CN101285038B - 一种用于海洋灰绿曲霉生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基及其制备方法 - Google Patents
一种用于海洋灰绿曲霉生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于海洋灰绿曲霉生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基，每升所述新型培养基包括：可溶性淀粉20～100g，蔗糖10～100g，麦芽糖20～100g，蛋白胨0.5-6g，酵母膏0.3-6g，黄豆粉0.2-4g，谷氨酸钠0.5-10g，七水硫酸镁0.01-1g，磷酸二氢钾0.01-2g，其余为人工海水，还提供了其制备方法。本发明的原料易得、成本低、制备方法简单、能显著促进海洋灰绿曲霉HB1-19发酵生产灰绿霉素A的产量，灰绿霉素A产量从原始的15mg/L提高到71mg/L，有利于大规模工业化生产，对海洋灰绿曲霉HB1-19发酵研究及灰绿霉素A医药学研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及培养基技术领域，更具体地，涉及用于培养海洋灰绿曲霉的培养基技术领域，特别是指一种用于海洋灰绿曲霉生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基及其制备方法。
背景技术
现在从陆地生物中发现新化合物越来越难，相反海洋是目前开发极少的巨大生物资源宝库。最近几年从海洋生物特别是无脊椎动物、微生物中分离出了大量新型生物活性物质，统计表明2003年报道了656种新化合物，2004年报道了716种新化合物。其中部分处于I-III期临床实验。海洋微生物，包括海洋放线菌、真菌等是新活性物质的重要来源。
灰绿霉素A(aspergiolide A)是中国海洋大学从海洋真菌灰绿曲霉HB1-19(Aspergillus glaucus HB1-19)中分离出来的一种具有自主知识产权的、结构全新的具有抗癌活性新蒽酮内酯化合物。灰绿霉素A以9-蒽酮为母核，利用SciFinder数据库进行相似化合物检索，未搜到该类9-蒽酮内酯衍生物，这说明灰绿霉素A结构骨架较为新颖。经中科院上海药物所评价，其对人肺癌A549细胞、人白血病HL60细胞有较强的增殖抑制作用，其IC50分别为0.13和0.28μM。此外该化合物在10-6M浓度下，对人脐静脉内皮细胞具有明显的增殖抑制作用和迁移抑制活性，具有良好的开发价值。
新药开发的历史证明，有些天然活性产物如青霉素等不仅本身可直接被开发成新药产品，而且还成为研制后续系列新药产品的重要先导物；即使是本身不宜直接开发的新天然活性产物，往往也会为创新药物研究提供新的活性先导结构，供进一步结构改造和优化。由于灰绿霉素A结构具有新颖性并且展示很好的抗癌活性，所以非常有必要对其进行深入研究。
然而灰绿霉素A在原始菌株中含量极低(＜15mg/L)，制约了对其进行进一步的体内外活性评价及构效研究，因此通过规模化发酵及代谢调控研究，进行高效发酵生产是必须加以解决的首要问题。而要进行大规模高效发酵生产和代谢调控研究，继而进行后续的医药学研究，首要解决的就是产量问题，所以开发一种促进海洋灰绿曲霉生产灰氯霉素A的培养基就成为后续研究的一个非常重要的前提条件。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种用于海洋灰绿曲霉生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基及其制备方法，该新型培养基原料易得、成本低、制备方法简单、能显著促进海洋灰绿曲霉HB1-19发酵生产灰绿霉素A的产量，有利于大规模工业化生产，对海洋灰绿曲霉发酵研究及灰绿霉素A医药学研究具有重要意义。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于海洋灰绿曲霉生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基，其特点是，每升所述新型培养基包括：可溶性淀粉20～100g，蔗糖10～100g，麦芽糖20～100g，蛋白胨0.5-6g，酵母膏0.3-6g，黄豆粉0.2-4g，谷氨酸钠0.5-10g，七水硫酸镁0.01-1g，磷酸二氢钾0.01-2g，其余为人工海水。
较佳地，所述可溶性淀粉40g，蔗糖40g，麦芽糖30g，蛋白胨2g，酵母膏1.07g，黄豆粉1g，谷氨酸钠2g，七水硫酸镁0.03g，磷酸二氢钾0.05g。
较佳地，每升所述人工海水包括：氯化钠24.5g，无水硫酸钠3.92g，无水氯化钙0.91g，六水氯化镁4.98g，硼酸0.026g，氯化钾0.664g，溴化钾0.096g，碳酸氢钠0.192g，其余为去离子水。
一种用于制备上述的新型培养基的方法，其特点是，包括步骤：
a.所述可溶性淀粉用部分所述人工海水进行糊化，冷却；
b.所述蔗糖，所述麦芽糖，所述蛋白胨，所述酵母膏，所述黄豆粉，所述谷氨酸钠，所述七水硫酸镁和所述磷酸二氢钾溶于部分所述人工海水；
c.将上述两步骤得到的溶液混合均匀，用所述人工海水定容。
上述步骤a中，所述可溶性淀粉需先用人工海水糊化，目的是防止灭菌过程中结块的问题。
较佳地，在步骤a中，所述糊化为用部分所述人工海水将所述可溶性淀粉制成悬浊液，然后缓慢倒入90-100℃的人工海水中并不断搅拌，至成半透明状液体。
较佳地，步骤c进一步包括：在121℃，灭菌20～40min。
一种使用上述的新型培养基培养海洋灰绿曲霉HB1-19生产灰绿霉素A的发酵方法，其特点是，包括步骤：取海洋灰绿曲霉HB1-19孢子接种所述新型培养基进行培养，获得新鲜接种液，取所述新鲜接种液按10～15％的接种量接入新鲜的所述新型培养基进行发酵培养6-9天，获得发酵液。
较佳地，按终浓度约1～10*107个所述海洋灰绿曲霉HB1-19孢子/ml进行接种；所述培养是在28℃，170r/min摇床培养30～60h。
一种上述发酵方法生产的灰绿霉素A的检测方法，其特点是，包括步骤：待所述发酵液pH变至7.0左右或所述发酵液变紫黑色后约30h，停止培养；取适量所述发酵液，加入乙酸乙酯和玻璃珠进行萃取，离心，取适量有机相进行旋转蒸馏；馏干物用无水甲醇溶解，离心；取适量上层液，用无水甲醇稀释若干倍后，用HPLC测定灰绿霉素A含量，进而换算成所述发酵液中灰绿霉素含量。
较佳地，所述发酵液取10ml，所述乙酸乙酯20ml，所述玻璃珠20粒；所述萃取在20℃和200r/min条件下进行。
本发明的有益效果具体如下：
1.由于本发明的新型培养基成分主要是淀粉、蔗糖、麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、黄豆粉、谷氨酸钠、七水硫酸镁、磷酸二氢钾等常见物质，原料易得，成本低；
2.制备本发明的新型培养基时，先将淀粉用人工海水制成悬浮液，煮沸糊化，再冷却，将其余组分溶解于人工海水，两者混合定容即可，制备简单；
3.采用本发明的新型培养基培养目的菌株海洋灰绿曲霉HB1-19，该菌株在该新型培养基中可以很好的生长，最终产量可达到71mg/L，是原始水平的4.73倍，显著促进海洋灰绿曲霉HB1-19发酵生产灰绿霉素A的产量，有利于大规模(＞500L)工业化生产，对海洋灰绿曲霉发酵研究及灰绿霉素A医药学研究具有重要意义。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。
实施例1
1.1制备人工海水：
称取氯化钠24.5g，无水硫酸钠3.92g，无水氯化钙0.91g，六水氯化镁(MgCl2·6H2O)4.98g，硼酸0.026g，氯化钾0.664g，溴化钾0.096g，碳酸氢钠0.192g，用去离子水充分溶解并定容至1000ml。
1.2可溶性淀粉糊化：
将40g可溶性淀粉用150ml人工海水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的人工海水中并不断搅拌，至成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。
1.3培养基配制：
称取蔗糖40g，麦芽糖30g，蛋白胨2g，酵母膏1.07g，黄豆粉1g，谷氨酸钠2g，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.03g，磷酸二氢钾0.05g，倒入适量人工海水将可溶性成分充分溶解，再倒入步骤1.2制备的冷却的淀粉糊化液，再用人工海水定容至1000ml。
1.4发酵生产灰绿霉素A：
海洋灰绿曲霉HB1-19(中国典型培养物保藏中心，保藏编号是：CCTCC M 206022)，用无菌水从斜面洗下海洋灰绿曲霉HB1-19孢子，按终浓度约(1-10)*107个/ml接入种子培养基，于28℃，170r/min摇床培养30-60h，按10-15％的接种量接入发酵培养基，培养6-9天，待发酵液pH变至7.0左右(发酵液变紫黑色后约30h)，停止培养。
1.5灰绿霉素A产量的测定
取上一步骤制备的发酵液10ml，加入20ml乙酸乙酯和20粒玻璃珠，于20℃，200r/min萃取10-20h。12000r/min离心5-10min，取有机相10ml进行旋转蒸馏，馏干物用2.5ml无水甲醇溶解，保存于-20℃，取甲醇溶解液1ml，12000r/min离心3min，取上层液250μl，用无水甲醇稀释4倍后，用HPLC测定灰绿霉素A含量，进而换算成发酵液中灰绿霉素A含量，测得灰绿霉素A含量为71mg/L。
实施例2
2.1制备人工海水：
同实施例1的步骤1.1。
2.2可溶性淀粉糊化：
将20g可溶性淀粉用150ml人工海水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的人工海水中并不断搅拌，至成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。
2.3培养基配制：
称取蔗糖100g，麦芽糖20g，蛋白胨6g，酵母膏0.3g，黄豆粉4g，谷氨酸钠0.5g，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)1g，磷酸二氢钾0.01g，倒入适量人工海水将可溶性成分充分溶解，再倒入步骤2.2制备的冷却的淀粉糊化液，再用人工海水定容至1000ml。
2.4发酵生产灰绿霉素A：
同实施例1的步骤1.4。
2.5灰绿霉素A产量的测定
同实施例1的步骤1.5，测得灰绿霉素A含量为42mg/L。
实施例3
3.1制备人工海水：
同实施例1的步骤1.1。
3.2可溶性淀粉糊化：
将100g可溶性淀粉用150ml人工海水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的人工海水中并不断搅拌，至成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。
3.3培养基配制：
称取蔗糖10g，麦芽糖100g，蛋白胨0.5g，酵母膏6g，黄豆粉0.2g，谷氨酸钠10g，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.01g，磷酸二氢钾2g，倒入适量人工海水将可溶性成分充分溶解，再倒入步骤3.2制备的冷却的淀粉糊化液，再用人工海水定容至1000ml。
3.4发酵生产灰绿霉素A：
同实施例1的步骤1.4。
3.5灰绿霉素A产量的测定
同实施例1的步骤1.5，测得灰绿霉素A含量为34mg/L。
实施例4
4.1制备人工海水：
同实施例1的步骤1.1。
4.2可溶性淀粉糊化：
将40g可溶性淀粉用150ml人工海水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的人工海水中并不断搅拌，至成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。
4.3培养基配制：
称取蔗糖40g，麦芽糖30g，蛋白胨2g，酵母膏1g，黄豆粉0.5g，谷氨酸钠8g，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.03g，磷酸二氢钾0.05g，倒入适量人工海水将可溶性成分充分溶解，再倒入步骤4.2制备的冷却的淀粉糊化液，再用人工海水定容至1000ml。
4.4发酵生产灰绿霉素A：
同实施例1的步骤1.4。
4.5灰绿霉素A产量的测定
同实施例1的步骤1.5，测得灰绿霉素A含量为21mg/L。
实施例5
5.1制备人工海水：
同实施例1的步骤1.1。
5.2可溶性淀粉糊化：
将60g可溶性淀粉用150ml人工海水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的人工海水中并不断搅拌，至成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。
5.3培养基配制：
称取蔗糖30g，麦芽糖30g，蛋白胨2g，酵母膏1.5g，黄豆粉1g，谷氨酸钠4g，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.03g，磷酸二氢钾0.05g，倒入适量人工海水将可溶性成分充分溶解，再倒入步骤5.2制备的冷却的淀粉糊化液，再用人工海水定容至1000ml。
5.4发酵生产灰绿霉素A：
同实施例1的步骤1.4。
5.5灰绿霉素A产量的测定
同实施例1的步骤1.5，测得灰绿霉素A含量为58mg/L。
对比例1
除培养基采用常用培养基(麦芽糖2％，甘露醇2％，葡萄糖1％，谷氨酸钠1％，KH2PO40.05％，MgSO4.7H2O 0.03％，酵母膏0.3％，玉米浆0.1％，人工海水)(参考文献：Du L，Zhu TJ，Fang YC，Liu HB，Gu QQ，Zhu WM.Aspergiolide A，a novel anthraquinone derivative withnaphtho[1，2，3-de]chromene-2，7-dione skeleton isolated from a marine-derived fungus Aspergillusglaucus[J].Tetrahedron 2007，63：1085-8)外，其余发酵生产灰绿霉素A及产量测定条件方法同实施例1的步骤1.4和1.5，测得灰绿霉素A含量为15mg/L。
通过以上实施例1～5的实施，本发明的新型培养基原料均为市场上随处可以买到的普通产品，价格比较低，制备也非常简单，与对比例1相比较，本发明的新型培养基能显著促进海洋灰绿曲霉HB1-19发酵生产灰绿霉素A，灰绿霉素A的产量得到显著提高。
综上所述，本发明的新型培养基原料易得、成本低、制备方法简单、能显著促进海洋灰绿曲霉HB1-19发酵生产灰绿霉素A的产量，有利于大规模工业化生产，对海洋灰绿曲霉发酵研究及灰绿霉素A医药学研究具有重要意义。
需要说明的是，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。
Claims (9)
1.一种用于海洋灰绿曲霉生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基，其特征在于，每升所述新型培养基包括：可溶性淀粉20～100g，蔗糖10～100g，麦芽糖20～100g，蛋白胨0.5-6g，酵母膏0.3-6g，黄豆粉0.2-4g，谷氨酸钠0.5-10g，七水硫酸镁0.01-1g，磷酸二氢钾0.01-2g，其余为人工海水，每升所述人工海水包括：氯化钠24.5g，无水硫酸钠3.92g，无水氯化钙0.91g，六水氯化镁4.98g，硼酸0.026g，氯化钾0.664g，溴化钾0.096g，碳酸氢钠0.192g，其余为去离子水。
2.根据权利要求1所述的新型培养基，其特征在于，所述可溶性淀粉40g，蔗糖40g，麦芽糖30g，蛋白胨2g，酵母膏1.07g，黄豆粉1g，谷氨酸钠2g，七水硫酸镁0.03g，磷酸二氢钾0.05g。
3.一种用于制备根据权利要求1所述的新型培养基的方法，其特征在于，包括步骤：
a.所述可溶性淀粉用部分所述人工海水进行糊化，冷却；
b.所述蔗糖，所述麦芽糖，所述蛋白胨，所述酵母膏，所述黄豆粉，所述谷氨酸钠，所述七水硫酸镁和所述磷酸二氢钾溶于部分所述人工海水；
c.将上述两步骤得到的溶液混合均匀，用所述人工海水定容。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤a中，所述糊化为用部分所述人工海水将所述可溶性淀粉制成悬浊液，然后缓慢倒入90-100℃的人工海水中并不断搅拌，至成半透明状液体。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤c进一步包括：在121℃，灭菌20～40min。
6.一种使用根据权利要求1所述的新型培养基培养海洋灰绿曲霉HB1-19生产灰绿霉素A的发酵方法，其特征在于，包括步骤：取海洋灰绿曲霉HB1-19孢子接种所述新型培养基进行培养，获得新鲜接种液，取所述新鲜接种液按10～15％的接种量接入新鲜的所述新型培养基进行发酵培养6-9天，获得发酵液。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，按终浓度1～10×107个所述海洋灰绿曲霉HB1-19孢子/ml进行接种；所述培养是在28℃，170r/min摇床培养30～60h。
8.一种根据权利要求6所述的发酵方法生产的灰绿霉素A的检测方法，其特征在于，包括步骤：待所述发酵液pH变至7.0或所述发酵液变紫黑色后约30h，停止培养；取适量所述发酵液，加入乙酸乙酯和玻璃珠进行萃取，离心，取适量有机相进行旋转蒸馏；馏干物用无水甲醇溶解，离心；取适量上层液，用无水甲醇稀释若干倍后，用HPLC测定灰绿霉素A含量，进而换算成所述发酵液中灰绿霉素含量。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述发酵液取10ml，所述乙酸乙酯20ml，所述玻璃珠20粒；所述萃取在20℃和200r/min条件下进行。
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