CN101287518A - 用于在组织中操作的超宽带天线 - Google Patents

Abstract

利用超短电脉冲对细胞功能进行细胞和胞内操作以及将电脉冲靶向递送到细胞培养物、患者和组织中的方法和装置。

Description

用于在组织中操作的超宽带天线

技术领域

产生超短电脉冲的系统被用于癌症及其它细胞和组织疾病的治疗。

背景技术

癌症是每年导致美国526,000人死亡的主要病因之一。例如，乳腺癌是西方国家妇女最常见形式的恶性疾病，在美国是40到55岁之间妇女的最常见死因(Forrest，1990)。乳腺癌的发生率——特别是在老年妇女中——正在增加，但增加的原因还未知。黑素瘤是另一形式的癌症，其发生率正以令人吃惊的速度上升，在美国是自1945年来的至少6倍，并且在所有皮肤病中最致命。

癌症最具破坏性的方面之一是恶性赘生物的细胞易从其原发位置扩散到远处的器官并发展成转移灶。尽管在原发性赘生物的外科治疗和侵入性疗法上有了进步，大多数癌症患者仍死于转移性疾病。动物测试表明约0.01％的实体瘤循环癌细胞建立成功的转移集落。

电场已应用于许多不同类型的癌症治疗中。其中一些涉及将肿瘤加热到大于43℃以通过高温杀伤细胞的射频或微波设备。其它使用脉冲电场来透化处理癌细胞从而能导入毒素或DNA。

本技术领域急需治疗癌症和其它疾病而不使用侵入性疗法和化疗剂，同时对整个动物的影响很小或没有影响。我们发现超短电脉冲可用作杀伤肿瘤和异常细胞而无需高温或药物的纯粹癌症电疗法。

发明内容

本发明涉及处理异常细胞的装置和方法。该装置产生10皮秒到1微妙的脉冲(超短脉冲)。在脉冲持续时长降到使得膜充电可以忽略时，开启了脉冲电场与细胞结构和功能相互作用的新区域。对于哺乳动物细胞，适用1纳秒或更短的脉冲持续时长。由于与细胞质相比介电常数较低，强度由复值介电常数确定的直接电场与细胞各部分的相互作用将是与膜的相互作用，而不是导致电穿孔的膜充电。

在一优选实施例中，作为纳秒脉冲施加到细胞和组织的宽带强非离子化辐射，nsPEF的脉冲持续时长为1-300ns，和电场≤1MV/cm，测得的热变化可忽略。当脉冲持续时长比细胞质、核质、以及周围介质的介电松驰时间短时，则为细胞应答开启了新的时间区域，其中电场直接作用在分子而非充电膜上。当电场足够强时，它们可导致构象改变，从而能选通离子通道并模拟细胞信号转导。

对于一般在数十微秒或毫秒量级的常规电穿孔脉冲，对细胞的效果与亚微秒范围的脉冲持续时长和提高的电场的乘积成比例。nsPEF与脉冲持续时长和电场的乘积成比例。然而，它们不依赖于能量密度。常规电穿孔和nsPEF都是膜充电所致，但是对生物细胞的结果截然不同。当脉冲降到亚纳秒范围时，膜不再可能充电，因为脉冲太短以致没有时间供膜完全充电。在这些条件下，亚纳秒脉冲的作用可能是对分子的直接作用所致。

该方法包括利用细胞的介电属性来改变细胞结构和功能的手段。受到影响的细胞结构包括但并不限于，线粒体、内质网、核、核仁、高尔基体、DNA、RNA、信使RNA、蛋白质、DNA-蛋白质相互作用、RNA-蛋白质相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、氨基酸、脂质、脂质筏(lipid rafts)、以及膜受体，包括离子通道。细胞功能包括但并不限于，新陈代谢、转录、翻译、基因表达、分泌、神经递质释放、离子通道选通、凋亡、细胞周期调控、第二信使生成、酶活性、活性氧生成、氧化/还原反应。这些活动可以影响可具有治疗或诊断应用的各种细胞结构、功能、和反应。

在一优选实施例中，一种系统/装置产生振幅从10kV到1MV且脉冲持续时长(半个周期)范围从10皮秒(ps)到50纳秒(ns)的单极子、偶极子、和振荡高电压脉冲。在一优选实施例中，该装置产生范围约50皮秒(ps)到5纳秒(ns)的脉冲持续时长(半个周期)。

在另一优选实施例中，该系统或装置使用例如椭球天线将电脉冲的能量聚焦到细胞培养物、组织和器官中界限明确的区域(volume)中。

在另一优选实施例中，该系统或装置使用例如抛物面天线经过长的距离发射能量。

在另一优选实施例中，该装置或系统通过一根或多根同轴电缆或其它波导将电能量递送到组织中的靶位。

在一优选实施例中，脉冲持续时长短于1纳秒。电场可以高达1.5MV/cm。

在另一优选实施例中，该装置产生在细胞和组织中诱导凋亡的电脉冲。这些细胞是异常细胞，例如肿瘤、受致疾病或肿瘤的生物，例如病毒感染的细胞。其它致疾病生物包括细菌、真菌、寄生虫等。

在另一优选实施例中，该装置产生在细胞中诱导钙或神经递质释放的电脉冲。该装置至关重要的一个示例是治疗其中神经递质偏离正常生理水平的抑郁症或任何神经障碍。

其它应用包括但并不限于，模拟激素、增强基因表达、以及诱导肿瘤和组织的凋亡。脉冲电场与细胞结构和功能相互作用使得脉冲持续时长可降到膜充电可忽略的值。对于哺乳动物细胞，适用1纳秒或更短的脉冲持续时长。强度由复值介电常数确定的直接电场与细胞各部分的相互作用将占主导，而不是导致电穿孔的膜充电。

使用天线作为代替，该方法最终能施加脉冲电场而无需递送侵入性电极。下文讨论了使我们能用聚焦天线产生非常高的电场的可能构造。采用几乎闭合的椭球天线并通过施加100kV的天线电压可在目标区域中实现超过100kV/cm的0.4ns脉冲电场。应用更高的电压脉冲使我们能在聚焦区中产生数百kV/cm的电场。使用多个脉冲便足以诱导凋亡。使用多个脉冲，我们已经显示凋亡处于远低于单个脉冲操作所需的电场。

除了诱导凋亡之外，诱导诸如亚细胞结构的钙释放等非致死效应(BeebeSJ，White J，Blackmore PF，Deng Y，Somers K，Schoenbach KH.纳秒脉冲电场对细胞和组织的各种效应(Diverse effects of nanosecond pulsed electric fields oncells and tissues).DNA Cell Biol.2003年12月；22(12)：785-96；White JA，Blackmore PF，Schoenbach KH，Beebe SJ.纳秒脉冲电场刺激库容性钙流入HL-60细胞(Stimulation of capacitative calcium entry in HL-60 cells bynanosecond pulsed electric fields).J Biol Chem.2004年5月28日；279(22)：22964-72；Beebe SJ，Blackmore PF，White J，Joshi RP，Schoenbach KH.纳秒脉冲电场通过细胞内信号转导机制来调节细胞功能(Nanosecond pulsedelectric fields modulate cell function through intracellular signal transductionmechanisms).Physiol Meas.2004年8月；25(4)：1077-93；Buesch′er ES，和Schoenbach KH.亚微秒高强度脉冲电场对活细胞-细胞内电处理的效应(Effects of submicrosecond，high intensity pulsed electric fields on livingcells-intracellular electromanipulation).IEEE Transactions on Dielectrics andElectrical Insulation 2003年10月，788-794；E.S.Buescher，R.R.Smith，KH.Schoenbach，“亚微秒强脉冲电场对细胞内自由钙进行作用：机制和效应(Submicrosecond，intense pulsed electric field effects on intracellular free calcium：mechanism and effects)”，IEEE Trans Plasma Science 32，1563-1572(2004))，或神经递质释放也是该新方法有诱惑力的应用。钙是许多细胞功能的关键调节剂，并且还影响细胞信号转导(Beebe SJ等，DNA Cell Biol.2003年12月；22(12)：785-96；White JA等，J Biol Chem.2004年5月28日；279(22)：22964-72；Beebe SJ等，Physiol Meas.2004年8月；25(4)：1077-93；Buescher ES和Schoenbach KH.IEEE Transactions on Dielectrics and Electrical Insulation 2003年10月，788-794；E.S.Buescher等，IEEE Trans Plasma Science 32，1563-1572(2004))。这涉及，例如电刺激。由于业已证明钙释放所需的电场远低于凋亡诱导，所以极大放宽了对脉冲发生器的约束。因而甚至能使用抛物面而非椭球反射体在更长的距离上刺激与钙相关的功能。一般而言，使用亚纳秒脉冲不仅使得我们能够进入电场细胞相互作用的新领域，而且开启了需要将电磁能量递送到利用诸如针等固体电极不易接近的组织的治疗应用的大门。

在另一优选实施例中，该装置或系统利用细胞的介电属性来改变细胞结构和功能。用途包括治疗新陈代谢失调，调节激素、神经递质等。受影响的细胞结构包括但并不限于，线粒体、内质网、核、核仁、高尔基体、DNA、RNA、信使RNA、蛋白质、DNA-蛋白质相互作用、RNA-蛋白质相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、氨基酸、脂质、脂质筏、以及膜受体，包括离子通道。细胞功能包括但并不限于，新陈代谢、转录、翻译、基因表达、分泌、神经递质释放、离子通道选通、凋亡、细胞周期调控、第二信使生成、酶活性、反应性氧生成、氧化/还原反应。这些活动可以影响具有治疗或诊断应用的各种细胞结构、功能、和反应。

附图说明

所附权利要求中的特征指明了本发明。参照下文并结合附图能更好地理解本发明的上述和其它优点，附图中：

图1A是生物细胞的结构(如采用光学显微镜见到的)的示意性表示。图1B是生物细胞的双壳模型和该细胞的重叠等效电路的示意性表示。

图2是生物细胞的等效电路(单壳近似)的示意性表示。

图3是用于描述电穿孔过程的等效电路的示意性表示。

图4是一般小于1ns的极短脉冲的生物细胞(单壳模型)的等效电路的示意性说明。

图5是所述装置的一个实施例的示意性表示。该图示出了超短脉冲发生器的框图以及辐照系统(右上方)的剖面。

图6是在负载——包含生物细胞的悬液处测得的电压(上图)和电流(下图)的曲线图。

图7是在对包含B16细胞的悬浮液施加750kV/cm和0.8ns持续时长的单个脉冲后胱冬酶活化的曲线图。

图8是聚焦天线(左)向组织中的焦点(右)递送电磁能量的的示意性说明。

图9A和9B是各种组织对频率的电导率(图9A)和电容率(图9B)的曲线图。

图10-13是天线构造、电场在靶区域中的空间分布、以及电场时间分布的曲线图。左图示出了天线构造以及电场在靶区域中的空间分布；而右图示出了电场在靶点的时间分布。参数是天线设计(图10和12半椭球面，图11和13全椭球面)和脉冲持续时长(图11和12中为0.8ns，而图12和13中为0.4ns)。

图14是具有反射面的椭球面天线的示图。

图15是800皮秒脉冲杀伤黑素瘤细胞的曲线图。

图16A-16B是这些实验中所用的脉冲发生器的示图。图16A是Blumlein构造的300纳秒脉冲形成网络的示例。每个陶瓷电容器的宽度是3cm。图16B是产生的跨肿瘤脉冲的典型电压(红或实迹线)和电流(蓝或虚迹线)的曲线图。

图17A和17B示出了针阵列电极和电场方式。图17A是用于第一实验的5针阵列的扫描照片。图17B是当在中心电极上设置8kV而将外围4个电极保持接地时产生的电场的3D图。

图18A-18T是皮肤和黑素瘤对在小鼠#56上用5针阵列电极施加一次或两次100个脉冲的典型应答的扫描照片。每对匹配的照片中左边的表示皮肤的体内透视而右边的表示表面视图。左边远端的数字表明脉冲后的天数，此时对所有右边的3个匹配对拍照。图18A-18示出了在第0天正常皮肤对所递送的100个脉冲(300ns长、20kV/cm、0.5Hz)的典型应答。图18B中所示的小浅表面糜烂增加(图18C-18E)，表明部分或全部表皮丧失。(图18H-18M)在第0天将电极阵列插入该肿瘤中但不递送脉冲。(图18O-18T)在第0天和第1天以0.5Hz递送100个脉冲(300ns长、20kV/cm)。在第二天有明显坏死，并随时间变得更加强烈。比例尺(图18A-18T)是1mm，给定行中所有照片的放大率相同。

图19A-19E是使用5针阵列进行所述治疗后总共23个黑素瘤的大小改变概况的曲线图。每天从透视图像检测肿瘤面积并将其除以在第0天测得的面积以获得归一化面积。以对数标度绘制不同动物的2个或3个肿瘤的平均应答，误差棒表示SEM。以0.5Hz频率施加脉冲。(图19A、19B)在中心和相隔4mm的外围针之间施加4kV以获得平均为10kV/cm的场。(图19C-19E)在中心与外围针之间施加8kV以获得平均20kV/cm的场。

图20A-20D是在第0天使用5mm直径平行板电极对小鼠#102施加间隔30为分钟的三次100个脉冲(300ns、40kV/cm、0.5Hz)和在第4天施加一次脉冲的黑素瘤典型应答的扫描照片。同一肿瘤的7个匹配图像组的集合均是在透视图像左下角所示日期拍摄的。(图20A、(列A))示出了透视图像。(图20B、(列B))表面视图。(图20C、(列C))肿瘤中心处的超声波切片。(图20D、(列D))从贯穿肿瘤的100个顺序超声波切片制成的3D重建。每列的放大率恒定，每列上端的比例尺表示1mm。

图21A是在异氟烷吸入麻醉的情况下用平行板电极处理SKH-1无毛小鼠的扫描照片。(插图)平行板电极的其中一块板的特写显示其凹进0.5mm从而具有在其上放置电导性琼脂凝胶的空间。图21B是3只小鼠的6个肿瘤的透视图像归一化面积的平均变化曲线图，所述小鼠利用平行板电极施加相同的4×100个脉冲(第一天3×100以及第三天1×100)进行处理。0.5Hz的40-80kV/cm、300ns脉冲。误差棒表示SEM。

图22是第一次治疗之后65天黑素瘤明显完全消退的扫描照片。在第0、1、2和21、22、23天施加100个脉冲(300ns和40kV/cm)。每对照片是在左边所示的日期拍摄；左边为透视图而右边为表面视图。左上方的比例尺表示1mm，对所有图像均相同。

图23A-23B示出了在施加nsPEF期间黑素瘤内温度的测量值。图23A是通过将铜线与由康铜制成的线熔在一起而制成的热电偶的扫描显微图。图23B是在施加脉冲期间放置于黑素瘤内部的热电偶所记录温度的曲线图。下部的点表明每个脉冲所施加的时间。

图24A-24E示出了靶标和nsPEF效应的机制。图24A-24D是用100个脉冲(300ns、40kV/cm、0.5Hz)处理后，在所示时间固定，用苏木精和曙红染色的对照和经处理黑素瘤的7微米厚石蜡切片的扫描照片。将最清晰的核复制并置于每个切片的右侧以帮助大小比较。(图24A)对照肿瘤切片；(图24B)10分钟后处理。(图24C)1小时后处理。(图24D)3小时后处理。比例尺：10μm。图24E是显示施加了100-200个脉冲后的平均核面积与时间图。每个时间点从至少两只小鼠测得的细胞核数目标于每列之后，(误差)棒表示SEM。0小时预脉冲对照与所有其它时间点之间差异显著(p＜0.001)，1与3小时之间差异显著(p＜0.001)。0.1与1小时之间差异不显著。(A)-(D)中比例尺：10μm。

图25A-25D示出了施加nsPEF前后黑素瘤中的血流。图25A示出了黑色素瘤区域的3D重建；图25B示出了在场施加之前血流的能量多普勒重建。图3C示出了在100个脉冲(300ns、40kV/cm、0.5Hz)之后约15分钟生成的图25A中所示同一黑色素瘤区域的3D重建。图25D示出了在100个脉冲(300ns、40kV/cm、0.5Hz)之后约15分钟生成的图25B中所示同一肿瘤中血流的能量多普勒重建。

详述

天线参数：1。近场天线(靶标非常靠近电磁波源)。(a)为了利用大小和功率合理的天线生成该振幅的电场，将细胞、组织放在天线的近场。近场定义为由半径小于波长除以2π的球形区域。(b)电极维度确定了这种近场“天线”的空间分辨率。在用作导管的同轴电缆中，这将是中心导体的直径和到周围的同轴导体的距离。在中心导体被两个同轴圆柱——其中内同轴电缆递送一个脉冲而外同轴电缆(由两个外同轴导体所确定)递送第二个经过相移的脉冲——所包围的双同轴“天线”中，使用叠加原理(对于远场应用，该原理用于相控阵天线系统中)来将这些场“聚焦”在有限的空间区域中。(c)在双同轴系统中，用厘米级的空间分辨率进行聚焦要求宽带脉冲发生器的基波长处于同一量级。对于空气，这将要求总持续时长为30ps的双极脉冲。对于介电常数为81的水，这增加到270ps或0.27ns。持续时长1ns的脉冲将提供3cm的空间分辨率。

天线参数2。聚焦天线(靶到源的距离由可以为透镜或反射镜的聚焦设备确定)。a)为了通过大小和功率合理的天线产生该振幅的电场，将细胞、组织置于天线的焦点区域中。焦点区域定义为由以焦点为中心、半径在处于波长量级的球形区域。(b)为了将这些场聚焦在有限空间区域中，使用聚焦反射镜或透镜。(c)用cm量级的空间分辨率进行聚焦要求宽带脉冲发生器的基波长处于同一量级。对于空气，这将要求总持续时长为30ps的双极脉冲。对于介电常数为81的水，这增加到270ps或0.27ns。持续时长1ns的脉冲将提供3cm的空间分辨率。

定义

除非另有明确陈述，否则本发明和本文所用的以下术语具有以下含义：

除非上下文另有明确指示，否则本文所用的“一(a)”、“一(an)”、以及“该”包括复数引用。

本文所用“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症或肿瘤或恶性肿瘤，包括但并不限于：白血病、淋巴癌、黑素瘤、癌和肉瘤。癌症的示例有：脑癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和髓母细胞瘤。术语“癌症”包括由于各种化学的、物理的、传染性生物致癌物所引起的任何癌症。例如，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒；阳光、铅和铅化合物、X射线、烤肉中发现的化合物、以及纺织燃料、涂料和墨水中所用的大量物质。在致癌物报告(The Report on Carcinogens)的第十一版中列出了致癌物的进一步的细节。联邦法律要求健康与公共事业部的部长每两年公布一次该报告。

可用根据本发明所公开的组合物治疗的其它癌症包括但并不限于，例如，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛素瘤(insulanoma)、恶性类癌瘤、泌尿膀胱癌、癌前皮肤损伤、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、和前列腺癌。

术语“肉瘤”一般是指由类似于胚性结缔组织的物质构成的肿瘤且一般由包埋在纤维状或均质物质中紧密堆积的细胞组成。可用(本发明)组合物或任选的增效剂和/或化疗药治疗的肉瘤的示例包括但并不限于，软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy肉瘤、脂肪肉瘤、脂肉瘤、泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色瘤、绒膜癌、胚胎性癌肉瘤、维尔姆斯(氏)肿瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、绿色瘤、霍奇金肉瘤、特发性多色素出血肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、晏森(氏)肉瘤、卡波济氏肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白色肉瘤、恶性间质肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、鲁斯氏肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤、和毛细血管扩张性肉瘤。

术语“黑素瘤”用来表示由于皮肤和其它器官的黑素细胞系统产生的肿瘤。可用(本发明)组合物和任选的增效剂和/或其它化疗药来治疗的黑素瘤包括但并不限于，例如，肢端着色斑性黑素瘤、无黑色素性恶性黑素瘤、良性幼年型黑素瘤、克劳德曼(氏)黑素瘤、S91黑素瘤、哈-腊二氏黑素瘤、幼年型黑素瘤、恶性雀斑样黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑素瘤、浅表扩展性黑素瘤。

术语“癌”表示由易于渗透周围组织并导致转移的上皮细胞组成的恶性新生物。可用(本发明)组合物和任选的增效剂和/或化疗药治疗的癌包括但并不限于，例如，腺泡癌、腺泡癌、囊性腺样癌、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌，蜂窝状癌，肺泡细胞癌，基底细胞癌，基底细胞癌、类基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、肺泡细胞癌、支气管癌、髓样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、粘液癌、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、胸廓癌、皮肤癌、柱状细胞癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌(epiermoidcarcinoma)、腺样上皮细胞癌、外植癌、溃疡性癌、硬癌、胶样癌、胶样癌、巨细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、基底细胞癌、多血癌、肝细胞癌、许特尔(氏)细胞癌、胶样癌、肾细胞癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗姆佩柯赫尔(氏)肿瘤、库尔契茨基(氏)细胞癌、大细胞癌、豆状癌、，豆状癌、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓样癌、黑色素癌、软癌、粘蛋白性癌、粘液癌、粘液细胞瘤、粘液表皮样癌、粘液癌、粘液癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨化性癌、乳头状癌、门脉周癌、原位癌、棘细胞癌、粉刺癌、肾细胞癌、贮备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德(氏)癌、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、硬癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌、鳞癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、血管扩张性癌、血管扩张性癌、移行细胞癌、结节性皮癌、结节性皮癌、疣状癌、和绒毛状癌。

术语“诊断”或“诊断的”表示鉴定病理情况或易患疾病的患者患者的存在或性质。诊断方法在灵敏性和特异性上有所不同。诊断试验的“灵敏性”是测试为阳性的患病个体的百分例(“真阳性”百分比)。试验未检测出的患病个体是“假阴性”。未患病且在试验中测试为阴性的受验者被称为“真阴性”。诊断试验的“特异性”为1减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为没有患病但测试为阳性的人的比例。虽然某具体诊断方法不能确切诊断某状况，但如果该方法能提供有助于诊断的阳性指示就足够了。

在本文中，术语“患者”或“个体”互换使用，指待治疗的哺乳动物，优选人类患者。在一些情形中，本发明的方法可用于实验动物、兽医应用以及疾病动物模型的开发，包括但并不限于啮齿类动物，包括小鼠、大鼠、和仓鼠；以及灵长类动物。

“治疗”是为防止某疾病的病状或症状发展或改变某疾病的病状或症状而实施的干预。因此，“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防御性治疗手段。“治疗”还可指治标疗法。需要治疗的对象包括已经患病的对象或要防止患病的对象。在肿瘤(例如，癌症)治疗中，脉冲电场可以直接降低肿瘤细胞的病状，或致使肿瘤细胞对诸如放射和/或化疗等其它治疗剂的治疗更敏感。

肿瘤疾病、癌症、或肿瘤细胞的治疗指利用说明书和以下示例所述的装置或系统递送一定量的电磁或脉冲能量，从而能产生一个或多个以下效应：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包括(i)减缓和(ii)生长完全停止；(2)肿瘤细胞数目减少；(3)维持肿瘤大小；(4)肿瘤大小的减小；(5)抑制肿瘤细胞向周边器官渗透，包括(i)减少、(ii)减缓或(iii)完全阻止；(6)抑制转移，包括(i)减少、(ii)减缓或(iii)完全阻止；(7)增强抗肿瘤免疫应答，可导致(i)维持肿瘤大小、(ii)减小肿瘤大小、(iii)减缓肿瘤的生长、(iv)降低、减缓或阻止侵入或(v)降低、减缓或阻止转移；和/或(8)在一定程度上缓解一个或多个疾病相关症状。

本文所用的术语“给予”和“治疗”指为直接或间接改善对象的状况而给予对象，特别是人类药物帮助的任何过程、动作、应用或治疗。

用本发明装置治疗患者可以与一种或多种疗法相结合。例如，以治疗癌症为例，可以联用电脉冲场与化疗剂疗法来治疗患者。“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂的示例包括诸如硫替派和环磷酰胺(环磷酰胺^TM)等烷化剂；诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡等磺酸烷酯；诸如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌、和乌瑞替派等吖丙啶；包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫化磷酰胺和三羟甲密胺的氮丙啶和甲蜜胺；诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新恩比兴、胆甾醇苯乙酸氮芥、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀等氮芥；诸如卡莫司汀、吡葡亚硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀等亚硝基脲；诸如阿柔比星、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、卡柔比星(carabicin)、卡波霉素(carnomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、道诺霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、黄胆素、马赛罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、波非罗霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、块菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星等抗生素；诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)等抗代谢物；诸如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙等叶酸同型物；嘌呤类似物如氟达拉滨，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU等嘧啶类似物；诸如卡普睾酮、丙酸甲雄烷醇酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪等雄激素；诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦等抗肾上腺；诸如叶烷酸等叶酸补充物；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝司特布斯(bestrabucil)；比生群；伊达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋胺；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK

；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；三氯乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；硫替派；紫杉烷，例如，紫杉醇(紫杉醇

，勃列斯多·迈耶施贵宝肿瘤学，普林斯顿，新泽西)和多西他赛(TAXOTERE

罗纳普朗克，安东尼，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；诸如顺铂和卡铂等铂类似物；长春碱；铂；依托泊甙(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；二羟基蒽醌；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；适罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯皮拉霉素(esperamicins)；卡培他滨；和药学上可接受的盐，酸或以上任意一种的衍生物。该定义还包括用以调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素药，诸如包括他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬盐酸盐(keoxifene)、LY117018、奥那司酮、和托瑞米芬(Fareston)的抗雌激素类；和诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、和戈舍瑞林等抗雄激素类；以及药学上可接受的盐、酸或以上任意一种的衍生物。

治疗患有感染性疾病生物(所致疾病)的个体指减少或消除个体中的该疾病生物。例如，由噬斑形成单位或诸如ELISA等其它自动诊断方法测得的病毒颗粒减少。

本文所述的“神经(神经元)缺陷、失调或疾病”是指任何神经失调，包括但不限于，神经变性疾病(帕金森病；阿尔茨海默病)或中枢神经系统的自身免疫疾病(多发性硬化症)；记忆力丧失；长期或短期记忆力障碍；学习障碍、自闭症、抑郁、良性健忘、幼儿学习障碍、闭合性脑外伤(close head injury)、以及注意力缺陷障碍；大脑自身免疫疾病、病毒感染的神经元反应；脑损伤；抑郁；诸如双极性和精神分裂等精神疾病；发作性睡病/睡眠障碍(包括昼夜节律障碍、失眠和发作性睡病)；神经切断或神经损伤；脑脊髓神经索切断(CNS)和大脑或神经细胞的任何损伤；AIDS相关的神经缺陷；抽搐(例如，图雷特综合征)；亨廷顿舞蹈症、精神分裂症、外脑损伤、耳鸣、神经痛、特别是三叉神经疼痛、神经性疼痛、不适当的神经元活性导致神经性感觉障碍(neurodysthesias)等疾病，例如糖尿病、MS和运动神经元病、运动失调、肌强直(僵直)和颞下颌关节机能障碍；对象的奖励缺乏综合征(Reward DeficiencySyndrome(RDS))行为；由酒精和药物(例如，摇头丸(ecstacy)、甲基苯异丙胺)滥用引起的神经毒性。

如在此所使用的，术语“感染物”或“感染性疾病生物”或“疾病生物”表示生长/繁殖会在人或动物体中致病的生物。这些事物的示例为：细菌、真菌、原生动物、和病毒。

装置/系统

对于单个和多个脉冲(shot)操作，当施加10ns脉冲时细胞内电处理要求10kV/cm到300kV/cm量级的电场。电场强度的范围反映了以下效应的范围：对于低电场，我们观察到基于钙释放的非致死效应，而对于高电场，已实现了凋亡。这是对应于单个脉冲操作的情形。对于10ns的多个脉冲操作，电场可以降到低于100kV/cm的值且仍能观察到凋亡。除了电场，脉冲持续时长也起重要作用。基于实验结果，任何细胞内效应似乎与脉冲持续时长和电场强度的乘积成比例。这意味着脉冲持续时长的任何降低需要增大电场来补偿。假定在多脉冲条件下，对于1ns脉冲，凋亡将要求电场接近1MV/cm。对于诸如钙释放等非致死效应(进而又可具有诸如血小板活化、神经刺激等许多二级效应)，所要求的电场将较低，但可能仍在数百kV/cm的范围内。这些估计是基于生物效应由胞膜和亚细胞膜的充电来确定这一假设。然而，在脉冲持续时长降到膜充电可以忽略时，开启了脉冲电场与细胞结构和功能相互作用的新区域。对于哺乳动物细胞，适用1纳秒或更短的脉冲持续时长。强度由复值介电常数确定的直接电场与细胞各部分的相互作用将占主导地位，而不是导致电穿孔或在超短脉冲的情形中导致纳米穿孔的膜充电。除了进入了电场细胞相互作用的新区域，使用天线作为代替，该新方法最终能施加脉冲电场而无需递送侵入式电极。

天线参数：1。近场天线(靶标非常靠近电磁波源)。(a)为了利用大小和功率合理的天线产生该振幅的电场，将细胞、组织置于天线的近场。近场定义为由半径小于波长除以2π的球形区域。(b)电极维度确定了这种近场“天线”的空间分辨率。在用作导管的同轴电缆中，这将是中心导体的直径和到周围的同轴导体的距离。在中心导体被两个同轴圆柱——其中内同轴电缆递送一个脉冲而外同轴电缆(由两个外同轴导体所确定)递送第二个经过相移的脉冲——所包围的双同轴天线中，使用叠加原理(对于远场应用，该原理用于相控阵天线系统中)来将这些场“聚焦”在有限的空间区域中。(c)在双同轴系统中，以厘米级的空间分辨率进行聚焦要求宽带脉冲发生器的基波长处于同一量级。对于空气，这将要求总持续时长为30ps的双极脉冲。对于介电常数为81的水，这增加到270ps或0.27ns。持续时长1ns的脉冲将提供3cm的空间分辨率。

天线参数2。聚焦天线(靶到源的距离由可以为透镜或反射镜的聚焦设备确定)。a)为了通过大小和功率合理的天线产生该振幅的电场，将细胞、组织置于天线的焦点区域中。焦点区域定义为由以焦点为中心、半径处于波长量级的球形区域。(b)为了将这些场聚焦在有限空间区域中，使用了聚焦反射镜或透镜。(c)以cm量级的空间分辨率进行聚焦要求宽带脉冲发生器的基波长处于同一量级。对于空气，这将要求总持续时长为30ps的双极脉冲。对于介电常数为81的水，这增加到270ps或0.27ns。持续时长1ns的脉冲将提供3cm的空间分辨率。

在一优选实施例中，可使用双同轴天线，其中两个波可在需要时经过相移以实现最高场。使用现有代码“MAGIC

”的建模结构表明该方法是成功的。

利用Kerr效应测量与组织电特性相似的水中电场分布。Mach-Zehnder干涉仪是可用的且已在评估水放电中得到测试。

在优选实施例中，本发明包括：高电压(高达2MV)纳秒脉冲发生器；设计并构造双同轴天线；根据这两个同轴波之间的相移对组织中的电场分布建模，并利用Kerr效应测量水中的电场分布。

在一优选实施例中，电场脉冲发生器和/或电脉冲辐射器(发射器)包括电极、天线、电缆、同轴电缆、板、以及辐射鳍。

在另一优选实施例中，诸如聚焦天线等天线(e)包括椭球反射体、抛物面反射体。特别优选地，天线包括聚焦透镜从而能聚焦电脉冲。我们已经证明该场的空间分辨率非常好，可以聚焦到例如约0.1mm的所需受限区域。这在需要聚焦在例如肿瘤上而不影响周围正常细胞时尤其有用。如果需要，场可以扩大至包括周围细胞和组织。透镜可以由任何反射材料或聚焦脉冲的材料制成，例如，金属、塑料、玻璃、水晶等。

在高频，可使用透镜天线来执行类似于反射体天线的功能。透镜和抛物面反射体都使用自由空间作为馈送网络来激发大孔径。透镜的馈送保持在孔径之外，从而消除孔径遮挡并得到高旁瓣电平。电介质透镜天线与光学透镜相似且该天线的孔径等于边缘形状的投影。透镜分为单面和双面两类。在单面透镜中，一个面是入射或出射波的等相位面，射线垂直通过该面而没有折射。

在双面透镜中，两个透镜表面都发生折射。单面透镜将柱面或球面波转换成平面波。柱面波需要线源和柱面透镜表面，而球面波使用点源和球面透镜表面。远场方向图由孔径的绕射所确定。双面透镜能更多地控制方向图特性。两个面都用于聚焦，且第二表面可用于控制孔径面中的分布。

这些简单透镜的厚度是多个波长，如果在这种情况下它们的焦距和孔径与波长相比较大，则透镜的表面可通过从厚度除去波长的倍数来分区。分区可以在折射或非折射表面完成。分区透镜是频率敏感的且可以在过渡区引起遮挡损耗。

可在电介质中引入诸如金属球、金属带、金属碟、或金属棒等粒子的人造电介质透镜。该粒子的大小必须小于波长。使用隔开的导电板的金属板透镜在微波频率使用。由于金属板介质的折射率取决于波长与板间间距之比，所以这些透镜是频率敏感的。Luneberg透镜是球形对称透镜，其折射率随半径而改变。入射在该透镜上的平面波将被带至对侧上的焦点。这些透镜可以使用各自具有介电常数的一系列同心球壳制成。

图14中示出了具有聚焦椭球反射体的超宽带天线的一个示例。在我们的情形中高电压脉冲借助图5中所示系统产生。该电压可以使用对于具有不同脉冲功率系统的脉冲功率技术领域普通技术人员已知的发生器产生。高电压脉冲通过高电压同轴电缆馈送至导线天线(偶极子天线)。该偶极子放置于该椭球反射体的焦点之一中。因此，在这种构造中，反射波反射到该椭球面的第二焦点(焦区(focal volume))。在治疗应用中，靶标(例如，体内的肿瘤)将正好放于第二焦点上。对该肿瘤前(例如，在皮肤处)和后的组织的影响的侵入性较低，因为那里的电能量密度将较小。具体地说，如果所需效果(例如，杀伤肿瘤细胞)是非线性的，即意味着电场强度在特定阈值之上的电场比线性更快地增长，则效果可以相当好地局限于所需的治疗区域。

在其它优选实施例中，使用从10皮秒到1微秒的脉冲(nsPEF)包括短于1纳秒的脉冲(超短脉冲)。在脉冲持续时长降到使得膜充电可以忽略时，开启了脉冲电场与细胞结构和功能相互作用的新区域。对于哺乳动物细胞，这适用1纳秒或更短的脉冲持续时长。强度由复值介电常数确定的直接电场与细胞各部分的相互作用将占主导地位，而不是导致电穿孔的膜充电。尽管如此，由于介电常数低于细胞质，所以大部分相互作用是与膜的相互作用。

除了进入了电场-细胞相互作用的新区域，使用天线作为替代，该新方法最终能施加脉冲电场而无需递送侵入式电极。已介绍了使我们能用聚焦天线产生非常高的电场的一种可能构造。除了反射体型的聚焦天线，还可能使用透镜将电磁能量聚焦到组织中。

本发明的优点众多。以前，我们使用施加到细胞和组织的宽带强非离子化辐射作为纳秒脉冲电场(nsPEF)。与常规电穿孔脉冲相比，nsPEF的脉冲持续时长更短(1-300ns)和电场更高(≤MV/cm)，它们非常短从而可忽略测得的热改变。当脉冲持续时长比细胞质、核质、以及周围介质的介电松驰时间短时，则为细胞应答开启了新的时间区域，其中电场直接作用在分子而非充电膜上。当电场足够强时，它们可导致构象改变，从而能选通离子通道并模拟细胞信号转导。

对于一般在数十微秒或毫秒量级的常规电穿孔脉冲，对细胞的效果与脉冲持续时长、电场、以及能量密度的乘积成比例。以前，我们将脉冲持续时长降到亚微秒的范围并增大电场。nsPEF与脉冲持续时长和电场的乘积成比例。然而，它们不依赖于能量密度。常规电穿孔和nsPEF都是膜充电所致，但是对于生物细胞的结果截然不同。当脉冲降到亚纳秒范围时，膜不再可能充电，因为脉冲太短以致没有时间供膜完全充电。在这些条件下，亚纳秒脉冲的作用可能是对分子的直接作用所致。在这里，物理学直面生物学并且在分子结构和功能上出现了机制和效果的新样式。该方法包括利用细胞的介电属性来改变细胞结构和功能的手段。受影响的细胞结构包括但并不限于，线粒体、内质网、核、核仁、高尔基体、DNA、RNA、信使RNA、蛋白质、DNA-蛋白质相互作用、RNA-蛋白质相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、氨基酸、脂质、脂质筏、以及膜受体，包括离子通道。细胞功能包括但不限于，新陈代谢、转录、翻译、基因表达、分泌、神经递质释放、离子通道选通、凋亡、细胞周期调控、第二信使生成、酶活性、活性氧生成、氧化/还原反应。这些活动可以影响可具有治疗或诊断应用的各种细胞结构、功能、和反应。

条件包括脉冲持续时长小于1纳秒。电场可以高达1.5或2MV/cm。实验数据表明胱冬酶活化而细胞未死亡。除了在凋亡细胞死亡中已得到充分表征的作用，胱冬酶已知涉及细胞生存功能，例如血小板活化，这对于受伤期间限制失血和伤口愈合、、T细胞功能和增殖、以及肌肉细胞分化至关重要。

本发明克服了电流脉冲发生器中所见的电场击穿的问题。这可以通过限制电场强度来加以限制。当前脉冲发生器的击穿范围大于1.5MV/cm。因此，所能施加的电场有一上限。降低脉冲持续时长可扩展此上限。可以作出其它工程修改，特别是在体外和体内研究中。

为了探究生物电学中的新方案，电脉冲的特性参数需要处于细胞质、核质、和上清液的松弛时间的量级或更小。这是小于1纳秒的值。已经设计和制造出了能够向生物负载提供亚纳秒脉冲的脉冲功率系统。这种火花隙开关脉冲功率设备的优点是高电压、低阻抗、以及成本较低。缺点是重复率有限。基于半导体开关的脉冲功率发生器可在突发模式下以高达50kHz的重复率工作，而基于火花隙开关的系统一般局限于约100Hz。

图5中示出了实验系统的框图，包括辐照系统的剖面。图5中示出了该系统的一个示例。该系统包括电场脉冲发生器。该发生器包括产生脉冲的装置。这些可包括但不限于天线、电极等。电极101包括诸如不锈钢、炭、炭板电极、铜、浸渍了铝的活性碳、钛、钽、镍等任何导电材料。活性碳包括例如，乙炔黑和KETJEN黑、天然石墨、热膨胀石墨、炭纤维、钌氧化物、钛氧化物等。电极可以用诸如导电琼脂等镀敷材料来镀敷。优选地，电极可以用一层约0.001mm到约2mm的导电琼脂来镀敷。优选地，导电琼脂的镀敷层为1mm。

超短脉冲发生器还包括使将细胞曝露于超短脉冲的一个或多个容器102、绝缘体103、同轴电缆104、超宽带辐照室105、电流探针106、容性分压器107、包括示波器109和触发器110的筛选室108、增压容器111中约20到30级的马科斯组(Marx-Bank)、脉冲成形或脉冲整形网络112、以及截尾开关113。该系统并不限于图5中所示的系统，这仅是一示意图示而无意以任何方式限制或解释本发明。绝缘体可以由本领域技术人员已知的任何绝缘材料构成，例如TEFLON^TM。通过引用全文包括于此的Carey，W.J和Mayes J.R.(2003)的“Mark发生器设计和实现(Marx Generator Design and Performance)”，Proc.ModulatorConf.2003第625页对马科斯组的示例进行了描述。

该系统能够在50Ω负载中产生振幅为350kV的0.8ns电场脉冲。在高阻抗负载上测得的电压达到700kV的值。间隙距离为4.25mm时相应的电场为1.5MV/cm。图6中示出了电压和电流脉冲波形。尽管电场极大，但并未观察到电击穿。这与用200和400ns脉冲所得结果一致，在该情况下针-板电极构造中水的击穿电场达到这些值。与水击穿实验中所用的相比，将脉冲持续时长振幅降低两个数量级的情况下，即使亚纳秒范围内的数个MV/cm也不会导致击穿。

在另一优选实施例中，脉冲发生器包括天线。天线参数：1。近场天线(靶标非常靠近电磁波源)。(a)为了利用大小和功率合理的天线产生该振幅的电场，将细胞、组织置于天线的近场。近场定义为由半径小于波长除以2π的球形区域。(b)电极维度确定了这种近场“天线”的空间分辨率。在用作导管的同轴电缆中，这将是中心导体的直径和到周围的同轴导体的距离。在中心导体被两个同轴圆柱——其中内同轴电缆递送一个脉冲而外同轴电缆(由两个外同轴导体所确定)递送第二个经过相移的脉冲——所包围的双同轴天线中，使用叠加原理(对于远场应用，该原理用于相控阵天线系统中)来将这些场“聚焦”在有限的空间区域中。(c)在双同轴系统中，用厘米级的空间分辨率进行聚焦要求宽带脉冲发生器的基波长处于同一量级。对于空气，这将要求总持续时长为30ps的双极脉冲。对于介电常数为81的水，这增加到270ps或0.27ns。持续时长1ns的脉冲将提供3cm的空间分辨率。

天线参数2。聚焦天线(靶到源的距离由可以为透镜或反射镜的聚焦设备确定)。a)为了利用大小和功率合理的天线产生该振幅的电场，将细胞、组织置于天线的焦点区域中。焦点区域定义为由以焦点为中心、半径处于波长量级的球形区域。(b)为了将这些场聚焦在有限空间区域中，使用了聚焦反射镜或透镜。(c)用cm量级的空间分辨率进行聚焦要求宽带脉冲发生器的基波长处于同一量级。对于空气，这将要求总持续时长为30ps的双极脉冲。对于介电常数为81的水，这增加到270ps或0.27ns。持续时长1ns的脉冲将提供3cm的空间分辨率。

在另一优选实施例中，该系统的装置是便携式仪器。这些仪器的用途很广。例如，在事故现场治疗患者以减轻疼痛、在战场上治疗受伤的士兵等。

应用

在一优选实施例中，用本发明的装置对罹患癌症的患者进行治疗。该装置包括含电极、天线、电缆、同轴电缆、板、和辐射鳍的电场脉冲发生器和/或电脉冲辐射器(发射器)。对于全身治疗，该患者在一圆筒中被暴露于电场，这与MRI等情形相似。可以使用反射体和/或聚焦透镜将电场集中或聚焦在患者身上有实体瘤的特定区域。使用抛物面反射体或抛物面和椭球反射体的组合——任选地还可与聚焦透镜相组合——实现电脉冲的广阔场扩散。

可以改变电场脉冲以适应每一个体患者的需求，例如更改nsPEF以包括诸如1纳秒的超短脉冲且场强可以改变。治疗可以通过1皮秒到数秒的超短nsPEF进行循环且根据需要可以更长。电场的强度值也可从V/cm量级变化到MV/cm。

在另一优选实施例中，可通过将电场脉冲聚焦在肿瘤区域上来治疗罹患局部肿瘤、组织异常等，例如黑素瘤、良性瘤、早期癌症等的患者。如果肿瘤是内部的，则该装置使用诸如电缆、电极等对特定细胞和/或组织递送电脉冲。

在另一优选实施例中，通过将电场脉冲聚焦在含这些细胞的区域上来治疗细胞培养物、组织和器官。例如，该装置包括细胞或组织容纳区。

在另一优选实施例中，通过使，例如受疾病因子感染的细胞、生理失衡的细胞、癌前细胞等异常或癌细胞经受电场脉冲而诱导其凋亡。该场可以使用例如椭球面天线来聚焦在细胞上。该装置能在有限区域中产生非常高的电场是基于一几何概念：从位于椭球反射体的一个焦点的点源辐射出的能量被聚焦在第二个焦点处。图8中示出了该概念及其将电磁能量聚焦在组织内的微小区域中的应用。该源放置于椭球反射体左侧的焦点处。反射自该反射体的电磁波被聚焦在位于组织中的第二焦点(右侧)。为了降低组织表面的反射，填充组织外部空间的介质的复值电容率值与组织的电容率大致相同。图9A和9B中给出了组织值的示例。表1还示出了使用时域介电谱技术测得的生物细胞的电参数。1ns范围(基频约为100MHz到1GHz)内的电容率介于10到100之间。电导率在0.02到1S/m之间变化。

观察到亚纳秒时间范围的单个脉冲有凋亡效果可能将这种脉冲用于凋亡诱导非常重要的治疗：所有类型的有害细胞和组织，特别是肿瘤的除去。现在正使用电极作为细胞悬液或组织的脉冲递送系统来研究这些效果[10]。然而对于治疗应用，利用诸如针或板等电极使得脉冲电场法局限于治疗接近身体表面的组织。另一方面，利用天线能将电场施加于用针不容易达到的组织(肿瘤)。同时，将电能量聚焦于靶标将减少对靶标周围的皮肤和正常组织层的损伤。

在这方面，如下所述，利用亚纳秒脉冲不仅允许我们将脉冲电场与生物细胞的相互作用扩展到新类型的时域，还能够使用超宽带天线将这些脉冲递送至体内的靶标。超短脉冲持续时长确定了此类脉冲可能的空间分辨率，其可以达到允许对身体的特定部分进行定靶的范围。对于0.8ns宽带的脉冲，截止频率约为0.75GHz。因此，在介电常数为80的组织中，对应于该截止频率的波长约为5cm，该值确定了该脉冲在组织中的空间分辨率。

在另一优选实施例中，天线包括椭球反射体和/或抛物面反射体。使用包含聚焦透镜的天线可将脉冲聚焦到诸如异常或肿瘤细胞、组织等感兴趣的区域。

在另一优选实施例中，对脂肪组织使用该装置以“分解(dissolve)”过度的脂肪。

在另一优选实施例中，该装置产生电场来调节激素失衡、治疗新陈代谢失调、神经递质释放、治疗疼痛等。电场脉冲已显示，例如能影响已知可调节许多细胞功能的钙释放。

在一个方面，甲状腺疾病的患者可使用本文所述的脉冲场进行治疗。靶器官可以是甲状腺。

给予以下示例仅是说明性而非限制性的。虽然已经提供了具体示例，但以上描述是说明性而非限制性的。先前所述实施例的任意一个或多个特征可以与本发明的任何其它实施例的一个或多个特征以任意方式组合。此外，阅读本说明书后，本发明的许多变形对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，不应参照以上描述来确定本发明的范围，而应参照所附权利要求及其等效方案的全部范围来确定。

如同每份出版物或专利文献单独标示出的程度一样，本申请所引用的所有出版物和专利文献出于所有用途通过引用包括在相关部分中。通过本文档中各个参考文献的引用，申请人不承认任何特定参考文献是其发明的“现有技术”。

示例

示例1：利用超短电脉冲对细胞功能进行细胞和细胞内操作以及将电脉冲靶向递送至细胞培养物和组织中的方法和装置。高强度纳秒电脉冲对生物细胞和组织的效果，特别是在过去5年中已经受到了科学团体的相当关注，已经建立了新的研究领域：生物电学[1]。在该时间域中，脉冲的上升时间比质膜的充电时间块，即意味着该场将穿过膜到细胞质中。将细胞视作电路、通过它们的电容来描述各种细胞膜、以及通过其电阻来描述它们所封闭的细胞质，可以定性地理解该效果。图1A示出了哺乳动物细胞的剖面，其中所示的唯一膜分界的亚结构是细胞核。与其它细胞器中的核质和细胞质一样，填充细胞大部分的细胞质包含溶解的蛋白质、电解液和葡萄糖，且适度导电。另一方面，包围细胞和亚细胞结构的膜的电导率低。因此，我们可将细胞视作由理想绝缘外壳包围且包含特性相似的亚结构的电导体。图1B中示出了含有一个亚结构、细胞核的这种细胞的等效电路(出于建模目的，考虑为球形)。

如果施加了长持续时长(与由外膜形成的电容器的充电时间相比)的直流电场或脉冲，则最终只有该外膜将被充电；对于理想的完全绝缘外膜，充电期间跨亚细胞膜产生的电场将为0。然而，在外膜的充电期间，我们还将期望产生跨亚细胞膜的电势差，这是一种脉冲上升时间越短将越强的效应。这种充电时间对于人体细胞在亚微秒范围内。

如果场足够大，则其对于胞内细胞器效应较强。纳秒到数百纳秒长的高电压脉冲已显示能穿透活细胞从而透化处理细胞内的细胞器[2，3]以及从内质网释放Ca²⁺[4，5，6]。它们提供了一种具有许多应用的物理靶向细胞内细胞器的新方法，所述应用包括精确控制凋亡[7，8]和增强基因转染效率[8，9]。我们还证明这种脉冲电场导致黑素瘤肿瘤的缩小，甚至完全消除[参见示例3]。

从亚微秒脉冲到亚纳秒脉冲：进入场-细胞相互作用的新区域：在图1B中所示的等效电路中，膜的导电性假定为0，忽略细胞质和核质的电容分量。时间范围分别由膜和细胞质及核质的介电松弛时间所确定。为了简单起见，在以下讨论中，我们将集中在生物细胞的单壳模型上，这意味着不考虑对内部膜分界结构的效应。(图2中示出了这种情况的等效电路)。然而，从该单壳模型的讨论得出的相同结论显示不难扩展以预测内部细胞结构的电效应。

在膜充电和电穿孔以及胞内电操作的大多数模型中，假设膜是完美的绝缘体并且细胞内外的液体的电容率总可以忽略。该假设将单壳细胞的通用等效电路简化到图3所示的电路。该等效电路非常适于描述细胞膜上的穿孔过程且显示了相对于膜的介电松弛时间(电阻与电容率的乘积)较短的时间和相对于细胞质和核质的介电松弛时间较长的时间。基于哺乳动物细胞的电特性的数据[11]，该等效电路(图5)的脉冲持续时长范围取决于细胞类型，适用于约1纳秒到数微秒。

表1.使用时域介电谱技术测得的生物细胞的电参数

表1.所研究的所有细胞群体的细胞结构部分的介电参数。该拟合是通过设定以下参数作出的。

ε_m＝60，ε_np＝120，d＝7nm，d_n＝40nm，以及R_n＝R·(0.6)^1/3

ε_cm：质膜的电容率；C_m：质膜的电容；σ_m：质膜的电导率；ε_ne：核被膜的电容率；C_ne：核被膜的电容；σ_ne：核被膜的电导率；σ_cp：细胞质的电导率；σ_np：核质的电导率；ε_cp：细胞质的电容率；ε_ne：核质的电容率；d：质膜的厚度；d_n：核膜的厚度；R_n/R：核与细胞直径之比。

对于非常短的脉冲，电场分布由介质的介电属性而非电阻特性确定。随后单壳细胞的等效电路仅由介电特性确定。细胞质阻抗中的电阻项相比于电容项可忽略的条件要求脉冲持续时长相比于细胞质的介电松弛时间(ε_cp/σ_cp)较短。基于表1中所列数据，这仅在脉冲持续时长处于一纳秒的量级或更小的情况下为真。然后通过电流密度的连续性确定细胞各部分中的电场。对于相对介电常数为8的膜，膜中的电场比介电常数为80的相邻细胞质中的电场高10倍。随后电场直接作用于分子而不导致膜充电，如果电场足够强则可导致诸如电压选通等直接和即时的构象改变。

脉冲持续时长短于细胞质、核质、以及细胞周围介质的介电松弛时间常数的条件确定了操作范围，该范围开启了细胞对脉冲电场应答的新时间区域。R.Joshi使用分子动态模拟的第一建模结果[12]已经显示施加极短的脉冲时可以预期这种构象改变。

用于亚纳秒生物电学研究的脉冲功率系统：为了探究生物电学中的新方案，电脉冲的特性参数需要处于细胞质、核质、和上清液的松弛时间的量级或更小。这是小于1纳秒的值。已经设计和制造出了能够向生物负载提供亚纳秒脉冲的脉冲功率系统。这种火花隙开关脉冲功率设备的优点是高电压、低阻抗、以及成本较低。缺点是有限的重复率。基于半导体开关的脉冲功率发生器可在突发模式下以高达50kHz的重复率工作，而基于火花隙开关的系统一般局限于约100Hz。

图5中示出了该实验系统的框图，包括辐照系统的剖面。

该系统能够在50Ω负载中产生振幅为350kV的0.8ns电场脉冲。在高阻抗负载上测得的电压达到700kV的值。间隙距离为4.25mm时相应的电场为1.5MV/cm。图6中示出了电压和电流脉冲波形。尽管电场极大，但并未观察到电击穿。这与用200和400ns脉冲所得结果一致，在该情况下针-板电极构造中水的击穿电场达到这些值。在与水击穿实验中所用的相比，将脉冲持续时长振幅降低了两个数量级的情况下，即使亚纳秒范围内的数个MV/cm也不会导致击穿。

亚纳秒脉冲对生物细胞的效应：实验结果：为了确定对生物细胞的非致死亚纳秒脉冲效应，我们在生理性介质中使用B16黑素瘤细胞作为靶细胞。向悬液中加入台盼蓝。台盼蓝是在进入细胞后结合到DNA的活体染料(vital dye)，其自身发出光谱中蓝色范围的荧光。由于台盼蓝仅在膜分解后进入细胞，所以它一般用来指示细胞死亡。辐照后用显微镜计数细胞，记录活细胞与死细胞(由台盼蓝摄取所表明)之比。

悬液中的B16细胞被曝露于0.7MV/cm振幅的单个脉冲的实验显示对细胞的活力仅有较小的效应。然而检测胱冬酶活化(指示凋亡)显示其细胞经过0.8ns脉冲的辐照两个小时后有相当增长(图7)。因此可以预期施加多次超短脉冲将导致悬液中的细胞以及组织中的细胞通过凋亡而死亡。

然而，当在辐照数小时之后检测细胞活力时，观察到活力严重下降(图8)。尽管对照细胞的成活力几乎保持恒定在95％，但仅一次脉冲辐照后的经脉冲B16细胞的活力经过8小时的时间降到了50％的值。相应的平均死亡率是5％/小时。该值在24个小时后稳定(待显示)。活力的这种延时改变表明发生了程序性细胞死亡、凋亡(参见[16])。在被这种巨大的电场脉冲击中后，大部分细胞明显严重受损，从而在最初的修复努力后开始程序性细胞死亡。已知这种死亡在物理或化学损伤后数小时的时间段标中发生，与我们的结果一致。

从侵入性递送系统到天线：观察到亚纳秒时间范围的单个脉冲有凋亡效应可能将这种脉冲用于凋亡诱导非常重要的治疗：所有类型的有害细胞和组织，特别是肿瘤的除去。现在正使用电极作为对细胞悬液或组织的脉冲递送系统来研究这些效果[10]。然而对于治疗应用，利用诸如针或板等电极使得脉冲电场法局限于治疗接近身体表面的组织。另一方面，利用天线能将电场施加于用针不容易达到的组织(肿瘤)。同时，将电能量聚焦于靶标将减少对靶标周围的皮肤和正常组织层的损伤。

在这方面，如下所述，利用亚纳秒脉冲不仅允许我们将脉冲电场与生物细胞的相互作用扩展到新类型的时域，还能够使用超宽带天线将这些脉冲递送至体内的靶标。超短脉冲持续时长确定了此类脉冲的可能的空间分辨率，其可以达到允许对身体的特定部分进行定靶的范围。对于0.8ns宽带的脉冲，截止频率约为0.75GHz。因此，在介电常数为80的组织中，对应于该截止频率的波长约为5cm，该值确定了该脉冲在组织中的空间分辨率。其表明将脉冲持续时长降到绝对最小至关重要。

一般而言，宽带天线设计适于在远场产生较大的电磁场。这种天线的示例在距离天线100m的距离产生600V/cm的电场。然而对于生物电学应用，在较小的区域中产生甚至更大的电场很重要。能让我们在有限区域中产生非常高电场的设计是基于一几何概念：从位于椭球反射体的一个焦点处的点源辐射出的能量被聚焦在第二个焦点处。图8中示出了该概念及其将电磁能量聚焦在组织内的微小区域中的应用。该源放置于椭球反射体左侧的焦点处。反射自该反射体的电磁波被聚焦在位于组织中的第二焦点(右侧)。为了降低组织表面的反射，填充组织外部空间的介质的复值电容率与组织的电容率大致相同。图9A和9B中给出了组织值的示例。1ns范围(基频约为100MHz到1GHz)内的电容率介于10到100之间。电导率在0.02到1S/m之间变化。这些值可以通过混合水与低电容率液体获得。然而，由于这种液体的电导率相对较大，波从源传播到靶标的衰减可极大限制靶标处可得到的电场。折衷方法是使用低电导率(经蒸馏和去离子的)水或其它极性液体、或者甚至诸如油等非极性液体。

基于对整个仿真区域采用“绝对吸收边界条件”的麦克斯韦求解器，利用时域计算通过四分之一波长偶极子的仿真对椭球天线的焦点处电场的产生进行建模。已使用了现有的仿真工具数值软件包(MAGIC)。图10、11、12和13中绘出了天线和源的几何(特性)、在最大场时电场强度在第二焦点处的空间分布、以及振幅在靶标处的时间展开。作为人体一部分的靶标正好放于电场集中度最高的地方即第二焦点处。计算清楚地显示天线以及脉冲持续时长的影响：采用最近的天线(图10和12)和短脉冲(图12和13)获得了最优结果。所有情形中施加的电压为100kV。

示例2：用于组织中的近场操作的超宽带天线

对于单个和多个脉冲操作，当施加10ns脉冲时细胞内电处理要求10kV/cm到300kV/cm量级的电场。电场强度的范围反映了以下效应的范围：对于低电场，我们观察到基于钙释放的非致死效应，而对于高电场，已实现了凋亡。这是对应于单个脉冲操作的情形。对于10ns的多个脉冲操作，电场可以降到低于100kV/cm的值且仍能观察到凋亡。除了电场，脉冲持续时长也起重要作用。基于实验结果，任何细胞内效应似乎与脉冲持续时长和电场强度的乘积成比例。这意味着脉冲持续时长的任何降低需要增大电场来补偿。假定在多脉冲条件下，对于1ns脉冲，凋亡将要求电场接近1MV/cm。对于诸如钙释放等非致死效应(进而又可具有诸如血小板活化、神经刺激等许多二级效应)，所要求的电场将较低，但可能仍在数百kV/cm的范围内。

天线参数：为了利用大小和功率合理的天线产生该振幅的电场，使细胞、组织或患者被暴露于天线的近场。近场定义为半径小于波长除以2π的球形区域。

为了将这些场“聚焦”有限空间区域中，使用了叠加原理(对于远场应用，该原理用于相控阵天线中)。以cm的空间分辨率进行聚焦要求宽度脉冲发生器的基波长处于同一量级。对于空气，这将要求总持续时长为30ps的双极脉冲。对于介电常数为81的水，这增加到270ps或0.27ns。持续时长1ns的脉冲将提供3cm的空间分辨率。

使用宽带天线，脉冲发生器的构造包括以下特征：脉冲持续时长：＜1ns；电压：＜1MV；阻抗：千欧量级。

已经有了200kV、1ns脉冲器。使用同样的马科斯组概念来构造电压更高的系统。为了使用叠加原理，可使用双同轴天线，其中两个波可在需要时经过相移以实现最高场。使用现有代码“MAGIC

”的建模结果表明该方法是成功的。利用Kerr效应测量与组织电特性相似的水中的电场分布。Mach-Zehnder干涉仪是可用的且已在评估水放电中得到测试。本发明包括：高电压(高达兆伏)纳秒脉冲发生器；双同轴天线；根据这两个同轴波之间的相移来对组织中的电场分布建模，并利用Kerr效应测量水中的电场分布。

天线参数：1。近场天线(靶标非常靠近电磁波源)。(a)为了利用大小和功率合理的天线产生该振幅的电场，将细胞、组织置于天线的近场。近场定义为由半径小于波长除以2π的球形区域。(b)电极维度确定了这种近场“天线”的空间分辨率。在用作导管的同轴电缆中，这将是中心导体的直径和到周围的同轴导体的距离。在中心导体被两个同轴圆柱——其中内同轴电缆递送一个脉冲而外同轴电缆(由两个外同轴导体所确定)递送第二个经过相移的脉冲——所包围的双同轴天线中，使用叠加原理(对于远场应用，该原理用于相控阵天线系统中)来将这些场“聚焦”在有限的空间区域中。(c)在双同轴系统中，以厘米级的空间分辨率进行聚焦要求宽带脉冲发生器的基波长处于同一量级。对于空气，这将要求总持续时长为30ps的双极脉冲。对于介电常数为81的水，这增加到270ps或0.27ns。持续时长1ns的脉冲将提供3cm的空间分辨率。

天线参数2。聚焦天线(靶到源的距离由可以为透镜或反射镜的聚焦设备确定)。a)为了利用大小和功率合理的天线产生该振幅的电场，将细胞、组织置于天线的焦点区域中。焦点区域定义为由以焦点为中心、半径处于波长量级的球形区域。(b)为了将这些场聚焦在有限空间区域中，使用聚焦反射镜或透镜。(c)以cm量级的空间分辨率进行聚焦要求宽带脉冲发生器的基波长处于同一量级。对于空气，这将要求总持续时长为30ps的双极脉冲。对于介电常数为81的水，这增加到270ps或0.27ns。持续时长1ns的脉冲将提供3cm的空间分辨率。

示例3：纳秒脉冲电场导致黑素瘤自毁

几种不同类型的癌症疗法中已利用了电场。其中一些涉及将肿瘤加热到大于43℃以通过高温杀伤细胞的射频或微波设备。其它使用脉冲电场来透化处理癌细胞，从而能导入毒素或DNA。我们发现超短电脉冲可用作杀伤肿瘤和异常细胞而无需高温或药物的纯粹癌症电疗法。本实验室的先前工作发现与同一动物中的对照肉瘤相比，用10个300ns脉冲体内处理纤维肉瘤呈现生长率降低(S.J.Beebe等，IEEE Trans.Plasma Sci.30(2002)286-292)。这里，我们公布，当用400个这样的脉冲处理黑素瘤时，两周内肿瘤收缩90％且随后的处理可导致完全消退。

这些纳秒脉冲电场(nsPEF)的主要特性是它们的低能量导致发热量非常低，和它们穿入细胞对胞内细胞器进行透化处理(K.H.Schoenbach，et al，Bioelectromagnetics 22(2001)440-448；E.S.Buescher，et al，IEEE Trans.Dielect.ElIn.10(2003)788-794)以及从内质网释放钙(J.A.White等，J.Biol Chem 279(2004)22964-22972)的能力。它们提供了一种具有许多应用的物理靶向胞内细胞器的新方法，所述应用包括引起培养细胞和肿瘤中的凋亡、提高基因转染效率和抑制肿瘤生长。在往年，我们已经用持续时长300ns的40kV/cm的电场脉冲对120只小鼠中的300个鼠黑素瘤进行了治疗并取得了显著效果。经过400个这种脉冲的照射的每个肿瘤呈现快速固缩和血流降低，两周内平均收缩90％。300个脉冲的第二次治疗可使黑素瘤完全消退。这种仅为210μs的非常短的场总辐照时间促使黑素瘤自毁而无需药物且没有明显副作用。这些纳秒脉冲电场如何穿入细胞并且具有这些显著效果？

该nsPEF治疗的功效取决于两个独立的电场参数：脉冲持续时长和振幅。脉冲持续时长的效应可以通过考虑将细胞置于电场中时膜充电的过程来理解。细胞内的离子对电场起反应而沿着电场方向移动并对高电阻膜进行充电直至它们不再受力。根据定义，这仅发生在它们的重新分布建立了相等且相反的场以使得细胞内部的净电场为零。然而，这种重新分布需要一定的时间量，该时间量由质膜的充电时间常数所表征，通常在0.1-1μs的范围内。如果nsPEF短于该充电时间，则内部电荷将没有充足的时间来重新分布以抵消所施加的场，并且它将穿入细胞并对每个细胞器膜充电，所述充电的持续时间取决于细胞的质膜充电时间常数和细胞器膜的充电时间常数。

第二个关键nsPEF参数是脉冲的振幅。施加在电荷上的力以及脂质膜的电穿孔取决于电场的强度。当跨细胞膜的电场超过约1V(对于直径10μm的细胞为2kV/cm)时，在膜的脂双层中形成由水填充的孔且这些孔的大小和寿命取决于电场脉冲的强度和持续时长。振幅超过2kV/cm且脉冲持续时长在毫秒范围时形成大孔，从而使膜电穿孔，进而用于将正常不能渗透的抗癌药物引入靶组织(J，Teissie等，Biochim.Biophys.Acta 1724(2005)270-280)。对于这些长脉冲，脉冲振幅限于2kV/cm以避免热效应。由于发热与脉冲持续时长和场强的平方正比例，所以纳秒范围内的非常短的脉冲在具有较高场强的同时向组织递送同样低水平的热能。这里，我们使用40kV/cm的20倍较高场强，该场强导致质膜产生结构变化，进而在脉冲的持续时间内产生跨细胞器的更小电势垒以及更高电压梯度。每个脉冲期间，直径10μm的典型肿瘤细胞核跨其直径将经受约40V的电压梯度。该电场足够大，从而能导致电极变形(R.P.Joshi等，Phys.Rev.E Stat.Nonlin.Soft.Matter Phys.65(2002)021913)。

细胞组织培养。从ATCC(马纳萨斯，弗吉尼亚州)获得鼠黑素瘤B16-F10细胞并将其冷冻存储在液氮中待用。它们在37℃水槽中融化，然后转移到包含补充了10％牛胎儿血清(FBS，亚特兰大生物制剂)、4毫摩尔谷氨酰胺(赛尔格若(cellgro))、和2％的青霉素-链霉素溶液(赛尔格若)的DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)的培养瓶中。37℃，在5％CO₂/95％空气/100％加湿孵育器中培养这些细胞。

黑素瘤诱导。通过在松弛的蜂窝组织中于皮肤下注射包含10⁶个B16-F10鼠黑素瘤细胞，在120只雌性SKH-I小鼠(免疫活性、无毛、白化品系、查理斯河，威尔明顿，马塞诸塞州)中诱导两个到四个肿瘤。在几天内就可在注射部位看到黑素瘤肿瘤。在5天内，肿瘤通常有3mm宽且已经呈现血管生成。不作处理的肿瘤在几周内生长至10mm宽或更大。对于所有动物研究，用氧气配制的1.6％异氟烷吸入麻醉小鼠。用5针电极阵列处理小鼠#4到#63中的肿瘤，用平行板电极处理#64到#120。在典型实验中，两个肿瘤用作对照而同一小鼠身上的其它两个用nsPEF处理。

体内成像。利用1.2x放大率的透照和表面照相每天对黑素瘤进行成像，还从小鼠50开始拍摄超声波图像。利用Visualsonics Vevo 770(视觉声学公司，多伦多，加拿大)对活体内肿瘤进行成像。我们使用他们的55MHz的708型扫描头和步进电机扫描器获得30μm的空间分辨率。能量多普勒模式提供了每个肿瘤的血流图像。

组织学。对小鼠施以安乐死之后立即在肿瘤部位的皮肤下向松弛的蜂窝层注射磷酸缓冲的福尔马林(10％)，15分钟后解剖肿瘤。室温下将肿瘤放在福尔马林固定剂(至少20X肿瘤体)中24-48个小时。修整肿瘤和周围皮肤，对外表面和内表面都拍照。固定的肿瘤经标准的30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％X3乙醇连续脱水、在100％X2二甲苯中清洁、60℃在熔融的石蜡槽X2中浸润(各自为1小时)，随后包埋入石蜡块中。切割出7微米厚的切片并用苏木精和曙红染色。

脉冲发生器。我们使用阻抗为75Ω的脉冲形成网络。它包括以Blumlein构造排列的30对高电压电容器和30个电感器，产生300ns长的高电压脉冲(J.F.KoIb，S.Kono，K.H.Schoenbach，用于亚细胞效应研究的纳秒脉冲电场发生器，生物电磁学(Nanosecond pulsed electric field generators for the study ofsubcellular effects，Bioelectromagnetics)(2006)，印刷中)(图16A和16B)。脉冲最初借助火花隙触发，随后用由微控制器控制的水银位移继电器代替。使用高电压探针(P6015A，泰克(Tektronix)，比佛顿，加利福尼亚州)监测跨靶标的电压，利用Pearson线圈(模型2877，皮尔森电子公司，帕洛阿尔托，加利福尼亚州)测量电流。使用数字示波器(TDS3052，泰克(Tektronix)，比佛顿，俄勒冈)同时记录电流和电压。

施加电场的电极：我们使用5针阵列和平行板这两类电极。针阵列(图17A和17B)利用从特氟隆基底伸出2mm的30号皮下注射针(300lm直径)制成。中央的针是阳极，而与中央电极相隔4mm的4个周围针连在一起形成阴极。在针插入之前用植物油对皮肤进行涂敷以增加沿皮肤的击穿场强并降低施加脉冲电场期间针之间产生飞弧的可能性。平行板电极(图21A)由直径为3-5mm——取决于所治疗肿瘤的大小——的不锈钢制成。我们用0.5mm厚的导电琼脂(2％琼脂配制的1M NaCl)层来镀敷电极以隔开皮肤与电极。为了治疗，每个肿瘤以0.5-1mm的间距放置于两个板之间，同时以0.5Hz的频率施加100个持续时长为300ns及振幅为4-8kV且上升时间约为30ns的脉冲。

胱冬酶活化的体外测定。在经过nsPEF辐照之后，体外测定黑素瘤肿瘤提取物的胱冬酶活性。解剖出小鼠的黑素瘤并将其冷冻在液氮中。从解冻的组织均浆液制备提取物并如先前所述(L.K.Parvathenani等J，Biol.Chem.273(1998)6736-6743)使用产萤光的底物Ac-DEVD-AFC(亚历克西斯生物制剂，圣地亚哥，加利福尼亚)检测胱冬酶活性。对于胱冬酶1、3、4和7，该肽序列是基于PARP切割位点，Asp²¹⁶，其在切割后呈现增强的荧光。简言之，提取物与50 1 M DEVD-AFC(Asp-Glu-Val-Asp-AFC)孵育并测定荧光(激发400nm以及发射505nm)。胱冬酶单位定义为每毫克提取物蛋白质每分钟切割底物的皮克摩尔数。

结果和讨论：使用两种不同电极构造施加电场。第一种是针刺进小鼠皮肤约2mm的5针电极阵列(图17A)。在59只小鼠中，中央的针放于要处理的黑素瘤中心而外围4根针在黑素瘤的边界边缘之外。该电极呈现出极不均匀的场，其中场线平行于皮肤的表面且在靠近中央电极处最强(图17B)。该针阵列插入黑素瘤中数分钟，再移除，则黑素瘤继续正常生长(图18H-18M)。然而，如果在针阵列移除之前向其实施了100个脉冲(8kV、300ns、0.5Hz)，则黑素瘤在两天内开始收缩(图18O-18T)。在施加脉冲之后肿瘤的血流被破坏，因为红血球从肿瘤周围的毛细血管渗漏(图18P)。局部血流在两周内通常不能恢复。在施加脉冲两天后，角质层显示出坏死和出血的迹象并伴有表皮的浅表糜烂且肿瘤变暗(图18Q)。这提示除了肿瘤细胞外，300ns脉冲电场(nsPEF)损伤了电极之间分化成角质层的皮肤表皮细胞。我们通过处理没有黑素瘤的皮肤区域并经过相同时间段观察类似的浅表糜烂确认了这点(图18A-18F)。使与表皮接触的针的上部轴绝缘可以降低该损伤。

该肿瘤应答取决于电场强度和脉冲数两者。如果使用4kV脉冲(10kV/cm的平均电场)将电场强度减半，则在处理和对照肿瘤的生长率之间没有显著差异(图19A)。对于施加10个和100个脉冲的情形也是如此(图19B)。8kV脉冲(20kV/cm场)的脉冲数依存性更明显，其中对100个脉冲的应答比对10个脉冲的应答更强(图19C和19D)，给予2次100个脉冲的处理时甚至更强(图19E)。在后一条件下，肿瘤在8天内收缩约75％。

使用的第二种电极构造涉及将肿瘤放在两块平行板之间(图21A)。两块平行板之间的电场除了边缘处之外是均匀的，使得板间的所有细胞都将经受相同场强辐照。在通过以下方式处理48只小鼠时使用这些电极：将包含黑素瘤的皮肤褶皱拉离小鼠，将其放在电极之间，从而使得整个肿瘤置于板间。因此，场的方向垂直于皮肤表面而不是像针电极那样平行于皮肤表面。板间的距离通常为0.5-1mm，这取决于肿瘤厚度。基于我们先前利用针电极所得结果，我们使用40kV/cm的场强，图20A-20D中示出了对采用这种电极构造的纳秒脉冲的典型应答。这两类电极之间的差异是从处理两天之后开始的皮肤外观。黑疤出现在脉冲区域中的角质层上，由于角质层再生而保持约两周(图20B)。该疤的组织学检查表明它由凝结的红血球组成。在使用板电极进行4次100个脉冲的处理(第0天3次以及第5天1次)之后，肿瘤一般在两周内收缩90％(图21B)。然而大约消退两周后，所有肿瘤开始再次生长，此时我们处死了小鼠以能对肿瘤进行组织学固定和切片。

多次处理导致肿瘤完全消退。当初次处理两到三周后肿瘤停止收缩时，我们开始采用第二次3天系列的100个脉冲来处理它们。现在在3个完成的案例中，我们观察到肿瘤完全消退，一个示例在图22中示出。在初次处理的两个月内，透照、超声波或连续切片组织检查未检测到黑素瘤。我们相信进一步优化nsPEF参数将能高效地常规消除这些皮肤肿瘤。

nsPEF仅将肿瘤温度提高了3℃。如果板间距为1mm，则递送到5mm板之间的组织中的能量是0.2J。假设为水的比热，这使组织温度只增加两到三度。我们向肿瘤中插入非常小的热电偶来测量该温度增加，确定在100个脉冲之后达到的最大温度是33℃(图23A-23B)。这比高温效应所要求的最低温度低10度，所以nsPEF对肿瘤生长的效应是高温所致不可能。

nsPEF效应的靶标和潜在机制：我们已鉴定了施加电场脉冲后肿瘤中可能造成肿瘤消退的两个即刻变化：(1)肿瘤细胞核迅速变得固缩以及(2)血液停止流向肿瘤。未处理的肿瘤细胞呈现轻度染色的多形核以及包含细微分散的黑素颗粒的丰富细胞质(图24A-24E)。经处理的肿瘤呈现稠密染色的收缩核以及单个细胞的细胞粘着障碍(dyshesion)，所述细胞含有粗糙的胞内黑素颗粒及在加宽的细胞间隙中有凝聚的胞外黑素颗粒。施加脉冲后的数分钟内肿瘤细胞核收缩54％，3小时内收缩68％。肿瘤大小减小了90％后的两周内没有发生进一步的核收缩(图24E)。部分肿瘤核沿电场轴伸长，但并不总能观察到。由于处理后1小时和3小时的细胞密度更高，所以在该时间段内肿瘤细胞本身也收缩。脉冲施加后核固缩发生得比任何先前观察到的固缩应答(S.M.Albarenque，K.Doi，Exp.Mol.Pathol.78(2005)144-149)更快，可能是由于电变形或直接电场与细胞的核纤层相关细胞支架元素的相互作用而产生核伸长和收缩(P.K.Wong，等，J.Biomech.38(2005)529-535；Y.Gruenbaum等，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.6(2005)21-31)。

即刻观察到的第二个主要变化是肿瘤的血流降低。透照和能量多普勒超声波重建都表明在施加脉冲后约15分钟内血流已停止(图25A-25D)。组织学证实发现红血球散布在黑素肿瘤内和周围。这暗示局部血管变得泄漏且红血球逸入周围组织。肿瘤的血流在约两周内通常不能恢复。如果血流恢复，则肿瘤通常开始再次生长。黑素瘤缺乏血流必然导致其消退。

我们还寻找典型的凋亡标志--胱冬酶活性的变化。在3次实验中，我们在100个脉冲处理后的第0、3、6、和9小时用荧光底物Ac-DEVD-AFC测量胱冬酶活性。胱冬酶活性显示提高的唯一一次是第3小时，此时平均活性提高2.6倍。然而，该微小改变不符合常态t测试和Mann-Whitney秩和检验，从而表明它不是统计学显著的差异。(p＝0.1)。引起凋亡程序是可能的，但是由于凋亡是要求能量的过程，肿瘤的供血中断可能会阻碍凋亡机制的完成。

我们的数据支持nsPEF可造成DNA损伤的假设。诱导该损伤的确切机制还不明确。两个可能的机制包括凋亡途径中脱氧核糖核酸酶的活化或机械诱导DNA断裂。测得直径为10lm的典型肿瘤细胞核在每次脉冲期间将经受穿过其自身的约40V的电压梯度。该电场足够大，从而导致核发生快速电机械形变而对附着在该核被膜上的DNA产生机械冲击，进而可能破坏该DNA。这些nsPEF通过触发快速固缩并减少血流来刺激鼠黑素瘤自毁而胱冬酶活性没有显著增大。电化疗法后也观察到肿瘤的血流减少，但是不会一直发生直到治疗后的24小时，此时博来霉素进入已经破坏了内皮细胞。相反，nsPEF无需药物即能明显减少肿瘤的血流。对脉冲电场施加的新纳秒时域的细胞应答是新颖而致命的。这相对于皮肤损伤的外科去除具有一些优点，因为真皮上的切口经常在愈合后的皮肤上留下瘢痕。NsPEF能影响肿瘤而不损伤真皮，因而减小了留下瘢痕的可能性。nsPEF对位于身体深处的其它肿瘤类型也应是有效的，只要能将导管电极导向该肿瘤。这种高度定位和无需药物的物理技术为肿瘤治疗提供了一种有前景的新疗法。

其它实施例

应该理解的是，虽然已结合本发明的详述对其进行了描述，但以上描述旨在说明而非限制由所附权利要求限定的本发明范围。其它方面、优点、和变形属于以下权利要求的范围。

虽然以上说明书包含许多细节，但这些细节不应理解为对本发明范围的限制，而是本发明的优选实施例的示例。许多其它变形也是可能的。因此，本发明的范围不应由所示实施例确定，而应由所附权利要求及其合法的等效方案确定。

本文引述的所有参考文献都通过引用结合于此。

参考文献

[1]Schoenbaoh，K.H.，Joshi，R.P.，KoIb，J.F.，Chen，N.，Stacey，M.，Blackmore，P.F.，Buescher，E.S.，和Beebe，SJ.，(2004)“超短电脉冲开启了进入生物细胞的新入口(Ultrashort Electrical Pulses Open a New Gatewayinto Biological Cells)”，Proc.IEEE5 92，1122。

[2]Schoenbach，K.H.，Beebe，SJ.，和Buescher，E.S.(2001).“超短电脉冲的细胞内效应(Intracellular effect of ultrashort electrical pulses)”，Bioelectromagnetics 22，440-448。

[3]Buescher，E.S.和Schoenbach，K.H.(2003).“亚微秒高强度脉冲电场对活细胞-细胞内电处理的效应(Effects of submicrosecond，high intensitypulsed electric fields on living cells-intracellular electromanipulation”，IEEETransactions on Dielectrics and Electrical Insulation 10，788-794。

[4]Vernier，P.T.，Sun，Y.H.，Marcu，L.，Craft，CM.，和Gundersen，M.A.(2004).“纳秒脉冲电场扰乱T成淋巴细胞中的膜磷脂(Nanosecond pulsedelectric fields perturb membrane phospholipids in T lymphoblasts)”，FEBSLett.572，103-108。

[5]White，J.A.，Blackmore，P.F.，Schoenbach，K.H.，和Beebe，SJ.(2004).“纳秒脉冲电场刺激库容性钙流入HL-60细胞(Stimulation of capacitativecalcium entry in HL-60 cells by nanosecond pulsed electric fields)”，J.Biol.Chem 279，22964-22972。

[6]Buescher，E.S.，Smith，R.R.，和Schoenbach，K.H.(2004).“对细胞内自由钙的亚微秒强脉冲电场效应：机制和效应(Submicrosecond intensepulsed electric field effects on intracellular free calcium：Mechanisms andeffects)”，IEEE Transactions on Plasma Science 32，1563-1572。

[7]Beebe，S.J.，Fox，P.M.，Rec，LJ.，Willis，EL.，和Schoenbach，K.H.(2003a).“纳秒高强度脉冲电场在人体细胞中诱导凋亡(Nanosecond，high-intensity pulsed electric fields induce apoptosis in human cells)”，FASEBJ.17，1493-1495。

[8]Beebe，SJ.，Blackmore，P.F.，White，L，Joshi，R.P.，和Schoenbach，K.H.(2004b).“纳秒脉冲电场通过细胞内信号换能机制调节细胞功能(Nanosecond pulsed electric fields modulate cell function throughintracellular signal transduction mechanisms)”，Physiol Meas.25，1077-1093。

[9]Beebe，SJ.，White，J.，Blackmore，P.F.，Deng，Y.，Somers，K.，和Schoenbach，K.H.(2003b).“纳秒脉冲电场对细胞和组织的不同效应(Diverse effects of nanosecond pulsed electric fields on cells and tissues)”，DNA Cell Biol.22，785-796。

[10]Nuccitelli，R.，Pliquett，U.，Chen，X.，Ford，W.，Swanson，J.，Beebe，SJ.，KoIb，J.F.，和Schoenbach，K.H.“纳秒脉冲电场导致黑素瘤自毁(Nanosecond pulsed electric fields cause melanomas to self-destruct)”，BBRC 343，351(2006)。

[11]Feldman，Yu.，Ermolina，L，和Hayashi，Y.，(2003)“生物系统的时域介电谱研究(Time domain dielectric spectroscopy study of biologicalsystems)”，IEEE Trans.Dielectrics and Electrical Insulation 10，pp.728-753。

[12]Hu，Q.，Joshi，R.P.，和Schoenbach，K.H.(2005)“经历高强度超短电脉冲的脂质膜中微毫孔形成和磷脂酰丝氨酸外化的模拟(Simulations ofnanopore formation and phosphatidylserine externalization in lipid membranessubjected to a high-intensity，ultrashort electric pulse)”，Phys.Rev.E.72，031902-1。

[13]Carey，W.J.，and Mayes，J.R.(2003)，“Marx发生器设计和实现(Marx Generator Design and Performance)”，Proc.Modulator Conf 2003，p.625。

[14]Shu Xiao，Juergen Kolb，Muhammad A.Malik，Xinpei Lu，MounirLaroussi，Ravindra P.Joshi，Edl Schamiloglu，Karl H.Schoenbach，“极性液体的电击穿和介电恢复(Electrical Breakdown and Dielectric Recovery of PolarLiquids)”，载于Trans.Plasma Science。

[15]S.Katsuki，H.Akiyama，A.Abou-Ghazala，and K.H.Schoenbach，“在水中线电极与平面电极之间的平行流光放电(Parallel StreamerDischarges Between Wire and Plane Electrodes in Water)”IEEE Trans.Dielectrics and Electrical Insulation 9，498-506(2002)。

[16]S.Afford，和S.Randhawa，“凋亡(Apoptosis)”，Mol.Path.53，55(2000)。

[17]Mayes，J.R.和Carey，WJ.，“使用Marx发生器的高电场强度RF能量的生成(The Generation of High Electric Field Strength RF Energy UsingMarx Generators)，Proc.Modulator Conference”，2003，p.236。

[18]Baum.C.E.，(2005)“在微小区域中产生较大瞬时电磁场：电磁内爆、传感器和仿真记录(Producing Large Transient Electromagnetic Fields ina Small Region：An Electromagnetic Implosion，Sensor and SimulationNotes)”，Note 501，August 2005。

[19]Foster，K.R.，(2000)“射频能量与生物系统的热机制和机制(Thermal and Nonthermal Mechanisms of Interaction of Radio-FrequencyEnergy with Biological Systems)”，IEEE Trans.Plasma Science 28，15。

[20]Andrei G.Pakhomov，Amy Phinney，John Ashmore，Kerfoot WalkerIII，Juergen Kolb，Susumu Kono，Karl H.Schoenbach，和Michael R.Murphy，“高强度10ns持续时长的电脉冲的细胞毒素效应的表征(Characterizationof the Cytotoxic Effect of High-Intensity，10-ns Duration Electrical Pulses)”，IEEE Trans.Plasma Science 32.1579-1586(2004)。

Claims (34)

1.一种装置，包括：

电场脉冲发生器；

电脉冲辐射器；以及

用于电磁波的聚焦反射体或聚焦透镜。

2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述电场脉冲发生器和/或电脉冲辐射器(发射器)包括电极、天线、电缆、同轴电缆、板极、以及辐射鳍。

3.如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述天线包括椭球反射体。

4.如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述天线包括抛物面反射体。

5.如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述天线包括聚焦透镜。

6.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述电脉冲发生器产生介于约0.1皮秒直到900纳秒(ns)之间的电压脉冲。

7.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述电场发生器产生最高达5MV/cm的电场。

8.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述电场发生器产生最高达10MV/cm的电场。

9.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述电场发生器产生10kV/cm到800kV/cm的电场。

10.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述电脉冲发生器产生小于或等于1纳秒(ns)的脉冲持续时长；小于或等于1MV的电压。

11.如权利要求1所述的装置，其特征在于，产生了振幅从约10kV到1MV且脉冲持续时长(半周期)范围从约10ps到5ns的单极子、偶极子、及振荡高电压脉冲。

12.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述电脉冲的能量被聚焦(用椭球天线)到细胞培养物、组织和器官中一界限明确的区域中或经过一较长的距离聚焦(用抛物面天线)。

13.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述电能量通过单根或多根同轴电缆或其它波导递送到组织中的靶位。

14.如权利要求1所述的装置，其特征在于，还包括：

包含要受超短脉冲辐照的细胞的一个或多个接受器；

绝缘体；

同轴电缆；

超宽带辐照室；

电流探针；

电容分压器；

包括示波器和触发器的筛选室；

增压容器中约20到30级的马科斯组；

脉冲形成网络；以及

截尾开关。

15.一种在细胞和组织中诱导凋亡的方法，包括：

使所述细胞或组织曝露于电场；

将所述电场聚焦到需要处理的细胞或组织上；以及

在细胞和组织中诱导凋亡。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述电场被聚焦到异常细胞或组织而不影响正常细胞。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述电场是由天线、电极、电缆、同轴电缆、板极、平行板极、针、以及辐射鳍来聚焦的。

18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述电场是用天线和反射体或透镜来聚焦的。

19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞曝露于至少约10到10000个脉冲，每天至少一次。

20.一种治疗癌症患者的方法，包括：

使所述患者经受电场；

将所述电场聚焦到癌细胞或包含癌细胞的组织；以及，

对癌症患者进行治疗。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述电场是被聚焦到异常细胞或包括异常细胞的组织上而不影响正常细胞。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述电场是由天线、电极、电缆、同轴电缆、板极、平行板极、针、以及辐射鳍来聚焦的。

23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述电场使用天线以及反射体或透镜来聚焦的。

24.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述癌细胞或包含癌的组织曝露于至少约10到10000个脉冲，每天至少一次。

25.一种对受感染性疾病生物感染的细胞和组织进行处理的方法，包括：

使所述细胞或组织曝露于电场；

将所述电场聚焦到需要处理的细胞或组织上；以及

对受感染性疾病生物感染的细胞和组织进行处理。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述电场被聚焦到异常细胞或组织上而不影响正常细胞。

27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述电场是由天线、电极、电缆、同轴电缆、板极、平行板极、针、以及辐射鳍来聚焦的。

28.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述电场是用天线和反射体来聚焦的。

29.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述细胞曝露于至少约50到1000个脉冲，每天至少一次。

30.一种用于在细胞中诱导钙释放的方法，包括：

使所述细胞或组织经曝露于电场；

将所述电场聚焦到需要处理的细胞或组织上；以及，

在细胞中诱导钙释放。

31.一种改变细胞结构和功能的方法，包括：

使所述细胞或组织曝露于电场；

将所述电场聚焦到需要处理的细胞或组织上；以及，

改变细胞结构和功能。

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述细胞结构是胞内的和胞外的。

33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述细胞结构包括：线粒体、内质网、核、核仁、高尔基体、DNA、RNA、信使RNA、蛋白质、DNA-蛋白质相互作用、RNA-蛋白质相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、氨基酸、脂质、脂质筏、膜受体、以及离子通道。

34.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述细胞功能包括：新陈代谢、转录、翻译、基因表达、分泌、神经导致释放、离子通道选通、凋亡、细胞周期调控、第二信使生成、酶活性、活性氧生成、氧化/还原反应。

Images