.5min)和6b(RT~18min)。
图3B显示了经PMA活化,经过此处所述的萃取和2,4-二硝基苯肼的衍生化的病斑物质的LCMS分析。以PMA(40μg/mL)激活后的动脉粥样硬化病灶中检测到大量化合物4b(RT~14.1min),和少量的化合物6b(RT~18min)。
图3C显示了标准4b的HPLC分析;插图显示了质谱分析。
图3D显示了标准6b的HPLC分析;插图显示了质谱分析。
图3E显示了标准5b的HPLC分析;插图显示了质谱分析。
图4A-D显示了萃取和衍生化的动脉粥样硬化物质的HPLC-MS分析,其中的100μl注射量被用于检测痕量腙。图4A显示了时间对强度的LC迹线,所采用条件参见上文。RT26.7为7b(与标准物质比较)。RT~24.7的峰是一种[M-H]-461的未知腙。图4B提供了[M-H]-597的单离子监测。图4C提供了[M-H]-579的单离子监测。图4D显示了[M-H]-461的单离子监测。
图5A-C显示了患者A-N的动脉粥样硬化萃取物中的胆固醇臭氧化产物的浓度。
图5A是显示了以PMA激活前和激活后的患者动脉粥样硬化病灶中的4a萃取和衍生化后的腙4b测得浓度的柱状图。该柱状图显示了采用针对Macintosh的GraphPad Prism V3进行的学生t-检验(双尾)(p<0.05,n=14)分析在激活前和激活后测得的数值。
图5B是显示了以PMA(n=14)激活前和激活后的患者动脉粥样硬化病灶中的5a萃取和衍生化后的腙5b测得浓度的柱状图。
图5C是显示了从患者采集的血浆样本的5a进行萃取和衍生化后的5b测得浓度的柱状图。群组A(n=8)患者将在24小时内进行颈动脉内膜切除术(在样本收集3天后进行血浆分析)。群组B(n=15)患者随机从参与一般医学临床的患者中选择(在样本收集7天后进行血浆分析)。注意到在预临床考察中,5a的血浆水平每天下降约5%。在该分析条件下,4b和5b的检测限为1-10nM。因此,当未观察到4b或5b时,4b或5b的水平低于10nM。
图6A显示了3,4a和5a对B细胞(WI-L2)细胞系的细胞毒性。每一个数据点至少是两次测量的平均值。4a(■)和5a(▲)的IC50s±标准误差可用针对Macintosh计算机的GraphPad Prism v 3.0采用非线性回归分析(Hill图分析)进行计算。在该浓度范围内未观察到3()的细胞毒性。
图6B显示了3,4a和5a对T细胞(Jurkat)细胞系的细胞毒性。每一个数据点至少是两次测量的平均值。4a(■)和5a(▲)的IC50s±标准误差可用针对Macintosh计算机的GraphPad Prism v 3.0采用非线性回归分析(Hill图分析)进行计算。在该浓度范围内未观察到3()的细胞毒性。
图7A-B显示了胆固醇臭氧分解产物4a和5a提高巨噬细胞的脂质负荷以生成泡沫细胞。
图7A显示了以LDL培养J774.1巨噬细胞对该巨噬细胞的脂质负荷具有很小的影响。巨噬细胞首先在含10%胎牛血清的RPMI-1640中培养24小时,然后于含LDL(100μg/mL)的相同培养基中培养72小时。以4%甲醛固定细胞并以苏木精和油红O染色从而使脂质颗粒染成暗红色。放大倍率x100。
图7B显示了以臭氧分解产物4a孵育的LDL诱导巨噬细胞的脂质负荷生成泡沫细胞。J774.1巨噬细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640中培养24小时。然后于含LDL(100μg/mL)和臭氧分解产物4a(20μM)的相同培养基中培养细胞72小时。以4%甲醛固定细胞并以苏木精和油红O染色从而使脂质颗粒染成暗红色。放大倍率x100。注意臭氧分解产物4a对巨噬细胞的作用无法与臭氧分解产物5a的作用相区分。
图8A-C显示了通过圆形二色性检测的暴露至臭氧分解产物4a或5a时LDL二级结构的改变。所报导的结果至少来自同一样本的两次重复试验。
图8A显示普通LDL的蛋白成分具有大比例的α螺旋结构(~40±2%)和少量的β结构(~13±3%),β转角(~20±3%)和无规则卷曲(27±2%)。图8A显示了LDL(100μg/ml)在37℃下于PBS(pH7.4)中的时间依赖性圆形二色性图谱。
图8B显示了在37℃下以溶于PBS(pH7.4)的臭氧分解产物4a孵育LDL可导致apoB-100二级机构的损失。图8A显示了LDL(100μg/ml)和4a(10μM)在37℃下于PBS(pH7.4)中的时间依赖性圆形二色性图谱。
图8C显示了在37℃下以溶于PBS(pH7.4)的臭氧分解产物5a孵育LDL可导致apoB-100二级机构的损失。图8A显示了LDL(100μg/ml)和5a(10μM)在37℃下于PBS(pH7.4)中的时间依赖性圆形二色性图谱。
图9显示了丹磺酰肼胆固醇臭氧化产物4a和5a(分别为4d和5c)的结构以及这些肼衍生物的HPLC洗脱模式。如图所示,胆固醇臭氧化产物4a和5a产生的丹磺酰腙缀合物具有不同的HPLC保留时间。
图10显示了可通过气相色谱-质谱连用(GCMS)分析检测到人颈动脉样本中的胆固醇臭氧化产物。所示的谱图是典型动脉粥样硬化病斑萃取物的谱图。在22.49分钟的洗脱峰同时对应胆固醇臭氧化产物4a和5a。插入质谱色谱显示22.49分钟的洗脱物质的m/z为354。
图11显示了使用ID-GCMS对两个动脉粥样硬化病斑(P1和P2)的定量分析。测得的胆固醇臭氧化产物4a和5a的量约为80-100pmol/mg组织,与LC-MS分析测得的结果类似。各个条均代表了双份萃取物并以平均±SEM表示。
图12A-D显示了胆固醇臭氧化产物5e的丹磺酰衍生物的摄取和定位。以溶于PBS的5e(50μM)处理巨噬细胞(J774A.1)培养物5分钟(100X,图12A)和1小时(200X,图12B)后进行荧光显微检查。图12C显示了在含有FCS(10%)的培养基中以胆固醇臭氧化产物5e(50μM)处理5分钟后的巨噬细胞培养物(60x)。图12D显示了在含有FCS(10%)的培养基中以胆固醇臭氧化产物5e(50μM)处理60分钟后的巨噬细胞(RAW 264.7)培养物(100x)。以化合物9d或用于合成5e的丹磺酰胺化合物处理的对照样本和细胞显示了最小的荧光(数据未显示)。处理后,以95%冷甲醇固定并以甘油将细胞制成样本。这些数据通过60x油浸物镜(NA 1.4)以及(激发)DAPI360/40和(发射)457/50滤光器组合采集。
图13显示了胆固醇臭氧化产物4a和5a对巨噬细胞清道夫受体表达的作用。如图所示,与LDL复合的胆固醇臭氧化产物4a和5a提高了SR-A表达但对CD36表达具有很小的作用或没有作用。巨噬细胞(J774A.1)以媒介(vehicle),LDL,Cu-OxLDL,25μM胆固醇臭氧化产物4a(称为atheronal A)结合LDL(100μg/ml蛋白)或25μM胆固醇臭氧化产物5a(称为atheronal B)结合LDL(100μg/ml蛋白)处理6小时。未处理样本显示了最小的荧光(CD36/FITC 12.7±0.5;SR-A/PE 31.7±4.1)。其中的数据代表了两个单独试验的平均荧光强度±SEM,相对对照*P<0.05,**P<0.01。
图14A-B显示了巨噬细胞对胆固醇臭氧分解产物4a(称为atheronal A)和5a(称为atheronal B)的趋化性。在趋化性室中以胆固醇(25μm),C5a(10nM),臭氧分解产物4a(25μM),或臭氧分解产物5a(25μM)处理J774A.1巨噬细胞。图14A显示了在具有胆固醇,C5a,臭氧分解产物4a或臭氧分解产物5a的室中每个显微视野内的迁移细胞。采用光镜对细胞计数并以每高倍视野的细胞进行表示。对每个样本总计计数15个高倍视野。胆固醇与媒介对照刺激迁移的情况类似(41±8细胞/视野)。图14B显示在含有臭氧分解产物5a的迁移室中细胞的荧光随臭氧分解产物的浓度上升。于下侧室中在不同浓度的臭氧分解产物5a的存在下孵育钙黄绿素-AM标记的细胞。通过荧光分析仪测量迁移细胞的荧光并以迁移细胞数/微孔表示。所示为3次试验的平均±SEM值。相对对照**P<0.001。
图15A-B显示在与LDL复合的臭氧分解产物4a(atheronal A)或5a(atheronal B)的存在下,在血管内皮细胞中粘附分子的表达。图15A显示了这些臭氧分解产物在单一浓度下的作用。图15B显示了LDL臭氧分解产物4a的浓度上升对E-选择素表达的作用。对于图15A,以LDL,Cu-oxLDL,臭氧分解产物4a/LDL或臭氧分解产物5a/LDL(100μg/mL蛋白)孵育HAAE-I内皮细胞4小时。以ELISA测量VCAM-I,E-选择素和ICAM-I的表面表达。所示的数据为两个单独试验中表达相对媒介(100%)的百分比的平均±SEM。相对媒介*P<0.05,**P<0.005。对于图15B,以与LDL复合的一定浓度范围(0-50μM)的臭氧分解产物4a(atheronal A)孵育培养的内皮细胞(HAAE-I),并以针对图15A描述的方法测量E-选择素的表面表达。所示数据为3次重复试验的平均±SEM。
图16A-H显示了胆固醇臭氧分解产物诱导单核细胞分化成为巨噬细胞,以12.5或25μM的下列试剂处理THP-1悬浮细胞7天:胆固醇(图16A-B),7-酮基胆固醇(阳性对照,图16C-D),臭氧分解产物4a(atheronal A,图16E-F),臭氧分解产物5a(atheronalB,图16G-H)。以7-KC或臭氧分解产物5a(atheronal-B)处理4天后THP-1细胞开始吸附。7日后观察到最大吸附。相反地,胆固醇和臭氧分解产物4a处理在同样的时间段内未诱导细胞吸附。图中显示了代表性的相差显微图像。
发明详述
如本发明所述,胆固醇的臭氧化产物存在于动脉粥样硬化病斑中。这些胆固醇的臭氧化产物能够通过多种方式加剧或加速病斑的形成,例如,通过向动脉粥样硬化组织募集巨噬细胞,促进单核细胞转化成为巨噬细胞,以及改变细胞吸附分子(E-选择素)或A类清道夫受体(SR-A)的表达。该SR-A受体是负责巨噬细胞对修饰LDL和氧化型胆固醇进行内在化的关键细胞表面受体。此外,胆固醇的臭氧化产物可以通过加速巨噬细胞脂质摄取以及提升形成的泡沫细胞的数量改变载脂蛋白B100以及其中发现载脂蛋白B100的低密度脂蛋白(LDLs)的结构。因此,胆固醇的臭氧化产物可以加速更容易导致如心脏病,充血性心力衰竭,中风等血管疾病疑难症状的晚期动脉粥样硬化病灶的形成。
本发明还提供了可用作动脉粥样硬化症标记的胆固醇臭氧化产物。此外还提供了能够抵消胆固醇臭氧化产物作用的组合物,试剂盒和结合剂。这些组合物,试剂盒和结合剂可用于治疗和预防动脉粥样硬化症,心血管疾病和其它血管疾病。
在另一实施例中,本发明还提供了作为细胞毒素的胆固醇臭氧化产物,以及使用该种细胞毒胆固醇臭氧化产物治疗自体免疫疾病,癌症,肿瘤,细菌感染,病毒感染,真菌感染,溃疡和/或其它可受益于局部给用细胞毒素的疾病的方法。
本发明的另一方面是一种能够抑制胆固醇臭氧分解产物对哺乳动物细胞活性的药剂的鉴定方法。该方法包括将细胞与一种测试药剂接触并观察该细胞的分化,表达模式,或趋化性是否变化,其中该细胞在胆固醇臭氧化产物存在的情况下进行培养。在一些实施例中,该细胞以胆固醇臭氧分解产物4a或5a进行培养。
胆固醇臭氧化
如本发明所述,胆固醇在动脉粥样硬化病斑物质内通过如臭氧等活性氧被氧化。通过该过程可产生一系列的胆固醇臭氧化产物且这些产物可在从动脉粥样硬化患者采集的组织或体液样本中检测得到。
胆固醇具有以下结构(3)。
当胆固醇在动脉中沉积时可形成动脉粥样硬化病斑。如此处所述动脉粥样硬化病斑可释放如臭氧等活性氧;该动脉粥样硬化病斑物质还可生成胆固醇臭氧化产物。尽管不希望被限定在一种特定的机制中,但可以看到巨噬细胞,嗜中性粒细胞,抗体和其它免疫细胞被陷入动脉粥样硬化病灶并释放如臭氧等活性氧。所生成的活性氧在病灶内与胆固醇反应并将胆固醇氧化成为一系列能在采自患者的生物样本中检测到的产物。
例如,当胆固醇3被氧化时所形成的主要产物为seco-酮醛4a及其丁间醇醛加合物5a。
此外,还可观察到与化合物6a-15a以及7c的结构类似的胆固醇臭氧化产物。
如本发明所述,该seco-酮醛4a,其丁间醇醛加合物5a以及相关的化合物如6a-15a和7c存在于从患有动脉粥样硬化的患者中采集的动脉粥样硬化病斑物质中。此外,在患者血流中检测到的seco-酮醛4a,丁间醇醛加合物5a以及相关化合物如6a-15a和7c与该患者中形成的动脉粥样硬化病斑的范围和严重性相关联。
例如,八位动脉粥样硬化疾病患者中六位的血流(血浆)显示其足以进展到保证动脉内膜切除术且测得的5a的数量范围在70-1690nM之内(图5C)。然而,从参与一般医学临床的患者组中随机选择的十五个患者的血浆样本中仅有一个样本中有可测得的5a。
此外,如本发明所述,胆固醇的臭氧化产物可以氧化修饰LDL,和/或LDL的蛋白成分,载脂蛋白B100(apoB-100)。以seco-酮醛4a或丁间醇醛加合物5a处理LDL可以降低LDL和/或apoB-100的α-螺旋含量并增加无规则卷曲含量,从而改变该复合物的二级机构。更重要的,该seco-酮醛4a或丁间醇醛加合物5a可以提高巨噬细胞对脂质的摄取并促进泡沫细胞的形成。
本发明提供了抵消胆固醇臭氧化产物副作用的方法。
抵消胆固醇臭氧化产物活性的药剂的鉴定
如此处所述,胆固醇臭氧化产物可以改变动脉粥样硬化症形成中关键细胞的分化,表达模式,或趋化性。例如,胆固醇臭氧化产物4a和5a可以向动脉粥样硬化组织募集巨噬细胞,促进单核细胞分化成为巨噬细胞,提高内皮细胞中细胞吸附分子(E-选择素)的表达并提高巨噬细胞中的A类清道夫受体(SR-A)的表达。
因此,本发明的一方面是一种能够在哺乳动物细胞中抑制胆固醇臭氧分解产物活性的药剂的鉴定方法。该方法包括将细胞与一种测试药剂接触并观察该细胞的分化,表达模式,或趋化性是否变化,其中该细胞在胆固醇臭氧分解产物存在的情况下进行培养。在一些实施例中,该胆固醇臭氧化产物为4a或5a。
在一个实施例中,该方法包括将巨噬细胞与一种测试药剂接触并观察该巨噬细胞暴露至胆固醇臭氧分解产物后A类清道夫受体(SR-A)的表达是否上升。该SR-A受体是负责巨噬细胞对修饰LDL和氧化型胆固醇进行内在化的关键细胞表面受体。巨噬细胞对LDL和氧化型胆固醇的摄取可以导致泡沫细胞的形成。因此,一种能在细胞暴露至胆固醇臭氧分解产物时抑制SR-A表达的药剂可用于延缓或抑制动脉粥样硬化组织中泡沫细胞的形成。在一些实施例中,该细胞在LDL存在的情况下被暴露至胆固醇臭氧分解产物4a或5a。
本发明的另一方法包括对一种能抑制向动脉粥样硬化组织募集巨噬细胞的药剂的鉴定。如此处所述,胆固醇臭氧分解产物为吸引巨噬细胞的趋化性药剂。巨噬细胞的累积是动脉粥样硬化病斑累积的一个标志。因此,能在胆固醇臭氧分解产物的存在下抵消巨噬细胞的趋化性的药剂可用于抑制动脉粥样硬化病斑形成。该方法包括将巨噬细胞与一种测试药剂接触并观察该巨噬细胞是否向胆固醇臭氧分解产物源头迁移。在一些实施例中,胆固醇臭氧分解产物4a或5a被用作该胆固醇臭氧分解产物。
本发明的另一方面是一种能通过抑制E-选择素表达上升来抑制动脉粥样硬化症的药剂的鉴定方法。该方法包括将内皮细胞与一种测试药剂接触并观察该内皮细胞暴露至胆固醇臭氧分解产物后其中E-选择素的表达是否上升。在一些实施例中,该内皮细胞在LDL存在的情况下被暴露至胆固醇臭氧分解产物4a或5a。
本发明的另一方面是一种能抑制单核细胞分化成为巨噬细胞的药剂的鉴定方法。如此处所示,胆固醇臭氧分解产物促进单核细胞分化成为巨噬细胞,后者可如上所述形成泡沫细胞。因此该方法包括将单核细胞与一种测试药剂接触并观察该单核细胞是否分化成为巨噬细胞,其中该单核细胞以胆固醇臭氧分解产物进行培养。在一些实施例中,该单核细胞以胆固醇臭氧分解产物4a或5a进行培养。
可进行对照测定以帮助鉴定能抵消胆固醇臭氧分解产物对细胞表达,细胞募集和细胞分化的作用的药剂。因此,可在未将细胞暴露至或培养于该测试药剂的情况下进行上述测试以开展对照测试。在该测试药剂的存在下用于评估细胞募集,表达和分化的相同方法可用于对无药剂时的募集,表达和分化水平进行观察和/或定量。当该测试药剂可以比无测试药剂时观察到的对照水平显著降低细胞募集,表达和分化水平时,该测试药剂是一种有用的抗动脉粥样硬化药剂。
还可进行附加的对照测试。例如,在一些实施例中在未将细胞暴露至或培养于胆固醇臭氧分解产物的情况下进行测试可能非常重要。该种对照测试可支持在不受胆固醇臭氧化产物影响下评估细胞募集,表达,和分化。因此可以单独评估测试药剂对细胞募集,表达,和分化的作用以确定该测试药剂是否直接阻断或调节胆固醇臭氧化产物的活性或该药剂是否可以独立调节细胞募集,表达,和分化。
细胞表达可通过任何现有方法进行评估和/或定量。例如,可采用逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR),northern分析和其它方法评估细胞表达。
可通过现有的观察细胞迁移的方法评估细胞募集。例如,可采用改良的Boyden小室迁移分析评估细胞募集。Zwirner等人(1998)Eur.J.Immunol.28:1570-77;Wilkinson(1988)Methods Enzymol.162:38-50。这些测定通常使用以具有允许细胞在两小室间移动的孔径(例如,5μm孔径)的膜分隔的两个小室。待测细胞被置于第一小室而该趋药剂(例如,胆固醇臭氧化产物)被置于另一(第二)小室中。当该趋药剂存在于第二小室时该细胞将由第一小室透过膜迁移至第二小室。向该趋药剂迁移的细胞的数量即该细胞募集水平的量度。因此,如果当该测试药剂存在时细胞向趋药剂(即,向胆固醇臭氧分解产物)的迁移显著减少,则该测试药剂是一种能够通过抑制巨噬细胞向动脉粥样硬化病灶迁移而抑制动脉粥样硬化症的药剂。
可通过在测试药剂和胆固醇臭氧分解产物的存在下培养单核细胞并观察是否检测到分化巨噬细胞的形态变化特征以评估细胞分化。该类巨噬细胞形态变化包括作为分化巨噬细胞特征的细胞吸附,胞内囊泡和长细胞质突出端的形成。此外,可通过观察巨噬细胞标记的细胞表达检测巨噬细胞分化。激活的巨噬细胞表达一种结合叶酸和叶酸衍生化合物的38 LD GPI-锚定的叶酸受体。因此,可使用38 LD GPI-锚定的叶酸受体在细胞上的表达或者与叶酸或叶酸衍生化合物的结合检测巨噬细胞。
一旦一种测试药剂经鉴定可以调节细胞募集,表达,和/或分化,可在动脉粥样硬化模型中进一步测试该药剂以鉴定其效率,评估其毒性并确定适当的剂量。
抵消胆固醇臭氧化产物作用的方法
如本发明所述,胆固醇臭氧化产物的副作用可通过结合或抑制该胆固醇臭氧化物的药剂进行控制或抑制。在其它实施例中,胆固醇臭氧化产物可用作动脉粥样硬化病灶的标记和位点特异性抗原从而使治疗剂传递至动脉粥样硬化病灶。
因此本发明涉及治疗或预防血管疾病,有关胆固醇沉积的循环疾病,以及与细胞毒胆固醇臭氧化产物相关问题的方法。该种疾病和问题可与解剖位点或系统内的脉管系统的损失,损伤或破坏相关联。术语“血管症状”或“血管疾病”指其中的血流已被,或可能被损害的血管组织的状态。
可通过本发明治疗或预防的血管疾病为哺乳动物的血管疾病。哺乳动物一词指任何哺乳动物。哺乳动物的一些范例包括,例如,宠物动物(例如狗和猫);畜牧动物(例如,猪,牛,绵羊,以及山羊);实验动物(例如小鼠和大鼠);灵长类动物(例如猴,猿,以及黑猩猩);以及人类。在一些实施例中,优先通过本发明治疗人类。
可通过本发明的组合物和方法治疗或预防的血管症状和疾病的范例包括动脉粥样硬化症(或动脉硬化),先兆子痫,外周血管疾病,心脏疾病,以及中风。因此,本发明涉及如中风,动脉粥样硬化症,包括不稳定绞痛的急性冠状动脉综合征,血栓症和心肌梗塞,病斑破裂,冠状动脉或外周动脉中的初级和次级(内支架)再狭窄,移植诱导硬化症,外周肢体疾病,间歇性跛行和糖尿病并发症(包括缺血性心脏病,外周动脉疾病,充血性心力衰竭,视网膜病,神经病和肾病),中风或血栓症等疾病的治疗方法。
此处提供的方法和试剂还可用于动脉粥样硬化病斑形成的任何阶段。根据美国心脏协会所采取的并在本研究中使用的新的分类,在动脉粥样硬化发展过程中可分为八种病灶类型。
I型病灶由(胞内和巨噬细胞泡沫细胞内)内膜中的小型脂质堆积形成并能引起动脉壁上初始的最细小的变化。该种变化不会使动脉壁加厚。
II型病灶以包含了能使内膜厚度增加1毫米以内的黄色斑纹或病斑的脂肪斑纹为特征。它们由比I型病灶中所观察到的更多的脂质的累积组成。脂含量约为病灶干重的20-25%。大部分脂质存在于胞内,主要存在于巨噬细胞泡沫细胞,以及平滑肌细胞。胞外空间可能包含脂滴,但它们要小于细胞内,以及囊泡粒内的脂滴。据描述这些脂滴由胆固醇酯(胆甾醇油酸酯和胆甾醇亚油酸酯),胆固醇,以及磷脂组成。如本发明所述,胆固醇臭氧化产物可以促进与动脉粥样硬化病灶形成相关的细胞对脂质的摄取。此外,与此处所述类似的胆固醇臭氧化产物可以在该类细胞的胞内或胞外堆积。
III型病灶还被称为粥样瘤前期病灶。III型病灶中的内膜仅比II型病灶中观察到的内膜略微增厚。III型病灶不阻碍动脉血流。胞外脂质和囊泡粒与II型病灶中所观察到的一致,但数量有所上升(约25-35%干重)并开始在小池(pool)中堆积。
IV型病灶与动脉粥样化相关联。它们呈新月型并增加了动脉的厚度。除具有极高血浆胆固醇水平的人以外,该病灶不会缩小动脉内腔(对于许多人而言,该病灶无法通过血管造影术观察到)。IV型病灶由内膜层中胞外脂质的广泛堆积(约60%干重)组成(有时称为脂质核)。该脂质核可包含小的矿物质夹钳。该病灶易于破裂并形成附壁血栓。
V型病灶与纤维动脉粥样化相关联。它们具有一层或多层主要由I型胶原质组成的纤维组织。V型病灶的壁厚增大,随动脉粥样硬化症的形成内腔更为缩小。这些病灶具有允许进一步细分的功能。在Va型病灶中,新组织是具有脂质核的病灶的一部分。在Vb型病灶中,该脂质核和病灶的其它部分被钙化(从而形成VII型病灶)。在Vc型病灶中,该脂质核缺失且通常具有最少的脂质(从而形成VIII型病灶)。一般而言,经历破裂的病灶为Va型病灶。它们相对较软并与胆固醇一水化物晶体相比具有高浓度的胆固醇酯。V型病灶能够破裂并形成附壁血栓。
VI型病灶为具有如裂缝等表面破裂,侵蚀或溃疡(VIa型),血肿或出血(VIb型),以及在IV型和V型病灶上的成阶层血栓形成沉积(VIc型)的复杂病灶。VI型病灶具有增厚的病灶厚度且内腔通常完全阻塞。这些病灶可以转化为V型病灶,但它们更大且更具阻碍作用。
VII型病灶为以更晚期病灶的大量矿化为特征的钙化病灶。矿化以磷酸钙和磷灰石的形式取代了死细胞和胞外脂质的累积残余。
VIII型病灶为主要由具有很少脂质的胶原质层组成的纤维化病灶。VIII型可以是血栓脂质退化或具有转化为胶原质的突出端的油脂病灶的产物。这些病灶可以阻塞中等大小的动脉的内腔。
尽管内皮损伤被认为动脉粥样硬化病灶形成的初始步骤,该种损伤通常可导致胆固醇积累,内膜增厚,细胞增殖,以及结缔组织纤维的形成。在损伤的内皮细胞和非内皮化内膜观察到IgG和补体因子C3的积累。来自血液的单核噬菌细胞同样是动脉粥样硬化病灶细胞群体的一部分。
如本发明所述,该种抗体和免疫细胞的累积可导致活性氧的生成,从而导致胆固醇臭氧化产物的形成。如上所述,与动脉粥样硬化病灶形成相关的细胞中的脂质积累是疑难动脉粥样硬化病灶形成中的关键步骤。病斑形成的机制之一是引起巨噬细胞流入的脂肪堆积,随后为T细胞,B细胞和抗体的生成。如此处所述,本发明的胆固醇臭氧化产物促进巨噬细胞的脂质摄取并提高了巨噬细胞泡沫细胞的形成。相应的,本发明显示了胆固醇臭氧化产物可以加剧如动脉粥样硬化症等炎性血管疾病。
本发明的目标在于预防和治疗血管疾病和症状的治疗性组合物和方法。本发明提供的组合物可用于通过多种途径治疗血管症状。
在一个实施例中,本发明提供了一种包括向动物给用一种能结合胆固醇臭氧化产物的抗体或结合剂的方法。该种抗体或结合实体调节胆固醇臭氧化产物并抑制该种臭氧化产物的脂质负荷和泡沫细胞生成活性。本方法中使用的抗体优选不生成臭氧等活性氧。抗体或结合剂可以结合此处所述的任意胆固醇臭氧化产物,例如,seco-酮醛4a,其丁间醇醛加合物5a或相关化合物如6a-15a或7c。这些抗体和结合实体可以使用与胆固醇臭氧化产物结构相关且生成能与自然形成胆固醇臭氧化产物交叉反应的抗体或结合实体的半抗原生成。
例如,在另一实施例中,本发明提供了能用来生成与胆固醇臭氧化产物反应的抗体的半抗原,该半抗原具有式3c,13a,13b,14a,14b,15a或14b之一:
针对具有式15a的化合物的杂交瘤KA1-11C5和KA1-7 A6已于2003年8月29日参照布达佩斯条约的条款在美国菌种保藏中心(10801 University Blvd.,Manassas,Va.,20110-2209 USA(ATCC))保存,其ATCC编号为PTA-5427和PTA-5428。针对具有式14a的化合物培养的杂交瘤KA2-8F6和KA2-1E9已同样于2003年8月29日参照布达佩斯条约的条款在ATCC保藏,其ATCC编号为PTA-5429和PTA-5430。
在另一实施例中,胆固醇臭氧化产物被用作动脉粥样硬化病灶的靶标或标记。因此,可以向患有动脉粥样硬化症的哺乳动物给用与能够结合胆固醇臭氧化产物的结合实体相连接的治疗剂。为治疗或预防动脉粥样硬化症和相关的血管疾病,胆固醇臭氧化产物可被用作动脉粥样硬化病灶的靶标或标记。任何胆固醇臭氧化产物(例如,seco-酮醛4a,其丁间醇醛加合物5a,和/或A-环脱水产物6a)可用作针对动脉粥样硬化病斑的靶标结合实体和/或治疗剂的标记。此外,任何具有式7a至15a或7c的胆固醇臭氧化产物可用作针对动脉粥样硬化病斑的靶标结合实体和/或治疗剂的标记。
该结合实体经设计不仅可以结合胆固醇臭氧化产物,还可以传递能定位作用减少动脉粥样硬化病灶或预防动脉进一步闭塞的治疗剂或药物。此外,该治疗剂可以阻断,防护,或抑制胆固醇臭氧化产物的副作用。因此,可以向患有如动脉粥样硬化症等血管疾病的哺乳动物给用与能够结合胆固醇臭氧化产物的结合实体相连接的治疗剂。
可识别胆固醇臭氧化产物并能用于本发明方法的结合实体包括任何能结合胆固醇臭氧化产物的小分子,多肽或抗体。该种多肽和抗体将在下文具体描述。
可以连接该种结合实体的治疗剂包括任何抗氧化剂,药物,因子,化合物,肽,多肽,核酸或其它本领域技术人员可以选用于减少氧化或治疗动脉粥样硬化病灶的药剂。任何能够抵消胆固醇臭氧化产物活性或能溶解,消化,分解或抑制动脉粥样硬化病斑生长或能改善动脉粥样硬化症进展的治疗剂均可采用。
治疗剂还可包括其活性代谢物和前药。活性代谢物是治疗剂被代谢时所产生的活性衍生物。前药是一种可以代谢成为治疗剂或代谢成为治疗剂的活性代谢物的化合物。本发明可用于给用如小分子量化合物,抗氧化剂,放射性核素,药物,酶,肽,蛋白,能编码治疗多肽的核酸,表达载体,反义RNA,小干扰RNA,核酶,或抗体等治疗剂。
例如,本发明的结合实体可用于传递溶解纤维蛋白剂。该种治疗剂包括,例如,溶血栓剂(例如溶栓酶),组织血浆酶原激活剂,血浆酶和尿激酶,抗血栓剂(例如组织因子蛋白酶抑制剂(TFPI)),抗炎剂,金属蛋白酶抑制剂,线虫萃取抗凝血剂蛋白(NAPs),抑制细胞生长的药物,抑制细胞生长因子的药物,以及类似的物质。可连接本发明结合实体的治疗剂的进一步范例包括下述药剂:
1)能调节脂质水平(例如,HMG-CoA还原酶抑制剂,拟甲状腺素药,纤维素类物质,过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)(包括PPAR-alpha,PPAR-gamma和/或PPAR-delta)激动剂)的药剂;
2)能够控制和调节氧化过程的药剂,例如,抗氧化剂,活性氧调节剂,胆固醇臭氧化产物的调节剂,或脂蛋白调节因子(包括胆固醇臭氧化产物)的抑制剂;
3)能够控制和调节胰岛素耐药性和/或活性或葡萄糖代谢或活性的药剂,其包括,但不限于,PPAR-alpha,PPAR-gamma和/或PPAR-delta的激动剂,DPP-IV的调节剂,以及糖皮质激素受体调节剂;
4)能够控制和调节任何血管位点中的内皮细胞或平滑肌细胞上的受体或吸附分子或整合素的表达的药剂;
5)能够控制和调节任何血管位点的内皮细胞或平滑肌细胞活性的药剂;
6)能够控制和调节炎症相关的受体的药剂,其包括但不限于,趋化因子受体,RAGE,toll样受体,血管紧缩素受体,TGF受体,白介素受体,TNF受体,C反应蛋白受体,以及其它包括NF-kb激活在内的炎症信号途径中的受体;
7)能够控制和调节内皮细胞,血管平滑肌或淋巴细胞,单核细胞,以及吸附至脉管或在脉管中的嗜中性粒细胞的增殖,凋亡或坏死的药剂;
8)能够控制和调节任何胞外基质蛋白的生成,降解,或交联的药剂,包括但不限于,胶原质,弹性蛋白,和蛋白多糖;
9)能够控制和调节哺乳动物的脉管中任何细胞类型的激活,分泌或脂质负荷的药剂;
10)能够控制和调节哺乳动物的脉管中树突状细胞的激活,增殖或任何其它调节的药剂;
11)能够控制和调节在脉管壁水平调节血小板事件的激活,吸附,或其它过程的药剂;
12)能够控制和调节抗体和/或动脉粥样硬化病斑物质生成臭氧的药剂;以及
13)布洛芬,乙酰水杨酸,酮洛芬等抗炎药剂。
本发明的结合实体可以与该种治疗剂进行共价连接或以其它方式连接。带有该结合实体并包含了该治疗剂的脂质体可以帮助治疗传递。给药时,该治疗剂将通过该结合实体定位在动脉粥样硬化病灶位点并将帮助控制,减少或以其它方式促进动脉粥样硬化病灶区域的动脉血流。本发明的结合实体还可以用于传递纳米颗粒,例如用于基因治疗的载体。
本发明预期的治疗剂还包括“抗氧化剂”,其定义为对氧化剂具有拮抗作用的任何分子。如此定义的抗氧化剂包括1)由抗体生成的臭氧或活性氧的抑制剂,2)胆固醇臭氧化产物的抑制剂,以及3)由胆固醇臭氧化产物引发的毒性作用的抑制剂。优选抗氧化剂包括能抑制胆固醇臭氧化产物生成并能中和已经形成的胆固醇臭氧化产物的抗氧化剂。抗氧化剂可通过任何机制(包括催化作用)产生作用。抗氧化剂的类别包括活性氧清道夫,臭氧清道夫,或自由基清道夫。抗氧化剂可以为不同类型从而在需要的场合可供采用。考虑到氧存在于整个好氧有机体中,抗氧化剂可用于不同的细胞,组织,器官和胞外区域。后者包括胞外液体空间,眼内液体,滑液,脑脊髓液,胃肠分泌物,胞间液,血液以及淋巴液。抗氧化剂可通过饮食补充物,或通过注射,静脉内给药等类似方式提供。
可供使用的抗氧化剂的范例包括但不限于抗坏血酸,α-生育酚,γ-谷胱甘肽,γ-谷酰胺转移酶,硫辛酸,二羟硫辛酸,乙酰-5-甲氧色胺,黄酮,flavonenes,黄烷醇,过氧化氢酶,过氧化物酶,超氧化物岐化酶,金属硫因,以及丁羟甲苯。
在另一实施例中,该结合实体提供了一种对动脉粥样硬化病斑进行激光血管成形切除的方法。本发明的一个或多个结合实体可以结合至其最大吸收对应用于血管成形术的激光的最大发射波长的染料。给药后,该带有染料的结合实体在动脉粥样硬化病灶中与胆固醇臭氧化产物结合且基本不与普通组织相结合。该染料可用作在动脉粥样硬化病灶聚集激光能量的靶标。在切除过程中,激光的能量被染料吸收从而集中在疾病区域。这样便可以在提升切除效率的同时使对周围普通组织的伤害最小化。
多种荧光染料可用于与结合实体相结合。一系列用于将染料与蛋白,特别是抗体相结合的方法已被发表。染料和结合方法的选择对于激光血管成形术和蛋白化学领域的技术人员而言将是显而易见的。一种可用于激光血管成形术的染料为若丹明。若丹明是一种荧光染料,其各种衍生物吸收约570nm波长的光。
结合实体可通过现有的方法与如若丹明等染料连接。例如,该结合实体可以用pH8.2的50mM硼酸钠缓冲液进行透析。可在0.25mg/mL的干丙酮中制备丽丝若丹明B磺酰氯(Molecular Probes,Inc.Eugene,Oreg.)新鲜溶液。将比待结合的结合实体过量6倍摩尔量的若丹明溶液的一等分转移至一个玻璃管中。在干燥氩气流中挥发丙酮。将透析后的抗体加入管中的若丹明残留物中。将玻璃管加盖,以铝箔覆盖,并在4℃下连续摇动培养3小时。
将等于1/10结合实体溶液体积的一等分1.5M盐酸羟胺(Sigma)溶液(pH 8.0)添加至反应混合物。将该溶液在4℃下连续摇动培养30分钟。然后将反应混合物在暗处用硼酸缓冲液进行充分透析。该若丹明-抗体缀合物可在4℃下于暗处贮存以防止染料的光漂白。
给药后,该标记结合实体特异性的将染料传递至动脉粥样硬化病灶而非普通组织。结合该标记结合实体的组织可采用约570nm波长的激光进行切除。
在另一实施例中,本发明的结合实体可用于将酶特异性传递至动脉粥样硬化病灶的位点。该酶可以是任何能够消化该病斑一个或多个组分的酶。该酶或酶的组合物可通过蛋白化学领域技术人员已知的多种结合技术中的任何一种结合至该结合实体。
在另一方法中,本发明的结合实体可以连接至酶的无活性形式,例如,酶原或酶抑制剂复合物。本方法的优势在于可以给用大量的酶,从而可以向病斑传递大量酶的同时不会因为该循环缀合物引起普通组织的任何损伤。在结合实体-酶缀合物与病斑结合且未结合的循环缀合物被清除后,该酶将被激活以开始消化该病斑。激活包括特异性裂解酶原或去除酶抑制剂。
在另一实施例中,识别和结合动脉粥样硬化病灶中其它因子的抗体或结合实体可被用于传递治疗剂。人们已从人动脉粥样硬化病斑中提取得到各种可溶性蛋白,IgA,IgG,IgM,B1C(C3),α1-抗胰蛋白酶,α2-微球蛋白,纤维蛋白原,白蛋白,LDL,HDL,α1-酸糖蛋白,β2-糖蛋白,铁传递蛋白以及血浆铜蓝蛋白。该病变内膜还被发现含有小量的组织结合IgG,IgA和BlC[Hollander,W.等人,Atherosclerosis,34:391-405(1979)]。IgG曾在病灶和邻近的内皮组织中被发现[Parums,D.等人,Atherosclerosis,38:211-216(1981),Hansson,G.等人,Experimental and Molecular Pathology,34:264-280(1981),Hannson,G.等人,Acta Path.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.A.,92:429-435(1984)]。这些蛋白中的任意一种均可用于向动脉粥样硬化病灶传递治疗剂。
美国专利6,025,477提供了一种纯化的特异存在于动脉粥样硬化病斑的胞外成分中的抗原以及针对该抗原的抗体。该抗原具有复合碳水化合物结构,且分子量大于200,000道尔顿。通过杂交瘤Q10E7描述的单克隆抗体选择性结合动脉粥样硬化病灶。美国专利6,025,477在此引用作为参考。
在一个更进一步的实施例中,内源释放进入动脉粥样硬化症患者血流的细胞毒性胆固醇臭氧化产物可通过使用结合臭氧化产物和促进胆固醇臭氧化产物去除的结合实体对患者进行体内治疗或对患者血液进行进行体外处理再输回体内从而被去除。如此处所述,来自动脉粥样硬化患者的血浆样本具有可测水平的胆固醇臭氧化产物。一个动脉粥样硬化患者测试组包括了动脉粥样硬化疾病状态足以进行动脉内膜切除术的八位患者。对照组患者从参与一般医学临床的患者中随机选取。测试组8位患者中的6位具有血浆水平在70-1690nM范围内的丁间醇醛5a(见图5)。在15个对照组的血浆样本中仅有1个具有可测的5a。事实上酮醛4a未在任何患者的血液样本中检测到,但该测试的检测限约为1-10nM。酮醛4a有可能在动脉粥样硬化病灶中或从该病灶释放后转化成为丁间醇醛5a。因此,在设计从动脉粥样硬化患者的血流中去除细胞毒性胆固醇臭氧化产物的治疗中,丁间醇醛加合物5a可能是主要需要去除的产物。
本发明提供的用于治疗血管疾病并从血流中去除细胞毒性胆固醇臭氧化产物的治疗方法可以避免外科手术以及其它侵入性和危险的治疗方法。例如,当前针对动脉粥样硬化症的治疗方法通常可以分为外科手术法和使用药物控制疾病的方法。外科手术法可以使用血管移植法对堵塞区域设置旁路(例如,冠状动脉旁路移植),从动脉壁去除堵塞病斑(例如,颈动脉内膜切除术),或经皮裂化病斑(例如,球囊血管成形术)。外科手术治疗将带来较大的风险且一次仅能处理一个病灶。外科手术治疗还无法限制动脉粥样硬化症的发展且伴有再狭窄等并发症。
使用本发明的方法靶向胆固醇臭氧化产物可以简化心脏病的治疗并使得患者避免外科手术的风险和并发症。本方法可以避免外科手术的原因之一是此处鉴定的胆固醇臭氧化产物表现为由动脉粥样硬化病灶特异性生成。因此,靶向这些臭氧化产物将准确和特异地靶向动脉粥样硬化的位点和成因。类似的,从血流中去除细胞毒性臭氧化产物可以预防对血管系统的进一步损伤。
鉴定可以预防胆固醇臭氧化的药剂
本发明进一步提供了阻断由抗体形成活性氧的药剂的鉴定方法。该方法包括筛选能够抑制提供了单线态氧(1O2 *)来源的抗体生成活性氧的药剂。所采用的单线态氧(1O2 *)可以是嗜中性粒细胞等天然来源的单线态氧(1O2 *)。该单线态氧(1O2 *)也可以是合成来源的单线态氧。例如,如无金属卟啉等“感光剂”分子可用于在暴露至光等诱导剂后生成单线态氧。
如本发明人所已显示,基本上任何抗体或嗜中性粒细胞在暴露至单线态氧(1O2 *)时均可以生成强活性氧,包括但不限于超氧化物基(O2 -),羟基(OH●),过氧化氢H2O2或臭氧(O3)。参见P.WentworthJr.等人,Science 298,2195(2002);B.M.Babior,C.Takeuchi,J.Ruedi,A.Guitierrez,P.Wentworth Jr.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,3920(2003);P.Wentworth Jr.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,1490(2003)。因此,此处所用的术语“活性氧”指抗体生成的氧类物质。这些活性氧具有一个或多个不成对电子或因其易于和其它分子反应而具有活性。该种活性氧包括但不限于超氧化物自由基,过氧化氢,羟基,过氧化物基,臭氧或其它具有与臭氧相同的化学特征的短寿命三氧加合物。此外,如此处的试验工作所示,臭氧在动脉粥样硬化病灶内生成。
抗体可在无需免疫系统的其它成分(即,无需补体级联或吞噬作用)的情况下将单线态氧(1O2 *)转化成为活性氧。由单线态氧生成活性氧的能力存在于完整的免疫球蛋白以及如Fab,F(ab′)2和Fv等抗体片段中。此外,该活性与抗体分子中二硫化物的存在无关。然而,当该抗体被变性时其通过单线态氧生成活性氧的能力也被破坏。这说明由抗体生成活性氧需要一个完整或基本完整的三维结构。
由抗体生成活性氧的最低需求是氧的存在。因此,通常需要好氧条件。更具体的说,抗体在体内的使用依赖于关键底物的1O2 *存在,但该1O2 *可在多种生理活动中生成并存在于体内。参见J.F.Kanofsky Chem.-Biol.Interactions 70,1(1989)及其参考文献。例如,1O2 *可在再灌注中生成。X.Zhai和M.Ashrafy Am.J.Physiol.269(Heart Circ.Physiol.38)H1229(1995)。此外,1O2 *还可以通过吞噬作用过程中的嗜中性粒细胞激活生成。J.R.Kanofsky,H.Hoogland,R.Wever,S.J.Weiss J.Biol.Chem.263,9692(1988);Babior等人,Amer.J.Med..109:33-34(2000)。
单线态氧(1O2)还可通过对无金属卟啉前体进行光照射得到。单线态氧向活性氧的生物转化在光,包括可见光,红外光和紫外线照射条件下进行。在采用可见光条件时,单线态氧的生成可通过其它能提供单线态氧来源的分子得到增强。能生成单线态氧的分子包括无需其它因子或诱导剂便能生成单线态氧的分子以及能在暴露至诱导剂后生成单线态氧的“感光剂”分子。无需其它因子或诱导剂便能生成单线态氧的分子的范例包括,但不限于,内过氧化物。在一些实施例中,所采用的内过氧化物可以是蒽-9,10-二丙酸内过氧化物。感光剂分子的范例可以包括,但不限于,喋呤,黄素,血卟啉,四(4-磺酸苯基)卟啉,联吡啶钌(II)复合物,孟加拉玫瑰红染料,醌,若丹明染料,苯二甲蓝染料,竹红菌素,rubrocyanin,频哪氰醇或别花青素。
感光剂分子可在暴露至诱导剂时被诱导生成单线态氧。该诱导剂之一为光。根据感光剂种类和结构的不同,该种光可以是可见光,紫外光,或红外光。
相应的,本发明提供了一种能调节抗体生成活性氧的药剂的筛选方法,其包括将一种抗体和单线态氧来源的混合物与药剂接触并观察抗体生成活性氧是否得到调解。在一些实施例中,该药剂优选生成更少的活性氧。在其它实施例中,该药剂优选生成更多的活性氧。
细胞毒性胆固醇臭氧化产物的用途
如此处所述,该seco-酮醛4a,其丁间醇醛加合物5a以及相关化合物6a-15a和7c对许多细胞类型具有细胞毒性。化合物7c的结构如下所示。
例如,如此处所示seco-酮醛4a及其丁间醇醛加合物5a对Levy等人,Cancer 22,517(1968)所述的人B-淋巴细胞(WI-L2);Weiss等人,J.Immunol.133,123(1984)所述的T-淋巴细胞系(Jurkat E6.1);Folkman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.16,5217(1979)所述的血管平滑肌细胞系(VSMC)和腹主动脉内皮(HAEC)细胞系;Ralph等人,J.Exp.Med.143,1528(1976)所述的鼠组织巨噬细胞(J774A.1);以及Mbawuike等人,J.Leukoc.Biol.46,119(1989)所述的肺巨噬细胞系(MH-S)具有细胞毒性。
通过类似的方法,本发明人已显示化合物6a,7a,7c,10a,11a和12a对白细胞细胞系具有细胞毒性,而seco-酮醛4a及其丁间醇醛加合物5a对神经细胞系具有细胞毒性。
因此本发明提供了包含本胆固醇臭氧化产物的组合物以及治疗和预防非正当免疫应答,自体免疫疾病,癌症,肿瘤,细菌感染,病毒感染,真菌感染,溃疡和/或其它可受益于局部给用细胞毒素的症状或疾病的方法。
该细胞毒素应当被掩蔽从而使胆固醇臭氧化不会对非患病组织具有副作用。一种在制剂中掩蔽4a或5a细胞毒素的方法范例是使用脂质体。例如,该4a或5a细胞毒素可被置于脂质体中,而结合实体可被锚定在脂质体的磷脂膜中。该结合实体可促进脂质体定位至患病组织,而该脂质体的脂质覆层可以保护非患病组织不接受细胞毒性胆固醇臭氧化产物。该脂质覆层还可以与动脉粥样硬化病灶内的脂质相互作用,从而导致脂质成分的融合和释放。
治疗癌症和肿瘤
在另一实施例中,该细胞毒性胆固醇臭氧化产物可用于治疗或预防癌症。因此本发明提供了包含化合物4a至15a和7c的抗癌细胞毒素,及其药物组合物。如此处所示,4a,5a及相关的化合物对包括Levy等人,Cancer 22,517(1968)所述的人B-淋巴细胞(WI-L2);Weiss等人,J.Immunol.133,123(1984)所述的T-淋巴细胞系(Jurkat E6.1);Folkman等人,Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.76,5217(1979)所述的血管平滑肌细胞系(VSMC)和腹主动脉内皮(HAEC)细胞系;Ralph等人,J.Exp.Med.143,1528(1976)所述的鼠组织巨噬细胞(J774A.1);以及Mbawuike等人,J.Leukoc.Biol.46,119(1989)所述的肺巨噬细胞系(MH-S)的一系列哺乳动物细胞具有细胞毒性。因此,该4a和5a细胞毒素可用于杀死一系列不同的癌细胞类型或抑制其生长。
此处所用的术语“癌症”包括实体哺乳动物肿瘤和血液系统恶性肿瘤。“实体哺乳动物肿瘤”包括头部和颈部,肺部,间皮瘤,纵隔,食道,胃部,胰腺,肝胆系统,小肠,结肠,结肠直肠,直肠,肛门,肾,尿道,膀胱,前列腺,尿道,阴茎,睾丸,妇科器官,卵巢,乳腺,内分泌系统,皮肤中枢神经系统的癌症;软组织和骨头的肉瘤;以及皮肤和眼部来源的黑素瘤。术语“血液系统恶性肿瘤”包括儿童白血病和淋巴瘤,霍奇金氏病,淋巴球和皮肤来源的淋巴瘤,急性和慢性白血病,血浆细胞瘤以及与AIDS相关的癌症,此外,处于任何发展阶段的癌症均可进行治疗,例如原发的,转移的,以及再生的癌症。有关各种类型癌症的信息可参见,例如美国癌症协会(www.cancer.org),或Wilson等人(1991)Harrison′sPrinciples of Internal Medicine,12th Edition,McGraw-Hill,Inc。人用和兽用均在预期之内。
此处所用的术语“普通哺乳动物细胞”和“普通动物细胞”定义为在普通生长控制机制(例如,遗传控制)并显示普通细胞分化的细胞。癌细胞与普通细胞的区别在于它们的生长模式及其细胞表面的性质。例如,癌细胞易于不顾其邻居进行连续和混乱的生长,并具有本领域公知的其它特征。
哺乳动物和其它包括鸟类在内的动物可通过此处所描述和主张的方法和组合物进行治疗。该哺乳动物和鸟类包括人,狗,猫,以及如马,牛,绵羊,山羊,鸡,火鸡等类似的牲畜。
因此本发明提供了一种用于治疗,抑制或预防动物体内癌细胞生长的药物组合物,其包括了一种其数量足以有效治疗或预防动物体内目标癌症的包含化合物4a至15a和7c中任意一种化合物的细胞毒素,以及一种药学可接受载体,其中该细胞毒素可以与选择性结合至癌症细胞的抗体或结合实体相连接。
本发明还提供了一种用于治疗,抑制或预防动物体内癌症细胞生长的方法,其包括将目标癌细胞与其数量足以诱导目标癌细胞死亡而不会诱导有害量的非癌症哺乳动物细胞死亡的包含化合物4a至15a和7c中任意一种化合物的细胞毒素相接触,其中该细胞毒素可以与选择性结合至癌症细胞的抗体或结合实体相连接。
本发明进一步提供了一种用于治疗,抑制或预防动物体内癌症细胞生长的方法,其包括施用一种包含了其数量足以诱导目标癌细胞死亡而不会诱导有害量的非癌症哺乳动物细胞死亡的包含化合物4a至15a和7c中任意一种化合物的细胞毒素的制剂,其中该细胞毒素可以与选择性结合至癌症细胞的抗体或结合实体相连接。
该选择性结合至癌症细胞的抗体或结合实体可以识别或结合任何现有的本领域技术人员选择的组织特异性抗原或癌症标记。
肿瘤抗原和针对肿瘤抗原的抗体均为已知。可与存在于肿瘤或肉瘤细胞或淋巴瘤的肿瘤相关抗原反应的结合实体,抗体或抗体片段可参见,例如,Goldenberg等人,Journal of Clinical Oncology,Vol9,No.4,pp.548-564,1991以及Pawlak等人,Cancer Research,Vol49,pp.4568-4577,1989,如LL-2和EPB-2(相同)。其它可参见Primus等人Cancer Res.,43:686-692,1983,其披露了抗CEA单克隆抗体;Hansen等人Proc.Am.Assoc.Cancer Res.,30:414,1989,其披露并比较了抗CEA单克隆抗体;Gold等人Cancer Res.,50:6405-6409,1990,其披露了与结肠特异性抗原-p(CSAp)反应的单克隆抗体,以及Gold等人Proc.Am.Assoc,Cancer Res.,31:292,1990,其披露了一种与胰腺,肿瘤相关表位反应的单克隆抗体。也可使用该KC-4鼠单克隆抗体;它对独特的抗原决定簇具有特异性,并与肿瘤癌细胞而非普通人组织选择性地强烈结合(针对Coulter的U.S.Pat.No.4,708,930)。
据显示该BrE-3抗体(Peterson等人,Hybridoma 9:221(1990);U.S.Pat.No.5,075,219)与人乳腺上皮黏蛋白的多肽核的串联重复序列相结合。当该黏蛋白被去糖基化时,更多的串联重复序列表位被暴露且抗体的结合增加。因此,如BrE-3等抗体优先针对肿瘤癌细胞,因为它们可表达普通上皮组织不表达的乳腺上皮黏蛋白的未糖基化形式。这种优先结合加上在癌症患者(例如乳腺癌患者)循环中观察到的针对这些抗体的表位的低浓度使得对黏蛋白表位具有特异性的抗体在癌症治疗中高度有效。
因此,本发明提供了治疗和/或预防癌症的组合物和方法。
治疗移植排斥
T-淋巴细胞是主要负责引起同种异体移植物(例如,心脏等移植器官)排斥的细胞类型。T-淋巴细胞(杀伤和辅助)通过IL-2受体在T-淋巴细胞表面的短暂存在为特征的增殖性爆发对同种异体移植物进行响应。在该增殖性爆发过程中通过给用与T-淋巴细胞特异性反应的细胞毒素杀死这些细胞可以抑制同种异体移植物排斥。通过将细胞毒素与特异性识别激活T-淋巴细胞的结合实体相连接,该细胞毒素将不容易对其它细胞(包括需要对抗感染的休眠或长期记忆T-淋巴细胞)产生副作用。白介素-2(IL-2)受体是一种存在于激活T-淋巴细胞而不存在于休眠或长期记忆T-淋巴细胞的细胞表面蛋白。因此,与IL-2受体结合的结合实体相连接的细胞毒素的使用可以提供针对激活T-淋巴细胞的选择性。
如此处所述所采用的细胞毒素为seco-酮醛4a,其丁间醇醛加合物5a以及具有化合物4a-15a和7c的相关化合物。这些胆固醇臭氧化产物对Weiss等人,J.Immunol.133,123(1984)所述的T-淋巴细胞系(Jurkat E6.1)具有细胞毒性。在一些实施例中该4a-12a或7c细胞毒素可以诱导细胞溶解,诱导细胞死亡或抑制细胞生长。
由于4a-14a或7c细胞毒素可以抑制T-淋巴细胞的作用或生长,所采用的结合实体的结合可以阻断或不阻断IL-2与IL2受体的相互作用。然而,阻断与IL-2结合的位点将进一步确保T-淋巴细胞不会被完全激活并能导致多种可引起组织排斥抑制的重要现象。
通过选择性靶向激活T-淋巴细胞,本发明的方法可通过不引起总体免疫抑制的方式抑制同种异体移植物排斥以及伴随的具有生命威胁风险的感染。此外,本方法可剩余供体特异性T抑制细胞,从而使该细胞可进行增殖并辅助延长同种异体移植物的存活。此外,该治疗无需在同种异体移植物植入后连续进行,而可以在治疗一段时间后中断。
本发明的一个实施例中采用一种与4a-15a或7c细胞毒素共价连接的对T-淋巴细胞上的IL-2受体特异性的抗体作为IL-2受体特异性结合实体。该细胞毒素可以溶解该结合实体结合的T-淋巴细胞。对T-淋巴细胞上的IL-2受体具有特异性的抗体可采用此处所述的标准技术进行制备。此外,该抗体可从Becton Dickenson等公司购得(例如,小鼠-人单克隆抗-IL-2受体抗体)。该抗体可以是单克隆或多克隆,也可以来自任何合适的动物。当该抗体为单克隆且该待治疗哺乳动物为人时,优选人或人源化抗-IL-2受体抗体。
对IL-2受体具有特异性的单克隆抗体的生产和初始筛选可参照Uchiyama等人(1981)J.Immunol.126(4),1393。简单而言,该方法采用下列步骤。将人培养T-淋巴细胞注射入哺乳动物(例如,小鼠),然后取出免疫动物的脾并分离脾细胞,然后与永生细胞(例如,小鼠或人骨髓瘤细胞)融合以形成杂交瘤。然后对来自培养上清液的含抗体上清液采用下述的补体-依赖性细胞毒性测试筛选特异性针对IL-2受体的抗体。以51Cr铬酸钠标记人T-淋巴细胞和EBV转化B-淋巴细胞并将其用作靶细胞;将这些细胞与杂交瘤培养上清液和补体进行培养,然后收集上清液并以伽马计数器计数。选取对激活T-淋巴细胞具有毒性,而对休眠T-或B-淋巴细胞没有毒性的上清液,然后进行进一步的筛选以选择包含能沉淀(即,进行特异性反应)50k道尔顿糖蛋白IL-2受体的抗体的上清液(具体描述参见Leonard等人(1983)P.N.A.S.USA 80,6957)。使用传统方法从上清液中纯化所需的抗-IL-2受体抗体。
自体免疫疾病的治疗
鉴于CD4+T-淋巴细胞(此处称为CD4+T-细胞)为其它白细胞在抵抗感染和潜在癌细胞方面所提供的“帮助”,该细胞是免疫系统的主要成员。CD4+T-细胞在体液和细胞-介导的免疫中都具有重要的作用。此外它们在寄生虫感染中发挥作用以促进嗜曙红细胞和肥大细胞的分化。如果该CD4+T-细胞群耗尽(如AIDS患者的情况)该宿主将容易遭到通常对该宿主没有威胁的病原体和肿瘤的入侵。
然而,尽管CD4+T-细胞在疾病预防中产生了重要的有益的作用,这些细胞的异常功能可能产生严重的问题,在一些个体中,CD4+T-细胞的异常功能可导致自身免疫性或其它疾病。涉及CD4+T-细胞的自体免疫疾病包括多发行硬化症,风湿性关节炎以及自体免疫葡萄膜炎。本质上这些疾病涉及一种异常免疫响应,其中该免疫系统攻击入侵病原体的常规作用遭到破坏,并转而攻击宿主身体组织,从而导致疾病甚至死亡。不同的自体免疫疾病的靶向宿主组织也有所不同。例如,在多发性硬化症中该免疫系统攻击脑部和脊髓的白色物质,而在风湿性关节炎中该免疫系统攻击关节的滑膜衬里。激活CD4+T-细胞还与其它疾病相关联,包括移植组织和器官的排斥以及CD4+T-细胞淋巴瘤的形成。
因此本发明提供了一种可用于治疗有害免疫响应的方法。在一个实施例中,本发明提供了治疗或预防T-细胞介导的自体免疫疾病的方法。在一个实施例中,本发明提供了治疗和预防激活CD4+T-细胞介导的自体免疫疾病的方法。可被治疗的疾病包括,例如,多发行硬化症,风湿性关节炎,肉状瘤病以及自体免疫葡萄膜炎,移植物抗宿主病(GVHD)和/或炎性肠道疾病。
在该种方法中采用的细胞毒素为seco-酮醛4a,其丁间醇醛加合物5a或具有任意式4a-15a和7c之一的化合物。这些胆固醇臭氧化产物对Weiss等人,J.Immunol.133,123(1984)所述的T-淋巴细胞系(Jurkat E6.1)具有细胞毒性。在一些实施例中该4a-15a或7c细胞毒素可以诱导细胞溶解,诱导细胞死亡或抑制细胞生长。
该4a-15a或7c细胞毒素被用于结合一种能特异性识别和结合T-细胞,优选特异性识别和结合CD4+T-细胞的结合实体。该结合实体可以是任何对T-细胞具有选择性的结合实体。例如,任何T-细胞特异性抗原均可用于生成能作为传递此处提供的细胞毒性胆固醇臭氧化产物的结合实体的抗体。范例包括人受体蛋白H4-1BB。一种在载体pH4-1BB中编码的针对H4-1BB的cDNA被保存于美国农业研究菌种保藏中心并分配得到索取号:NRRL B21131。特异性针对该H4-1BB蛋白的抗体参见U.S.Patent 6,569,997。
根据U.S.Patent 6,566,082,一种称为OX-40的特定蛋白抗原在抗原激活的T-细胞,例如尤其是在激活CD4+T-细胞的细胞表面特异性表达。使用在大鼠中的EAE疾病模型可显示该抗原在存在于炎症位点(在本疾病模型中为脊髓)的激活自身抗原-特异性CD4+T-细胞表面表达,但在非炎症位点的CD4+T-细胞上缺失。该种抗原在CD4+T-细胞上的最高表达出现于自体免疫的临床表现开始的前一天;且该抗原的表达随疾病的进展而下降。在本发明中首次显示的该OX-40抗原表达的特异性以及该表达的瞬时性推动了将该种抗原作为患有T-细胞介导症状的人等动物中抗体介导激活T-细胞损耗的可能靶标进行测试。
据显示CD4+T-细胞负责动物中多种实验诱导的自体免疫疾病,包括实验性自体免疫性脑脊髓膜炎(EAE),胶原诱导性关节炎(CIA),以及实验性自体免疫性葡萄膜炎(EAU)。该种动物模型可用于测试此处提供的方法和制剂。
溃疡的治疗
幽门螺旋杆菌是于1982年首次从患有慢性胃炎患者的胃部活组织切片中分离的弯曲的,微好氧的,革兰氏阴性细菌,Warren等人,Lancet:1273-75(1983)。尽管最初被称为幽门弯曲杆菌,它已被认可为是一种称为幽门菌属的独立属的一部分,Goodwin等人,Int.J.Syst.Bacterid.39:397-405(1989)。该细菌定位于人胃黏膜上,其感染可持续数十年。在最近几年中,该细菌的存在被认为与B型慢性胃炎相关,一种在多数感染人体中保持无症状但可显著提升胃溃疡和胃腺癌的风险的疾病。其它的研究强烈暗示幽门螺旋杆菌感染可以成为B型胃炎,消化性溃疡,以及胃肿瘤的起因或辅助因子,例如参见Blaser,Gastroenterology 93:371-83(1987);Dooley等人,New Engl.J.Med.321:1562-66(1989);Parsonnet等人,New Engl.J.Med.325:1127-31(1991)。幽门螺旋杆菌被认为通过口服途径传递,Thomas等人,Lancet:340,1194(1992)。感染的风险随年龄而上升,Graham等人,Gastroenterology 100:1495-1501(1991),并为拥挤所促进,Drumm等人,New Engl.J.Med.4322:359-63(1990);Blaser,Clin.Infect.Dis.15:386-93(1992)。在发达国家,30和60岁的人中针对幽门螺旋杆菌抗原的抗体的存在分别由少于20%增加至高于50%,Jones等人,Med.Microbiol.22:57-62(1986);Morris等人,N.Z.Med.J.99:657-59(1986),而在发展中国家的人群到20岁时已有超过80%被感染,Graham等人,Digestive Diseases and Sciences36:1084-88(1991)。
如本发明所述,一种与结合幽门螺旋杆菌抗原的结合实体相连接的细胞毒素可用于抑制幽门螺旋杆菌生长。所采用的细胞毒素为seco-酮醛4a,其丁间醇醛加合物5a或具有任意式6a-15a或7c之一的化合物。在一些实施例中该4a-15a或7c细胞毒素可以诱导细胞溶解,诱导细胞死亡或抑制细胞生长。
治疗微生物感染
本发明的细胞毒性胆固醇臭氧化产物还可用于调节微生物生长和感染。
下列目标微生物的感染可通过本发明的细胞毒性胆固醇臭氧化产物进行治疗:气单胞菌属,杆菌属,拟杆菌属,弯曲杆菌属,梭菌属,肠杆菌属,埃希氏菌属,胃螺旋菌属,幽门菌属,克雷伯氏菌属,沙门氏菌属,志贺氏菌属,葡萄状球菌属,假单胞菌属,弧菌属,耶尔森氏菌属等。可采用本发明的细胞毒性胆固醇臭氧化产物进行治疗的感染包括与葡萄球菌感染相关的感染(金黄色葡萄球菌),斑疹伤寒症(伤寒沙门氏菌),食物中毒(大肠杆菌,例如O157:H7),杆菌性痢疾(痢疾志贺菌),肺炎(铜绿假单胞菌和/或洋葱假单胞菌),霍乱(霍乱弧菌)溃疡(幽门螺旋杆菌),以及其它。已显示大肠杆菌血清型0157:H7与痢疾,出血性大肠炎,溶血性尿毒症综合症(HUS)以及血栓性血小板减少性紫癜的发病机理相关。本发明的细胞毒性胆固醇臭氧化产物还对细菌的耐药和多重耐药菌株具有活性,例如,金黄色葡萄球菌的多重耐药菌株以及屎肠球菌和粪肠球菌的万古霉素耐药菌株。
本发明的抗微生物组合物还可作用于病毒。术语“病毒”指DNA和RNA病毒,类病毒,以及朊病毒。病毒包括带包膜或不带包膜的病毒,例如,肝炎A病毒,肝炎B病毒,肝炎C病毒,人免疫缺陷病毒(HIV),痘病毒,疱疹病毒,腺病毒,乳多空病毒,细小病毒,呼吸道肠道病毒,环状病毒,小核糖核算病毒,轮状病毒,甲病毒,rubivirues,A型和B型流行性感冒病毒,黄病毒,冠状病毒,副粘病毒,麻疹病毒,肺病毒,棒状病毒,狂犬病病毒,正粘病毒,崩芽病毒,phlebo viruses,纳伊罗病毒,嗜肝DNA病毒,沙粒病毒,逆转录酶病毒,肠道病毒,鼻病毒以及纤丝病毒。
本发明的化合物为可用于在动物(包括人)体内治疗全身,局部和粘膜真菌感染的活性抗真菌剂。可被本发明治疗的真菌感染的范例包括假丝酵母,曲霉菌,以及镰刀菌的感染。在一些实施例中该真菌感染由白色念珠菌或光滑念珠菌引发。本发明的化合物可用于治疗动物(包括人)体内多种真菌感染。该种感染包括表面的,皮肤的,皮下的以及全身的真菌感染如呼吸道感染,胃肠道感染,心血管感染,尿道感染,CNS感染,念珠菌病以及慢性黏膜皮肤病和真菌引起的皮肤感染,皮肤和黏膜皮肤念珠菌病,脚癣,甲沟炎,真菌性尿布皮疹,念珠菌外阴炎,念珠菌龟头炎以及外耳道炎。它们可用作预防全身和局部真菌感染的预防药剂。预防药剂的使用可作为预防免疫低下患者(例如,AIDS患者,接受癌症治疗的患者或移植患者)感染的选择性肠道消毒方案的适当部分。
已知有多种曲霉菌可在严重的免疫低下患者中引起侵入性鼻窦肺部感染。在孢子吸入后,临床上曲霉病可以以三种主要的形式存在。第一种形式,过敏性支气管肺曲霉病,形成于曲霉菌定位于支气管树并释放能引起超敏性肺炎的抗原时。第二种形式,曲霉球病或“真菌球”,形成于肺部空穴,通常与其它肺部疾病如肺结核相协同。第三种形式,侵入性肺部或传播曲霉病,这是一种具有高死亡率的致命感染。
细胞毒性胆固醇臭氧化产物的抗菌活性可通过本领域技术人员现有的方法采用各种微生物进行评估。例如,抗菌活性可通过确定本发明的细胞毒性胆固醇臭氧化产物防止特定微生物生长的最小抑制浓度(MIC)进行测定。在一个实施例中,抗菌活性为使用标准剂量或剂量响应方法测定时杀死50%微生物的细胞毒性胆固醇臭氧化产物的数量。
此处所述的评估细胞毒性胆固醇臭氧化产物治疗微生物感染的治疗有效剂量的方法包括测定在体外基本上无微生物生长时的细胞毒性胆固醇臭氧化产物的最小抑制浓度。该种方法可以计算抑制微生物生长或杀死50%微生物所需的每体积中细胞毒性胆固醇臭氧化产物的大约数量。该数量可通过标准微量稀释法等方法进行测定。例如,准备包含相同体积培养基和基本相同数量微生物的微生物培养管,然后添加等分的细胞毒性胆固醇臭氧化产物。该等分在相同体积的溶液内包含了不同数量的细胞毒性胆固醇臭氧化产物。将微生物培养1至10代的时间并测定培养基中的微生物数量。
培养基的光密度也可用于估计微生物是否生长-如果光密度没有明显上升,则微生物没有明显生长。反之,如果光密度上升,则微生物已生长。为测定在暴露至细胞毒性胆固醇臭氧化产物后有多少微生物细胞仍存活,可在添加细胞毒性胆固醇臭氧化产物时(零时间)并在其后定期取出一小等分的培养基。将培养基等分涂布于微生物培养平板,在利于微生物生长的条件下培养该平板,当出现菌落时,对这些菌落进行计数。
抗体和结合实体
本发明提供了能与可作为向疾病位点传递本发明细胞毒性臭氧化产物的标记的胆固醇臭氧化产物或任何目标抗原相结合的抗体和结合实体。如此处所述针对胆固醇臭氧化产物的抗体和结合实体可被用于抑制或调节这些胆固醇臭氧化产物的细胞毒性并从而治疗动脉粥样硬化症,心脏病,或心血管疾病等血管疾病。同样如上所述该细胞毒性胆固醇臭氧化产物可被连接至抗体或结合实体并用于治疗或预防如自体免疫疾病,癌症,肿瘤,细菌感染,病毒感染,真菌感染,溃疡等症状或疾病和/或其它可受益于局部给用细胞毒素的症状或疾病。
此处所用的术语结合实体包括能够结合胆固醇臭氧化产物或其它疾病标记的抗体和其它多肽。
因此,在一个实施例中,本发明提供了针对胆固醇臭氧化产物的抗体制备物和结合实体,例如,seco-酮醛4a,其丁间醇醛加合物5a,相关化合物如3c,6a-15a或7c胆固醇臭氧化产物或半抗原。该种抗体和结合实体可用于治疗如炎性血管疾病,动脉粥样硬化症,心脏病,以及心血管疾病等胆固醇相关的血管疾病。在一些实施例中,该胆固醇臭氧化产物可进行化学修饰以促进抗体的制备。例如,seco-酮醛4a,其丁间醇醛加合物5a以及相关化合物如3c,6a-15a或7c中的任意化合物的腙衍生物可用于抗体制备。这些腙衍生物包括具有类似化合物4b,4c,5b,以及6b-15b或10c中任意一种的结构的化合物。
胆固醇臭氧化产物可通过与如2,4-二硝基苯肼等肼化合物反应转化为腙衍生物。在一些实施例中,该反应在乙腈,或醇(例如,甲醇或乙醇)等有机溶剂中进行。通常采用酸性环境以及一种不含氧,无反应性的大气。
本发明进一步涉及与该胆固醇臭氧化产物结构相关的半抗原以及该臭氧化产物的腙衍生物。例如,本发明提供了可用于生成与胆固醇臭氧化和腙产物反应的抗体的具有式3c,13a,13b,14a,14b,15a或15b的半抗原:
针对具有式15a的化合物的杂交瘤KA1-11C5和KA1-7 A6已于2003年8月29日参照布达佩斯条约的条款在美国菌种保藏中心(10801 University Blvd.,Manassas,Va.,20110-2209 USA(ATCC))保存,其ATCC编号为PTA-5427和PTA-5428。针对具有式14a的化合物的杂交瘤KA2-8F6和KA2-1E9已同样于2003年8月29日参照布达佩斯条约的条款在ATCC保藏,其ATCC编号为PTA-5429和PTA-5430。
本发明还提供了以现有方法制备的能够结合胆固醇臭氧化产物或某种疾病的任何简便标记的抗体和结合实体。该种抗体的结合区域(例如,这些抗体的CDR区)还可被转入任何简便的结合实体骨架或与该结合实体骨架一起使用。
属于血浆蛋白家族的抗体分子称为免疫球蛋白,其基础砌块免疫球蛋白折叠或区域以多种形式被用于免疫系统和其它生物识别系统的分子中。标准抗体是一种由两条相同的免疫球蛋白重链和两条相同的免疫球蛋白轻链组成的分子量约为150,000道尔顿的四聚体结构。
抗体的重和轻链由不同的区域组成。每条轻链包含一个可变区(VL)和一个恒定区(CL),而每条重链包含一个可变区(VH)和三或四个恒定区(CH)。例如参见Alzari,P.N.,Lascombe,M.-B.& Poljak,R.J.(1988)Three-dimensional structure of antibodies.Annu.Rev.Immunol.6,555-580。约由110个氨基酸残基组成的各区域被折叠成为由两个相互压紧的β-折叠形成的典型的β-夹层结构,免疫球蛋白折叠。该VH和VL区分别具有环形或转角的,在该区域一端与β-链连接的3个决定簇互补区(CDR1-3)。一般轻和重链的可变区均影响抗原特异性,尽管各链对特异性的贡献并不总是相同。抗体分子通过使用六个随机环(CDRs)与大量分子结合。
免疫球蛋白可依据其重链恒定区的氨基酸序列被归入不同的类别。至少存在五(5)种类别的免疫球蛋白:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM。其中一些还可以进一步细分为亚类(同型),例如,IgG-1,IgG-2,IgG-3和IgG-4;IgA-1和IgA-2。对应IgA,IgD,IgE,IgG和IgM类免疫球蛋白的重链可变区分别被称为alpha(α),delta(δ),epsilon(ε),gamma(γ)和mu(μ)。抗体的轻链基于其恒定区的氨基酸序列可被归入两个明显不同的类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))之一。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型已众所周知。
抗体可变区中的术语“可变”指一种抗体的可变区中特定部分与另一抗体明显不同这一事实。可变区用于特定抗体与其特定抗原的结合并决定该抗体对其抗原的特异性。然而,该可变性并非平均分布于抗体的可变区。事实上,可变性集中于轻链和重链可变区中三个称为决定簇互补区(CDRs)(也称为高变区)的片段中。
可变区中相对更保守的部分称为框架区(FR)。天然重和轻链的可变区分别包含四个主要呈β-折叠构型的FR区,所述FR区由形成环状连接,在某些情况下形成β-折叠结构一部分的三个CDRs连接。各链的CDRs通过FR区彼此接近并与另一链上的CDRs接近,从而形成抗体的抗原结合位点。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但显示了不同的效应功能,例如参与抗体的抗体依赖细胞毒性。
本发明预期使用的抗体可以是各种形式的抗体,包括完整免疫球蛋白,如Fv,Fab等的抗体片段,以及类似片段,包含可变区的决定簇互补区(CDR)的单链抗体,以及类似形式,如此处所述以上所有形式均落入广泛的术语“抗体”。本发明预期使用多克隆和单克隆抗体的任何特异性,并且不限于识别特定胆固醇臭氧化产物或其衍生物以及与之免疫反应的抗体。
此外,抗体的结合区,或CDR可被置于任何简便结合实体多肽的骨架中。在优选实施例中,在此处所述的方法中所采用的抗体,结合实体或其片段对任何具有式3,3c,4a-15a,7c的化合物及其衍生物(包括腙衍生物)具有免疫特异性。
术语“抗体片段”指全长抗体的一部分,通常为抗原结合或可变区。抗体片段的范例包括Fab,Fab′,F(ab′)2和Fv片段。以木瓜蛋白酶消化抗体可生成两种相同的抗原结合片段,称为Fab片段,其分别带有一个单独的抗原结合位点,以及一个残留Fc片段。因此Fab片段具有一条完整的轻链和一条重链的一部分。胃蛋白酶处理可获得一种具有两个能与抗原交联的抗原结合片段的F(ab′)2片段,以及一个称为pFc′片段的残留片段。Fab′片段可通过还原胃蛋白酶消化的抗体获得,并由一条完整轻链和重链的一部分组成。每个抗体分子可得到两个Fab′片段。Fab′片段与Fab片段的区别在于在重链CH1区的羧基末端添加了少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)。
Fv是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密,非共价结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚物(VH-VL二聚物)组成。在该构型下各可变区的三个CDRs相互作用在VH-VL二聚物表面得到了抗原结合位点。该六个CDRs一起赋予了抗体的抗原结合特异性。然而,尽管亲和性低于完整的结合位点,一个单独的可变区(或包含了三个对抗原有特异性的CDRs的半个Fv)也可具有识别和结合抗原的能力。此处所用的抗体的“功能性片段”指Fv,F(ab)以及F(ab′)2片段。
其它片段可包括双价小抗体,线性抗体,单链抗体分子,以及由抗体片段形成的多特异性抗体。单链抗体为包含轻链可变区和重链可变区的基因工程分子,其中轻链可变区和重链可变区通过合适的多肽接头连接成为基因融合单链分子。该单链抗体可以被称为“单链Fv”或“sFv”抗体片段。一般而言,Fv多肽进一步包含使sFv形成抗原结合所需结构的介于VH和VL间的多肽接头。关于sFv的综述参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,N.Y.,pp.269-315(1994)。
术语“双价小抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段,其中该片段包含了在相同多肽链上(VH-VL)连接轻链可变区(VL)的重链可变区(VH)。通过采用短到无法使同一链上的两个区域配对的接头迫使该区域与另一条链上的互补区域配对并形成两个抗原结合位点。有关双价小抗体更具体的描述参见,例如,EP 404,097;WO93/11161,and Hollinger等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA 90:6444-6448(1993)。
因此本发明预期的抗体片段并非全长抗体。然而,该种抗体可具有与全长抗体类似或更高的免疫学特性。该种抗体片段可小到约为4个氨基酸,5个氨基酸,6个氨基酸,7个氨基酸,9个氨基酸,约12个氨基酸,约15个氨基酸,约17个氨基酸,约18个氨基酸,约20个氨基酸,约25个氨基酸,约30个氨基酸或更多。
一般说来,本发明的抗体片段只要具有与特异性结合一种疾病标记(例如,胆固醇臭氧化产物)的抗体具有类似或更高的免疫学特性,它的大小可具有任何上限。例如,如果该抗体片段与轻链抗体亚基相关,则较小结合实体和轻链抗体片段可具有小于约200个氨基酸,小于约175个氨基酸,小于约150个氨基酸,或小于约120个氨基酸。此外,如果该抗体片段与重链抗体亚基相关,则较大结合实体和重链抗体片段可具有小于约425个氨基酸,小于约400个氨基酸,小于约375个氨基酸,小于约350个氨基酸,小于约325个氨基酸或小于约300个氨基酸。
针对疾病标记的抗体可通过任何现有方法制备。制备多克隆抗体的方法已为本领域技术人员所知。例如,参见,Green,等人,Production of Polyclonal Antisera,in:Immunochemical Protocols(Manson,ed.),pages 1-5(Humana Press);Coligan,等人,Productionof Polyclonal Antisera in Rabbits,Rats Mice and Hamsters,in:Current Protocols in Immunology,section 2.4.1(1992),其内容在此引用作为参考。
本发明同样采用单克隆抗体。此处所用的术语“单克隆抗体”指从一批基本同质的抗体群中获取的抗体。换言之,包含该群的抗体除小量抗体产生偶然自然突变外完全相同。单克隆抗体对一个单一的抗原性位点具有高度的特异性。此外,与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备不同,每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外,单克隆抗体的优势还在于它们通过杂交瘤培养合成,不受其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指该抗体来源于基本同质的抗体群体这一特性,不可解释为需要通过特定方法制备该抗体。
此处的单克隆抗体特别包含“嵌合”抗体,该抗体中重和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相一致或同源,而该链的剩余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体的相应序列相一致或同源。只要具有所需的生物活性,也可采用该抗体的片段。参见U.S.Patent No.4,816,567;Morrison等人Proc.Natl.Acad Sci.81,6851-55(1984)。
同样的,单克隆抗体的制备也是常规的技术。例如,参见Kohler& Milstein,Nature,256:495(1975);Coligan,等人,sections2.5.1-2.6.7;and Harlow,等人,in:Antibodies:A Laboratory Manual,page 726(Cold Spring Harbor Pub.(1988)),其内容在此引用作为参考。单克隆抗体可通过多种成熟的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化。该种分离技术包括使用蛋白-A琼脂糖进行亲和层析,分子排阻色谱,和离子交换层析。例如,参见Coligan,等人,sections2.7.1-2.7.12 and sections 2.9.1-2.9.3;Barnes,等人,Purification ofImmunoglbulin G(IgG),in:Methods in Molecular Biology,Vol.10,pages 79-104(Humana Press(1992)。
体外和体内操作抗体的方法已为本领域技术人员所知。例如,本发明所用的单克隆抗体可通过上述杂交瘤方法和通过如U.S.Pat.No.4,816,567等所述的重组方法进行制备。本发明所用的单克隆抗体还可通过Clackson等人Nature 352:624-628(1991),以及Marks等人,J.MoI Biol.222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库分类得到。
制备抗体片段的方法同样为本领域所知(例如,参见,Harlowand Lane,Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory,New York,(1988),在此引用作为参考)。本发明的抗体片段可通过对抗体蛋白水解和通过编码该抗体片段的核酸在适当的宿主中表达进行制备。抗体片段可通过胃蛋白酶和木瓜蛋白酶消化完整抗体的传统方法获取。例如,可采用胃蛋白酶裂解抗体以提供称为F(ab′)2的5S片段。该片段可使用硫醇还原剂进一步裂解,并选择性使用针对二硫键裂解得到的巯基的阻断基团以生成3.5SFab′单价片段。此外还可采用胃蛋白酶裂解直接生成两个单价Fab′片段和一个Fc片段。这些方法可参见,例如,US Patents No.4,036,945和No.4,331,647,及其包含的参考文献。这些专利在此全文引用作为参考。
也可采用其它裂解抗体的方法,例如分离重链抗体形成轻-重链片断,进一步裂解片段,或使用其它酶,化学,或遗传技术,只要这些片段与被完整抗体识别的抗原相结合。例如,Fv片段包含了VH和VL链的结合体。该结合体可以是非共价的或者该可变链可通过分子间二硫键连接或通过戊二醛等化学物质进行交联。该Fv片段优选包含由肽接头连接的VH和VL链.这些单链抗原结合蛋白(sFv)可通过构建包含了由寡核苷酸连接的编码该VH和VL区的DNA序列的结构基因进行制备。将该结构基因插入一个表达载体,随后将载体导入一个宿主细胞(如大肠杆菌)。该重组宿主细胞将合成一种在两个V区之间具有接头肽的单多肽链。制备sFvs的方法可参见,例如,Whitlow,等人,Methods:a Companion to Methods in Enzymology,Vol.2,page 91(1991);Bird,等人,Science242:423-426(1988);Ladner,等人,US Patent No.4,946,778;以及Pack,等人,Bio/Technology 11:1271-77(1993)。
抗体片段的另一种形式为编码单个决定簇互补区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)经常包含在抗原识别和结合中。CDR肽可通过克隆或构建编码目标抗体CDR的基因获取。该种基因可通过如采用聚合酶链式反应从抗体生成细胞的RNA合成可变区等方法进行制备。例如,参见Larrick,等人,Methods:a Companion to Methods in Enzymology,Vol.2,page 106(1991)。
本发明考虑包括人和人源化形式的非人(例如,鼠)抗体。该种人源化抗体为包含了从非人免疫球蛋白得到的最小序列的嵌合免疫球蛋白,免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv,Fab,Fab′,F(ab′)2或其它抗原结合子序列)。多数情况下,人源化抗体为一种人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体的决定簇互补区(CDR)的残基被来自如小鼠,大鼠或兔子等具有所需特异性,亲和性和能力的非人类(供体抗体)CDR的残基所替代。
在一些实例中,人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基所替代。此外,人源化抗体可包含未发现于受体抗体或者引入CDR或框架序列的残基。这些修饰目的在于进一步改进和优化抗体性能。一般而言,人源化抗体将基本包含至少一个,通常为两个可变区的全部,其中全部或基本全部CDR区对应非人免疫球蛋白的CDR区,而全部或基本全部FR区为人免疫球蛋白的共有序列。优选的人源化抗体还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常为人免疫球蛋白恒定区。进一步细节参见:Jones等人,Nature 321,522-25(1986);Reichmann等人,Nature 332,323-29(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2,593-596(1992);Holmes,等人,J.Immunol.158:2192-2201(1997)and Vaswani,等人,Annals Allergy,Asthma &Immunol.81:105-115(1998)。
尽管已有生产抗体的标准化方法,抗体的大小,抗体的多链结构以及抗体中存在的六个结合环的复杂性构成了大量抗体改良和生产的障碍。因此,本发明进一步预期使用包含了识别和结合疾病标记(包括胆固醇臭氧化产物)的多肽的结合实体。
许多蛋白可用作蛋白支架与疾病标记的结合区连接并从而形成一个适当的结合实体。该蛋白支架仅仅支持和稳定该结合区以使其结合,该结合区可与本发明的胆固醇臭氧化产物结合或相互作用。有多种蛋白支架可供使用。例如,可采用噬菌体衣壳蛋白。综述参见Clackson & Wells,Trends Biotechnol.12:173-84(1994)。噬菌体衣壳蛋白曾作为支架展示任意肽序列,包括牛胰腺胰岛素抑制剂(Roberts等人,PNAS 89:2429-33(1992)),人生长激素(Lowman等人,Biochemistry 30:10832-38(1991)),以及链球菌的IgG结合区(O′Neil等人,Techniques in Protein Chemistry V,(Crabb,L5.ed.)pp.517-24,Academic Press,San Diego(1994))。这些支架曾展示可经修饰包含疾病标记(例如胆固醇臭氧化产物)结合区的随机环或区域。
研究人员曾采用小型74氨基酸α-淀粉酶抑制剂Tendamistat作为丝状噬菌体M13上的表达支架。McConnell,S.J.,& Hoess,R.H.,J.Mol.Biol.250:460-470(1995)。Tendamistat是一种来自唐德链霉菌的β-折叠蛋白。它的多种特性使其成为一种具有吸引力结合肽支架,这些特性包括它的小尺寸,稳定性,以及可获得高分辨的NMR和X射线结构数据。Tendamistat的总体拓扑结构与免疫球蛋白区域类似,具有两个由一系列环连接的β-折叠。与免疫球蛋白区域不同,Tendamistat的β-折叠采用两个而非一个二硫键连接,这使蛋白获得了显著的稳定性。Tendamistat中的环可与免疫球蛋白中发现的CDR环发挥类似的功能并可被体外突变简单的随机化。Tendamistat来自于唐德链霉菌,并可在人体内具有抗原性。因此,采用Tendamistat的结合实体优选在体外使用。
III型纤维连接蛋白区也曾被用作结合实体可以连接的蛋白支架。III型纤维连接蛋白是免疫球蛋白超家族中的一个大的亚家族(Fn3家族或s型Ig家族)的一部分。采用该种III型纤维连接蛋白区作为结合实体(例如,CDR肽)蛋白支架的序列,载体和克隆方法可参见,例如,U.S.Patent Application Publication 20020019517。还可参见Bork,P.& Doolittle,R.F.(1992)Proposed acquisition of ananimal protein domain by bacteria.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,8990-8994;Jones,E.Y.(1993)The immunoglobulin superfamily Curr.Opinion Struct.Biol.3,846-852;Bork,P.,Horn,L.& Sander,C.(1994)The immunoglobulin fold.Structural classification,sequence patternsand common core.J.MoI.Biol.242,309-320;Campbell,I.D.&Spitzfaden,C.(1994)Building proteins with fibronectin type IIImodules Structure 2,233-337;Harpez,Y.& Chothia,C.(1994)。
在该免疫系统中,从一个大型库(亲和力成熟)中选择和扩增特定抗体。可通过突变和结合实体组合库的生成模仿免疫细胞中采用的组合技术。因此也可通过展示型技术生成各种结合实体,抗体片段和抗体。该种展示型技术包括,例如,噬菌体展示,逆转录病毒展示,核糖体展示,以及其它技术。本领域现有的技术可用于生成结合实体库,从而对库进行筛选并选择能进行附加成熟(例如亲和力成熟)的结合实体。Wright和Harris,见上文,Hanes和PlucthauPNAS USA 94:4937-4942(1997)(核糖体展示),Parmley和SmithGene 73:305-318(1988)(噬菌体展示),Scott TIBS 17:241-245(1992),Cwirla等人PNAS USA 87:6378-6382(1990),Russel等人Nucl.Acids Research 21:1081-1085(1993),Hoganboom等人Immunol.Reviews 130:43-68(1992),Chiswell和McCafferty TIBTECH10:80-84(1992),以及U.S.Pat.No.5,733,743。
因此本发明还提供了一种突变抗体,CDRs或结合区以优化它们的亲和性,选择性,结合强度和/或其它所需特性的方法。突变结合区指不同于选定结合区(例如,CDR)的氨基酸序列。一般而言,突变结合区中的一个或多个氨基酸残基不同于参考结合区中存在的残基。该种突变抗体与参考氨基酸序列的一致性或相似度必然小于100%。一般而言,突变结合区与参考结合区的氨基酸序列至少具有75%的氨基酸序列一致性或相似度。突变结合区与参考结合区氨基酸序列的氨基酸序列一致性或相似度优选至少为80%,更优选至少为85%,更优选至少为90%,最优选至少为95%。
例如,采用噬菌体展示进行的亲和力成熟可用作一种生成突变结合区的方法。采用噬菌体展示进行的亲和力成熟指Lowman等人,Biochemistry 30(45):10832-10838(1991)所描述的方法,也可参见Hawkins等人,J.MoI Biol.254:889-896(1992)。尽管无需严格局限于以下描述,该过程可简述为在一系列不同位点突变多个结合区或抗体高变区从而在各位点产生所有可能的氨基酸替换。以单价形式从丝状噬菌体颗粒展示作为融合蛋白的由此生成的结合区突变体。通常与M13的基因III产物进行融合。表达各种突变体的噬菌体可循环多次以选择目标特性,例如,结合亲和性或选择性。对目标突变体进行分离和测序。对该方法更具体的描述参见U.S.Patent5,750,373,U.S.Patent 6,290,957以及Cunningham,B.C.等人,EMBO J.13(11),2508-2515(1994)。
因此,在一个实施例中,本发明提供了操作结合实体或抗体多肽或编码它们的核酸以生成识别如胆固醇臭氧化产物等疾病标记的具有改进的结合特性的结合实体,抗体和抗体片段的方法。
该种对现有结合实体或抗体的一部分进行突变的方法包括将一种能编码针对疾病标记的结合区的多肽的核酸融合至编码噬菌体外壳蛋白的核酸以生成编码融合蛋白的重组核酸,突变该编码融合蛋白的重组核酸以生成突变融合蛋白,在噬菌体表面表达该突变融合蛋白,并选择与疾病标记结合的噬菌体。
相应的,本发明提供了能识别和结合一种疾病标记(例如,胆固醇臭氧化产物,半抗原或胆固醇衍生物)的抗体,抗体片段,和结合实体多肽。本发明还提供了操作这些抗体,抗体片段,和结合实体多肽以优化它们的结合特性或其它所需特性(例如,稳定性,大小,使用简便度)的方法。
剂量,剂型和给药途径
给用本发明的组合物以实现与一种疾病相关的至少一种症状的减轻,该疾病如动脉粥样硬化症,心脏病,心血管疾病,自体免疫疾病,癌症,肿瘤,细菌感染,病毒感染,真菌感染,溃疡和/和其它可受益于局部给用细胞毒素的疾病和症状。
为实现所需的效果,该细胞毒素,结合实体,抗体或其组合物可作为单独或分开剂量进行给药,例如,至少约0.01mg/kg体重至约500至750mg/kg体重,至少约0.01mg/kg体重至约300至500mg/kg体重,至少约0.1mg/kg体重至约100至300mg/kg体重或至少约1mg/kg体重至约50至100mg/kg体重,尽管其他的剂量可能提供有益的效果。该给药量将取决于多种因素,包括但不限于,该治疗剂为细胞毒素,结合实体或抗体,该哺乳动物的疾病,体重,身体状态,健康,年龄,是否将实现预防或治疗,以及该治疗剂是否经过化学修饰。临床医生可采用本领域现有的动物模型或其它测试系统简单的测定该种因素。
依据受体的生理条件,给药目的为治疗还是预防,以及其它医师已知的因素,如本发明所述对治疗剂的施用可以是以连续或间歇的方式进行的单剂量,多剂量。该细胞毒素,结合实体,抗体或其组合的给药可以在一个预定时间段内连续或进行一系列间隔给药。局部和全身给药均在预期之内。
为制备该组合物,可通过合成或其它方式获得该细胞毒素,结合实体,抗体或其组合,并根据需要和目的进行纯化。随后可将这些治疗剂进行冻干或稳定,其浓度可调节至合适的量,且该治疗剂可选择性地与其它药剂组合。包含在一个单位剂量中的给定细胞毒素,结合实体,抗体或其组合的绝对重量可大范围变化。例如,特异性针对一种特定细胞类型可给用约0.01至约2g,或约0.1至约500mg的至少一种细胞毒素,结合实体,或抗体。此外,该单位剂量的范围可从约0.01g至约50g,从约0.01g至约35g,从约0.1g至约25g,从约0.5g至约12g,从约0.5g至约8g,从约0.5g至约4g,或从约0.5g至约2g。
细胞毒素,结合实体,抗体或其组合的日剂量也可变化。该日剂量的范围可以是,例如,从约0.1g/天至约50g/天,从约0.1g/天至约25g/天,从约0.1g/天至约12g/天,从约0.5g/天至约8g/天,从约0.5g/天至约4g/天,从约0.5g/天至约2g/天。
因此,一种或多种包含本发明治疗剂的适当单位剂量形式可通过多种途径给药,包括口服,肠胃外(包括皮下,静脉内,肌肉以及腹膜内),直肠,皮肤,透皮,胸内,肺内和鼻内(呼吸)途径。该治疗剂还可以是缓释制剂(例如,使用微胶囊,参见WO 94/07529,以及U.S.Patent No.4,962,091)。在适当时候该制剂可以作为分散的单位剂型的方便形式呈现,且可采用医药领域公知的方法进行制备。该方法可包括将治疗剂与液体媒介,固体基质,半固体媒介,细颗粒固体媒介或其组合相混合,随后根据需要将该产物导入或成形进入目标传递系统。
当本发明的治疗剂针对口服给药进行制备时,它们通常会与药学可接受的载体,稀释剂或赋形剂混合以形成一种药物制剂,或单位剂型。对于口服给药,该治疗剂可以呈粉末,颗粒制剂,溶液,悬浮液,乳液或者在天然或合成聚合物或树脂中从而可以由咀嚼胶摄入活性成分。该治疗剂还可呈药丸,干药糖剂或糊剂。本发明的口服给用治疗剂还可以是缓释制剂。例如,该治疗剂可以被包覆,微胶囊化,或以其它方式置于缓释载体中。该制剂中的总活性成分包含制剂重量的0.1至99.9%。
“药学可接受的”指与制剂中其它成分相兼容,且对其受体无害的载体,稀释剂,赋形剂,和/或盐。
包含本发明治疗剂的药物制剂可通过本领域已知的方法使用公知和容易得到的成分进行制备。例如,该治疗剂可与普通赋形剂,稀释剂,或载体进行配制,并制成片剂,胶囊,溶液,悬浮液,粉末,气雾剂等。适用于该种制剂的赋形剂,稀释剂,以及载体的范例包括缓冲液,以及如淀粉纤维素,糖,甘露醇,以及硅衍生物等填充剂和混合剂。也可采用如羧甲基纤维素,羟甲基纤维素,羟丙基甲基纤维素以及其它纤维素衍生物,藻酸盐,凝胶,和聚乙烯吡咯烷酮等结合剂。保湿剂可包括如丙三醇,分解剂如碳酸钙和碳酸氢钠。也可使用如石蜡等用于延缓分解的试剂。还可使用如季铵化合物等吸收促进剂。也可包含如十六烷醇和甘油单硬脂酸酯等表面活性剂。可添加如高岭土和斑脱土等吸附载体。也可包含如滑石,硬脂酸钙和硬脂酸镁,以及固体聚乙烯二醇等润滑剂。还可添加防腐剂。本发明的组合物还可包含纤维素和/或纤维素衍生物等增厚剂。它们还可以包含如黄原胶,瓜儿胶或卡尔博胶或阿拉伯树胶,或者聚乙二醇,有机皂土和高岭石等胶。
例如,包含本发明治疗剂的片剂或囊片可包含如碳酸钙,氧化镁和碳酸镁等缓冲剂。囊片和片剂还可包含如纤维素,预胶化淀粉,二氧化硅,羟丙基甲基纤维素,硬脂酸镁,微晶纤维素,淀粉,滑石,二氧化钛,苯甲酸,玉米淀粉,矿物油,聚丙二醇,磷酸钠,硬脂酸锌等无活性成分。至少包含一种本发明治疗剂的硬或软凝胶胶囊可包含如凝胶,微晶纤维素,月桂基磺酸钠,淀粉,滑石,以及二氧化钛等无活性成分,以及如聚乙二醇(PEGs)和植物油等液体载体。此外,包含本发明一种或多种治疗剂的肠溶囊片或片剂经设计可防止在胃中分解并溶解于十二指肠的更为中性到碱性的环境中。
本发明的治疗剂还可以制成便于口服给药的酏剂或溶液,或是利于肠胃外给药(例如通过肌肉,皮下,腹膜内或静脉途径)的溶液。本发明治疗剂的药物制剂可呈水溶液或无水溶液或胶体溶液等形式,也可呈乳状液或悬浮液或药膏形式。
因此,该治疗剂可制成供肠胃外给药(例如,通过注射,如弹丸注射或连续输注)的制剂并可在安瓿,预填充注射器,小体积输注容器或多剂量容器中作为单位剂量形式提供。如上所述,可添加防腐剂以维持剂型的保存期。该活性药剂和其它成分可在油或水载体中呈悬浮液,溶液,或乳状液,并可包含如悬浮剂,稳定剂和/或分散剂等配方剂。另外,该治疗剂和其它成分可通过从无菌固体中无菌分离或从溶液中冻干形成粉末形式,以供在使用前与适当的媒介(例如,无菌,无热原水)混合。
这些制剂可包含本领域公知的药学可接受的载体,赋形剂和佐剂。人们可以采用一种或多种从生理角度可被接受的有机溶剂来制备溶液,除水外,该溶剂可选自如丙酮,乙醇,异丙醇,乙二醇醚(例如名为“Dowanol”的商品),聚乙二醇和聚乙烯乙二醇,短链酸的C1-C4链烷酯,乳酸乙酯或乳酸异丙酯,脂肪酸甘油三酸酯(例如名为“Miglyol”的商品),肉豆蔻酸异丙酯,动物油,矿物油,和植物油以及聚硅醚等溶剂。
如有必要可以选择添加抗氧化剂,表面活性剂,其它防腐剂,成膜剂,角质层分离剂或粉刺溶解剂,香精,调味剂和着色剂等佐剂。可以添加如叔丁基对苯二酚,丁基羟基茴香醚,二丁基羟基甲苯以及α-生育酚及其衍生物等抗氧化剂。
此外,该治疗剂还适合于制成缓释剂型等制剂。该制剂通过该种组成可以在一段时间内在如血管系统或呼吸道等特定部位释放该活性剂。覆层,包膜和保护性基质可采用如聚合物质(例如聚交酯-羟乙酸盐),脂质体,微乳液,微颗粒,纳米颗粒或蜡等制备。这些覆层,包膜,和保护性基质可用于包覆留置设备,例如,支架,导管,腹膜透析管,引流装置等。
为进行局部给药,该治疗剂可制成本领域已知的可直接应用于目标区域的制剂。主要用于局部应用的形式有,例如,乳膏,乳液,凝胶体,分散剂或微乳液,以较大或较小程度增稠的洗剂,浸渍垫,油膏或贴,气雾剂(例如,喷雾或泡沫),皂,清洁剂,洗剂或钙皂。其它用于该目的的常规形式包括创伤敷裹,涂层绷带或其它聚合物包膜,油膏,乳膏,洗剂,糊剂,凝胶剂,喷雾,以及气雾剂。因此,本发明的治疗剂可通过药膏或绷带进行皮肤给药。此外,该治疗剂可制成粘性聚合物(例如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/醋酸乙烯酯共聚物)的一部分。为进行长期应用,可采用多微孔和/或可呼吸支撑层压板从而使皮肤的水合或浸软最小化。该支撑层可采用任意合适的厚度以提供所需的保护和支撑功能。合适的厚度通常在约10至约200微米。
油膏和乳膏通过在水或油基中添加合适的增稠和/或凝胶剂制成。洗剂可通过水或油基制成并通常包含一种或多种乳化剂,稳定剂,分散剂,悬浮剂,增厚剂,或着色剂。该活性成分还可以通过离子电渗疗法进行传递,例如,参见U.S.Patent Nos.4,140,122;4,383,529;或4,051,842。本发明治疗剂在一种局部制剂中的重量百分比将取决于多种因素,但通常在制剂总重的0.01%至95%,典型的占质量的0.1-85%。
滴剂,例如眼部滴剂或鼻部滴剂,可通过水或非水基中的一种或多种治疗剂制成,并包含一种或多种分散剂,增溶剂或悬浮剂。液体喷雾可通过加压包装方便地递送。滴剂可通过简单的眼药水-加盖瓶,或通过可逐滴传递液体成分的塑料瓶,通过特殊形状的闭合进行递送。
该治疗剂可进一步制成供嘴部和喉部局部给药的制剂。例如,该活性成分可制成进一步包含一种调味基(通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶)的糖锭;在一种惰性基(例如白明胶和丙三醇或蔗糖和阿拉伯树胶)中包含该组合物的锭剂;以及在一种合适液体载体中包含本发明组合物的漱剂。
本发明的药物制剂可包括,例如选择性的成分,药学可接受的载体,稀释剂,增溶剂或乳化剂,以及本领域现有的盐类型。该物质的范例包括普通盐溶液,例如生理缓冲盐溶液和水。可用于本发明药物制剂的载体和/或稀释剂的特定的非限定范例包括水和生理可接受缓冲盐溶液(例如pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲盐溶液)。
本发明的活性成分还可给用于呼吸道。因此,本发明还提供了可用于本发明方法的气雾剂药学制剂和剂型。一般而言,该种剂型包含了一定量的至少一种本发明的可治疗或预防特定免疫应答,血管症状或疾病的临床症状的药剂。依照本发明方法处理的免疫应答,血管症状或疾病的一种或多种症状的任意具有统计显著性的减轻均可认为在本发明范围内对该免疫应答,血管症状或疾病的治疗。
此外,为进行吸入或吹入给药,该组合物还可呈干粉剂(例如,治疗剂与如乳糖或淀粉等适当的粉末基的粉末混合物)形式。该粉末组合物还可作为胶囊或药筒,或如白明胶或泡罩包装等单位剂型提供从而可在吸入器,吹入器,或定量吸入器(例如,参见Newman,S.P.in Aerosols and the Lung,Clarke,S.W.and Davia,D.eds.,pp.197-224,Butterworths,London,England,1984中描述的加压定量吸入器(MDI)和干粉吸入器)的帮助下给用该粉末。
在以气雾剂或吸入形式给药时本发明的治疗剂还可作为水溶液给用。因此,其它气雾剂药物组合物可包含,例如,包含约0.1mg/ml和约100mg/ml的一种或多种特异针对待治疗适应症或疾病的本发明治疗剂的生理可接受缓冲盐溶液。未溶解或悬浮于液体中的细颗粒固体治疗剂形式的干气雾剂也可用于本发明的实践中。本发明的治疗剂可制成喷粉并包含平均粒径介于约1至5μm,或是介于2至3μm的细颗粒。细颗粒可通过本领域公知技术粉碎并筛选过滤制备得到。该种颗粒可通过吸入预定量的可以呈粉末形式的细颗粒材料进行给药。应当可以理解包含在各剂型的单独气雾剂剂量中的单位含量活性成分本身无需构成治疗特定免疫应答,血管症状或疾病的有效量,因为该必需的有效量可通过给用多个剂量单位实现。此外,既可通过单独给药,也可通过系列给药采用小于该剂型的剂量实现该有效量。
为通过吸入在上(鼻腔)或下呼吸道给药,本发明的治疗剂可通过喷雾器或加压包装或其它方便的传递气溶胶喷雾的方式进行简单递送。加压包装可包含一个合适的推进剂,例如二氯二氟甲烷,三氯氟甲烷,二氯四氟乙烷,二氧化碳或其它合适的气体。对于加压气雾剂,该剂量单位可通过一个阀进行定量传递。喷雾器包括,但不限于,如U.S.Patent Nos.4,624,251;3,703,173;3,561,444;以及4,635,627所述。此处披露的气雾剂传递系统类型可由多个商业来源提供,包括Fisons Corporation(Bedford,Mass.)和AmericanPharmoseal Co.,(Valencia,CA)。对于鼻内给药,该治疗剂还可通过鼻部滴剂,液体喷雾给药,例如通过塑料瓶喷雾器或定量吸入器给药。典型的喷雾器为Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。
此外,不管针对此处所述的症状还是一些其它症状,该活性成分还可与其它治疗剂(例如,止痛剂,抗炎剂,抗组胺剂,支气管扩张剂)合并使用。
试剂盒
本发明进一步涉及一种包装的药物组合物,例如试剂盒或其它用于控制,预防或治疗疾病的容器。该试剂盒或容器包含了治疗有效量的药物组合物以控制疾病,还包含了使用该药物组合物控制疾病的说明。该药物组合物至少包含一种治疗有效量(从而可以控制,预防或治疗疾病)的本发明的结合实体或抗体。
在一个实施例中,该试剂盒包括了一个包含一种特异性结合胆固醇臭氧化产物的抗体的容器。该抗体可以直接或间接与治疗剂结合。该抗体还可以作为液体形式,粉末形式或其它允许简单施用给动物的形式提供。
在另一个实施例中,本发明提供了一种包含至少一种治疗有效量(从而可以控制,预防或治疗疾病)的细胞毒性胆固醇臭氧化产物的药物组合物。该种具有胆固醇臭氧化产物的试剂盒可用于,例如,作为细胞毒素抑制或杀死有害细胞类型。
在本发明的另一实施例中,该试剂盒包含一种与细胞毒性胆固醇臭氧化产物结合的结合实体。该种试剂盒可用于治疗患有自体免疫疾病,癌症,肿瘤,细菌感染,病毒感染,溃疡和/或其它可受益于局部给用细胞毒素的疾病的患者。该结合实体-细胞毒素缀合物优选以适于向患者注射给药的形式提供。因此,该试剂盒包含的结合实体-细胞毒素缀合物可呈悬浮形式,例如悬浮于一种合适的药物赋形剂中。此外,该缀合物可以呈适于重构的固态形式。
本发明的试剂盒还可包含具有可用于给用本发明组合物的工具的容器。该种工具包括注射器,药签,导管,杀菌溶液等。
下列实施例可对本发明进行阐述,但非进行限制。在不脱离本发明精神和范围的情况下可对本发明进行多种变更和修改。
具体实施方式
实施例1:材料和方法
手术分离和处理粥样硬化动脉样本。组织样本可通过颈动脉内膜切除术获取。该样本包含动脉粥样硬化病斑以及一些粘附内膜和介质。该病斑分析方案经斯克里普斯临床人体委员会(Scripps ClinicHuman Subjects Committee)批准并在手术前得到患者的同意。在手术去除后30分钟内对新鲜颈动脉内膜切除组织进行分析。注意该病斑样本既不贮存也不保藏。所有的分析操作在手术去除后2小时内完成。不向样本添加定色剂。
使用人粥样硬化动脉样本氧化靛蓝胭脂红1。按上述方法分离的动脉内膜切除样本(n=15)被分为湿重基本相同(±5%)的两个切片。各样本被置于含靛蓝胭脂红1(200μM,Aldrich)和牛过氧化氢酶(100μg)的磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH7.4,1.8mL)中。靛蓝胭脂红1被作为臭氧的化学陷阱添加。Takeuchi等人,Anal.Chem.Acta 230,183(1990);Takeuchi等人,Anal.Chem.61,619(1989)。佛波肉豆蔻酯(PMA,40μg溶于0.2mL的DMSO中)或DMSO(0.2mL)被作为蛋白激酶C的激活剂添加。将各样本采用组织匀浆机匀质化10分钟并离心(10,000rpm离心10min)。倒出上清液,通过过滤器(0.2μm),然后使用定量HPLC分析滤出液中靛红磺酸2的存在。
如图1B所示,靛蓝胭脂红1的可见吸收变白且反应生成了新的可使用定量HPLC检测的化学物质(表1),该物质被鉴定为靛红磺酸2(见图1A)。
靛红磺酸2的HPLC定量分析。HPLC在带有L-7200自动进样器,L-7100泵和L-7400紫外检测器(254nm)的Hitachi D-7000机器上进行。该L-7100可通过在Dell GX150个人电脑使用Hitachi-HSM软件进行控制。LC条件为Spherisorb RP-C18柱和乙腈∶水(0.1%TFA)(80∶20)流动相,流速1.2mL/min。靛红磺酸2的保留时间RT约为9.4分钟。通过针对Macintosh的GraphPad v3.0软件,对峰面积与对应标准样品浓度的标准曲线下的峰面积进行比较而定量(表1)。
表1
激活粥样硬化动脉物质内的靛红磺酸2(ISA)
样本 | ISA nmol/mg |
1 | 27.3 |
2 | 54.4 |
3 | 27.6 |
4 | 1.0 |
5 | 30.1 |
6 | 238.3 |
7 | 39.4 |
8 | 152.9 |
9 | 127 |
10 | 262.1 |
11 | 27.9 |
12 | 64.6 |
13 | 1.4 |
14 | 3.2 |
15 | 32.1 |
平均±SEM=72.62±21.69
使用人粥样硬化动脉样本在H2 18O中氧化靛蓝胭脂红1。除以下区别外该实验采用如上所述的靛蓝胭脂红分析。首先,将各病斑样本(n=2)添加入大于95%H2 18O的磷酸盐缓冲液(10mM,pH7.4)。其次,在PD10柱上对滤出液脱盐并在Finnegan电喷雾质谱分光计上进行阴性电喷雾质谱光谱分析。原始离子丰度数据被提取为Graphpad Prism v 3.0格式以供展示。
这些实验显示在病斑物质和H2 18O(>95%18O)存在下,该18O同位素被整合进入靛红磺酸2的内酰胺羰基。由于只有臭氧可以氧化裂解靛蓝胭脂红1的双键并促进同位素从H2 18O整合进入靛红磺酸2的内酰胺羰基。因此,臭氧可能是氧化靛蓝胭脂红1的活性氧。因此,臭氧在动脉粥样硬化病症内生成。还可参见P.Wentworth Jr.等人,Science 298,2195(2002);B.M.Babior,C.Takeuchi,J.Ruedi,A.Guitierrez,P.Wentworth Jr.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,3920(2003);P.Wentworth Jr.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,1490(2003)。
从粥样硬化动脉样本萃取和衍生化乙醛的方法。按上述方法分离的动脉内膜切除样本被分为湿重基本相同(±5%)的两个切片。各样本被置于含牛过氧化氢酶(100μg)以及佛波肉豆蔻酯(40μg溶于0.2mL的DMSO)或DMSO(0.2mL)的磷酸盐缓冲盐(PBS,pH7.4,1.8mL)中。将各样本采用组织匀浆机匀质化10分钟。然后以二氯甲烷(DCM,3x5mL)洗涤按上述方法分离的匀质化动脉内膜切除样本。在真空下蒸发干燥合并的有机相。将残留物溶解在乙醇(0.9mL)中并添加2,4-二硝基苯肼(100μL,2mM,以及1N HCl)的乙醇溶液。向该溶液吹氮气5分钟,然后搅拌该溶液2小时。将所得的悬浮液通过0.22μm过滤器进行过滤,参考下文以HPLC分析滤出液。在该种条件下处理胆固醇3(1-20μM)时,未形成4a或5a。使用学生双尾t-检验分析在PMA添加前和添加后的粥样硬化动脉萃取物中测得的4b的量以确定PMA添加对动脉萃取物中4a水平影响的显著性(p<0.05被认为具有显著性)并以针对Macintosh的Graphpad v3.0软件进行测定。
在该条件下衍生化4a的过程中,在一定的4a浓度范围(5至100μM)内,约20%的4a被转化为5b。这些数据显示实际测得的超过相同病斑样本中4a的20%的5a由3先后臭氧分解和羟醛缩合产生。在所采用衍生化条件下,在一定的4a浓度范围(5至100μM)内4a向6b的转化率均<2%。这些观察显示病斑萃取物中超过酮醛4a的2%的6a数量存在于衍生化之前并通过水的β-清除而由臭氧分解产物4a生成。
除了三个主要的腙产物4b-6b外,在多个病斑萃取物中检测到了痕量(<5pmol/mg)的7a腙衍生物(称为7b)(RT~26分钟,[M-H]-579,SOM图2和4)。化合物7a为5a的A-环脱水产物。衍生化病斑萃取物中7b的量接近所用的HPLC的检测限,因此未对所有病斑样本中的该种化合物进行完全分析考察。化合物7a和7b的构象分配基于合成物质7b的1H-1H ROESY实验。
合成制备化合物6b,7a,7b,8a和9a以鉴定具有图4中RT~26分钟的峰[M-H]-579的化合物。
腙的HPLC-MS分析。HPLC-MS分析在带有L-7200自动进样器(常规注射量10μl),L-7100泵和L-7400紫外检测器(360nm)或L-7455二极管阵列检测器(200-400nm)以及在线M-8000离子阱质谱计(负离子模式)的Hitachi D-7000机器上进行。该L-7100和M-8000可通过在Dell GX150个人电脑使用Hitachi-HSM软件进行控制。HPLC在Vydec C18反相柱上进行。以0.5mL/min的流速使用等度流动相(75%乙腈,20%甲醇和5%水)。采用Hitachi D7000色谱站软件测定峰高和峰面积并通过与标准物质的标准曲线比较转化为浓度。在这些条件下腙4b-6b的检测限介于1-10nM。通过该HPLC系统不能分辨顺式和反式腙异构体。
图4显示了代表性的萃取和衍生化动脉粥样硬化物质的HPLC-MS。表2显示了一些关键腙化合物的标准样本的保留时间和质量分数。
表2标准腙的LCMS分析
腙 | RT/min | [M-H]- |
4b | 13.9 | 597 |
5b | 20.3 | 597 |
6b | 18.0 | 579 |
7b | 26.8 | 579 |
a,d8b | 26.6 | 579 |
b9b | 16.5 | 579 |
c10b | 48.2 | 561 |
a标准醛8a的腙可通过上述方法衍生制备,该醛8a并非独立合成和纯化。b商品化的酮9a的腙可通过上述方法衍生制备,并且非独立合成和纯化。c标准醛10a的腙可通过上述方法衍生制备,并且非独立合成和纯化。d8b和9b的区分基于它们的紫外光谱[使用Hitachi L-7455二极管阵列检测器(200-400nm)检测]。α,β-不饱和腙8b的λmax为435nm,而腙9b的λmax为416nm。
在血浆样本中分析醛4a和5a。从将在24小时内进行颈动脉内膜切除术患者体内获取血浆样本(n=8)。在样本采集3天后分析所有样本中4a和5a的存在。从参与普通医学临床的患者中随机采集对照血浆样本(n=15)并在采集7天后进行分析。在一种典型的方法中,采用二氯甲烷(DCM,3x1mL)洗涤EDTA(1ml)中的血浆。在真空下蒸发干燥合并的有机相。将残留物溶解在甲醇(0.9mL)中并添加2,4-二硝基苯肼(100μL,0.01M,Lancaster)以及1N HCl的乙醇溶液。向该溶液吹氮气5分钟,然后搅拌该溶液2小时。将所得的溶液通过0.22μm过滤器进行过滤,参考上文以HPLC分析滤出液。初步考察显示可从血浆萃取的5a的量每天约下降5%。
4a,4b,5a,5b,6a,6b,7a,7b,8a和8b标准样本的制备
总体方法。除非另行指明,所有反应采用干燥试剂,溶剂和火焰干燥的玻璃器具在惰性气体中进行。所有的起始原料均购自Aldrich,Sigma,Fisher或Lancaster并直接使用购得物品。酮9a购自Aldrich。所有的快速柱层析均使用硅胶60(230-400目)。制备薄层层析(TLC)采用Merck(0.25,0.5或1mm)涂覆硅胶Kieselgel 60 F254平板。1H NMR光谱记录于Bruker AMX-600(600MHz),AMX-500(500MHz),AMX-400(400MHz)或AC-250(250MHz)分光计。13CNMR光谱记录于Bruker AMX-500(125.7MHz)或AMX-400(100.6MHz)分光计。化学位移以δ标度表示为自内标的百万分之几(ppm).高分辨质谱记录于VG ZAB-VSE仪器。
3β-羟基-5-氧代-5,6-seco胆甾烷-6-醛(4a)。该化合物参照K.Wang,E.W.A.Pryor,Steroids 58,225(1993)中的一般描述合成得到。将胆固醇3(1g,2.6mmol)的氯仿-甲醇(9∶1)(100ml)溶液在干冰温度下臭氧处理10分钟。蒸发干燥反应混合物并以水-醋酸(1∶9,50ml)中的Zn粉末(650mg,10mmol)在室温下搅拌3小时。以二氯甲烷(100ml)稀释该还原混合物并用水(3x50ml)洗涤。用硫酸钠干燥合并的有机相并在真空下蒸发干燥。以硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(25∶75)]纯化残留物并获得白色固体标题化合物4a(820mg,76%):
1H NMR(CDCl3)δ9.533(s,1H,CHO),4.388(m,1H,H-3),3.000(dd,J-14.0,4.0Hz,1H,H-4e),0.927(s,3H,CH3-19),0.827(d,J=6.8Hz,3H,CH3-21),0.782(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.778(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.603(s,3H,CH3-18);13C NMR(CDCl3)δ217.90(C-5),202.76(C-6),70.81(C-3),55.96(C-17),54.26(C-14),52.52(C-10),46.70(C-4),44.17(C-7),42.43(C-13),42.17(C-9),39.75(C-12),39.33(C-24),35.85(C-22),35.61(C-20),34.58(C-8),33.99(C-1),27.87(C-25),27.73(C-16),27.52(C-2),25.22(C-15),23.62(C-23),22.91(C-11),22.70(C-27),22.44(C-26),18.44(C-21),17.46(C-19),11.42(C-18).通过高分辨基质辅助激光解吸飞行时间质谱计算C27H46O3Na(M+Na)+的分子量为441.3339,测得分子量为441.3355。
3β-羟基-5-氧代-5,6-seco胆甾烷-6-醛的2,4-二硝基苯腙(4b)。该化合物参照K.Wang,E.Tdez,W.A.Pryor,Steroids 58,225(1993)中的一般描述合成得到。将2,4-二硝基苯腙(52mg,0.26mmol)和对甲苯磺酸(1mg,0.0052mmol)添加入酮醛4a(100mg,0.24mmol)的乙腈(10ml)溶液。在室温下将反应混合物搅拌4小时,并在真空下蒸发干燥。将该残留物溶解于乙酸乙酯(10ml)并用水(3x20ml)洗涤。用硫酸钠干燥合并的有机相并在真空下蒸发干燥。以硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶4)]纯化残留物以获得顺式和反式异构体(1∶4)混合物形式的黄色固体标题化合物4b(100mg,70%)。从己烷-二氯甲烷结晶可得到黄色针状反式-4b(30mg,21%):
1H NMR(CDCl3):δ10.994(s,1H,NH),9.107(d,J=2.8Hz,1H,H-3′),8.316(dd,3=9.6,2.8Hz,1H,H-5′),7.923(d,J=9.6Hz,1H,H-6′),7.419(dd,J=6.0,3.6Hz,1H,H-6),4.417(m,1H,H-3),2.971(dd,J=13.6,4.0Hz,1H,H-4e),1.076(s,3H,CH3-19),0.915(d,J=6.4Hz,3H,CH3-21),0.853(d,J=6.4Hz,3H,CH3),0.849(d,J=6.4Hz,3H,CH3),0.710(s,3H,CH3-18);13C NMR(CDCl3)δ216.05(C-5),150.84(C-6),144.96(C-1′),137.87(C-4′),130.23(C-5′),128.90(C-2′),123.50(C-3′),116.52(C-6′),71.42(C-3),56.07(C-17),54.54(C-14),52.69(C-10),47.34(C-4),42.61(C-13),42.61(C-9),39.82(C-12),39.42(C-24),36.99(C-8),35.96(C-22),35.67(C-20),34.13(C-1),32.65(C-7),27.98(C-16),27.93(C-25),27.90(C-2),25.31(C-15),23.70(C-23),23.12(C-11),22.78(C-27),22.52(C-26),18.56(C-21),17.77(C-19),11.67(C-18);通过高分辨基质辅助激光解吸飞行时间质谱计算C33H50N4O6Na(M+Na)的分子量为621.3622,测得分子量为621.3622:λmax 360nm,ε2.57±0.31x104M-1cm-1。
3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾烷-6β-甲醛(5a)。该化合物参照T.Miyamoto,K.Kodama,Y.Aramaki,R.Higuchi,R.W.M.Van Soest,Tetrahedron Letter42,6349(2001)中的一般描述合成得到。向酮醛4a(800mg,1.9mmol)的乙腈-水(20∶1,100ml)溶液添加L-脯氨酸(220mg,1.9mmol)。在室温下将反应混合物搅拌2小时,并在真空下蒸发干燥。将该残留物溶解于乙酸乙酯(50ml)并用水(3x50ml)洗涤。用硫酸钠干燥合并的有机相并在真空下蒸发干燥。以硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶4)]纯化残留物并获得白色固体标题化合物5a(580mg,73%):
1H NMR(CDCl3)δ9.689(d,J=2.8Hz,1H,CHO),4.115(m,1H,H-3),3.565(s,1H,3β-0H),2.495(broad s,1H,5β-OH),2.234(dd,1=92,3.2Hz,1H,H-6),0.920(s,3H,CH3-19),0.904(d,J=6.4Hz,3H,CH3-21),0.854(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.850(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.705(s,3H,CH3-18);13C NMR(CDCl3)δ204.74(C-7),84.26(C-5),67.33(C-3),63.89(C-9),56.10(C-14),55.67(C-17),50.42(C-6),45.47(C-10),44.72(C-13),44.22(C-4),40.02(C-8),39.67(C-12),39.44(C-24),36.15(C-22),35.58(C-20),28.30(C-16),27.98(C-2),27.91(C-25),26.69(C-1),24.55(C-15),23.78(C-23),22.78(C-27),22.52(C-26),21.54(C-11),18.71(C-21),18.43(C-19),12.48(C-18).
通过高分辨基质辅助激光解吸飞行时间质谱计算C27H46O3Na(M+Na)+的分子量为441.3339,测得分子量为441.3351。
3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾烷-6β-甲醛的2,4-二硝基苯腙(5b)。该化合物参照K.Wang,E.W.A.Pryor,Steroids 58,225(1993)中的一般描述合成得到。向醛5a(100mg,0.24mmol)的乙腈(10ml)溶液添加2,4-二硝基苯腙(52mg,0.26mmol)和盐酸(12M,2滴)。在室温下将反应混合物搅拌4小时,并在真空下蒸发干燥。将该残留物溶解于乙酸乙酯(10ml)并用水(3x20ml)洗涤。用硫酸钠干燥合并的有机相并在真空下蒸发干燥。以硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶4)]纯化残留物并获得为反式-5b苯腙的黄色固体标题化合物5b(90mg,62%):
1H NMR(CDCl3)11.049(s,1H,NH),9.108(d,J=2.4Hz,1H,H-3′),8.280(dd,J=9.6,2.6Hz,1H,H-51),7.901(d,J=9.6Hz,1H,H-61),7.561(d,J=7.2Hz,1H,H-7),4.214(m,1H,H-3),3.349(s,1H,3β-OH),2.337(dd,1=92,6.8Hz,1H,H-6),0.967(s,3H,CH3-19),0.917(d,J=6.8Hz,3H,CH3-21),0.850(d,J=6.4Hz,3H,CH3),0.846(d,1=6.4Hz,3H,CH3),0.713(s,3H,CH3-18);13C NMR(CDCl3)δ155.18(C-7),145.12(C-I1),137.51(C-41),129.91(C-51),128.64(C-21),123.57(C-31),116.36(C-61),83.35(C-5),67.56(C-3),56.34(C-17),56.34(C-9),55.56(C-14),51.47(C-6),45.50(C-IO),44.76(C-13),43.62(C-4),42.59(C-8),39.66(C-12),39.43(C-24),36.16(C-22),35.58(C-20),28.50(C-16),28.07(C-2),27.98(C-25),27.70(C-I),24.67(C-15),23.78(C-23),22.78(C-27),22.52(C-26),21.63(C-Il),18.75(C-21),18.67(C-19),12.48(C-18);通过高分辨基质辅助激光解吸飞行时间质谱计算C33H50N4O6Na(M+Na)+的分子量为621.3622,测得分子量为621.3625。HPLC-MS检测:RT20.8min;[M-H]-597;λmax 361nm,ε2.47±0.68x104M-1m-1。
5-氧代-5,6-seco胆甾烷-3-烯-6-醛(6a)。该化合物参照P.Yates,S.Stiveer,Can.J.Chem.66,1209(1988)中的一般描述合成得到。向冰浴温度下搅拌的酮醛4a(300mg,0.72mmol)和三乙胺(65μl,0.84mmol)的CH2Cl2溶液(15ml)逐滴添加甲烷磺酰氯(400μl,2.87mmol)。将所得溶液在0℃下的氩气中搅拌30分钟,然后添加三乙胺(400μl,2.87mmol)并将溶液加温至室温。2小时后,在真空下蒸发干燥该反应混合物。将该残留物溶解于二氯甲烷(15ml)并用水(3x20ml)洗涤。用无水硫酸钠干燥合并的有机相并在真空下蒸发干燥。以硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶9)]纯化粗残留物。蒸发干燥该组分得到无色油状的醛6a(153mg,53%)。1H NMR(CDCl3)显示δ9.574(s,1H,CHO),6.769(m,1H3 H-3),5.822(d,J=10Hz,1H,H-4),2.512(dd,J=16.8,3.6Hz,1H,H-7),1.070(s,3H,CH3-19),0.882(d,J=6.8Hz,3H,CH3-21).0.845(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.841(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.674(s,3H,CH3-18);13C NMR(CDCl3)δ208.22(C-5),202.42(C-6),147.46(C-3),128.44(C-4),56.08(C-17),54.96(C-14),47.80(C-10),45.05(C-7),42.33(C-13),42.04(C-9),39.73(Ol 2),39.43(C-24),35.93(C-22),35.71(C-20),35.42(C-I),33.77(C-8),27.97(C-25),27.67(C-16),25.22(C-15),24.67(C-2),23.71(C-23),23.27(C-Il),22.77(C-27),22.51(C-26),18.54(C-21),17.71(C-19),11.48(C-18).通过高分辨基质辅助激光解吸飞行时间质谱计算C27H45O2(M+H)+的分子量为401.3414,测得分子量为401.3404。
5-氧代-5,6-seco胆甾烷-3-烯-6-醛的2,4-二硝基苯腙(6b)。将2,4-二硝基苯肼(45mg,0.23mmol)添加入酮醛6a(80mg,0.2mmol)和对甲苯磺酸(1mg,0.0052mmol)的乙腈(10ml)溶液。在室温下将反应混合物搅拌2小时,并在真空下蒸发干燥。将该残留物溶解于二氯甲烷(10ml)并用水(3x20ml)洗涤。用硫酸钠干燥合并的有机相并在真空下蒸发干燥。以硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(15∶85)]纯化残留物并获得黄色固体标题化合物6b(70mg,60%):
反式-6b1H NMR(CDCl3)显示δ10.958(s,1H,NH),9.104(d,J=2.4Hz,1H,H-3′),8.288(dd,J=9.8,2.8Hz,1H,H-5′),7.896(d,J=9.6Hz,1H,H-6′),7.337(dd,J=5.6,5.6Hz,1H,H-6),6.771(m,1H,H-3),5.822(d,J=10Hz,1-H,H-4),2.600(ddd,J=16.4,4.8,4.8Hz,1H,H-7),1.139(s,3H,CH3-19),0.897(d,J=6.4Hz,3H,CH3-21),0.840(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.837(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.703(s,3H,CH3-18);13C NMR(CDCl3)δ207.78(C-5),151.17(C-6),147.69(C-3),145.00(C-1′),137.61(C-4′),129.97(C-5′),128.52(C-2′),128.38(C-4),123.48(C-3′),116.46(C-6′),56.05(C-17),54.68(C-14),47.87(C-10),42.30(C-13),41.69(C-9),39.72(C-12),39.37(C-24),36.35(C-8),35.91(C-22),35.66(C-20),35.34(C-I),32.84(C-7),27.93(C-25),27.73(C-16),24.93(C-15),24.68(C-2),23.69(C-23),23.24(C-11),22.74(C-27),22.48(C-26),18.52(C-21),17.81(C-19),11.58(C-18);通过高分辨基质辅助激光解吸飞行时间质谱计算C33H48N4O5Na(M+Na)+的分子量为603.35 17,测得分子量为603.3523。HPLC-MS检测:RT18.3min;[M-H]-579;λmax 360nm,ε2.29±0.23x104M-1cm-1。
5β-羟基-B-降胆甾烷-3-烯-6β-甲醛(7a)。该化合物参照P.Yates,S.Stiveer,Can.J.Chem.66,1209(1988)中的一般描述合成得到。向室温下氩气中的酮醛4a(50mg,0.125mmol)的无水甲醇溶液(10ml)逐滴添加甲醇钠的甲醇溶液(0.5M,0.16mmol)。30分钟后,真空下去除甲醇,将残留物溶解于二氯甲烷(20ml)并用水(3x20ml)洗涤。用硫酸钠干燥合并的有机相并在真空下蒸发干燥。以硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶9)]纯化残留物并获得无色油状的标题醛7a(16mg,32%):
1H NMR(CDCl3)δ9.703(d,J=3.2,1H,CHO),5.716(m,2H,H-3和H-4),2.398(dd,J=9.6,3.6Hz,1H,H-6),0.953(s,3H,CH3-19),0.904(d,J=6.4Hz,3H,CH3-21),0.854(d,J=6.4Hz,3H,CH3),0.849(d,J=6.4Hz,3H,CH3),0.706(s,3H,CH3-18);13C NMR(CDCl3)δ204.41(C-7),134.21(C-3),126.66(C-4),81.44(C-5),64.49(C-9),55.86(C-14),55.55(C-17),48.44(C-6),45.12(C-10),44.47(C-13),39.92(C-8),39.45(C-12),39.40(C-24),36.16(C-22),35.57(C-20),29.06(C-1),28.31(C-16),27.98(C-25),24.73(C-15),23.76(C-23),22.78(C-27),22.53(C-26),21.69(C-2),21.24(C-11),18.74(C-21),18.44(C-19),12.37(C-18);通过高分辨基质辅助激光解吸飞行时间质谱计算C27H44O2Na(M+Na)+的分子量为423.3233,测得分子量为423.3240。
5β-羟基-B-降胆甾烷-3-烯-6β-甲醛的2,4-二硝基苯腙(7b):将2,4-二硝基苯肼(8mg,0.041mmol)和对甲苯磺酸(1mg,5.2μmol)添加入醛7a(15mg,0.037mmol)的乙腈(5ml)溶液。在室温下将反应混合物搅拌2小时,真空下蒸发干燥并用二氯甲烷稀释(10ml)。用水(3x20ml)洗涤有机层,使用硫酸钠干燥并进行蒸发干燥。以硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶9)]纯化残留物并获得黄色固体的腙7b(9mg,41%):
1H NMR(CDCl3)反式-7b 11.060(s,1H,NH),9.119(d,J=2.8Hz,1H,H-3′),8.291(dd,J=9.2,2.0Hz,1H,H-5′),7.930(d,J=9.6Hz,1H,H-6′),7.546(d,J=7.2Hz,1H,H-7),5.761(ddd,J=I 0.2,4.4,2.0Hz,1H,H-3),5.705(d,J=9.6Hz,1H,H-4),2.485(dd,J=10.45 7.6Hz,1H,H-6),0.977(s,3H,CH3-19),0.917(d,J=6.4Hz,3H,CH3-21),0.848(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.844(d,J=6.4Hz,3H,CH3),0.707(s,3H,CH3-18);1H-1H ROESY NMR显著相关性(H4-H6),(H6-H7),(H7-H8),(H7-H19),缺失相关性(H3-H19),(H4-H7),(H4-H19),(H6-H19);13CNMR(CDCl3)δ154.62(C-7),145.09(C-F),137.59(C-4′),133.89(C-3),129.94(C-5′),128.68(C-2′),127.12(C-4),123.57(C-3′),116.42(C-6′),80.91(C-5),56.83(C-9),56.07(C-14),55.39(C-17),49.58(C-6),45.00(C-10),44.58(C-13),42.50(C-8),39.44(C-12),39.44(C-24),36.17(C-22),35.54(C-20),30.46(C-1),28.53(C-16),27.98(C-25),24.91(C-15),23.74(C-23),22.77(C-27),22.52(C-26),21.79(C-2),21.31(C-11),18.76(C-21),18.76(C-19),12.34(C-18).HPLC-MS检测:RT18.3min;[M-H]-579;λmax 364nm,ε2.32±0.17x104M-1cm-1。
3β-羟基-B-降胆甾烷-5-烯-6-甲醛(8a)。将醛5a(50mg,0.12mmol)和磷酸(85%,5ml)的乙腈-二氯甲烷(1∶1,4ml)溶液回流加热30分钟。在真空下蒸发干燥该反应混合物,用二氯甲烷(50ml)稀释,并用水(3x20ml)洗涤。使用硫酸钠干燥有机层并在真空下蒸发干燥。在硅胶柱上通过液相层析用乙酸乙酯-己烷(1∶4)纯化残留物以获得标题醛12mg(25%)的α,β-不饱和醛8a:8a的1H NMR(CDCl3)显示δ9.958(s,1H,CHO),3.711(tt,J=10.8,4.5Hz,1H,H-3),3.475(dd,J=14.1,4.8,1H,H-4),2.563(dd,J=11.0,11.0Hz,1H,H-8),0.953(s,3H,CH3-19),0.941(d,J=6.9Hz,3H,CH3-21),0.881(d,J=6.6Hz,3H,CH3),0.876(d,J=6.6Hz,3H,CH3),0.746(s,3H,CH3-18);13C NMR(CDCl3)δ189.44(C-7),168.74(C-5),139.21(C-6),70.88(C-3),60.16(C-9),55.40(C-17),54.48(C-14),46.35(C-IO),46.19(C-8),45.27(C-13),39.86(C-12),39.55(C-24),36.26(C-4),36.22(C-22),35.64(C-20),33.93(C-1),31.32(C-2),28.62(C-16),28.09(C-25),26.65(C-15),24.00(C-23),22.90(C-27),22.64(C-26),20.80(C-11),19.02(C-21),15.73(C-19),12.59(C-18);通过HRMS计算C27H44O2Na(M+Na)+的分子量为423.3233,测得分子量为423.3239。
B-降胆甾烷-3,5-二烯-6-甲醛12a为一种白色固体(27mg,60%),是通过以下反应得到的副产物:1H NMR(CDCl3)δ10.017(s,1H,CHO),6.919(d,J=10.2Hz,1H,H-4),6.225(m,1H,H-3),2.675(dd,J=10.8,10.8Hz,1H,H-8),0.950(d,J=6.9Hz,3H,CH3-21),0.914(s,3H,CH3-19),0.882(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.877(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.769(s,3H,CH3-I8);13C NMR(CDCl3)δ189.41(C-7),163.33(C-5),138.18(C-6),135.75(C-3),120.68(C-4),59.54(C-9),55.41(C-17),54.30(C-14),45.47(C-8),45.08(C-10),44.72(C-13),39.79(C-12),39.55(C-24),36.27(C-22),35.65(C-20),34.18(C-I),28.62(C-16),28.09(C-25),26.72(C-15),24.00(C-23),23.96(C-2),22.90(C-27),22.64(C-26),20.72(C-11),19.03(C-21),14.87(C-19),12.62(C-18);通过高分辨基质辅助激光解吸飞行时间质谱计算C27H43O(MH-H)+的分子量为383.3308,测得分子量为383.3309。
使用氨基酸对酮醛4a的羟醛缩合。在一个典型的方法中,酮醛4a(2mg,4.8μmol)在NMR管中溶于DMSO-d6(800μl)和D2O(80μl)中。向该溶液添加1等分的下列物质之一:a)L-脯氨酸,b)甘氨酸,c)L-赖氨酸盐酸盐或d)L-赖氨酸乙酯二盐酸盐。在时间点上使用1H NMR分析该样本。反应后通过检测1H NMR(DMSO-d6)中的一系列共振的变化。1H NMR 5a显示δ9.527(d,J=3.2Hz,1H,CHO),3.876(m,1H,H-3),0.860(d,J=6.4Hz,3H,CH3-21),0.772(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.767(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.771(s,3H,CH3-19),0.642(s,3H,CH3-18).1H NMR 4a显示δ9.518(s,1H,CHO),4.223(m,1H,H-3),2.994(dd,J=12.8,4.0Hz,1H,H-4e),0.858(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.842(s,3H,CH3-19),0.811(d,J=6.8Hz,3H,CH3),0.807(d,J=6.4Hz,3H,CH3-21),0.615(s,3H,CH3-18).在这些条件下,在DMSO-d6(800μl)和D2O(80μl)中未发生4a的羟醛缩合。
使用粥样硬化动脉和血液组分对seco酮醛4a的羟醛缩合。在一个典型的方法中,酮醛4a(5mg,0.0012mmol)溶于DMSO-d6(800μl)和D2O(80μl)中。向该溶液添加1等分的下列物质之一:a)在组织匀浆机中的PBS(1ml)中匀质化后冻干的粥样硬化动脉(2.1mg),b)冻干的人血液(1ml),c)冻干的人血浆(1ml)或d)冻干的PBS(1ml)。在时间点上取出样本参照上述方法用1H NMR进行分析。在这些条件下当冻干PBS存在时未发生4a的羟醛缩合。
对4a和5a的生物学考察
据描述一些氧化型胆固醇可通过体内氧化胆固醇生成。E.Lund,I.Acc.Chem.Res.28,241(1995)。此外,在对海绵Stellettahiwasaensis中的细胞毒性天然产物进行一般筛选时分离得到了仅与5a在胆甾烷侧链上结构不同的5a类似物.T.Miyamoto,K.Kodama,Y.Aramaki,R.Higuchi,R.W.M.Van Soest,TetrahedronLett.42,6349(2001);B.Liu,Z.Weishan,Tetrahedron Lett.43,4187(2002)。然而,如甾酮4a和5a一样,甾核被破坏的衍生物尚未在人体中报导。
细胞毒性实验。WI-L2人B-淋巴细胞系,HAAE-1人腹主动脉内皮细胞系,MH-S鼠肺巨噬细胞系,以及J774A.1鼠组织巨噬细胞系均从ATCC获得。人主动脉内皮细胞系(HAEC)以及人血管平滑肌细胞(VSMS)均从Cambrex Bio Science获得。Jurkat E6-1T-淋巴细胞由J.Kaye博士友情提供(斯克利普斯研究院)。细胞在含有10%胎牛血清的ATCC推荐培养基中培养。细胞在具有5或7%CO2的可控气氛下于37℃培养。针对乳酸脱氢酶(LDH)释放试验可通过添加0.05%胰蛋白酶/EDTA或通过刮擦收集吸附细胞。将所得的细胞接种于96孔微定量板(25,000细胞/微孔)并再生24-48小时。轻柔洗涤细胞并以含5%胎牛血清的新鲜培养基置换培养基。以3,4a或5a(0-100μM)处理双份或更大量的细胞样本18小时。然后通过测定培养物中细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞毒性。简单地说,细胞上清液中的LDH活性通过CytoTox 96非放射性细胞毒性试验(Promega,USA)对培养于96孔板上的细胞在酮醛4a,丁间醇醛5a,或胆固醇3处理末期进行测定。100%细胞毒性定义为由台盼蓝拒染法显示的死细胞释放的最大LDH量,或通过0.9%Triton X-100溶解细胞后测得的最大LDH量。IC50可通过针对Macintosh的Graphpad v3.0软件对浓度相对细胞毒性(%)的原始副本数据与非线性回归分析(Hill图)进行比较而得。
脂质负荷试验(泡沫细胞形成)。J774.1巨噬细胞在8孔室玻片内在含10%胎牛血清的ATCC推荐培养基中具有5或7%CO2的可控气氛下于37℃培养。然后将细胞培养于含抗氧化剂2,6-双-叔-丁基-4-甲基苯酚甲苯(100μM),二乙烯三胺-五乙酸(100μM)以及LDL(100μg/mL),LDL(100μg/mL)和atheronal-A 4a(20μM)或LDL(100μg/mL)和atheronal-B 5a(20μM)的相同培养基中72小时。终止后,以PBS(pH7.4)洗涤细胞两次。然后以溶于PBS的6%(v/v)多聚甲醛固定细胞30分钟,以丙二醇洗涤2分钟并用5mg/ml油红O对脂质染色8分钟。然后以哈里斯苏木精对细胞复染色45秒,以6%的多聚甲醛去除背景染色并分别以PBS和自来水各洗涤一次。使用丙三醇将盖玻片封固在载玻片上并用光镜检查玻片制备物。在各玻片的单个视野中的至少100个细胞总数中计算脂质负荷细胞的数量,并以总细胞的百分比表达。在放大倍率为100X时摄像。
圆形二色性。溶于PBS(pH7.4,含有1%异丙醇)的LDL(100μg/mL),LDL(100μg/mL)和4a(10μM),以及LDL(100μg/mL)和5a(10μM)圆形二色性(CD)光谱可在37℃下于恒温控制(±0.1℃)的0.1cm石英玻璃管中使用Aviv分光偏振计测定。在肽范围(200-260nm)内记录光谱。为提高信噪比,对每次测量可通过多次(三次)光谱平均。可在Dell个人电脑上通过CDPro软件组件(由科罗拉多州立大学的Narasimha Sreerama提供)对各测量进行摩尔椭圆光谱的去卷积。
实施例2:动脉粥样硬化病斑生成臭氧和胆固醇臭氧分解产物
通过上文描述的方法,本实施例显示了从15位人类患者(n=15)中经颈动脉内膜切除获得的动脉粥样硬化组织可生成能通过与靛蓝胭脂红1反应检测得到的臭氧。
动脉粥样硬化病斑生成的臭氧对靛蓝胭脂红的漂白
本发明人之前已显示当使用蛋白激酶C激活剂,4-β-佛波醇12-豆蔻酸酯13-醋酸酯(PMA)在靛蓝胭脂红1(一种臭氧的化学陷阱)溶液中处理抗体包覆的白细胞时,靛蓝胭脂红1的可见吸收被漂白且靛蓝胭脂红1被转化成为靛红磺酸2。例如,参见P.Wentworth Jr.等人,Science 298,2195(2002);B.M.Babior,C.Takeuchi,J.ituedi,A.Guitierrez,P.Wentworth Jr.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,3920(2003);P.Wentworth Jr.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,1490(2003)。靛红磺酸2的结构见图1A。当该试验在H2 18O(>95%18O)中进行时,可观察到整合进入靛红磺酸2内酰胺羰基的同位素。该方法可区分臭氧和1O2 *与其它同样能氧化靛蓝胭脂红1的氧化剂,因为在被认为与炎症相关的氧化剂中,仅臭氧能氧化裂解靛蓝胭脂红1的双键,从而同位素(来自H2 18O)整合进入靛红磺酸2的内酰胺羰基(参见上文和图1A)。
如实施例1所述,从15位被认为具有疑难动脉粥样硬化症的人类患者通过颈动脉内膜切除获取病斑物质。将各病斑分为相等的部分(约50mg湿重悬浮于1mL的PBS中)。将各部分病斑物质添加入靛蓝胭脂红1(200μM)和牛过氧化氢酶(50μg/mL)的磷酸盐缓冲盐溶液中(PBS,pH7.4,10mM磷酸盐缓冲液,150mM NaCl)(1mL)。该分析可通过向一份或另一份悬浮病斑物质添加DMSO(10μL)或DMSO中的佛波肉豆蔻酯(PMA,10μL,20μg/mL)启动。
当添加PMA时在15个病斑样本中有14个观察到1的可见吸收的漂白(图1B)。该漂白伴随可由反相HPLC分析测得的靛红磺酸2的生成(图1A和C)。根据所测试的病斑分离物,靛红磺酸2的数量可在1.0至262.1nmol/mg之间变化。由不同分离物生成的靛红磺酸2的平均值为72.62±21.69nmol/mg。
如分离裂解产物靛红磺酸2的质谱中[M-H]-228和230质量碎片峰的相对强度所示,在具有靛蓝胭脂红1的含H2 18O PBS(>95%18O)(n=2)中进行悬浮病斑物质的PMA活化时,约40%的靛蓝胭脂红1内酰胺羰基氧结合了18O(图1D)。
这些针对靛蓝胭脂红1的研究显示激活动脉粥样硬化病斑物质中生成了臭氧。
胆固醇臭氧分解产物
在动脉粥样硬化病斑中存在的一种主要的脂质为胆固醇3。D.M.Small,Arteriosclerosis 8,103(1988).在一项化学模型研究中,工作者显示在多种氧化剂(3O2,1O2 *,●O2 -,O2 2-,羟基,O3和●O2 +以及臭氧O3)中,仅臭氧裂解了胆固醇3的Δ5,6双键并获得5,6-seco甾酮4a(图2A)。该发现与其它化学报导相一致,后者同样指出5,6-seco甾酮4a为胆固醇3臭氧分解的主产物。Gumulka等人J.Am.Chem.Soc.105,1972(1983);Jaworski等人,J.Org.Chem 53,545(1988);Paryzek等人,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1,1222(1990);Cornforth等人,Biochem.J.54,590(1953)。
因此进一步的试验涉及检测和鉴定动脉粥样硬化病斑中是否存在5,6-seco甾酮4a或其它胆固醇臭氧分解产物。因此可检测14位患者(n=14)的人动脉粥样硬化病斑中在PMA激活前和激活后5,6-seco甾酮4a的存在。
该研究采用了改良的Pryor及其同事开发的分析方法。参见K.Wang,E.W.A.Pryor,Steroids 58,225(1993)。该改良方法包括使用一种有机溶剂(二氯甲烷,3x5mL)萃取匀质化病斑物质(约50mg湿重)的PBS(1mL,pH7)悬浮液,随后在室温下使用2,4-二硝基苯肼氢氯化物(DNPH HCl)(2mM溶于pH6.5乙醇溶液)的乙醇溶液处理有机相2小时。使用HPLC(直接注射,在360nm下紫外检测)和在线阴离子电喷雾质谱分析反应混合物中4b(臭氧分解产物4a的2,4-二硝基苯腙衍生物)的存在(图3)。在14个未激活病斑萃取物的11个(每个病斑中介于6.8和61.3pmol/mg)和所有激活的病斑萃取物(每个病斑中介于1.4和200.6pmol/mg)中检测到了腙4b。此外,以PMA激活时以4b平均值判定的4a的数量在病斑物质中显著上升。特别当不使用PMA时,4b的平均值为18.7±5.7pmol/mg。相反的,在添加PMA时,4b的平均值为42.5±13.6pmol/mg(n=14,p<0.05)(图3A-B)。
除4b外,在病斑萃取物的HPLC分析中还发现了其它两个主要的腙峰。第一个峰的RT~20.5分钟而[M-H]-=597,第二个峰RT~18.0分钟而[M-H]-=579(图3A,B)。由于腙4b的保留时间约为13.8分钟(RT-13.8分钟,[M-H]-597),它可与这些峰轻易的区分(图3A,B)。通过与标准样本进行比较,RT约为20.8分钟的峰被确定为丁间醇醛加合产物5a的腙衍生物5b(图2和3E)。在化学模型研究中,Pryor已指出4a肼衍生化的一个主要副产物为丁间醇醛腙加合产物5a的腙衍生物5b,其相对量为酸浓度和反应时间的函数。K.Wang,E.W.A.Pryor,Steroids 58,225(1993)。
在所采用衍生化条件下,在一定的4a测试浓度范围(5至100μM)内4a向5b的转化率均约为20%。然而,经常观察到超过20%的转化。实际测得的超过相同病斑样本中4a的20%的5a由3先后臭氧分解和羟醛缩合产生。
许多含氨基或羧酸盐基团的生化成分可以催化羟醛缩合反应。该种成分存在于病斑和血液中,并可促进4a转化为5a。进一步的试验显示下列氨基酸和物质可促进4a转化为5a:L-脯氨酸(2小时,完全转化),甘氨酸(24小时,完全转化),L-赖氨酸·盐酸(24小时,完全转化),L-赖氨酸(OEt)·2盐酸(100小时,62%转化)以及粥样硬化动脉萃取物(22小时,完全转化),全血(15小时,完全转化),血浆(15小时,完全转化)以及血清(15小时,完全转化)。所有该种药剂可相对对照反应加快4a转化为5a。
如上所述,病斑中的酮醛4a的量随PMA激活可上升。然而,PMA对5a形成的作用尚不甚清楚。在一些案例中5a的水平在PMA激活后提升(图5B,患者F和H),而在其它案例中5a的水平在PMA激活后下降(图5B,患者C,G和N)。
合成并分析一系列其2,4-二硝基苯腙衍生物在质谱中具有峰[M-H]-579的含羰基类固醇衍生物6a-9a(图2B)以帮助鉴定18分钟[M-H]-579的峰(图3A,B)。通过与标准样本的HPLC共注射,阴性电喷雾质谱和紫外光谱进行比较,在约18分钟的峰被确定为6b(6a的腙衍生物,以及4a的A-环脱水产物)(图3D)。在所选的衍生化标准条件下考察4a向6b的转化率。在所测试的4a浓度范围(5至100μM)内所观察到的转化率始终小于2%。这些数据显示病斑萃取物中超过该萃取物的酮醛4a量2%的6a数量存在于衍生化之前并通过水β-清除从臭氧分解产物4a生成。
在三个主要腙产物4b-6b外,另一产物7b被检测和确定为7a的腙衍生物以及5a的A-环脱水产物。该产物(7b)痕量(<5pmol/mg)存在于多个病斑萃取物且保留时间约为26分钟([M-H]-579,图4)。然而,病斑萃取物中7b的量接近所用的HPLC的检测限,因此未对所有病斑样本中的该种化合物存在或缺失的情况进行完全分析考察。
该试验证明激活病斑物质通过臭氧的化学特征氧化裂解靛蓝胭脂红1的双键且胆固醇的Δ5,6双键由化学特性已知的臭氧独特的途径裂解,从而得到明显证据说明动脉粥样硬化病斑可生成臭氧。此外,由于这些独特的胆固醇臭氧氧化产物同样在病斑激活前存在,因此也可能在动脉粥样硬化病斑的发展过程中产生臭氧。
据公认外源臭氧通过白介素(IL)-1α,IL-8,干扰素(IFN)-γ,血小板凝集因子(PAF),生长相关致癌基因(Gro)-α,核因子(NF)-κB和肿瘤坏死因子(TNF)-α的激活在体内具有促炎性。除了臭氧在炎症方面的这些公知作用外,在某些特别针对动脉粥样硬化病斑的情况下,当外源臭氧在该位点生成时可增强其引发和延续疾病的病理作用,胆固醇的臭氧分解产物可能独特存在于该种病斑,因为仅在该位点具有必需的高浓度臭氧和胆固醇且没有其它能捕获生成臭氧的反应性物质。
至于所谓粥样硬化动脉同时含有激活巨噬细胞和髓过氧物酶形式的抗体和1O2 *生成系统,粥样硬化病斑可能通过抗体催化水氧化途径生成O3。事实上,3的Δ5,6双键被裂解得到4a这一现象进一步证明了炎症中抗体催化生成臭氧。已知许多氧化型胆固醇可通过体内氧化胆固醇得到且在对海绵Stelletta hiwasaensis中的细胞毒性天然产物进行一般筛选时分离得到了仅与5a在胆甾烷侧链上结构不同的5a类似物。T.Miyamoto,K.Kodama,Y.Aramaki,R.Higuchi,R.W.M.Van Soest,Tetrahedron Letter 42,6349(2001);B.Liu,Z.Weishan,Tetrahedron Lett.43,4187(2002)。然而据我们所知如甾酮4a-6a一样甾核被破坏的衍生物尚未在人体中报导。因此有必要考察其它此类类固醇及其衍生物并考察它们的生物功能。
实施例3:在动脉粥样硬化患者血流中存在的胆固醇臭氧分解产物
本发明人曾曾显示可在抗体催化水氧化途径生成臭氧且该臭氧作为强效的氧化剂在炎症中产生作用。P.Wentworth Jr.等人,Science 298,2195(2002);B.M.Babior,C.Takeuchi,J.Ruedi,A.Guitierrez,P.Wentworth Jr.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,3920(2003);P.Wentworth Jr.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,1490(2003)。
炎症被认为是动脉粥样硬化症发病机理中的一个因素。R.Ross,New Engl.J.Med.340,115(1999);G.K.Hansson,P.Libby,U.Z.-Q.Yan,Circ.Res.91,281(2002)。然而,在本发明之前还没有特定的可区分炎性动脉疾病和其它炎症过程的非侵入性方法。动脉粥样硬化病斑的独特成分,以及动脉粥样硬化病斑物质向血流释放的产物可提供该种方法。动脉粥样硬化病灶特别包含高浓度的胆固醇。如此处所示,动脉粥样硬化病症可生成臭氧并能生成如4a和/或其羟醛缩合产物5a等胆固醇臭氧分解产物。因此可进行进一步试验以确定该胆固醇臭氧分解产物是否可以成为动脉粥样硬化症等炎性动脉疾病的标记。
对来自两个患者群组的血浆样本分析4a或5a的存在。群组A由动脉粥样硬化疾病状态足以进行动脉内膜切除术的患者(n=8)组成。群组B患者从参与一般医学临床的患者中随机选取。群组A8位患者中的6位检测到了数量范围在70-1690nM(~1-10nM为该分析的检测限)内的丁间醇醛5a(图5A-C)。在15个群组B的血浆样本中仅有1个具有可测的5a。未在患者血液样本中测得酮醛4a(~1-10nM为该分析的检测限)。这些数据显示或者4a被血液中所含的催化剂转化为5a,或者血浆中的组分对4a和5a有不同的亲和性。
在过去,由于胆固醇自动氧化的问题,“氧化型胆固醇”的血清分析充满困难。H.Hietter,P.Bischoff,J.P.Beck,G.Ourisson,B.Luu,Cancer Biochem.Biophys.9,75(1986)。然而,如此处所述,在所有生物相关的胆固醇3氧化所生成的胆固醇氧化产物中,类固醇衍生物4a和5a特别针对臭氧。这些研究显示以它的DNP腙衍生物5b的形式在血浆中检测到的羟醛缩合产物5a可作为动脉粥样硬化症中晚期动脉炎症的标记。因此,该臭氧的抗体催化生成可将胆固醇积累,炎症,氧化和细胞损伤这些其它情况下看似独立的因素联系成为可导致动脉粥样硬化症的病理级联。
一些研究显示胆固醇氧化产物具有如细胞毒性,致动脉粥样硬化性,致突变性等生物活性。H.Hietter,P.Bischoff,J.P.Beck,G.Ourisson,B.Luu,Cancer Biochem.Biophys.9,75(1986);J.L.Lorenso,M.Allorio,F.Bernini,A.Corsini,R.Fumagalli,FEBS Lett.218,77(1987);A.Sevanian,A.R.Peterson,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,4198(1984)。假定胆固醇氧化产物4a和5a从未考虑在人体中出现,按照如下所述对这些化合物对动脉粥样硬化形成主要方面的作用进行考察。
实施例4:胆固醇臭氧分解产物的细胞毒性
一些胆固醇氧化产物具有如细胞毒性,致动脉粥样硬化性,致突变性等生物活性。本实施例中分析了4a和5a对多种细胞系的细胞毒性作用。
本研究中采用了下列细胞系:Levy等人,Cancer 22,517(1968)所述的人B-淋巴细胞(WI-L2);Weiss等人,J.Immunol.133,123(1984)所述的T-淋巴细胞系(Jurkat E6.1);Folkman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.16,5217(1979)所述的血管平滑肌细胞系(VSMC)和腹主动脉内皮(HAEC)细胞系;Ralph等人,J.Exp.Med.143,1528(1976)所述的鼠组织巨噬细胞(J774A.1);以及Mbawuike等人,J.Leukoc.Biol.46,119(1989)所述的肺巨噬细胞系(MH-S)具有细胞毒性。
化学合成的4a和5a对已知存在于动脉粥样硬化病斑中的一系列细胞类型(白细胞,血管平滑肌和内皮细胞)具有细胞毒性。其结果显示于图6和表3中。
表3
细胞系 | 4a的IC50 | 5a的IC50 |
WIL2 | 10.9±1.6μM | 17.7±2.3μM |
Jurkat E6.11 | 15.5±1.7μM | 12.6±1.9μM; |
HAEC | 24.6±3.2μM | 18.2±1.9μM |
VSMC | 21.9±2.2μM | 29.8±2.8μM |
J774A.1 | 15.6±2.1μM | 26.1±2.8μM |
MH-S | 11.2±1.2μM | 13.6±1.1μM |
4a和5a对所有测试细胞系的IC50值均非常类似。此外,化合物4a和5a对所有测试细胞系的细胞毒性作用均非常类似。考虑到4a和5a之间显著的结构差异,这些结果令人意外。然而,4a和5a在上文所述的由细胞成分如氨基酸等促进的过程中彼此相当,4a和5a可在细胞毒性试验的时间段内彼此相当。因此,化合物4a和5a可在体内具有类似的细胞毒性。
通过类似的方法,本发明人已显示化合物6a,7a,7c,10a,11a和12a对白细胞细胞系具有细胞毒性,而seco-酮醛4a及其丁间醇醛加合物5a对神经细胞系具有细胞毒性。
臭氧和胆固醇的接近可得到细胞毒性的类固醇4a-6a,其在原位生成,可如上文所述通过促进内皮或平滑肌细胞损伤或通过引发粉瘤中炎症细胞凋亡而在病灶的进展中发挥作用。在前述动脉粥样硬化病斑的晶相中的胆固醇臭氧分解可导致病斑扰动,这被认为是动脉闭塞前的最终步骤。
实施例5:胆固醇臭氧分解产物促进泡沫细胞生成并改变LDL和载脂蛋白B100结构
可提高其致动脉粥样硬化性的对低密度脂蛋白(LDL)的修饰被认为是心血管疾病形成中的关键事件。D.Steinberg,J.Biol.Chem.272,20963(1997)。例如,可提高巨噬细胞通过CD36和其它巨噬细胞清道夫受体摄取LDL的对LDL,或载脂蛋白B100(apoB-100,LDL的蛋白成分)的氧化性修饰被认为是动脉粥样硬化症的发作中至关重要的致病事件。本实施例描述了一些实验,其显示胆固醇臭氧分解产物4a和5a能促进由巨噬细胞形成泡沫细胞并能修饰LDL和apoB-100的结构。
如实施例1所述在未激活鼠巨噬细胞(J774.1)的存在下孵育LDL(100μg/mL)与4a或5a。在暴露至4a或5a后这些巨噬细胞开始脂质加载且在反应容器中出现泡沫细胞(图7)。
此外,孵育人LDL(100μg/ml)与4a或5a可导致如圆形二色性检测测得的apoB-100时间依赖性的结构变化(图8B,C)。无4a和5a的总LDL圆形二色性分析显示LDL的二级机构在试验过程(48小时)中基本稳定(图8A)。如图8A所示,普通LDL的蛋白成分具有大比例的α螺旋结构(~40±2%)和少量的β结构(-13±3%),β转角(-20±3%)和无规则卷曲(27±2%)。然而,尽管与4a和5a孵育的LDL的光谱形状与天然LDL(图8B和C)有一定程度的相似性,但在二级结构上有明显的损失,该损失主要为α螺旋结构(4a~23±5%;5a~20±2%)和相应更高比例的无规则卷曲(4a~39±2%;5a 32±4%)。因此,该4a和5a胆固醇臭氧分解产物表现为可破坏LDL的结构完整性。
为修饰LDL结构,可在胆固醇臭氧分解产物4a和5a的醛部分与apoB-100赖氨酸残基的ε-氨基酸-侧基团之间产生共价反应以形成与丙二醛和4-羟壬烯醛与apoB-100的反应中观察到的化合物类似的Schiff碱或烯胺中间体。Steinbrecher等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,3883(1984);Steinbrecher等人,Arteriosclerosis 1,135(1987);Fong等人,J.Lipid.Res.28,1466(1987).该Schiff碱或烯胺中间体具有显著的寿命且可以将衍生化LDL转化成被巨噬细胞清道夫受体识别的形式。因此,在胆固醇臭氧分解产物4a和5a与apoB-100-LDL之间的共价反应可生成被巨噬细胞清道夫受体以更高的比率识别和摄取的衍生化apoB-100-LDL复合物,从而生成图7中所观察到的泡沫细胞。
仅知的含有醛成分的胆固醇氧化形式为4a和5a臭氧分解产物。因此,该种胆固醇衍生物与LDL/apoB-100之间的反应可提供迄今为止缺少的胆固醇,泡沫细胞形成动脉病斑形成之间的联系。因此在患者血流中臭氧分解产物4a和5a的高水平的检测为患者遭受动脉粥样硬化症的程度提供了直接的检测。
实施例6:针对胆固醇臭氧化产物的抗体
本实施例描述了可与胆固醇臭氧化和腙产物反应的针对具有式13a,14a或15a的半抗原的抗体。具有式13a,14a或15a的半抗原结构如下:
化合物13a为4-[4-甲酰基-5-(4-羟基-1-甲基-2-氧代-环己基)-7a-甲基-八氢-1H-茚-1基]戊酸。
方法
制备化合物13a,14a和15a的KLH缀合物。通过标准程序使用KLH缀合物免疫小鼠。从小鼠取出脾并分散以获得作为抗体生成细胞的脾细胞。
将该脾细胞和来自小鼠骨髓瘤的SP2/0-Agl4 cells(ATCCCRL-1581)共悬浮于无血清RPMI-1640培养基中(pH7.2),预热至37℃,从而分别得到3x104细胞/ml和1x104细胞/ml的细胞密度。将悬浮液离心收集沉淀物。在1分钟内向沉淀物滴入1ml含50w/v%聚乙二醇(pH7.2)的无血清RPMI-1640培养基,随后将所得的混合物在37℃下孵育1分钟。继续向混合物滴入无血清RPMI-1640培养基(pH7.2)以达到50ml的终体积,然后离心获得沉淀物。将沉淀物悬浮于HAT培养基中,并分成200μl的等分加入96孔板的微孔中。将微孔板在37℃下培养一周,最终形成约1200种杂交瘤类型。通过免疫测定分析杂交瘤上清液与胆固醇臭氧化产物的结合。
针对具有式15a的化合物的杂交瘤KA1-11C5和KA1-7 A6已于2003年8月29日参照布达佩斯条约的条款在美国菌种保藏中心(10801 University Blvd.,Manassas,Va.,20110-2209 USA(ATCC))保存,其ATCC编号为PTA-5427和PTA-5428。针对具有式14a的化合物的杂交瘤KA2-8F6和KA2-1E9已同样于2003年8月29日参照布达佩斯条约的条款在ATCC保存,其ATCC编号为PTA-5429和PTA-5430。
生成针对半抗原15a的KLH缀合物的单克隆抗体库KA1-7A6:6和KA1-11C5:6,以及针对半抗原14a的KLH缀合物的KA2-8F6和KA2-1E9。通过ELISA测定分析针对15a的单克隆抗体KA1-7A6:6和KA1-11C5:6对臭氧化产物5a和胆固醇半抗原3c的结合效价。还可通过ELISA测定分析KA2-8F6:4和KA2-1E9:4抗体(针对臭氧化产物5a)针对13b,14b和胆固醇半抗原3c的结合效价。
胆固醇半抗原3c的结构如下所示。
该ELISA测定按如下进行。将13a,14a,3c,13b,14b或15a的BSA缀合物分别添加入高结合96孔微量滴定板上(Fischer Biotech.)并在4℃下维持过夜。使用PBS充分洗涤平板并添加牛奶溶液(1%w/v溶于PBS,100μL)。将平板在室温下维持2小时并以PBS洗涤。将含有不同抗体制备的培养物以PBS系列稀释并取各稀释液50μL分别加入各行的第一个微孔。混合和稀释后,将平板在4℃下维持过夜。以PBS洗涤平板并添加山羊抗-小鼠辣根过氧化酶缀合物(0.01μg,50μL)。在37℃培养平板2小时。洗涤平板并添加底物溶液(50μL)3,3′,5,5′-四甲基联苯胺[0.1mg溶于10mL的醋酸钠(0.1M,pH6.0)和过氧化氢(0.01%%w/v)]。将平板在暗处显影30分钟。加入硫酸(1.0M,50μL)终止反应并在450nm下测定光密度。
所报导的效价为对应50%最大光密度的血清稀释物。使用Graphpad Prism v.3.0分析数据并报导至少两次测试的平均值。
结果
ELISA测试的结果见表4和表5。
表4:针对15a,臭氧化产物5a和胆固醇半抗原3c的抗15a抗体KA1-7A6:6和KA1 11C5:6结合效价
*通过针对15a,5a和3c的BSA缀合物采用ELISA测定效价。该绝对值为对应结合时50%最大吸收的抗体的组织培养上清溶液的稀释因子。
如表4所示,按上文测定的表观结合亲和力几乎相同。
表5:针对5a的抗体KA2-8F6:4和KA2-1E9:4对15b,14b和胆固醇半抗原3c的结合效价
抗体 | 15b | 14b | 3c |
KA2-8F6:4 | 32,000 | 32,000 | 16,000 |
KA2-1E9:4 | 64,000 | 64,000 | 16,000 |
*通过针对15b,14b和胆固醇半抗原3c的BSA缀合物采用ELISA测定效价。该绝对值为对应结合至13b,15b和胆固醇半抗原3c的BSA缀合物时50%最大吸收的抗体的组织培养上清溶液的稀释因子。
这些结果显示可生成针对胆固醇臭氧化产物的高亲和力抗体。
实施例7:检测胆固醇臭氧化产物的附加方法
本实施例阐述了胆固醇臭氧化产物可通过多种方法检测,包括通过将臭氧化产物上的自由醛基与荧光部分结合以及通过使用与这些臭氧化产物反应的抗体。
材料与方法
总体方法
除非另行指明,所有的反应均使用干燥试剂,溶剂和火焰干燥玻璃器具进行。除非另行说明,起始原料均购自Aldrich化学公司并直接使用购得物品。胆固醇-[26,26,26,27,27,27-D6]购自MEDICALISOTOPES,INC。快速柱层析使用硅胶60(230-400目)。胆固醇臭氧化产物4a和5a以及胆固醇臭氧化产物4a和5a的2,4-二硝基苯腙(分别为4b和5b)均按前述实施例中的方法合成。薄层层析(TLC)采用Merck(0.25mm)涂覆硅胶Kieselgel 60 F254平板并使用对甲氧苯甲醛染色进行显示。1H NMR光谱记录于Bruker AMX-600(600MHz)分光计。13C NMR光谱记录于Bruker AMX-600(150MHz)分光计。化学位移以δ标度表示为自外标的百万分之几(ppm)。
3β-羟基-5-氧代-5,6-seco胆甾烷-6-醛的丹磺酰腙(4d)。
将丹磺酰肼(50mg,0.17mmol)和对甲苯磺酸(1mg,0.0052mmol)添加入胆固醇臭氧化产物4a(65mg,0.16mmol)的乙腈(8ml)溶液。在室温下氩保护气氛中将反应混合物搅拌2小时,并在真空下蒸发干燥。将该残留物溶解于二氯甲烷(10ml)并用水(2x10ml)洗涤。使用硫酸镁干燥有机相并真空浓缩。以硅胶色谱[乙酸乙酯-己烷(1∶1;7∶3)]纯化粗品黄色油以获得作为几何异构体混合物的(顺式∶反式8∶92)标题化合物4d(70mg,68%):1H NMR(CDCl3)δ9.341(s,1H),8.567(d,J=8.4Hz,1H),8.358(dd,1=1.2,1.2Hz,1H),8.290(d,J=8.4Hz,1H),7.550(dd,J=8.4,7.6Hz,1H),7.539(dd,J=8.4,7.6Hz,1H),7.167(d,J=7.6Hz,1H),7.000(t,J=4.0Hz,0.92H反式),6.642(dd,J=6.8,2.8Hz,0.08H顺式),4.273(bs,1H),3.045(dd,J=13.6,3.4Hz,1H),2.869(s,6H),,2.233(d,1=13.6Hz,1H),2.097(dt,J=I8,4.4Hz,1H)51.162(s,3H),0.904(d,J=6.4Hz,3H),0.899(d,J=6.8Hz,3H),0.892(d,J=6.4Hz,3H),0.513(s,3H);13C NMR(CDCl3)δ209.66,151.77,149.49,133.52,131.20,130.99,129.64(2C)*,128.52,123.25,118.83,115.25,71.07,56.20,52.68,52.56,47.10,45.40,42.32,40.81,39.82,39.48,36.5 1,36.05,35.79,34.39,3 1.05,28.02,27.74,27.30,24.27,24.13,22.99,22.84,22.56,18.53,17.45,11.31;通过高分辨基质辅助激光解吸飞行时间质谱计算C39H59N3O4SNa(M+Na)的分子量为688.4118,测得分子量为688.4152;Rf 0.43[乙酸乙酯-己烷(7∶3)].*2C表示该信号被认为对应丹磺酰部分的两个碳信号(按照gHSQC的C0)。
3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾烷-6β-甲醛的丹磺酰腙(5c)。
向胆固醇臭氧化产物5a(30mg,0.072mmol)的四氢呋喃溶液(5ml)添加丹磺酰肼(25mg,0.08mmol)和盐酸(浓,0.05ml)。添加水(0.2ml)溶解立即形成的白色沉淀物。在室温下氩保护气氛中将均一反应混合物搅拌3小时,并在真空下蒸发干燥。将该红色残留物溶解于乙酸乙酯(10ml)并用水(2x10ml)洗涤。使用硫酸镁干燥有机相并真空浓缩。先后以硅胶色谱[乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶4-1∶1)]和制备HPLC(C18 Zorbax 21.22mm和25cm。100%乙腈)纯化粗品黄色油以获得作为几何异构体混合物的(顺式∶反式17∶83)标题化合物5c(14.5mg,30%):1H NMR(CDCl3)δ8.557(d,J=8.8Hz,1H),8.372(dd,J=7.2,1.2Hz,1H),8.300(d,J=8.8Hz,1H),8.084(s,1H),7.575(dd,J=8.8,7.6Hz,1H),7.554(dd,J=8.8,7.6Hz,1H),7.197(d,J=7.6Hz,1H),7.057(d,J=7.2Hz,0.84H反式),6.517(d,J=5.2Hz,0.16H顺式),4.229(m,0.17H顺式),4.004(m,0.83H反式),2.905(s,6H),2.379(bm,4H),1.913(dd,J=9.6,7.2Hz,2H),0.886(d,J=6.8Hz,3H),0.879(d,J=6.4Hz,3H),0.841(d,J=6.8Hz,3H),0.691(s,3H),0.393(s,3H);13C NMR(CDCl3)δ154.081,133.425,131.367,130.912,129.695,128.611,123.35O5 115.121,83.268,70.469,67.079,55.773,55.677,55.280,51.652,45.429,45.038,44.372,43.129,42.443,39.488,36.143,35.585,28.580,28.458,27.984,27.766,23.850,22.825,22.549,21.389,18.659,18.063,12.192;通过高分辨基质辅助激光解吸飞行时间质谱计算C39H59N3O4SNa(M+Na)的分子量为688.4118,测得分子量为688.4118;Rf 0.41[乙酸乙酯-二氯甲烷(1∶1)]。
3β-羟基-5-氧代-5,6-seco-[26,26,26,27,27,27-D6]-胆甾烷-6-醛(D6-4a)。
在-78℃下向5mL的D6-胆固醇(50mg,0.13mmol)的氯仿-甲醇(9∶1)溶液吹入臭氧的氧气混合物1分钟,此时该溶液转为浅蓝色。蒸发反应混合物并以醋酸-水(9∶1,2.5ml)中的Zn粉末(40mg,0.61mmol)在室温下搅拌3小时。以二氯甲烷(10mL)稀释该非均相混合物并以水(3x5mL)和盐水(5mL)洗涤。使用硫酸镁干燥有机相并蒸发。以硅胶色谱[以己烷-乙酸乙酯5∶1,3∶1和2∶1洗脱]纯化残留物并获得白色固体标题化合物(44mg,0.104mmol),产率:81%。1H NMR600MHz(δ,ppm,CDCl3):9.61(s,1H),4.47(s,1H),3.09(dd,1H,J=13.6Hz,4.0Hz),2.25-2.40(m,3H),2.15-2.19(m,1H),1.01(s,3H),0.88(d,3H,J=6.1Hz),0.67(s,3H).13C NMR 150MHz(δ,ppm,CDCl3):217.5,202.8,71.0,56.1,54.2,52.6,46.8,44.1,42.5,42.1,39.8,39.3,35.9,35.7,34.7,34.0,27.8,27.7,27.5,25.3,23.7,23.0,18.5,17.5,11.5.
3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾醇-[26,26,26,27,27,27-D6]-6β-甲醛(D6-5a)。向D6-4a(26mg,0.061mmol)的乙腈-水(20∶1,5ml)溶液添加L-脯氨酸(11mg)。在室温下将反应混合物搅拌2.5小时,并在真空下蒸发干燥。将该残留物溶解于乙酸乙酯(10ml)并用水(2x5ml)和盐水洗涤。使用硫酸镁干燥有机相并蒸发以得到分析纯的白色固体(26mg,0.061mmol,产率:100%),进行NMR分析。1H NMR 600MHz(δ,ppm,CDCl3):9.69(s,1H),4.11(s,1H),2.23(dd,1H,J=9.2Hz,3.0Hz),0.91(s,3H),0.90(d,3H,J-6.6Hz),0.70(s,3H);13CNMR 150MHz(δ,ppm,CDCl3):204.7,84.2,67.3,63.9,56.1,55.7,50.4,45.5,44.7,44.2,40.0,39.7,39.3,36.1,35.6,28.3,27.9,27.5,26.7,24.5,23.8,21.5,18.7,18.4,12.5.
4-(5-(4-羟基-1-甲基-2-氧代环己基)-7α-甲基-4-(2-氧代乙基)-八氢-1H-茚-1基]戊酸15a。参照对D6-5a的臭氧分解方法进行3β-羟基胆甾-5-烯-24-酸3c的臭氧分解。1H NMR 400MHz(δ,ppm,CDCl3):9.60(s,1H);4.47(s,1H),3.40(dd,J=13.6Hz,4Hz,1H);1.00(s,1H),0.91(d,J=6.4Hz,3H),0.67(s,3H).13C NMR 100MHz(δ,ppm,CDCl3):218.7,202.9,179.8,70.9,55.5,54.1,52.5,46.4,44.0,42.4,42.1,39.6,35.1,34.5,34.0,30.8,30.4,27.5,27.3,25.1,22.8,17.9,17.4,11.4.
胆固醇臭氧化产物萃取。
采用改良的Bligh和Dyer方法萃取血液和组织样本中的总脂质。参见Bligh EG,D.W.Can J Biochem Physiol 1959,37,911-17。将收集于含抗凝血剂柠檬酸盐或EDTA的采血器中并在4℃下储存的人血浆(200μL)添加入加盖玻璃管中的磷酸二氢钾(KH2PO4,0.5M,300μL)中。添加甲醇(500μL)然后将样本短暂涡旋。添加氯仿(1mL)并将样本涡旋2分钟,3000rpm离心5分钟并去除有机相。重复添加氯仿,涡旋和离心过程。合并有机相并在真空下蒸发干燥。从进行颈动脉内膜切除手术的患者获取动脉内膜切除术样本以考察常规指标。斯克里普斯绿色医院伦理委员会批准了本人体方案。样本在分析前被冷冻并储存在-70℃。为进行分析,将组织样本恢复至室温,然后使用组织匀浆机(Tekmar)在水缓冲液(KH2PO4,0.5M,1-2mL)中匀质化。将匀浆物添加至甲醇∶氯仿(1∶3,6mL)溶液并在3000rpm离心5分钟。收集有机相。向残留水混合相添加氯仿(6mL)并将样本离心(3000rpm,5分钟)。然后在真空下蒸发干燥合并的有机相。
萃取胆固醇臭氧化产物的丹磺酰肼衍生化和HPLC-分析。
将参照上文得到的浓缩血液或组织萃取物重悬浮于含丹磺酰肼(200μM)和H2SO4(100μM)的异丙醇(200μL)中并在37℃下培养48小时。该分析方法包括在连接了使用乙腈∶水的等度流动相(90∶10,0.5mL/min)的C-18 RP柱,并采用荧光检测(激发波长360nm,发射波长450nm)的Hitachi D-7000 HPLC系统进行HPLC分析。臭氧化产物5a的丹磺酰衍生物(5c)的保留时间(RT)约为8.1分钟。5a的肼衍生物(5b)的保留时间约为10.7分钟。采用Macintosh个人电脑和Prism 4.0软件通过参考标准品进行峰面积计算测定浓度。
气相色谱-质谱
将浓缩样本在二氯甲烷中重构至1mL并通过向浓缩病斑萃取物添加100uL嘧啶和含1%三甲基氯硅烷的100uLN,O-双(三甲基硅)-三氟乙酰胺进行甲硅烷基化。将样本在37℃下培养2小时,然后以旋转蒸发仪蒸发干燥。在分析前将各样本重悬浮于100uL二氯甲烷中。通过分流进样(Agilent 7673自动取样器)将2.5uL样品注入HP-5ms柱,30mx0.25mm IDx0.25um膜厚,流速1.2ml/min,注入器温度为290℃,温度程序起始于50℃,维持5分钟,然后以20℃/min的速度上升至300℃,维持12分钟。质量分析在Agilent5973型inert气质联用仪上进行,扫描范围50-700m/z,然后以选择离子监控(SIM)扫描m/z 354和360。MS quad温度为150℃,MS源温度为280℃。
半抗原15a与载体蛋白KLH和BSA的偶联
将1-乙基-3,3′-二甲氨基丙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC,1.5mg,0.008mmol)和磺基N-羟基丁二酰亚胺(1.8mg,0.008mmol)溶解于0.01mL H2O中并加入0.1mL半抗原(2.5mg,0.006mmol)的DMF溶液。涡旋混合物并在4℃下添加至BSA(5mg)的PBS缓冲液(0.9ml,0.05mM,pH=7.5)前在室温下放置24小时。将最终混合物在4℃下放置24小时并在-20℃下储存。以下描述了合成化合物15a的KLH或BSA缀合物的反应。
反应a涉及按如上所述以O3/O2臭氧分解化合物3c。反应b涉及以溶于DMF的EDC和HOBt过夜处理化合物15a并以BSA或KLH的pH7.4磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)孵育。
以标准方法进行单克隆抗体制备。使用每只小鼠10ug KLH-15a缀合物的50uL PBS溶液混合等体积的RIBI佐剂每3天一次共计5次腹腔注射免疫接种8周大的129GLX+小鼠。通过ELISA测定血清效价。30天后,最终在尾静脉处静脉注射(IV)50ug KLH-15a缀合物的100uL PBS溶液。处死动物并在3天后取出脾以进行融合。将免疫动物的脾细胞与RPMI培养基中的X63-Ag8.653骨髓瘤细胞5∶1混合,离心并在37℃下重新悬浮于1mL PEG 1500中。在3分钟内以9mL RPMI稀释PEG并在37℃下培养10分钟,然后离心,重悬浮于培养基中并涂布于15X96孔板上。通过ELISA筛选结合胆固醇臭氧化产物4a或5a但不结合胆固醇的抗体。将选定杂交瘤亚克隆2代以保证单克隆性。
制备ApoE敲除小鼠升主动脉的组织切片。
将样本在液氮中快速冷冻。取10微米切片并封固在载玻片上。然后将样本连续沉浸在1∶1乙醇∶二乙醚中20分钟,在100%乙醇中10分钟,并在95%乙醇中10分钟进行固定。以PBS洗涤后,使用针对胆固醇臭氧化产物的抗体的1∶200稀释液与组织培养1小时。以FITC标记的山羊抗-小鼠IgG(Calbiochem)的40∶1稀释液进行二次标记。使用Optronics microfire数码相机获取图像并以AdobePhotoshop进行处理。
结果
胆固醇臭氧化产物的丹磺酰腙的荧光检测。
如前述实施例所述,可通过经改良的K.Wang,E.W.A.Pryor,Steroids 58,225(1993)的化学研究中开发的分析方法体内测定胆固醇臭氧化产物。该改良方法包括使用一种有机溶剂(二氯甲烷,3x5mL)萃取匀质化病斑物质(~50mg湿重)的PBS(1mL,pH7.4)悬浮液,随后在室温下使用2,4-二硝基苯肼盐酸盐(DNPHHCl)(2mM溶于pH6.5乙醇溶液)的乙醇溶液处理有机可溶组分2小时。使用反相HPLC(直接注射,在360nm下紫外检测)和在线阴离子电喷雾质谱分析反应混合物中4b,4a和5b的2,4-二硝基苯腙(2,4-DNP)衍生物,5a的2,4-DNP衍生物的存在。该技术快速并具有很高的灵敏度。然而,当其应用于生物学样本时具有一些局限。这些局限包括其它在360nm下具有紫外吸收的生物化合物的干扰,在结合反应中4b向5b的转化,以及在低浓度胆固醇臭氧化产物时结合反应效率的下降。
因此可对新方法进行测试以确定是否能够提高分析灵敏度。该方法包括将胆固醇臭氧化产物与具有荧光发色团的肼结合,并进行荧光检测和HPLC分析。所选的荧光发色团为丹磺酰基团。该测试包括如上所述在酸性条件下用丹磺酰肼衍生化萃取的胆固醇臭氧化产物。丹磺酰肼与胆固醇臭氧化产物4a反应的产物为4d,如下所示。
丹磺酰肼与胆固醇臭氧化产物5a反应的产物为5c,如下所示。
丹磺酰肼衍生物的反应效率可通过一系列溶剂进行评估,例如己烷,甲醇,氯仿,四氢呋喃,乙腈,以及异丙醇(IPA)。通过该分析可确定就反应效率和胆固醇臭氧化产物4a羟醛缩合为5a的最低自发羟醛缩合率而言IPA为最佳溶剂。该反应效率可通过HPLC采用化学合成的丹磺酰腙标准4d和5c进行定量(图9)。在37℃下的IPA中以丹磺酰肼(200μM)和硫酸(100μM)衍生化胆固醇臭氧化产物4a48小时生成保留时间(RT)约为11.2分钟的4a腙衍生物4d的衍生化效率为86.0±8.0%。重要的是,在衍生化过程中4a或4d的羟醛缩合仅生成1.3%的5c。在5a的浓度范围介于0.01-100μM时5a转化为其丹磺酰腙衍生物5c(RT~19.4分钟)的转化效率为83±11%。丹磺酰-腙4d和5c的灵敏度水平为~10nM。
为测定4a和5a胆固醇臭氧化产物从血浆样本萃取和衍生化的效率,在人血浆样本中补充5a,然后萃取并与2,4-DNP或丹磺酰肼结合。各方法测得的缀合腙数量并无明显差别;37.5±1.9%被衍生为丹磺酰腙5c且31±8.9%被回收为2,4-DNP腙5b。
带有在线质谱的同位素稀释气相色谱(ID-GCMS)。
目前多数在富胆固醇组织如血液(血浆)和粥样硬化动脉中检测氧化型胆固醇的分析方法均基于具有火焰离子化检测(FID)或选择离子检测(SIM)的GC。SIM相比FID法的优势在于检测的特异性。在生物基质中分析氧化型胆固醇要求该种特异性。SIM策略的关键点在于内标的使用。最常用的是5α-胆甾烷。参见Jialil,I.;Freeman,D.A.;Grundy,S.M.Aterioscler.Thromb.1991,11,482-488;Hodis,H.N.;Crawford,D.W.;Sevanian,A.Atherosclerosis 1991,89,117-126。然而,使用氘标记内标的GC-MS为优选方法,因为它具有较高的灵敏性和特异性,并且它可对不同分析物的不同回收进行校正。Dzeletovic,S.;Brueuer,O.;Lund,E.;Diszfalusy,U.AnalyticalBiochem.1995,225,73-80。氘内标具有双重作用。首先,它们支持通过同位素丰度和浓度之间的关联进行定量。其次,在萃取过程前添加已知数量的氘化分子可支持评估胆固醇臭氧化产物萃取的效率。Leoni,V.;Masterman,T.;Patel,P.;Meaney,S.;Diczfalusy,U.;I.J.Lipid.Res.2003,44,793-799.
如下所示,六氘化胆固醇臭氧化产物D6-4a和D6-5a可从[26,26,26,27,27,27-D]-胆固醇(氘化3c)制备而得。
在合成的第一步(a),在78℃下向D6-3c的氯仿-甲醇溶液(9∶1)吹入臭氧以生成D6-4a。在第二步(b)中,D6-4a被溶解于DMSO并与脯氨酸在室温下反应2.5小时以生成D6-5a。
D6-4a和D6-5a被用作测试室内Agilent GC/MS上的GC/MS法灵敏度的内标。在典型的方法中通过在37℃下氩气中用嘧啶和BSTFA处理标准胆固醇,4a,5a,D6-胆固醇,D6-4a和D6-5a 2小时,将其转化成为它们的三甲基硅醚。在去除挥发物(真空下)后将残留物溶解于二氯甲烷并转移进入自动取样器小瓶。
然后在耦联至5973 Inert MSD的Agilant Technologies 6890 GC(带有分流/不分流进样口系统和7683自动注射组件)上进行GC-MS分析。在全离子扫描模式下运行质谱。观察到的保留时间(RT)和M+离子如下:臭氧化产物4a和5a(RT=29.6min,M+354);D6-4a和D6-5a(RT=29.6min,M+360);胆固醇(RT=27.2min,M+329);D6-胆固醇(RT=27.2min,M+335)。胆固醇臭氧化产物4a和5a在GC-MS中的推导碎裂如下所示。
如上所示,胆固醇臭氧化产物4a和5a均产生约M+354的碎片。氘化(D6)4a和5a胆固醇臭氧化产物产生约M+360的碎片。
因此,在GC-MS测定中未观察到胆固醇臭氧化产物4a和5a的区别,这可能是由于胆固醇臭氧化产物4a在硅烷基化步骤中转化为5a。因此,M+354(或360)的数量即是对标准4a和5a胆固醇臭氧化产物浓度的量度。354离子峰的面积与浓度呈线性且对胆固醇臭氧化产物测得的较低水平的灵敏度目前为止为10fg/μL(等于对前述实施例中描述的LC/MS测定检测限的估计为2-log的上升)。
该GCMS测定通过从临床切除的颈动脉病斑物质中萃取胆固醇臭氧化产物得到了进一步的验证。使用组织匀浆机将从进行颈动脉内膜切除手术的患者获取的供常规分析的颈动脉内膜切除组织(n=2)匀质化10分钟(氩气氛围下)然后萃取进入CHCl3/MeOH。参考上文将萃取物硅烷化,然后进行GC-MS分析(图10和11)。离子丰度相对时间的GC-MS迹线显示存在许多尚待确定的氧化型胆固醇。然而,对组合的臭氧化产物4a和5a(RT=22.49min)可以清楚确定。
这些数据明确支持了从生物样本中萃取并使用GC-MS分析4a和5a胆固醇臭氧化产物的总体可行性并验证了前述实施例中对动脉粥样硬化病斑物质分析所描述的结果。
胆固醇臭氧化产物4a-5a的免疫组化定位
如上所述,以胆固醇臭氧化产物4a的类似物化合物15a的KLH缀合物对小鼠免疫接种。通过杂交瘤方法生成单克隆抗体。两种鼠单克隆抗体11C5和7A7具有对胆固醇臭氧化产物5a的高结合亲和力<1μM以及对胆固醇的出色特异性(少1000倍亲和力)。
针对4a类似物的半抗原的抗-5a抗体的生成并不令人惊奇,因为如上所示向血液添加胆固醇臭氧化产物4a可导致其迅速转化为5a。
以抗体11C5和FIFC标记的抗IgG第二抗体对冷冻固定的ApoE缺陷小鼠大动脉切片的免疫组化染色与以非特异性鼠抗体染色的连续切片的比较证明胆固醇臭氧化产物5a定位于动脉粥样硬化区域的脉管的内膜下层中。可溶胆固醇对抗体的吸收不会消除内膜下的荧光。
实施例8:胆固醇臭氧分解产物的进一步致动脉粥样硬化作用
本实施例提供的数据显示胆固醇臭氧分解产物4a和5a为在LDL存在下促进该位点募集巨噬细胞的趋药剂。本实施例还显示胆固醇臭氧化产物4a和5a在LDL存在下上调A类清道夫受体(SR-A)在巨噬细胞中的表达,同时上调内皮细胞吸附分子中E-选择素的表达。此外,本发明显示了臭氧分解产物5a(而非4a)诱导单核细胞分化成为巨噬细胞。
材料与方法:
除非另行指明,所有反应采用干燥试剂,溶剂和火焰干燥的玻璃器具在惰性气体中进行。所有的起始原料均购自Aldrich,Sigma,Fisher或Lancaster并直接使用购得物品。所有的快速柱层析均使用硅胶60(230-400目)。制备薄层层析(TLC)采用Merck(0.25,0.5或1mm)涂覆硅胶Kieselgel 60 F254平板,胆固醇臭氧分解产物4a(3β-羟基-5-氧代-5,6-seco胆甾烷-6-醛)和胆固醇臭氧分解产物5a(3β-羟基-5β-羟基-B-降胆甾烷-6β-甲醛)参照前述方法合成。
氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)可通过在37℃下用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐溶液透析5μM CuSO4中的LDL(CalBiochem,La Jolla,CA)12小时生成。脂质过氧化反应可通过测定硫代巴比妥酸反应性物质的生成进行评估。以2等分溶于0.06 N HCl的3.8%(w/v)三氯乙酸,0.1%2-硫代巴比妥酸,以及0.2等分的0.625mM SDS处理反应混合物,然后加热至95℃30分钟。冷却后,以100μL正丁醇萃取样本两次并在532nm下检测萃取物的吸收。通过酸处理生成丙二醛的丙二醛双(二甲基缩醛)被用做标准。
细胞培养:
HAAE-1人主动脉内皮细胞系(CRL-2472),J774A.1鼠组织巨噬细胞系(TIB-67),以及单核细胞系U-937组织细胞淋巴瘤(CRL-1593.2)和THP-1急性单核细胞白血病(TIB-202)均从ATCC获得。参见Nichols等人(1987)J.Cell.Physiol.132:453-62;Ralph等人(1976)J.Exp.Med.143:1528-33;Tsuchiya等人(1982)Cancer Res.2:1530-36;Sundstrom,C.& Nilsson,K.(1976)Int.J.Cancer 17:565-77。所有的细胞系均在含有10%胎牛血清(FCS)的ATCC推荐培养基中培养。细胞在具有5或7%CO2的可控气氛下于37℃培养。如实施例1所述,从细胞释放的乳酸脱氢酶被用于测定胆固醇臭氧化产物的细胞毒性。
胆固醇臭氧化产物定位:
将J774A.1细胞涂布于8孔腔室玻片中(Nalge NuncInternational)。在暴露至以无FCS培养基(DMSO最终浓度0.05%v/v)稀释的50μM胆固醇臭氧化产物5d或5e的丹磺酰衍生物,丹磺酰胆固醇衍生物9c或9d,或丹磺酰肼前5分钟或1小时以pH7.4的PBS轻柔洗涤细胞两次。
抽吸去除培养基并立即在95%冰冷甲醇中固定细胞5分钟。将细胞封固在含Antifade试剂(Molecular Probes)的甘油中。使用配备了与Olympus IX_70倒置式显微镜连接的Photometries CH350L液冷式CCD相机的DeltaVision Deconvolution显微镜(API,IssaquahWA)记录荧光图像。这些数据通过60x油浸物镜(NA 1.4)以及(激发)DAPI 360/40和(发射)457/50滤光器组合采集。所有的图像使用DeltaVision软件(softWoRx,v2.5)的约束性迭代算法进行去卷积。该去卷积图像以softWoRx,v2.5进行后续处理。
在一些试验中,鼠巨噬细胞RAW 264.7(ECACC 91062702)在37℃和5%CO2下在含有10%FCS的RPMI(Gibco)中培养。为进行荧光成像,将细胞于6-孔腔室平板(Costar)的盖玻片上培养12小时,以pH7.4的PBS轻柔洗涤3次,并在含10%FCS的RPMI中与50μM胆固醇臭氧化产物5d或5e的丹磺酰衍生物,丹磺酰胆固醇衍生物9c或9d培养5,15,30,和60分钟。然后将丹磺酰衍生物添加于DMSO溶液[最终DMSO,0.05%(v/v)]。抽吸去除培养基,并用PBS洗涤细胞两次,然后在多聚甲醛(3.7%于PBS中)中固定10分钟。使用MOWIOL 4-88(Calbiochem)封固盖玻片。通过倒置式ZeissAxioscope 2 Plus荧光显微镜进行显微观察,并通过采用Axiovision软件(3.1版)的Axiocam数码相机获取图像。通过63x油镜和DAPI(激发360/发射460)滤光器获取数据,并以Axiovision软件和Adobe软件(Photoshop 6.0)处理图像。
清道夫受体表达:
细胞表面CD36和SR-A可通过流式细胞仪采用CD36(BDBiosciences Pharmingen,San Diego,CA)和CD204(Serotec,Oxford,UK)特异性单克隆抗体进行测定。参见Liao等人(2000)Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.20:1968-75;Hu等人(1996)Blood87:2020-28。将鼠巨噬细胞J774A.1在含0.5%BSA的培养基中血清饥饿过夜。然后将用胆固醇臭氧化产物或胆固醇臭氧化产物和LDL的复合物处理指定时间的细胞(1x106)以PBS洗涤两次。通过刮取收集细胞后,以6%的多聚甲醛固定20分钟。然后重悬浮于含2%热灭活FCS,0.05%NaN3以及适当的第一抗体,抗体缀合物或同型对照(1∶100稀释)的PBS中,并在冰上培养30分钟。CD36或SR-A的表达分别通过CD36(BD Biosciences Pharmingen,SanDiego,CA)和CD204(Serotec,Oxford,UK)特异性单克隆抗体进行测定。洗去第一抗体后,添加第二抗体,再次洗涤细胞,然后以FACScalibur 2(Becton Dickinson,Sparks,MD)流式细胞仪和CellQuant软件进行分析。其结果表示为平均荧光强度±至少两次测定的平均(SEM)的标准误差。显著性可通过学生双尾t-检验测定,相对对照而言(*)指p<0.05,而(**)指p<0.01。
趋化性和侵入分析采用改良的Boyden小室迁移分析进行测定。Zwirner等人(1998)Eur.J.Immunol.28:1570-77;Wilkinson(1988)Methods Enzymol.162:38-50。该测定在带有无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜(5μm孔径)的MultiScreen-MIC平板(Millipore,Billerica,MA,USA)上进行。洗涤细胞(鼠巨噬细胞J774A.1)并以1x106细胞/ml重悬浮于含0.2%BSA的无血清DMEM中。向微室的上部微孔中添加50微升的细胞,并在下部微孔中添加150μl溶于DMEM/0.2%BSA中的趋化蛋白。在37℃下于8%CO2的氛围中培养4小时。从膜的上侧去除细胞后,通过染色和相差显微术,或荧光显示下侧的细胞。使用DiffQuik染色试剂盒(Dade Behring,Newark,DE)对吸附在膜上的细胞染色。各试验均以一式三份进行,并在X200下的5个视野中计算迁移细胞的数量。用PBS洗涤以PBS-EDTA收集进行荧光标记的细胞两次,然后重悬浮于含钙黄绿素(5μM)的无血清培养基中。在轻柔间歇混合下培养细胞30分钟(37℃,5%CO2)。将钙黄绿素标记的细胞洗涤两次,并使用SPECTRAmaxTM GEMINI双扫描微板分光荧光计测定钙黄绿素荧光(激发=390nm,发射em=460nm)。将荧光测定与通过将细胞稀释于100μl PBS/BSA中并分配入96孔板所生成的标准曲线进行比较。按如上所述对荧光进行定量。
内皮吸附分子表达:
内皮细胞表面吸附分子表达通过ELISA使用抗人CD54(ICAM-1),CD106(VCAM-1)和CD62E(E-选择素)抗体(LeincoTechnologies,Inc.,St.Louis,MO)进行测定。该ELISA方法可从前述方法改良而得。Ng等人(2003 J.Am.Coll.Cardiol.42:1967-74;Khan(1995)J.Clin.Invest.95:1262-70;Huang等人(2004)Carcinogenesis 25:1925-34。将生长于96孔板中的HAAE-1细胞暴露至媒介,LDL(1-3nmol/mg蛋白),CuOx-LDL(TBARS,80-100nmol/mg蛋白),胆固醇臭氧化产物4a或5a(25μM/LDL)适当的时间并以PBS洗涤一次。
将细胞与针对VCAM-1,E-选择素,或ICAM-1的并以1∶400稀释于含5%FCS的PBS的抗体在37℃下培养30分钟。以PBS洗涤微孔两次,然后以PBS/5%FCS中的辣根过氧化酶(HRP)结合的山羊抗小鼠IgG(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,AL,USA)在37℃下培养30分钟。以PBS洗涤微孔四次,然后以H2O2/3,3′,5,5′-四甲基-对二氨基联苯过氧化酶底物(Pierce Chemical,Rockford,IL,USA)在暗处培养30分钟。通过添加25μl的8N H2SO4终止反应,并用读板仪读取平板,以仅用第二抗体染色的微孔作为空白。各测定均一式三份,数据表示为媒介表达水平百分比的平均±SEM。为研究胆固醇臭氧化产物5a浓度(5-50μM)对E-选择素表达的作用,以上述相同方式进行测定,其中各点为至少双重测试的平均±SEM。
单核细胞形态变化
将悬浮液中的THP-1单核细胞涂布于8孔腔室玻片中。将细胞与媒介(DMEM和0.4%DMSO),胆固醇,7-酮基胆固醇(7-KC),或胆固醇臭氧分解产物4a或5a(12和25μM)进行培养,并在37℃下的7天培养期中检查形态变化。4天后对含适当处理化合物的培养基进行替换。处理4天后,以相差显微术评估吸附细胞的形态变化并用Olympus Microfire数码相机摄像。
统计学分析:
在各案例中均在Microsoft EXCEL软件中使用双尾,成对学生t-检验对数据进行统计学分析。P≤0.05的值可认为具有显著性。所给的数据表示平均±标准误差。
结果与讨论
前述实施例显示以胆固醇臭氧分解产物4a和5a与低密度脂蛋白(LDL)处理的培养巨噬细胞具有与大量脂质负荷相关的泡沫细胞形态。为进一步考察该现象并深入了解胆固醇臭氧化产物内在化的过程,可用丹磺酰化胆固醇臭氧化产物4e,5d,5e或9c处理巨噬细胞,然后进行荧光显微检查。丹磺酰胆固醇臭氧化产物4e,5d,5e或9c如上所示。
这些试验揭示仅5分钟后在巨噬细胞胞液中胆固醇臭氧化产物明显积累(图12A)。暴露1小时后出现明显的核周定位(图12B)。
即使不与LDL复合时胆固醇臭氧化产物4a和5a也被巨噬细胞有效摄取。该种非LDL依赖性摄取可能在体内特别相关,因为在胆固醇臭氧化产物可在缺乏功能性LDL的胞外区域(例如该情况下为在动脉粥样硬化症患者动脉的动脉内膜中)生成的情况下,这些分子仍可能通过非受体依赖途径在细胞中积累,因此对巨噬细胞功能具有胞内作用。此外,丹磺酰化胆固醇臭氧化产物5e最初的点状胞内积累,及随后在细胞中的核周增长提示5e未被酯化并储存在可定位于整个胞浆的脂滴中。
不管胆固醇臭氧化产物通过胆固醇胞外氧化生成或是在巨噬细胞中生成并在坏死时释放,该化合物的摄取可影响巨噬细胞下游功能。此外,胆固醇臭氧化产物先在胞浆积累,而后在细胞中增长提示存在一种通过一些尚为未知的机制与胆固醇普通内体循环的扰乱相联系的脂质负荷机制。Ridgway等人(1992)J.Cell.Biol.116:307-19;Johansson等人(2003)MoI.Biol.Cell.14:903-15.
A类清道夫受体(SR-A)和CD36是负责巨噬细胞内在化修饰LDL和氧化型胆固醇的主要表面受体。Huh等人(1996)Blood 87:2020-28;Nicholson等人(2001 Ann.N.Y.Acad.Sci.947:224-28;Kunjathoor等人(2002)J.Biol.Chem.277:49982-88.两种受体均在ox-LDL的存在下受到上调。然而,在乙酰化-LDL存在下SR-A上调的程度高于CD36。Yoshida等人(1998)Artioscler.Thromb.Vase.Biol.18:794-802;Han等人(1997)J.Biol.Chem.272:21654-59;Nakagawa等人(1998)Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.18:1350-57.
如间接流式细胞仪(图13)和细胞溶解产物免疫印迹测得,以LDL与胆固醇臭氧分解产物4a或5a处理J774A.1巨噬细胞可导致SR-A的显著上调(约3倍,P<0.05)。然而当胆固醇臭氧化产物与LDL复合时未观察到LDL受体(CD36)的明显上升。以CuOx-LDL(TBARS,50-75nmol/mg蛋白)处理J774A.1巨噬细胞可导致CD36(相对天然LDL约4倍上升)和SR-A(相对天然LDL约3倍上升)的同时显著上调。相反的,以胆固醇臭氧分解产物4a或5a在LDL缺失的情况下处理培养巨噬细胞并不提高两者中任一受体的表达。
SR-A和CD36是负责巨噬细胞内在化修饰LDL和氧化型胆固醇的主要表面受体。据显示在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的存在下两种表面受体均得到上调(Yoshida等人Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.18:794-802(1998);Han等人,J.Biol.Chem.272:21654-21659(1997))。然而,在乙酰化LDL存在下SR-A上调的程度高于CD36(Nakagawa等人,Arterioscler.,Thromb.,Vase.Biol.18:1350-1357(1998)。因此,在巨噬细胞中响应胆固醇臭氧化产物4a或5a复合LDL处理的SR-A而非CD36的上调揭示了与乙酰化-LDL高度类似的推定Schiff碱LDL-臭氧分解产物缀合物的内在化途径。
这些数据显示臭氧分解产物5a在LDL缺失的情况下于巨噬细胞的胞浆中快速积累(图12A)。此外,该数据还显示臭氧分解产物4a或5a在LDL存在时可导致SR-A的上调,而当LDL缺失时未导致上调(图13)。综合这些数据揭示了臭氧分解产物4a或5a依据其是否与LDL复合能够通过两种完全不同的机制进入巨噬细胞。不与LDL复合时,臭氧分解产物4a或5a可通过被动扩散进入巨噬细胞,而当与LDL复合时,臭氧分解产物4a或5a可通过表面受体介导途径进入。
如通过Boyden小室迁移分析测得的结果(0-25μM,P<0.001;图14A和14B),臭氧分解产物4a或5a均能刺激巨噬细胞的剂量依赖募集。有趣的是,当臭氧分解产物4a或5a与天然LDL复合时未出现巨噬细胞的显著迁移(100μg/ml;TBARS,1-4nmol/mg蛋白)。然而,当臭氧分解产物4a或5a与BSA迁移共培养时仍出现了巨噬细胞迁移。LDL而非BSA对胆固醇臭氧分解产物诱导的巨噬细胞迁移的抑制进一步支持了臭氧分解产物4a或5a与LDL的复合物与氧化修饰LDL以类似方式作用这一结论。该结论可通过显示氧化LDL积累时巨噬细胞不能迁移的数据得到支持。(Parthasarathy等人(1988)Basic Life Sci 49:375-80;Quinn等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2995-98)。
众所周知巨噬细胞复制较慢;因此,为在炎症位点提高局部组织水平,可使用一系列在炎症位点提高白细胞积累的天然存在的趋药剂,例如,单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)或白细胞三烯B4(LTB-4)。巨噬细胞为目前为止在动脉粥样硬化症进展和最终血栓形成阶段的动脉粥样硬化症患者动脉中存在的主要白细胞。因此,臭氧分解产物4a或5a募集巨噬细胞的能力可从多种途径影响动脉粥样硬化形成。首先,已存在于动脉壁中的巨噬细胞可被募集至已胞外生成胆固醇臭氧分解产物的位点,从而导致在病斑中出现已知存在于不稳定病斑边缘的高白细胞密度区域。此外,含有高水平胆固醇臭氧分解产物的巨噬细胞可能会坏死,从而释放胆固醇臭氧分解产物并进一步向炎症病灶募集巨噬细胞。最后,该胆固醇臭氧分解产物可以从动脉壁的脆弱部位扩散,该可能性可通过人动脉粥样硬化症患者血浆中臭氧分解产物5a的存在得到支持。这些现象将形成一个趋化蛋白形成、巨噬细胞趋化性、募集和激活、导致进一步的趋化蛋白形成的循环。该过程可充分促进动脉粥样硬化病灶的形成和进展。
以臭氧分解产物4a(25μM)在LDL的存在下处理血管内皮细胞(HAAE-1)单层可刺激吸附分子内皮E-选择素表达相对媒介对照大于4倍的上调(P<0.05,图15)。与之相反,整合素水平,血管细胞吸附分子(VCAM)-1和胞间吸附分子(ICAM)-1则保持不变。臭氧分解产物4a对E-选择素水平的诱导具有剂量依赖性,其水平上升可从1.25μM臭氧分解产物4a时的2倍到50μM atheronal-A时的约8倍(图15B)。该种E-选择素上调作用,以及对整合素表达作用的缺失与对CuOx-LDL所观察到的情况相同[(TBARS,80-100nmol/mg蛋白),p<0.005]。内皮细胞与臭氧分解产物5a和LDL的培养可导致E-选择素水平相对于媒介对照的上调(1.8倍),这与天然LDL观察到的情况类似(约上升3倍,多次试验,每个测验一式三份,图15)。给用臭氧分解产物4a或5a(不与LDL复合),胆固醇(数据未显示),或媒介可导致对选择素或整合素表达均无作用。
假定臭氧分解产物4a与LDL复合时会引起E-选择素上调显著的剂量依赖性的上升,然后通过荧光光谱法对细胞-细胞吸附进行评估。这些试验揭示臭氧分解产物4a或5a,单独或与LDL复合,或CuOx-LDL与单独的LDL相比,均未显著提高培养的U-937单核细胞与内皮细胞单层的结合。当同时考虑与LDL复合的臭氧分解产物4a和5a对主动脉内皮细胞吸附时,它们与CuOx-LDL的情况高度类似(Khan等人(1995)J.Clin.Invest.95:1262-70;Vielma等人(2004)J.Lipid Res.45:873-80)。选择素上调作用、对整合素表达没有作用且对单核细胞与内皮细胞的平衡结合没有显著提高这些情况与白细胞-内皮的弱相互作用的诱导相一致,并且是诱导白细胞滚动而非严格吸附的经典模型(Charo等人,J.Biol.Chem.262:9935-9938(1987)一种在炎性动脉疾病早期重要的生物作用。
以前工作显示氧化型胆固醇7-酮基胆固醇,7-羟基胆固醇和22(R)-羟基胆固醇可以诱导单核细胞分化,而其它如25-羟基胆固醇则不能诱导(Hayden等人(2002)J.Lipid Res.43:26-35)。因此对臭氧分解产物4a或5a的单核细胞分化作用进行了检验。
针对胆固醇5,6-seco甾酮对培养的人单核细胞THP-1细胞分化作用的初始研究显示这些来自于悬浮液的细胞在臭氧分解产物5a处理24-48小时后开始聚集成簇。当暴露至臭氧分解产物5a(12.5和25μM)更长时间时,一些细胞群体开始吸附。在7天培养中,该吸附THP-1细胞显示肥大,发育细胞质液泡,并形成伸展过程,这些均为成熟巨噬细胞的特征(图16G-H)。臭氧分解产物5a对THP-1分化的这些作用在范围和时限上均与7-KC(25μM,图16C-D)的阳性对照严格类似。相反的,以单独媒介(数据未显示),胆固醇(25μM,图16A-B),或臭氧分解产物4a(25μM,图16E-F)处理的THP-1细胞既未吸附也未形成前述的形态变化。因此,臭氧分解产物5a,特别当其与天然存在的募集单核细胞的趋化因子如MCP-1结合时的分化活性可在炎性动脉壁中提高功能性巨噬细胞的数量。
臭氧分解产物5a诱导的THP-1细胞分化与人单核细胞体外分化发生于相同的时间进程内,THP-1细胞衍生的巨噬细胞通常需要4-7天时间进行发育。此外,引起确定的THP-1细胞分化的臭氧分解产物5a的浓度25μM(10.4μg/mL),与THP-1细胞分化所需的氧化型胆固醇7-KC具有相同的量级,从而提示它们在这一方面彼此相当(Hayden等人,J.Lipid Res.43:26-35(2002))。臭氧分解产物5a诱导巨噬细胞分化的机制尚不清楚。然而,基于细胞吸附和形态变化的诱导相对缓慢这一事实,一种包括细胞因子诱导和释放的机制便显得比较合理。据显示包括7-KC在内的其它氧化型胆固醇能够在分化缓慢时在其它血管细胞中生成促炎性因子,例如单核细胞集落刺激因子(M-CSF)以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。臭氧分解产物5a可引发单核细胞分化为巨噬细胞而臭氧分解产物4a无此作用这一事实揭示尽管胆固醇臭氧分解产物具有相同的化学组成和类似的结构,它们可以表现为截然不同的分子种类。
研究揭示氧化型胆固醇以高于病斑整体水平数倍的水平在泡沫细胞中得到聚集。据显示氧化型胆固醇可以约总胆固醇1%的水平存在于动脉粥样硬化病斑和从人动脉粥样硬化病斑中分离的泡沫细胞中(Brown等人J.Lipid Res.38:1730-1745(1997))。对于胆固醇臭氧化产物,患有动脉粥样硬化的动脉中与胆固醇相关的绝对浓度目前尚未确定。然而,如前面的实施例所述,臭氧分解产物5a的血浆水平可在20-500nM变化(在健康患者和患有晚期颈动脉疾病的患者群组中)。基于已知氧化型胆固醇的总体水平,在粥样硬化动脉中的臭氧分解产物水平可能明显更高。本实施例中所进行的实验集中关注介于3-25μM的臭氧分解产物浓度范围,该浓度范围被认为更能反映动脉粥样硬化病斑和泡沫细胞中发现的水平而非均衡血浆水平。由于所有进行的研究不是考察在病斑物质内引发的作用(例如直接或通过巨噬细胞表面受体上调摄取入巨噬细胞以及单核细胞分化为组织巨噬细胞),便是由病斑物质向密切相关的细胞(例如血管内皮细胞)泄漏臭氧分解产物所引发的作用,因而该水平被认为是有效的。
因此该实施例证明了存在于动脉粥样硬化病斑物质中的胆固醇臭氧分解产物4a或5a具有可显著影响动脉粥样化形成和动脉粥样硬化症进展的生物作用。臭氧分解产物4a或5a促进巨噬细胞通过趋化性和内皮吸附分子上调向血管组织募集。此外,这些臭氧分解产物引发单核细胞向巨噬细胞分化,并通过清道夫受体摄取臭氧分解产物修饰的LDL引发巨噬细胞泡沫细胞形成。此外,胆固醇臭氧化产物4a和5a通过非受体依赖过程进入巨噬细胞。所有这些由胆固醇臭氧化产物诱导的作用均是炎性动脉疾病发展过程中的关键病理作用。
本发明人在其它实施例中显示了激活炎性细胞可导致臭氧分解产物4a或5a在离体粥样硬化动脉中的快速生成然而臭氧分解产物4a或5a也可能部分通过肺暴露至来自环境污染的臭氧长期生成。同样地,臭氧分解产物4a或5a可能是已知的环境污染和心血管疾病之间联系中的一种迄今为止未被认识的化学作用物。
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此处参考或提及的所有专利和出版物均表明本发明所属领域的技术人员的技术水平,且各参考专利或出版物据此引用的水平等同于将其单独全文引用或在此全文阐述。申请人保留将引用的任何专利或出版物中的任意或所有材料和信息物理引入本说明书的权利。
此处所述的特定方法和组合物为优选实施例的代表,且为示范性,并无意限制本发明的范围。其他对象,方面和实施例可由本领域技术人员在考虑本说明书的基础上获得,且它们包含在本权利要求书范围所定义的本发明的精神之内。本领域技术人员将显而易见的了解可对本发明在此披露的内容进行各种替换和修改而不脱离本发明的范围和精神。本发明在此所作的示范性描述可在此处未特别披露为要素的任何元素,限定的缺失下进行适当实施。此处示范性描述的方法和程序可通过不同的步骤顺序进行适当实施,且它们并非必然限定于此处或权利要求书中指出的步骤顺序。除非另行明确指明,本说明书和权利要求书所用的单数形式“一个”,“一种”和“该”包含了复数对象。因此,例如“一种抗体”包括了复数量(例如,一种抗体溶液或一系列抗体制备)的该种抗体。任何情况下本发明均不得解释为限定于此处披露的特定范例或实施例或方法。在任何情况下本发明均不得解释为受专利商标局的任何审查员或者其他官员或雇员的任何声明所限定,除非该申明是由申请人在书面回复中具体的不加限定和保留明确采纳。
此处所用的术语和表达方式用作描述的术语而非限制,且该术语和表达方式的使用并不排除与所显示或描述相等同的特征或部分等同的特征,但应认识到在本发明所主张的范围内可能进行各种修改。因此,应当认识到尽管本发明已通过优选实施例和可选特征进行了具体披露,本领域的技术人员可对此所披露的概念进行修改和变更,且该种修改和变更被认为在权利要求定义的本发明所披露的范围之内。
此处已对本发明作了广泛和一般的描述。落在普通披露范围内的更小的种类和亚属群组同样构成该发明的一部分。这包括了带有从上位概念中去除任何主题的条件或否定限制的对发明的一般描述,而不论其中是否明确列举了该离体材料。
其它实施例在之后的权利要求之内。此外,对于发明中根据马库什组的形式描述的功能和部分,本领域中受教育人员可以认识到本发明同样根据该马库什组中任何单独成员或亚组成员进行了描述。
Claims (21)
2.如权利要求1所述的方法,其进一步包括对SR-A表达水平定量。
3.如权利要求2所述的方法,其进一步包括将该定量SR-A表达水平与对照定量SR-A表达水平进行比较。
4.如权利要求3所述的方法,其中该对照定量SR-A表达水平可通过观察未与该测试药剂接触的巨噬细胞在LDL存在的情况下暴露至胆固醇臭氧分解产物4a或5a后A类清道夫受体(SR-A)表达的上升进行检测。
5.如权利要求3所述的方法,其中该对照定量SR-A表达水平可通过观察巨噬细胞暴露至该测试药剂但未暴露至在LDL存在的情况下的胆固醇臭氧分解产物4a或5a后A类清道夫受体(SR-A)表达的上升进行检测。
7.如权利要求6所述的方法,其进一步包括对向胆固醇臭氧分解产物4a或5a源头迁移的巨噬细胞的百分比进行定量。
8.如权利要求6所述的方法,其进一步包括将该向胆固醇臭氧分解产物4a或5a源头迁移的巨噬细胞的百分比和向胆固醇臭氧分解产物4a或5a源头迁移的巨噬细胞的对照百分比进行比较。
9.如权利要求8所述的方法,其中该向胆固醇臭氧分解产物4a或5a源头迁移的巨噬细胞的对照百分比可通过观察未经暴露至该测试药剂的巨噬细胞向胆固醇臭氧分解产物4a或5a源头迁移的百分比进行测定。
11.如权利要求10所述的方法,其进一步包括对E-选择素表达水平定量。
12.如权利要求11所述的方法,其进一步包括将该定量E-选择素表达水平与对照定量E-选择素表达水平进行比较。
13.如权利要求12所述的方法,其中该对照定量E-选择素表达水平可通过观察未与该测试药剂接触的巨噬细胞在LDL存在的情况下暴露至胆固醇臭氧分解产物4a或5a后E-选择素的表达的上升进行检测。
14.如权利要求12所述的方法,其中该对照定量E-选择素表达水平可通过观察巨噬细胞暴露至该测试药剂但未暴露至在LDL存在的情况下的胆固醇臭氧分解产物4a或5a后E-选择素表达的上升进行检测。
16.如权利要求15所述的方法,其进一步包括检测单核细胞分化成为巨噬细胞的百分比。
17.如权利要求16所述的方法,其进一步包括将该单核细胞分化成为巨噬细胞的百分比与单核细胞分化成为巨噬细胞的对照百分比进行比较。
18.如权利要求17所述的方法,其中该单核细胞分化成为巨噬细胞的对照百分比可通过观察未与该测试药剂接触的单核细胞在暴露至胆固醇臭氧分解产物4a或5a后分化成为巨噬细胞的百分比进行测定。
19.如权利要求17所述的方法,其中该单核细胞分化成为巨噬细胞的对照百分比可通过观察暴露至该测试药剂的单核细胞在未暴露至胆固醇臭氧分解产物4a或5a的情况下分化成为巨噬细胞的百分比进行测定。
20.一种分离的胆固醇臭氧分解产物丹磺酰衍生物,其基本上由化合物5d或5e组成:
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